JP2008523844A5 - ワルファリンの投与範囲を予想する方法 - Google Patents
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Description
本研究において、我々はVKORC1のプロモータにおける多型がワルファリン感受性と関連があることを発見した。この多型は、ワルファリン用量要求性における個体間および民族間の差異の両方を説明することができる。さらにまた、この多型はプロモータ活性と関連がある。−1639位(開始コドンの第一ヌクレオチドに対して番号付けされた)にGを有するVKORC1プロモータは、同じ位置にAを有するプロモータより44%活性が高い。−1639位にAの多型を有する患者は、ワルファリンに対してより感受性である。−1639位のホモ接合のAA患者は最も低い用量要求性を有し、ヘテロ接合のAG患者は中間の用量要求性を有し、ホモ接合のGG患者は最も高い用量要求性を有した。したがって、どの程度のワルファリンが被験者に対して処方されるべきかを予想するために、被験者のVKORC1遺伝子のプロモータ配列または活性が使用されることができる。本方法はワルファリン用量の正確性を有意に改良する。これまでのところ、患者に初回投与量が与えられ、かれらのINRが定期的にモニタされ、患者に対して安全である維持量が獲得されることができるまで、それに応じてワルファリン投与量が調整されている。本発明を用いれば、予想投与量が維持量に極めて近づき、その結果ワルファリン投与量がより迅速に、より安全に、およびより経済的になるであろう。
具体的には、VKORC1遺伝子の−1639位の配列が解析されている。この位置のヌクレオチドがAである場合、被験者はワルファリンに対してより感受性である。したがって、VKORC1遺伝子の−1639位にホモ接合のAAを有する被験者は、この位置にAおよび他のヌクレオチド(G,CまたはT)を有するヘテロ接合を有する被験者より感受性が高い。同様に、同じヘテロ接合を有する被験者はこの位置にAを有さない被験者よりワルファリン感受性が高い。
−1639位のAまたは−1639位のG/C/Tアレルと等価の遺伝子マーカーに対するアッセイによって、配列が解析されることができ、等価の遺伝子マーカーの存在は対応するアレルの存在の指標である。例えば、等価の遺伝子マーカーは、VKORC1遺伝子のrs9934438、rs8050894、rs2359612およびrs7294からなる群より選択されたSNPであってもよく、その多型の各々はワルファリン感受性の指標である。
本発明の幾つかの実施形態において、VKORC1遺伝子のプロモータと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いることによって、配列が解析されている。オリゴヌクレオチドは、VKORC1遺伝子の−1639位の少なくとも6,8,10,12,14,16,18,20,22または24ヌクレオチド範囲と特異的にハイブリダイズすることが好ましい。被験者の抹消血から調製されたDNAを用いることによって配列が解析されてもよい。
さらに本発明の他の態様は、ワルファリンの投与範囲を決定するためのキットを提供し、本キットは、
(a)VKORC1遺伝子の−1639位の配列Aを検出するための手段と、
(b)VKORC1遺伝子の−1639位の配列Gを検出するための手段と
からなる群より選択された少なくとも一成分を含む。
(a)VKORC1遺伝子の−1639位の配列Aを検出するための手段と、
(b)VKORC1遺伝子の−1639位の配列Gを検出するための手段と
からなる群より選択された少なくとも一成分を含む。
さらに、キットはそれぞれVKORC1遺伝子の−1639位の配列CおよびTを検出するための手段を含むことができる。したがって、ある実施形態において、キットはこの位置における四つの可能性のある塩基の各々を検出するための手段を含んでもよい。他の実施形態において、この位置におけるAの存在がワルファリン感受性の最も良い指標となるので、キットはこの位置におけるAを検出するための手段、およびG,CまたはTを検出するための手段を含んでもよい。その手段はオリゴヌクレオチドであることが好ましい。キットは必要に応じてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、PCR増幅、および/または使用説明書を含んでもよい。
