ES2347167T3 - Variantes geneticas de vkorc1 que predicen la sensibilidad a warfarina. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento de predecir un intervalo de dosis de una warfarina para un paciente humano, que comprende: investigar el nucleótido en la posición 3673 de la SEQ ID N.º:1 del paciente; determinar si el paciente es sensible a warfarina o si es resistente a warfarina en base al nucleótido en la posición 3673; en la que homocigosis AA, heterocigosis AG, y homocigosis GG en la posición 3673 indican que el paciente es sensible a warfarina, que es sensible de forma intermedia a warfarina y que es resistente a warfarina, respectivamente; y predecir un intervalo de dosificación de warfarina en base a la sensibilidad o resistencia a warfarina del paciente.
Description
Variantes genéticas de VKORC1 que predicen la
sensibilidad a warfarina.
La presente invención se refiere a
procedimientos de dosificar fármacos, en particular warfarina.
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La warfarina es un anticoagulante ampliamente
preferido para la prevención de enfermedades tromboembólicas para
sujetos con trombosis venosa profunda, fibrilación atrial, o
reemplazo de válvulas cardiacas metálicas (1-4).
Sin embargo, el tratamiento con warfarina es problemático porque el
requerimiento de dosis para warfarina es altamente variable, tanto
inter-individualmente como inter-étnicamente
(5-7). Las poblaciones asiáticas, incluyendo la
china, generalmente requieren una dosis de mantenimiento mucho más
baja que los caucasianos y los hispanos (6-9). El
sangrado es con mucho la complicación más grave de tratamiento con
warfarina (10-12). Se ha dedicado mucho esfuerzo a
monitorizar la seguridad de este anticoagulante oral. Actualmente,
la dosis se ha monitorizado estrechamente por determinaciones en
serie de tiempo de protrombina en sangre usando proporción
normalizada internacional estandarizada (INR).
El polipéptido 9, de la subfamilia IIC, del
citocromo P450 (CYP2C9) es la enzima que metaboliza el fármaco
principal que cataliza la hidroxilación de warfarina
(12-15). CYP2C9*2 y CYP2C9*3 son los polimorfismos
más frecuentemente encontrados en la población caucasiana. Tomando
CYP2C9* 1 como el tipo silvestre, las frecuencias de haplotipos
para CYP2C9*1/*2 y CYP2C9*1/*3 son \sim20% y \sim12%
respectivamente (16, 17). Las variantes CYP2C9*2 y CYP2C9*3 han
mostrado disminuir la actividad enzimática de CYP2C9, lo que conduce
a sensibilidad a warfarina y, en casos graves, a complicaciones de
sangrado (18-20). Sin embargo, tanto CYP2C9*2 como
CYP2C9*3 bien están completamente ausentes o bien son raros en las
poblaciones asiáticas (9, 21). Las variantes genéticas descritas en
CYP2C9 hasta ahora pueden explicar sólo parcialmente algunas de las
diferencias inter-individuales en dosificación de
warfarina., pero no pueden explicar las diferencias interétnicas (6,
7, 16).
La gamma-carboxilación de los
factores de coagulación dependientes de vitamina k (factores II,
VII, IX y X) es esencial para la coagulación de la sangre. La
gamma-carboxilasa usa la forma reducida de vitamina
K y oxígeno para añadir una molécula de dióxido de carbono a la
cadena lateral de ácido glutámico en los factores de coagulación.
Durante la carboxilación, la vitamina K reducida se oxida a
2,3-epóxido de vitamina K, a partir del que la
vitamina K reducida se regenera por reductasa de epóxido de vitamina
K para otro ciclo de catálisis. La warfarina bloquea la síntesis
del factor de coagulación inhibiendo la reductasa de epóxido de
vitamina K (22, 23). Recientemente, el gen que codifica para la
subunidad 1 del complejo reductasa de epóxido de vitamina K (VKORC1)
se ha clonado (24, 25) y se han encontrado mutaciones en gen VKORC1
en pacientes resistentes a warfarina (25, 26). Se descubrió también
que un polimorfismo intrónico estaba asociado con cierta
variabilidad inter-individual relativa a warfarina
en pacientes italianos (27).
Estos estudios no pueden explicar toda la
variabilidad de dosificación de warfarina, particularmente la
variación interétnica. Además, una gran parte de la población
mundial, los asiáticos, no se ha tenido en cuenta. Por lo tanto, es
deseable encontrar un procedimiento para predecir el intervalo de
dosis de warfarina apropiado que se pueda aplicar más
ampliamente.
La secuencia génica de VKORC1 que incluye el
Polimorfismo de promotor en posición 1639 está disponible como EMBL
de Número de Acceso AY587020.
El documento WO 2006/044686 revela
procedimientos para predecir respuestas a fármacos. En particular,
revela procedimientos para determinar dosificaciones de warfarina
basadas en la presencia o ausencia de polimorfismos en el gen
VKORC1. El documento WO 2006/044686 indica que un paciente que lleva
clado A/A o B/B es sensible o resistente a warfarina
respectivamente. Los clados se basan en el número de haplotipos que
se refieren a una combinación particular de diez polimorfismos de
un sólo nucleótido localizado en el gen VKORC1.
El documento WO2005030039 revela un vínculo
entre la dosificación de warfarina y los polimorfismos de un sólo
nucleótido en las posiciones 6853 y 9041 de la SEQ ID N.º: 1.
En este estudio, los autores de la presente
invención descubrieron que un polimorfismo en el promotor del gen
VKORC1 está asociado con sensibilidad a warfarina. Este polimorfismo
puede explicar tanto las diferencias
inter-individuales como las diferencias
inter-étnicas en los requerimientos de dosis de warfarina. Además,
el polimorfismo está asociado también con la actividad del promotor.
El promotor de VKORC1 que tiene una G en la posición -1639
(numerada con respecto al primer nucleótido del codón de iniciación)
es un 44% más activo que el promotor que tiene una A en la misma
posición. Los pacientes con el polimorfismo -1639 A son más
sensibles a warfarina. Los pacientes homocigotos AA en la posición
-1639 tuvieron los requerimientos de dosis más bajos, los
heterocigotos AG tuvieron requerimientos de dosis intermedios y los
homocigotos GG tuvieron la dosificación más alta. Así, la secuencia
o actividad del promotor del gen VKORC1 de un sujeto se puede usar
para predecir cuanta warfarina debería prescribirse para el sujeto.
Este procedimiento mejora significativamente la seguridad de la
dosificación de warfarina. Actualmente, se da a los pacientes una
dosis inicial, su INR se monitoriza periódicamente y la
dosificación de warfarina se ajusta de acuerdo con ello, hasta que
se logra una dosis de mantenimiento que es segura para el paciente.
Con la presente invención, la dosis predicha estará mucho más cerca
de la dosis de mantenimiento, así la dosificación de warfarina será
más rápida, más segura y más económica.
De acuerdo con ello, un aspecto de la presente
invención proporciona un procedimiento de predecir un intervalo de
dosis de una warfarina para un paciente humano, que comprende:
investigar el nucleótido en la posición -3673 de la SEQ ID N.º: 1
del paciente; determinar si el paciente es sensible o resistente a
warfarina en base al nucleótido en la posición -3673 en la que
homocigosis AA, heterocigosis AG y homocigosis GG en la posición
3673 indican que el paciente es sensible a warfarina, sensible de
forma intermedia a warfarina y resistente a warfarina,
respectivamente; y predecir un intervalo de dosificación de
warfarina en base a la sensibilidad o resistencia a warfarina del
paciente. Cuanto más sensible es el sujeto a warfarina, más alto es
el riesgo para desarrollar complicaciones, tales como sangrado.
En particular, se investiga la secuencia en la
posición -1639 del gen VKORC1. Si el nucleótido en esta posición es
una A, el sujeto es más sensible a warfarina. Así, un sujeto que
tiene homocigosis AA en la posición -1639 del gen VKORC1 es más
sensible que un heterocigoto que tiene una A y otro nucleótido (G, C
o T) en esta posición. En cambio, el mismo heterocigoto es más
sensible a warfarina que un sujeto que no tiene ninguna A en esa
posición.
La secuencia puede investigarse ensayando para
un marcador genético equivalente del alelo -1639 A o -1639G/C/T, en
el que la presencia del marcador genético equivalente es indicadora
de la presencia del alelo correspondiente. Por ejemplo, el marcador
genético equivalente puede ser un polimorfismo de un sólo nucleótido
seleccionado del grupo constituido por rs9934438, rs8050894,
rs2359612 y rs7294 del gen VKORC1, cada uno de los cuales es
indicativo de la sensibilidad a warfarina.
En algunas realizaciones de la presente
invención, se investiga la secuencia usando un oligonucleótido que
hibrida específicamente con el promotor del gen VKORC1.
Preferentemente, el oligonucleótido hibrida específicamente con al
menos 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ó 24 nucleótidos que abarcan
la posición -1639 del gen VKORC1. La secuencia se puede investigar
usando DNA preparado a partir de sangre periférica del sujeto.
El sujeto de esta invención es preferentemente
un asiático, caucásico, africano, afroamericano, o hispánico.
Se pueden combinar otros procedimientos de
dosificar warfarina con la investigación del gen VKORC1. Por
ejemplo, la secuencia del gen CYP2C9 se puede examinar también en
base al conocimiento disponible en la técnica. Por ejemplo, tanto
CYP2C9*2 como CYP2C9*3 están asociadas con sensibilidad a
warfarina.
La presente invención puede implementarse usando
un kit para determinar el intervalo de dosis de warfarina,
comprendiendo al menos un componente seleccionado del grupo
constituido por:
(a) un medio para detectar secuencia A en la
posición -1639 del gen VKORC1; y
(b) un medio para detectar secuencia G en la
posición -1639 del gen VKORC1.
El kit puede comprender adicionalmente un medio
para detectar secuencia C y T en la posición -1639 del gen VKORC1,
respectivamente. Así, en ciertas realizaciones, el kit puede
comprender un medio para detectar cada una de las cuatro posibles
bases en esta posición. En otras realizaciones, el kit puede
contener un medio para detectar A y un medio para detectar G, C o T
en esta posición, dado que la presencia de una A en esta posición
es lo más indicativo de sensibilidad a warfarina. El medio es
preferentemente un oligonucleótido. El kit puede comprender
opcionalmente los reactivos para hibridación de oligonucleótidos,
amplificación de PCR, y/o interacciones de uso.
El oligonucleótido, o el complemento del mismo,
hibrida con una región del promotor del gen VKORC1, en el que la
región abarca la posición -1639 del promotor y consta de al menos 6
nucleótidos. Preferentemente, el oligonucleótido hibrida
específicamente con al menos 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22 ó 24
nucleótidos que abarcan la posición -1639 del gen VKORC1. El
oligonucleótido puede hibridar con esta región en la que el
nucleótido en la posición -1639 es A, Q C o T, preferentemente A o
G. En ciertas realizaciones, el oligonucleótido puede consistir en
aproximadamente 15 nucleótidos o menos, 16-20
nucleótidos, 20-25 nucleótidos,
25-30 nucleótidos, o 30-40
nucleótidos. Se proporciona también una disposición que comprende el
oligonucleótido de esta invención.
Los detalles de una o más realizaciones de la
invención se exponen en los dibujos adjuntos y en la descripción
más adelante. Otras características, objetos y ventajas de la
invención serán patentes a partir de la descripción y de los
dibujos, y a partir de las reivindicaciones.
Figura 1. Trazado de dispersión de dosis de
warfarina frente al genotipo de VKORC1 -1639. Las dosis de warfarina
en pacientes seleccionados con sensibilidad a warfarina o
resistencia a warfarina (véase Tabla 1 para detalles) se trazaron
frente a genotipos diferentes en la posición -1639 del promotor de
VKORC1. *Individuos con variantes CYP2C9 que incluyen CYP2C9*3,
T299A (es decir, residuo aminoacídico 299 cambiado de T a A) y P382L
(es decir, residuo aminoacídico 382 cambiado de P a L).
Figura 2. Las medidas relativas de niveles de
actividad luciferasa en células HepG2. El comunicador pGL3
luciferasa contiene bien el alelo A (pGL3-A) o bien
el alelo G (pGL3-G) en la posición -1639 del
promotor. Se presenta el promedio de los datos de 9 experimentos, y
las barras de error representan desviación estándar,
pGL3-básico se usó como control sin ninguna
secuencia promotora insertada.
Figura 3. La secuencia genómica del gen VKORC1
(N.º de Acceso de Banco de Genes AY587020). El sitio de inicio de
transcripción está en el nucleótido número 5086 (marcado y en un
recuadro) en esta figura, que se designa como +1 del gen en la
nomenclatura tradicional. La A del codón de iniciación de traducción
ATG (marcada) está en el nucleótido número 5312 en esta figura, que
se recomienda por la Sociedad de Variación del Genoma Humano que se
designe como +1 en el nuevo sistema de nomenclatura. El polimorfismo
de promotor descrito en esta invención está subrayado y marcado
(nucleótido número 3673 en esta secuencia), que está en -1413 en el
sistema tradicional y en -1639 en el sistema nuevo,
recomendado.