本発明の他の態様はVKORC1遺伝子プロモータ領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはその相補体を提供し、その領域はプロモータの−1639位まで及び、少なくとも六ヌクレオチドから構成される。オリゴヌクレオチドはVKORC1遺伝子の−1639位まで及ぶ少なくとも6,8,10,12,14,16,18,20または24ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが好ましい。オリゴヌクレオチドは−1639位のヌクレオチドがA,G,CまたはT,好ましくはAまたはGであるこの領域とハイブリダイズすることができる。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは約15ヌクレオチドまたはそれより少ないヌクレオチド、16乃至20ヌクレオチド、20乃至25ヌクレオチド、25乃至30ヌクレオチド、または30乃至40ヌクレオチドから構成されてもよい。また、本発明のオリゴヌクレオチドを構成するアレイが提供される。
我々は、VKORC1遺伝子のプロモータにおける多型がワルファリン感受性と関連があることを発見した。この多型はワルファリン用量要求性における個体間および民族間の差異の両方を説明することができる。さらに、この多型はプロモータ活性とも関連がある。−1639位(開始コドンの第一ヌクレオチドに対して番号付けされた)にGを有するVKORC1プロモータは、同じ位置にAを有するプロモータより44%活性が高い。−1639位にAの多型を有する患者は、ワルファリンに対してより感受性である。−1639位におけるホモ接合のAA患者は最も低い用量要求性を有し、ヘテロ接合のAG患者は中間の用量要求性を有し、ホモ接合のGG患者は最も高い用量要求性を有していた。したがって、被験者のVKORC1遺伝子のプロモータ配列または活性は、その被験者に対して処方されるべきワルファリン投与量を予想するために使用されることができる。さらなる発明の詳細な説明の前に、本出願において使用される用語は特に指示がなければ以下のように定義される。
他方で、我々は、VKORC1遺伝子における変異が、中国人集団における個体間および中国人と白人との間の民族間のワルファリン用量要求性を変化させることができることを見出した。−1639位のプロモータの多型AA遺伝子型を有する患者がより低い用量要求性を有するのに対して、AG/GG遺伝子型を有する患者はより高い用量要求性を有していた(実施例1および2)。さらに、ホモ接合AAが白人集団において稀有である一方で、この遺伝子型は多数の中国人集団を形成している(実施例3)。白人と中国人との間の遺伝子型頻度における差異、およびAAのワルファリン感受性との相関は、中国人集団が白人集団より低い用量を要求するといった臨床的に観察されてきたことに従っている。
具体的には、VKORC1遺伝子の−1639位の配列が解析された。任意の他の遺伝子型を調べる必要がなくワルファリン感受性を予想するために、このSNPのみが使用されることができる。したがって、この位置におけるホモ接合のAAはワルファリン感受性の指標であり、ヘテロ接合のAGは中間の感受性を示し、ホモ接合のGGを有する被験者は比較的抵抗性である。感受性の被験者、中間の感受性の被験者、または比較的抵抗性の被験者に投与されるべきワルファリンの実際の投与量は、ワルファリンの剤形および被験者の指示および症状に伴って変化し、ワルファリンを処方する医師によって決定されることができる。例えば、我々の研究によって(実施例1)、ワルファリン感受性またはワルファリン抵抗性を有する選択された患者集団において、最も低い用量要求性(一日当たり平均1.19mg、一日当たり0.71〜1.50mgの範囲)を有する患者はAA遺伝子型を有し、中間の用量要求性(一日当たり平均8.04mg、一日当たり6.07〜10mgの範囲)を有する患者はヘテロ接合AGを有し、最も高い用量要求性(一日当たり平均9.11mg、一日当たり8.57〜10mgの範囲)を有する患者はホモ接合GGの遺伝子型に関連していた。無作為に選択された患者において(実施例2)、AA遺伝子型はAGおよびGG(一日当たり3.81プラスマイナス1.24mg)より低い維持量(一日当たり2.61プラスマイナス1.10mg)に関連している。これらの範囲はワルファリン投与における出発点としての機能を果たすことができる。
VKORC1遺伝子のゲノム配列はGenbank登録番号AY587020(配列番号1;図3)として入手可能である。VKORC1アイソフォーム1のmRNAの配列は登録番号NM_024006.4.として入手可能である。これらの配列の両方において、転写開始位置は+1として指定されており、したがって本明細書中に記載されたワルファリン感受性のプロモータ多型の指標は1413位に位置されるだろう。しかしながら、配列変異の記載に対するヒトゲノム変異学会(Human Genome Variation Society(HGVS)による最近の推奨に従って(http://www.genomic.unimelb.edu.au/mdi/mutnomen/)、プロモータSNPはATG転写開始コドンのAに関して記載することを推奨されている。この命名法に基づいて、NM_024006.4またはAY587020のATG転写開始