Los autores de la presente invención han
descubierto que un polimorfismo en el promotor del gen VKORC1 está
asociado con sensibilidad a warfarina. Este polimorfismo puede
explicar tanto las diferencias inter-individuales
como las diferencias inter-étnicas en los requerimientos de dosis de
warfarina. Además, el polimorfismo está asociado también con la
actividad del promotor. El promotor de VKORC1 que tiene una G en la
posición -1639 (numerada con respecto al primer nucleótido del
codón de iniciación) es un 44% más activo que el promotor que tiene
una A en la misma posición. Los pacientes con el polimorfismo -1639
A son más sensibles a warfarina. Los pacientes homocigotos AA en la
posición -1639 tuvieron los requerimientos de dosis más bajos, los
heterocigotos AG tuvieron requerimientos de dosis intermedios y los
homocigotos GG tuvieron la dosificación más alta. Así, la secuencia
o actividad del promotor del gen VKORC1 de un sujeto se puede usar
para predecir cuanta warfarina debería prescribirse para el
sujeto.
Antes de describir la invención en detalle
adicional, los términos usados en esta solicitud se definen como
sigue a menos que se indique lo contrario.
El término "warfarina" abarca derivados de
cumarina que tienen una actividad anticoagulante. Una realización
preferida, warfarina, es
4-hidroxi-3-(3-oxo-1-fenilbutil)-2H-1-benzopiran-2-ona
(es decir,
3-\alpha-fenil-\beta-acetiletil-4-hidroxicumarina).
El producto comercial actual es una mezcla racémica del isómero R y
el isómero S. El término "warfarina" abarca el isómero R, el
isómero S, cualquier mezcla racémica y cualquier sal de los mismos.
Están específicamente incluidos como warfarina Cumadina, Marevan,
Panwarfina, Protromadina, Tintorano, Warfilona, Waran,
Atrombina-K, warfarina-deanol,
Adoisina, ácido de warfarina, Coumafeno, Zoocumarina, Fenprocumón,
dicumarol, brodifacum, difenadiona, clorofacinona, bromadiolona y
acenocumarol.
Un "oligonucleótido", como se usa en el
presente documento, es una molécula que comprende 2 a
aproximadamente 100 nucleótidos contiguos unidos por medio de
puentes nucleotídicos. Un oligonucleótido puede ser al menos de
aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, o 60 nucleótidos de largo.
Además, un oligonucleótido es preferentemente de hasta
aproximadamente 200, y más preferentemente de hasta aproximadamente
150, 100, 75, 50, 40, 30, o 20 nucleótidos de largo.
Una "sonda" de hibridación es un
oligonucleótido que se une de una manera específica de bases a una
cadena de ácido nucleico complementaria. Tales sondas incluyen
ácidos nucleicos de péptidos. Las sondas pueden ser de cualquier
longitud adecuada para hibridación específica a la secuencia de
ácidos nucleicos objetivo. La longitud más apropiada de la sonda
puede variar dependiendo del procedimiento de hibridación en el que
se esté usando; por ejemplo, las longitudes particulares pueden ser
más apropiadas en disposiciones microelaboradas, mientras que otras
longitudes pueden ser más adecuadas para usar en procedimientos de
hibridación clásicos. Tales optimizaciones se conocen por el
trabajador experto. Las sondas y cebadores adecuados típicamente
varían de aproximadamente 8 nucleótidos a aproximadamente 100
nucleótidos de longitud. Por ejemplo, las sondas y los cebadores
pueden ser de aproximadamente 8-20,
10-30, 15-40, 50-80
y preferentemente de 12-20 nucleótidos de longitud.
La secuencia de nucleótidos puede corresponder a la secuencia
codificante del gen o al complemento de la secuencia codificante
del gen.
Tras comparar las secuencias de DNA CYP2C9 y
VKORC1 de pacientes chinos con sensibilidad o resistencia a
warfarina (Ejemplo 1), los autores de la presente invención
encontraron que las variantes de secuencia de DNA CYP2C9 estuvieron
presentes en sólo el 5,4-7,3% de la población china
Han. Las variantes fueron principalmente CYP2C9*3. Además, dos
mutaciones sustitutivas identificadas en este estudio, que incluyen
una mutación novedosa (P382L) no comunicada anteriormente, fueron
raras y sólo estuvieron presentes en pacientes sensibles a
warfarina. Las variantes CYP2C9 también mostraron prevalencia
diferente en diferentes poblaciones étnicas. CYP2C9* 1/*2 estaba
presente en el 20% de la población caucasiana (17); sin embargo,
estaba completamente ausente en la población china en este estudio.
Por lo tanto, las mutaciones en CYP2C9 pueden dar cuenta de sólo un
porcentaje pequeño de la sensibilidad a warfarina en la población
china y no pueden explicar las diferencias inter-étnicas en
requerimientos de dosis de warfarina.
Por otro lado, los autores de la presente
invención encontraron que cambios en el gen VKORC1 pueden alterar
los requerimientos de dosis de warfarina tanto
inter-individualmente en la población china como
inter-étnicamente entre chinos y caucasianos. Los pacientes con el
genotipo de polimorfismo AA del promotor -1639 tuvieron
requerimientos de dosis más bajos mientras que los genotipos AG/GG
tuvieron requerimientos de dosis más altos (Ejemplos 1 y 2).
Además, los homocigotos AA son raros entre la población caucasiana,
mientras que este genotipo compone la mayoría de la población china
(Ejemplo 3). Las diferencias en las frecuencias genotípicas entre
caucasianos y chinos y la correlación de AA con sensibilidad a
warfarina, están en concordancia con lo que se ha observado
clínicamente de que la población china requiere una dosis más baja
que la población caucasiana.
De acuerdo con ello, un aspecto de la presente
invención proporciona un procedimiento de determinar el intervalo
de dosis de warfarina para un sujeto, que comprende investigar la
secuencia del promotor del gen VKORC1 del sujeto. La secuencia del
promotor contiene preferentemente menos del 10%, 8%, 6%, 4%, 3%, 2%,
o 1% de variación en 3 kb a partir del sitio de la iniciación de la
traducción comparado con SEQ ID N.º: 1. Más preferentemente, el
promotor contiene menos de 20, 15, 12, 10, 8, 6, 4, 3 ó 2
variaciones de base única en esta región de 3 kb. Una variación de
secuencia tal, acoplada con un cambio en actividad del promotor, es
indicadora de un intervalo de la dosis de warfarina que debería
recetarse.
En particular, se investiga la secuencia en la
posición -1639 del gen VKORC1. Este polimorfismo de un sólo
nucleótido se puede usar solo para predecir sensibilidad a warfarina
sin tener que consultar cualquier otro genotipo. Así, la
homocigosis AA en esta posición es indicadora de sensibilidad a
warfarina, la heterocigosis AG indica sensibilidad intermedia y los
sujetos con homocigosis GG son relativamente resistentes. La
dosificación real de warfarina que debería darse a sujetos que son
sensibles, sensibles de forma intermedia, o relativamente
resistentes variaría con la formulación de warfarina así como con la
indicación y los síntomas del sujeto y se puede determinar por el
médico que receta la warfarina. Por ejemplo, el estudio de los
autores de la presente invención (Ejemplo 1) muestra que en un
grupo de pacientes seleccionado con sensibilidad o resistencia a
warfarina, los pacientes con los requerimientos de dosis más bajos
(promedio 1,19 mg/día, intervalo 0,71-1,50 mg/día)
tuvieron el genotipo AA, aquellos con los requerimientos de dosis
intermedios (promedio 8,04 mg/día, variación
6,07-10 mg/día) tuvieron heterocigosis AG y los
requerimientos de dosis más altos (promedio 9,11 mg/día, intervalo
8,57-10 mg/día) estuvieron asociados con el genotipo
homocigoto GG. En pacientes seleccionados al azar (Ejemplo 2), el
genotipo AA está asociado con una dosis de mantenimiento más baja
(2,61 +/- 1,10 mg/día) que AG y GG (3,81 +/- 1,24 mg/día). Estos
intervalos pueden servir como puntos de partida en dosificación de
warfarina.
La secuencia genómica del gen VKORC1 está
disponible como N.º de Acceso de Banco de Genes AY587020 (SEQ ID
N.º: 1; Figura 3). La secuencia de isoforma 1 de RNAm de VKORC1 está
disponible como Número de Acceso NM_024006.4. En ambas de estas
secuencias, el sitio de inicio de transcripción se designa como +1,
así el polimorfismo de promotor indicador de sensibilidad a
warfarina descrito en el presente documento se localizaría en la
posición -1413. Sin embargo, de acuerdo con las recomendaciones
recientes de la Sociedad de variación del Genoma Humano (HGVS) para
la descripción de variaciones de secuencia
(http://www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/ mutnomen/), el polimorfismo
de un sólo nucleótido del promotor se recomienda que se describa en
relación a la A del codón de iniciación de traducción ATG. Según
esta nomenclatura, la A del codón de iniciación de traducción de ATG
(Met) de NM_024006.4 o AY587020 sería la posición 1, el
polimorfismo de un sólo nucleótido del promotor descrito en el
presente documento estaría en posición -1639, y el polimorfismo de
G>A en esta posición se referiría como
"NM_024006.4:c.-1639G>A". Debería aclararse que el
polimorfismo -1639 G>A (o de forma más precisa
"NM_024006.4:c.-1639G>A") de esta revelación es el mismo que
el polimorfismo -1413 G<A de acuerdo con la numeración de
secuencia del promotor tradicional.
Además del polimorfismo específico (por ejemplo,
AA, AG o GG en la posición -1639), los marcadores genéticos que
están ligados a cada uno de los polimorfismos de un sólo nucleótido
específicos se pueden usar para predecir la sensibilidad a
warfarina correspondiente también. Esto es porque los marcadores
genéticos cerca del polimorfismo de un sólo nucleótido de interés
tienden a cosegregar, o a mostrar un desequilibrio de ligazón, con
el polimorfismo de un sólo nucleótido de interés. Consecuentemente,
la presencia de estos marcadores (marcadores genéticos
equivalentes) es indicadora de la presencia del polimorfismo de un
sólo nucleótido de interés, que, a su vez, es indicador del nivel
de sensibilidad a warfarina.
El polimorfismo del promotor de VKORC1 -1639
A>G está en desequilibrio de ligazón con el polimorfismo
intrónico de VKORC1 C>T 1173 comunicado recientemente por
D'Andrea y col. (27) y puede explicar sus resultados de que los
paciente italianos con el genotipo 1173 TT tuvieran la dosis diaria
promedio más baja que el genotipo CT o CC. El estudio de los
autores de la presente invención muestra también que el polimorfismo
3730 G>A (es decir, rs7294), que se localiza en la región no
traducida 3', está en desequilibrio de ligazón con -1639 A>G y
1173 C>T en la población china. Específicamente, el alelo 3730G
está asociado con el alelo -1639A y con el alelo 1173T. Otros
marcadores genéticos equivalentes del polimorfismo de un sólo
nucleótido -1639 incluyen rs9934438 (intrón 1), rs8050894 (intrón
2) y rs2359612 (intrón 2). Así, -1639A está ligado con T en
rs9934438, con C en rs8050894, con T en rs2359612 y con G en rs7294,
mientras que -1639G está ligado con C en rs9934438, con G en
rs8050894, con C en rs2359612 y con A en rs7294.
El marcador genético equivalente puede ser
cualquier marcador, incluyendo microsatélites y marcadores de
polimorfismos de un sólo nucleótido (SNP). Preferentemente, los
marcadores genéticos útiles están aproximadamente a 200 kb a partir
de la posición -1639 de VKORC1 o menos. Más preferentemente, los
marcadores están aproximadamente a 100 kb, 80 kb, 60 kb, 40kb, 20
kb, 15 kb, 10 kb, o 5 kb a partir de la posición -1639 de VKORC1 o
menos.
Un aspecto de la presente invención proporciona
oligonucleótidos que son capaces de hibridar con los polimorfismos
de un sólo nucleótido de esta invención. El oligonucleótido será
útil, por ejemplo, como una sonda de hibridación o como un cebador
para la detección de la secuencia del promotor del gen VKORC1. El
oligonucleótido preferentemente comprende la secuencia TGGCCGGGTGC
(3668 a 3678 de SEQ ID N.º: 1), o el complemento de la misma. Para
el propósito de hibridación, es preferible que la secuencia que
corresponde a la posición -1639 esté cerca del centro del
oligonucleótido. Preferentemente, hay al menos 4 nucleótidos en cada
lado de la secuencia que corresponde a -1639. La posición
correspondiente -1639 está flanqueada más preferentemente por al
menos 5, 6, 7, 8 ó 9 nucleótidos a cada lado.
Las hibridaciones se llevaron a cabo usualmente
en condiciones restrictivas, por ejemplo, a una concentración de
sales de no más de 1 M y a una temperatura de al menos 25ºC. Por
ejemplo, las condiciones de SSPE 5x (NaCl 750 mM,
Na-fosfato mM, EDTA mM, pH 7,4) y una temperatura de
25-30ºC, o condiciones equivalentes de las mismas,
son adecuadas para hibridaciones de sonda específicas de nucleótido
individual. Más preferentemente, se lleva a cabo un lavado poco
restrictivo después de hibridación, que incluye, por ejemplo, 42ºC,
SSC 5x y SDS al 0,1%; o 50ºC, SSC 2x y SDS al 0,1%. Las condiciones
de lavado altamente restrictivas son las más preferibles e
incluyen, por ejemplo, 65ºC, SSC 0,1x y SDS al 0,1%. Las condiciones
equivalentes se pueden determinar variando uno o más de los
parámetros, como se conoce en la técnica, manteniendo mientras un
grado similar de identidad o similitud entre la secuencia del
nucleótido objetivo y el cebador o sonda usado.