コドン(Met)のAは、+1に位置付けられ、本明細書中に記載されたプロモータSNPは−1639位であり、この位置におけるG>A多型は「NM_024006.4:C.−1639G>A」として参照されるだろう。本開示の−1639位のG>A多型(すなわちより正確には「NM_024006.4:C.−1639G>A」)は、従来のプロモータ配列番号付けに従って1413位のG>A多型と同じであることが明らかにされるべきである。
コドン(Met)のAは、+1に位置付けられ、本明細書中に記載されたプロモータSNPは−1639位であり、この位置におけるG>A多型は「NM_024006.4:C.−1639G>A」として参照されるだろう。本開示の−1639位のG>A多型(すなわちより正確には「NM_024006.4:C.−1639G>A」)は、従来のプロモータ配列番号付けに従って1413位のG>A多型と同じであることが明らかにされるべきである。
特異的多型(例えば、−1639位のAA,AGまたはGG)に加えて、特異的SNPsの各々に結合される遺伝子マーカーは、同様に対応するワルファリン感受性を予想するために使用されることができる。これは対象のSNP近傍の遺伝子マーカーが対象のSNPと共分離する傾向にあるか、あるいは対象のSNPと連鎖不均衡を示すためである。その結果、これらのマーカー(同等の遺伝子マーカー)の存在は、対象のSNPの存在の指標であり、換言すると、ワルファリン感受性レベルの指標となる。
VKORC1の−1639位のA>Gプロモータ多型は、D‘Andreaらによって最近報告されたVKORC1の1173位のC>Tイントロン多型(27)と連鎖不均衡状態にあり、この結果によって、1173位のTT遺伝子型を有するイタリア人患者がCTまたはCC遺伝子型を有する患者より低い平均一日服用量を有していたことが説明されるかもしれない。また、我々の研究によって、3730位(すなわちrs7294)のG>A多型は、3’非翻訳領域に位置されるが、中国人集団における−1639位のA>Gおよび1173位のC>Tと連鎖不均衡状態にあることが示された。具体的には、3730位のGアレルは−1639位のAアレルおよび1173位のTアレルと関連がある。−1639位のSNPの他の等価の遺伝子マーカーは、rs9934438(イントロン1)、rs8050894(イントロン2)およびrs2359612(イントロン2)を含む。したがって、−1639位のAがrs9934438におけるT,rs8050894におけるC,rs2359612におけるTおよびrs7294におけるGと関連している一方で、−1639位のGは、rs9934438におけるC,rs8050894におけるG、rs2359612におけるCおよびrs7294におけるAと関連している。
等価の遺伝子マーカーは、マイクロサテライトマーカーおよび一ヌクレオチド多型(SNP)マーカーを含めて任意のマーカーであることが可能である。有用な遺伝子マーカーはVKORC1の−1639位から約200キロベースまたはそれより小さい距離であることが好ましい。遺伝子マーカーはVKORC1の−1639位から約100キロベース、80キロベース、60キロベース、40キロベース、20キロベース、15キロベース、10キロベース、または5キロベースあるいはそれより小さい距離であることがより好ましい。
本発明の一態様は、本発明のSNPsとハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、オリゴヌクレオチドはVKORC1遺伝子のプロモータ配列の検出のためのハイブリダイゼーションプローブまたはプライマとして有用であろう。オリゴヌクレオチドは、配列TGGCCGGGTGC(配列番号1の3668位から3678位)、またはその相補体から構成されることが好ましい。ハイブリダイゼーションの目的のために、−1639位に対応する配列がオリゴヌクレオチドの中心近傍であることが好ましい。−1639位に対応する配列の両側上に少なくとも4ヌクレオチドあることが好ましい。−1639位に対応する位置は両側上の少なくとも5,6,7,8または9ヌクレオチドによって側面を守られていることがより好ましい。
−1639位のプロモータSNPはE−BOX(E−BOXのコンセンサス配列はCANNTGである)内に位置され、短距離(200塩基対)以内にさらに三つのE−BOXが存在する。E−BOXが筋肉、神経細胞、肝臓および膵臓等の細胞/組織型特異的転写を媒介するための重要な要素であることが示されてきた(28,29)。−1639位において観察されたAからGへの第二塩基の置換はE−BOXコンセンサスを無効にしてプロモータ活性を変えるだろう。コンセンサス配列が無効にされる場合、HepG2細胞においてプロモータ活性が44%増加されることがプロモータアッセイによって、明確に例証された(図2)。理論によって限定したい訳ではなく、このことはE−BOXがHepG2におけるリプレッサ結合部位として機能することを示唆する。HepG2が肝臓癌由来であるため、−1639位のE−BOXは肝臓において転写を抑制しそうである。
−1639位にGG遺伝子型を有する人々がより高いワルファリン投与量を要求することは、以下のように説明されることができる。VKORC1遺伝子はビタミンKエポキシド還元酵素複合体のサブユニット1をコードし、ビタミンKの還元型を再生することに関与している。ビタミンKの還元型はガンマカルボキシラーゼによって要求され、ビタミンK依存性凝固因子(因子II,VII,IXおよびX)のガンマカルボキシル化が血液凝固にとって必須である。VKORC1プロモータ活性が増加される場合、VKORC1mRNAの増加レベルがより高いVKOR活性に通じることができ、その結果還元型ビタミンKの再生効率を増長する。それ故に、ビタミンK依存性凝固因子のガンマカルボキシル化は、より高レベルの還元型ビタミンKによって増長される。ワルファリンは凝固因子の合成を阻害することによって作用し、より活性的な凝固因子を有することによってその抗凝固効果のためにより多くのワルファリンが要求されるだろう。肝臓がビタミンK依存性凝固因子の合成のための主要な器官であり、VKORC1の発現が肝臓で最も高いために、肝臓におけるVKORC1のレベルの44%の変化は血液凝固過程に関して重要な影響を与える可能性がある。したがって、ワルファリンの用量要求性はVKORC1遺伝子多型およびそのプロモータ活性に関連がある。
VKORC1プロモータの−1639位におけるA以外の任意の配列が、E−BOXを破壊してプロモータ活性を増加させることを、我々は予想している。換言すれば、プロモータ活性における増加がワルファリンの用量要求性を増加させる。したがって、プロモータ配列、具体的に−1639位の配列は、ワルファリン投与量の指標となる。さらに、本発明の他の実施形態は、VKORC1遺伝子のプロモータ活性を検出することによって、ワルファリンの投与方法、あるいはワルファリン感受性の決定方法を提供する。同様に、VKORC1遺伝子の遺伝子産物(mRNAまたはタンパク質)あるいはVKOR活性のレベルもワルファリンの用量要求性を反映することができる。VKORC1プロモータ活性、mRNAレベル、タンパク質レベル、またはAA遺伝子型を有する被験者のVKOR活性より少なくとも10%,15%,20%,25%,30%,35%または40%高いVKOR活性が、AAの遺伝子型を有する被験者より高いワルファリンの用量要求性の指標となる。
さらに本発明の他の態様は、ワルファリンの投与範囲を決定するためのキットを提供し、本キットは、
(a)VKORC1遺伝子の−1639位における配列Aを検出するための手段と、
(b)VKORC1遺伝子の−1639位における配列Gを検出するための手段と
からなる群より選択された少なくとも一成分を含む。
(a)VKORC1遺伝子の−1639位における配列Aを検出するための手段と、
(b)VKORC1遺伝子の−1639位における配列Gを検出するための手段と
からなる群より選択された少なくとも一成分を含む。
さらに、そのキットは、それぞれVKORC1遺伝子の−1639位における配列CおよびTを検出するための手段を含むことができる。したがって、ある実施形態において、そのキットはこの位置における四つの可能性のある塩基の各々を検出するための手段を含んでもよい。他の実施形態において、この位置におけるAの存在がワルファリン感受性の最も良い指標であるため、キットはこの位置におけるAを検出するための手段、およびG,CまたはTを検出するための手段を含んでもよい。その手段はオリゴヌクレオチドであることが好ましい。キットは必要に応じてオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、PCR増幅法のための試薬、および/または使用説明書を含んでいてもよい。
本発明の他の態様は、VKORC1遺伝子のプロモータ領域とハイブリダイズするオリゴヌクレオチド、またはその相補体を提供し、その領域はプロモータの−1639位まで及び、少なくとも6ヌクレオチドから構成される。オリゴヌクレオチドはVKORC1遺伝子の−1639位まで及ぶ少なくとも6,8,10,12,14,16,18,20,22,または24ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズすることが好ましい。オリゴヌクレオチドは、−1639位におけるヌクレオチドがA,G,CまたはT、好ましくはAまたはGであるこの領域とハイブリダイズすることができる。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドは約15ヌクレオチドまたはそれより小さいヌクレオチド、16〜20ヌクレオチド、20〜25ヌクレオチド、25〜30ヌクレオチド、または30〜40ヌクレオチドから構成されてもよい。また、本発明のオリゴヌクレオチドを構成するアレイも提供される。
ルシフェラーゼレポータ分析
プラスミドの構築