El polimorfismo de un sólo nucleótido del
promotor -1639 está localizado en una caja-E (la
secuencia consenso de las cajas-E es CANNTG) y
dentro de una distancia corta (200 pares de bases), hay tres
cajas-E adicionales. Se ha mostrado que las
cajas-E son elementos importantes para mediar
transcripción específica de tipo de célula/tejido, tal como en
músculos, neuronas, hígado y páncreas (28, 29). Cambiar la segunda
base de A a G como se observa en el sitio -1639 aboliría la
secuencia consenso de la caja-E y alteraría la
actividad del promotor. Esto se demostró claramente por el ensayo
del promotor que en las células HepG2 la actividad del promotor se
incrementó en el 44% cuando las secuencias consenso se abolieron
(Figura 2). Sin desear estar limitados por la teoría, esto sugiere
que la caja-E puede funcionar como un sitio de unión
represor en HepG2. Dado que HepG2 se deriva de un hepatoma, es
probable que la caja-E de -1639 reprima la
transcripción en el hígado.
El hecho de que las personas con el genotipo
-1639 GG requieran una dosis de warfarina más alta puede explicarse
como sigue. El gen VKORC1 codifica para la subunidad 1 del complejo
de reductasa de epóxido de la vitamina K, que es responsable de
generar la forma reducida de la vitamina K. La forma reducida de la
vitamina K se requiere por gamma-carboxilasa y la
gamma-carboxilación de factores de coagulación
dependientes de vitamina K (factor II, VII, IX y X) es esencial
para la coagulación de la sangre. Cuando la actividad del promotor
de VKORC1 se incrementa, un nivel elevado de RNAm de VKORC1 puede
conducir a actividad de VKOR más alta (25) y puede potenciar así la
eficiencia de regeneración de la vitamina K reducida. Así, la
gamma-carboxilación de los factores de coagulación
dependientes de vitamina K está potenciada debido al nivel más alto
de la vitamina K reducida. La warfarina actúa bloqueando la
síntesis de factores de coagulación y tener más factores de
coagulación activos requeriría más warfarina para su efecto
anti-coagulación. Dado que el hígado es el órgano
principal para la síntesis de los factores de coagulación
dependientes de vitamina K y que la expresión de VKORC1 es más alta
en el hígado, un cambio del 44% en el nivel de VKORC1 en el hígado
es probable que tenga un impacto significativo en el proceso de
coagulación de la sangre. Así, los reque-
rimientos de dosis de warfarina están asociados con el polimorfismo del gen VKORC1 y su actividad de promotor.
rimientos de dosis de warfarina están asociados con el polimorfismo del gen VKORC1 y su actividad de promotor.
Los inventores presentes consideran que
cualquier secuencia en la posición -1639 del promotor de VKORC1,
distinta de una A, destruirá la caja-E e
incrementará la actividad del promotor. Un incremento en la
actividad del promotor, a su vez, incrementa los requerimientos de
dosis de warfarina. Así, la secuencia del promotor, particularmente
la secuencia en la posición -1639, es indicadora de las
dosificaciones de warfarina. Además, otras realizaciones de la
presente invención proporcionan procedimientos de dosificar
warfarina, o de determinar sensibilidad a warfarina, detectando la
actividad promotora del gen VKORC1. Similarmente, el nivel del
producto génico del gen VKORC1 (bien RNAm o bien proteína) o la
actividad VKOR puede reflejar los requerimientos de dosis de
warfarina. Una actividad promotora de VKORC1, un nivel de RNAm, un
nivel de proteína, o una actividad de VKOR que es al menos el 10%,
15%, 20%, 25%, 30%, 35% o 40% más que aquella de un sujeto que tiene
el genotipo AA es indicadora del requerimiento de una dosis más
alta de warfarina que el sujeto con el genotipo AA.
Los procedimientos de determinar actividades
promotoras o niveles de RNAm o proteínas se conocen bien en la
técnica. En ciertas realizaciones, PCR puede emplearse para detectar
nivel de RNAm. En otras realizaciones, los anticuerpos específicos
se usan para medir la proteína VKORC1. Las actividades del promotor
se pueden examinar, por ejemplo, aislando la secuencia del promotor
del sujeto de interés usando una muestra de sangre periférica,
uniendo la secuencia del promotor a un gen comunicador, expresando
el gen comunicador y determinando la cantidad del comunicador
producido. Los procedimientos de medir actividades de VKOR se
conocen también en la técnica.
Los siguientes ejemplos se ofrecen para ilustrar
esta invención y no son para interpretarse de ninguna manera como
limitantes del alcance de la presente invención. Mientras que esta
invención se muestra y se describe particularmente con referencias
a realizaciones preferidas de la misma, se entenderá por aquellos
expertos en la técnica que se pueden hacer diversos cambios en la
forma y en los detalles sin apartarse del espíritu y alcance de la
invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.
\vskip1.000000\baselineskip
En los ejemplos más adelante, las siguientes
abreviaturas tuvieron los siguientes significados. Las abreviaturas
no definidas tienen sus significados generalmente aceptados.
- ºC
- = grado Celsius
- hr
- = hora
- min
- = minuto
- secos
- = segundo
- \muM
- = micromolar
- mM
- = milimolar
- M
- = molar
- ml
- = mililitro
- \mul
- = microlitro
- mg
- = miligramo
- \mug
- = microgramo
- mol
- = mol
- pmol
- = picomol
- ASO
- = oligonucleótido específico de alelo
- CYP2C9
- = citocromo P450, subfamilia IIC, polipéptido 9
- IND
- = proporción normalizada internacional
- LD
- = desequilibrio de ligazón
- NTP
- = nucleósido trifosfato
- PBS
- = solución salina tamponada por fosfato
- PCR
- = reacción en cadena de la polimerasa
- SNP
- = polimorfismo de un sólo nucleótido
- VKORC1
- = complejo de reductasa de epóxido de vitamina K, subunidad 1.
Los inventores presentes reunieron 16 pacientes
quienes recibieron warfarina bien a dosis baja o bien a dosis alta
de clínicas cardiovasculares de cuatro centros médicos principales
en Taiwán (Hospital Universitario Nacional de Taiwán, Hospital
Universitario Médico de Kaohsiung, Hospital de Veteranos de Taipei y
Hospital Memorial de Shin-Kong Wu
Ho-Su). La dosis de mantenimiento promedio de
warfarina en los pacientes chinos es de 3,3 mg/día (8, 9). Por lo
tanto, los autores de la presente invención consideraron pacientes
quienes recibieron dosis de mantenimiento \leq 1,5 mg por día
como sensibles a warfarina (Tabla 1, 11 pacientes) y pacientes de
dosis de mantenimiento de warfarina \geq 6 mg por día como
resistentes a warfarina (Tabla 1, 5 pacientes). La definición de
pacientes resistentes a warfarina estaba respaldada por los propios
datos de los autores de la presente invención de que ninguno de los
pacientes seleccionados al azar (Tabla 2) tuvieron dosis de
warfarina mayor de 6 mg/día. Esto está en contraste con los
pacientes caucasianos, quienes tuvieron una dosis de mantenimiento
promedio entre 5,1 y 5,5 mg/día (20, 27).
La dosis promedio diaria de warfarina se calculó
a partir de un periodo de una semana y se registró la última
proporción normalizada internacional (INR) de cada paciente. Los 104
pacientes reclutados al azar quienes recibieron warfarina, sin
tener en cuenta la dosis, tuvieron una INR objetivo de 1,4 a 3 a
partir de los mismos 4 hospitales (Tabla 2). Las indicaciones de
warfarina fueron: reemplazo de válvula (90 pacientes), trombosis
venosa profunda (5 pacientes), fibrilación atrial (5 pacientes) y
apoplejía (4 pacientes). La información clínica (incluyendo edad,
sexo, peso y dosis de mantenimiento diaria promedio) se obtuvo a
partir de cada participante. Al tiempo de sacar sangre, cada
paciente tenía una dosis de mantenimiento constante durante al
menos tres semanas. Se excluyeron los pacientes con cáncer de
hígado, de riñón, gastrointestinal, o con problemas de sangrado
anormal antes de la terapia con warfarina.
Además, se usaron muestras de DNA de 92
caucasianos sin parentesco (N.º de Cat., HD100CAU, Depósito de
Células de Genética Humana del Instituto Nacional de Ciencias
Médicas Generales (NIGMS), Camden, NJ, EE.UU.) como controles
caucasianos. Las muestras de DNA de 95 sujetos sanos seleccionados
al azar de un biobanco en un estudio de población que abarcaba toda
la nación, en el que se reunieron 3312 descendientes de chinos Han
en base a la distribución geográfica a través de Taiwán, se usaron
como controles chinos. Los controles chinos y todos los pacientes
participantes que recibieron terapia de warfarina fueron chinos Han
sin parentesco que residían en Taiwán. Los chinos Han forman el
grupo étnico más grande en Taiwán, constituyendo aproximadamente el
98% de la población. Ninguno de los participantes fue un taiwanés
aborigen, que dan cuenta del 2% que queda de la población
taiwanesa.
El estudio se aprobó por el consejo de estudios
institucional y se obtuvo el consentimiento informado de todos los
participantes.
El DNA genómico se aisló usando el sistema de
purificación de DNA PUREGENE^{TM} (Gentra systems, Minnesota,
EE.UU.). Las variantes de secuencia de DNA CYP2C9 y VKORC1 se
determinaron primero por secuenciación directa (analizador de DNA
3730 de Applied Biosystems, Applied Biosystems, Foster City, CA,
EE.UU.) en 16 pacientes chinos Han que tenían sensibilidad a
warfarina (\leq 1,5 mg/día, 11 pacientes) y resistencia a
warfarina (\geq 6,0 mg/día, 5 pacientes). Los cebadores se
diseñaron específicamente para las uniones
intrón-exón, exones y 2 kbps antes en la cadena que
el sitio de iniciación de la transcripción tanto para CYP2C9 como
para VKORC1 usando el programa de cebadores de PCR Primer3
(\underbar{http://fokker.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3\_www.cgi}).
Los cebadores usados para detectar variantes en el promotor de
VKORC1 fueron: 5'- CAGAAGGGTAGGTGCAACAGTAA (SEQ ID N.º:2; cadena en
sentido normal localizada 1,5 kb antes en la cadena que el sitio de
iniciación de la transcripción) y
5'-CACTGCAACTTGTTTCTCTTTCC (SEQ ID N.º:3; cadena
antisentido localizada 0,9 kb antes en la cadena que el sitio de
iniciación de la transcripción). Las reacciones en cadena de la
polimerasa (PCR) se llevaron a cabo en un volumen final de 25
\mul, que contenía 0,4 \muM de cada cebador,
Tris-HCl 10 mM (pH 8,3), KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5
mM, dNTP 0,2 mM y 1 unidad de HotStart Taq^{TM} (Qiagen
Inc., Valencia, CA, EE.UU.). Las condiciones de amplificación
consistieron en una desnaturalización inicial de 12 minutos a 96ºC,
seguida por 34 ciclos de PCR en 30 segundos a 96ºC, 30 segundos a
60ºC, 40 segundos a 72ºC.
Se usó después espectrometría de masas
MALDI-TOF (sistema MassARRAY de SEQUENOM, Sequenom,
San Diego, CA, EE.UU.) para revisar buscando las variantes
identificadas en 104 pacientes chinos seleccionados al azar que
reciben warfarina, 95 controles chinos normales y 92 controles
caucasianos normales. Brevemente, se diseñaron cebadores y sondas
usando el software SpectroDESIGNER (Sequenom). Se llevó a cabo PCR
múltiple, y los dNTP no incorporados se defosforilaron usando
fosfatasa alcalina de camarón (Hoffman-LaRoche,
Basel, Suiza), seguido por extensión del cebador. Las reacciones de
extensión de cebador purificado se dispersaron en un chip de
silicio de 384 elementos (SpectroCHIP, Sequenom), analizados en el
espectrómetro de masas Bruker Biflex III MALDI-TOF
SpectroREADER (Sequenom) y el espectro resultante se procesó con
SpectroTYPER (Sequenom).
Para ensayar la actividad del promotor de
VKORC1, se clonó primero el promotor de VKORC1 que comprende el
polimorfismo -1639 (desde -1798 hasta -35) de pacientes con
genotipos -1639 AA y -1639 GG en el vector pGEM-T
(Promega, Madison, WI, EE.UU.) con el cebador directo:
5'-ccgctcgagtagatgtgagaaacagcatctgg (SEQ ID N.º: 4;
conteniendo un sitio de restricción XhoI) y el cebador
reverso: 5'-cccaagcttaaaccagccacggagcag (SEQ ID
N.º: 5; conteniendo un sitio de restricción HindIII). El
fragmento conteniendo el promotor de VKORC1 se liberó del vector
pGEM-T Easy digiriendo el vector con enzimas de
restricción XhoI y HindIII y se subclonó dentro de
los sitios de clonación múltiples (XhoI y
HindIII) de vector pGL3-básico
(Promega). El vector pGL-3 contiene el cDNA
codificado por luciferasa de luciérnaga, que cuando se condensa con
un promotor, se puede usar para analizar la actividad del promotor
insertado tras transfección en células de mamífero. El vector que
contiene el genotipo -1639 G/G se designó pGL3-G y
el vector que contiene el genotipo -1639 A/A se designó
pGL3-A. Se confirmaron las secuencias de promotores
de VKORC1 en ambos vectores por análisis de secuenciación
directa.
Las células HepG2 se cultivaron en medio Eagle
modificado de Dulbecco (DMEM) y suero fetal de ternero al 10%
suplementado con 100 unidades/ml de Penicilina, Estreptomicina a 100
\mug/ml y L-Glutamina 2 mM. Veinticuatro horas
antes de la transfección, se sembraron 1,5 x 10^{5} células en
cada pocillo de una placa de 12 pocillos. En el día de la
transfección, cada pocillo se cotransfectó con 1,5 \mug del vector
pGL3 y con 50 ng del vector pRL-TK (Promega) usando
lipofectamina 2000 (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, EE.UU.).
El vector pRL-TK codificó la luciferasa de
Renilla transcrita mediante un promotor
HSV-TK, que se usó como un control interno para
normalizar la expresión de luciferasa de luciérnaga. Cuarentaiocho
horas después de la transfección, las células se lisaron en tampón
de lisis pasiva (Promega). El lisado cellular se añadió al sustrato
de luciferasa (sistema comunicador de luciferasa dual, Promega) y
las actividades de las luciferasas de Luciérnaga y de
Renilla se midieron con un luminómetro (SIRIUS, Pforzheim,
Alemania).
Se contaron las frecuencias genotípicas de cada
polimorfismo de un sólo nucleótido. La prueba de
Chi-cuadrado se usó para comparar las frecuencias
genotípicas de cada polimorfismo de un solo nucleótido para los tres
grupos de muestra. La prueba-T y la prueba de
Wilcoxon-Mann-Whitney se llevaron a
cabo por comparaciones múltiples de niveles de dosis promedio entre
los diferentes grupos genotípicos. Se evaluó el desequilibrio de
ligazón inter-marcador mediante dos medidas, D' y
r2, calculadas usando Visión General Gráfica de Desequilibrio de
Ligazón (GOLD, http://www.sph.umich.edu/csg/abecasis/GOLD/).
Ejemplo
1
La dosis de mantenimiento promedio de warfarina
en chinos es de 3,3 mg/día (8, 9). Por lo tanto, los autores de la
presente invención consideraron pacientes quienes recibieron dosis
de mantenimiento \leq 1,5 mg por día como sensibles a warfarina
(Tabla 1, 11 pacientes) y pacientes de dosis de mantenimiento de
warfarina \geq 6 mg por día como resistentes a warfarina (Tabla
1, 5 pacientes, véase Materiales y Procedimientos para detalles
adicionales). La secuenciación de las regiones codificantes, las
uniones exón-intrón y la región promotora del gen
CYP2C9 revelaron tres variantes de secuencia en 4 de los 11
pacientes sensibles a warfarina. Las variantes fueron: 1075 A>C
(1359L conocida como CYP2C9*3), 895 A>G (T299A), y 1145 C>T
(P382L). CYP2C9*3 se detectó en 3 pacientes (sujetos 1, 3 y 5,
Tabla 1). El sujeto 5, además de CYP2C9*3, tenía también el cambio
895 A>G (T299A) como se describe anteriormente (7). Se detectó
una mutación exónica novedosa, 1145 C>T (P382L), en el cuarto
paciente (sujeto 6). Como se muestra en la Tabla 1, las variantes
del gen CYP2C9 no estuvieron presentes en todos los pacientes
sensibles a warfarina y estuvieron completamente ausentes en todos
los pacientes resistentes a warfarina.
Los inventores presentes secuenciaron también el
promotor, las regiones codificantes, y las uniones
exón-intrón del gen VKORC1. Se detectó una variante
(3730 G>A) que estaba localizada en la región no traducida (UTR)
3' de VKORC1. Además, se detectó un polimorfismo de promotor, -1639
G>A (o -1413 usando sitio de inicio de transcripción como +1) en
la región anterior en la cadena de VKORC1. Este polimorfismo mostró
una asociación con sensibilidad a warfarina en la que todos los
pacientes sensibles a warfarina fueron homocigotos AA en la
posición -1639. Los pacientes resistentes a warfarina, por otro
lado, fueron bien heterocigotos AG o bien homocigotos GG (Tabla 1).
Cuando se trazaron las dosis de warfarina frente a los genotipos de
-1639, se demostró que pacientes con el genotipo AA tuvieron los
requerimientos de dosis más bajos (promedio de 1,19 mg/día,
intervalo de 0,71-1,50 mg/día), los heterocigotos AG
tuvieron requerimientos de dosis intermedios (promedio de 8,04
mg/día, intervalo de 6,07-10 mg/día) y el genotipo
homocigoto GG tuvo los requerimientos de dosis más altos (promedio
9,11 mg/día, intervalo de 8,57-10 mg/día) (Figura
1).
Además de la -1639 G>A, se ha identificado
también un polimorfismo de intrón 1 1173 C>T, que se ha descrito
por D'Andrea y col. (27), en nuestros pacientes. Estos dos
polimorfismos parecieron estar en fuerte desequilibrio de ligazón
(LD) (Tabla 1). Los pacientes sensibles a warfarina con el genotipo
-1639 AA se encontró que estaban asociados con la homocigosis TT en
1173 salvo para un paciente (sujeto 6). En pacientes resistentes a
warfarina, los pacientes con el genotipo AG heterocigoto -1639 se
encontró que estaban asociados con la heterocigosis CT en 1173 y se
encontró que la homocigosis -1639 GG estaba asociada con la
homocigosis TT en 1173 (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
Investigando adicionalmente si el polimorfismo
-1639 G>A estuvo asociado con las diferencias
inter-individuales en dosificación de warfarina,
los autores de la presente invención genotiparon 104 pacientes que
recibieron warfarina sin tener en cuenta la dosis, usando
espectrometría de masas MALDI-TOF. Los grupos AA y
AG/GG no difirieron con respecto a la edad, sexo e INR (Tabla 2).
Sólo se encontraron dos pacientes que eran homocigotos para GG y se
agruparon conjuntamente con AG para análisis estadístico. Los
autores de la presente invención analizaron los datos sin tener en
cuenta la presencia de otras variables que causan confusión, tales
como dieta u otras medicaciones. Como se muestra en la Tabla 2, el
grupo AA tuvo significativamente requerimientos de dosis más bajos
(2,61 mg/día) que el grupo AG/GG (3,81 mg/día). Las diferencias
fueron significativamente bien por prueba T (p < 0,0001) o bien
por prueba de Wilcoxon Mann Whitney (p = 0,0002) entre los grupos
AA y AG/GG.
Se ha sabido que la población china requiere una
dosis de mantenimiento de warfarina mucho más baja que la población
caucasiana. Para probar si las diferencias en las frecuencias
genotípicas de VKORC1 -1639 podían dar cuenta de las diferencias
inter-étnicas en las dosificaciones de warfarina, se genotiparon 95
sujetos chinos Han normales y 92 sujetos caucasianos normales. En
la población caucasiana, la homocigosis AA fue la secuencia más
baja, mientras que los genotipos AG y GG componían la mayoría de la
población (14,2%, 46,7% y 39,1% respectivamente, Tabla 3). En la
población china, por el contrario, los homocigotos AA componían la
mayoría de la población (82,1%), con el resto de la población siendo
heterocigotos AG (17,9%). No se detectaron homocigotos GG en esta
población seleccionada al azar. Esta proporción fue también similar
en los 104 pacientes de warfarina en los que se encontró que el
79,8% eran homocigotos AA, el 18,3% eran heterocigotos AG y el 1,8%
que queda eran homocigotos GG. Las diferencias en las frecuencias
genotípicas entre el grupo caucásico y los dos grupos de chinos
fueron significativas, con los valores de p de menos de 0,0001.
Estas diferencias entre los dos grupos étnicos (caucasianos y
chinos) y la correlación de AA con sensibilidad a warfarina están
en concordancia con la observación clínica de que la población china
requiere una dosis más baja que la población caucasiana.
Además de -1639 G>A, los inventores presentes
revisaron en busca de los tres polimorfismos intrónicos
(rs9934438, intrón 1 1173 C>T; rs8050894, intrón 2 g.509+124C; y rs2359612, intrón 2 g.509+837C) y de un polimorfismo UTR 3' (rs7294, 3730 G>A) en la población china. Todos los cuatro polimorfismos estuvieron en desequilibrio de ligazón con el polimorfismo de promotor -1639 (Inter-marcador D' y valores de r2 = 1,0).
(rs9934438, intrón 1 1173 C>T; rs8050894, intrón 2 g.509+124C; y rs2359612, intrón 2 g.509+837C) y de un polimorfismo UTR 3' (rs7294, 3730 G>A) en la población china. Todos los cuatro polimorfismos estuvieron en desequilibrio de ligazón con el polimorfismo de promotor -1639 (Inter-marcador D' y valores de r2 = 1,0).
Las variantes CYP2C9 se genotiparon también en
los grupos de chinos. La frecuencia de CYP2C9*1/*3 era del 7,3% en
la población china normal y del 5,4% en los pacientes chinos
seleccionados al azar que recibieron warfarina. La variante
CYP2C9*2 no se detectó en los pacientes chinos o en los controles
chinos. Comparados con los datos publicados sobre la frecuencia de
la variante CYP2C9 en caucasianos, la población caucasiana tuvo una
frecuencia mucho más alta de variantes CYP2C9 que la china
(\sim30% frente al 7%), sin embargo los caucasianos son más
resistentes a warfarina. Otras mutaciones sustitutivas detectadas en
los pacientes sensibles a warfarina, 895 A>G (T299A) y 1145
C>T (P382L) (Tabla 1) no se encontraron en cualquiera de los
pacientes seleccionados al azar ni en los controles, sugiriendo que
éstas eran mutaciones raras.
\vskip1.000000\baselineskip
Las diferencias en sensibilidad a warfarina
entre los pacientes de genotipo AA y los pacientes de genotipo GG
podrían explicarse por cambios en la actividad del promotor de
VKORC1. El polimorfismo de un sólo nucleótido del promotor -1639 se
localizó en el segundo nucleótido de una caja-E
(CANNTG) y por lo tanto, este polimorfismo alteraría la secuencia
consenso de la caja-E y podría conducir a cambios en
la actividad del promotor de VKORC1. Probando esta hipótesis, el
promotor de VKORC1 que comprende la posición -1639 se amplificó por
PCR a partir de pacientes con el genotipo -1639 AA o GG y se clonó
en el vector pGL-3. Se eligió célula HepG2 (una
línea celular humana de hepatoma) para el ensayo de promotor debido
a que VKORC1 se expresa al nivel más alto en el hígado. Se llevaron
a cabo un total de 9 experimentos y todos demostraron resultados
consistentes (mostrados en la Figura 2). El promotor de VKORC1
-1639 G presentó actividad luciferasa más alta (aproximadamente el
44% más alta) comparada con el promotor -1639 A. El control de
vector pGL-3 básico no tiene ningún promotor
insertado en el sitio de clonación múltiple y tuvo una cantidad
despreciable de actividad luciferasa. Por lo tanto, la secuencia en
la posición -1639 es importante para promover actividad y la
actividad de promotor más alta (por ejemplo, -1639G) está asociada
con requerimientos de dosis de warfarina más altos.
\vskip1.000000\baselineskip
Aunque el polimorfismo de un sólo nucleótido en
-1639 de VKORC1 se puede usar solo para predecir sensibilidad a
warfarina, este polimorfismo de un sólo nucleótido puede combinarse
opcionalmente con otro(s) marcador(es)
genético(s). Por ejemplo, las secuencias tanto del gen VKORC1 como del gen CYP2C9 se pueden examinar en dosificación de warfarina. La siguiente tabla ilustra las dosis de Cumadina sugeridas para cada haplotipo cuando estos dos genes se consideran ambos:
genético(s). Por ejemplo, las secuencias tanto del gen VKORC1 como del gen CYP2C9 se pueden examinar en dosificación de warfarina. La siguiente tabla ilustra las dosis de Cumadina sugeridas para cada haplotipo cuando estos dos genes se consideran ambos:
<110> Academia Sinica
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Variantes Genéticas que Predicen
Sensibilidad a Warfarina
\vskip0.400000\baselineskip
<130> JB/070217/JH
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 05855433.8
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
21-12-2005
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/638,837
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
21-12-2004
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/679,694
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
10-5-2005
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> FastSEQ para Windows Version 4.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11190
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de cebador usada para
detectar las variantes en el promotor de VKORC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> secuencia de cebador usada para
detectar las variantes en el promotor de VKORC1
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo que contiene un
sitio de restricción de XhoI
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador reverso que contiene un
sitio de restricción HindIII
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm
Claims (8)
1. Un procedimiento de predecir un intervalo de
dosis de una warfarina para un paciente humano, que comprende:
- investigar el nucleótido en la posición 3673 de la SEQ ID N.º:1 del paciente; determinar si el paciente es sensible a warfarina o si es resistente a warfarina en base al nucleótido en la posición 3673; en la que homocigosis AA, heterocigosis AG, y homocigosis GG en la posición 3673 indican que el paciente es sensible a warfarina, que es sensible de forma intermedia a warfarina y que es resistente a warfarina, respectivamente; y
- predecir un intervalo de dosificación de warfarina en base a la sensibilidad o resistencia a warfarina del paciente.
\vskip1.000000\baselineskip
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que la secuencia se investiga usando un oligonucleótido que hibrida
específicamente con el promotor del gen VKORC1.
3. El procedimiento de la reivindicación 2 en el
que el oligonucleótido hibrida específicamente con al menos 6
nucleótidos que abarcan la posición 3673 de la SEQ ID N.º: 1.
4. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que la secuencia se investiga usando DNA preparado a partir de la
sangre periférica del sujeto.
5. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que el sujeto es un asiático.
6. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que el sujeto es un caucásico.
7. El procedimiento de la reivindicación 1 en el
que el sujeto es un africano, afroamericano, o hispánico.
8. El procedimiento de la reivindicación 1 que
comprende adicionalmente examinar la secuencia del gen CYP2C9, y
predecir un intervalo de dosis de warfarina para el paciente en base
al nucleótido en la posición 3673 de la SEQ ID N.º: 1 y de la
secuencia del gen CYP2C9.
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