VKORC1プロモータ活性に対して分析するために、順方向プライマ:5’−ccgctcgagtagatgtgagaaacagcatctgg(配列番号4;XhoIの制限酵素部位を含む)および逆方向プライマ:5‘−cccaagcttaaaccagccacggagcag(配列番号5;HindIIの制限酵素部位を含む)を用いて、−1639位のAAおよび−1639位のGG遺伝子型を有する患者から得た−1639位の多型(1798位から35位)を網羅するVKORC1プロモータを、pGEM−T Easy ベクター(アメリカ、ウィスコンシン州、マディソン、Promega社)中にまずクローニングした。XhoIおよびHindIII制限酵素部位を用いてベクターを切断することによって、VKORC1プロモータを含む断片をpGEM−T EASY ベクターから切り離し、pGL3−標準ベクター(Promega社)の多重クローニング部位(XhoIおよびHindIII)中にサブクローニングした。pGL−3ベクターは、蛍ルシフェラーゼに対してコードされたcDNAを含み、プロモータとともに融合された場合、哺乳類細胞中へのトランフェクション上に挿入されたプロモータ活性を解析するために使用されることができる。−1639位のG/G遺伝子型を含むベクターをpGL3−Gに設定し、−1639位のA/A遺伝子型を含むベクターをpGL3−Aに設定した。両ベクター中のVKORC1プロモータ配列を直接配列決定解析によって確認した。
プラスミドの構築
VKORC1プロモータ活性に対して分析するために、順方向プライマ:5’−ccgctcgagtagatgtgagaaacagcatctgg(配列番号4;XhoIの制限酵素部位を含む)および逆方向プライマ:5‘−cccaagcttaaaccagccacggagcag(配列番号5;HindIIの制限酵素部位を含む)を用いて、−1639位のAAおよび−1639位のGG遺伝子型を有する患者から得た−1639位の多型(1798位から35位)を網羅するVKORC1プロモータを、pGEM−T Easy ベクター(アメリカ、ウィスコンシン州、マディソン、Promega社)中にまずクローニングした。XhoIおよびHindIII制限酵素部位を用いてベクターを切断することによって、VKORC1プロモータを含む断片をpGEM−T EASY ベクターから切り離し、pGL3−標準ベクター(Promega社)の多重クローニング部位(XhoIおよびHindIII)中にサブクローニングした。pGL−3ベクターは、蛍ルシフェラーゼに対してコードされたcDNAを含み、プロモータとともに融合された場合、哺乳類細胞中へのトランフェクション上に挿入されたプロモータ活性を解析するために使用されることができる。−1639位のG/G遺伝子型を含むベクターをpGL3−Gに設定し、−1639位のA/A遺伝子型を含むベクターをpGL3−Aに設定した。両ベクター中のVKORC1プロモータ配列を直接配列決定解析によって確認した。
−1639位のG>Aに加えて、イントロン1の多型である1173位のC>Tは、D‘Andreaらによって記載されてきたが、我々の患者においても同定された。これら二つの多型は強力な連鎖不均衡(LD)の関係にあるように思われる(表1)。−1639位のAA遺伝子型を有するワルファリン感受性患者が一患者(被験者6)を除いて1173位のホモ接合のTTと相関することが見出された。ワルファリン抵抗性患者において、−1639位のヘテロ接合のAGを有する患者は1173位のヘテロ接合のCTと相関することが見出され、ホモ接合の−1639位のGGは1173位のホモ接合のTTと相関があることが見出された(表1)。
実施例2
ワルファリンを受けている無作為中国人患者におけるVKORC1の−1639位のG>A多型
−1639位のG>A多型がワルファリン用量における個体間の差異と相関があるかどうかさらに解析するために、我々は用量に関係なくワルファリンを受けている104人の患者に、MALDI−TOF質量分析法を用いて遺伝子解析を行った。AAおよびAG/GG集団は年齢、性別、およびINRに関して差異がなかった(表2)。二患者においてのみGGに対してホモ接合であることが見出され、彼らは統計解析のためにAGを有する患者と一緒に集団化された。我々は食事または他の投薬等の他の混乱させる変数の有無に関係なくデータを解析した。表2に示されるように、AA集団は、AG/GG集団(一日当たり3.81mg)より有意に低い用量要求性(一日当たり2.61mg)を有していた。T検定(p<0.0001)またはWilcoxon Mann Whitney検定(p=0.0002)によって、AA集団とAG/GG集団との間の差異は優位なものとなった。
ワルファリンを受けている無作為中国人患者におけるVKORC1の−1639位のG>A多型
−1639位のG>A多型がワルファリン用量における個体間の差異と相関があるかどうかさらに解析するために、我々は用量に関係なくワルファリンを受けている104人の患者に、MALDI−TOF質量分析法を用いて遺伝子解析を行った。AAおよびAG/GG集団は年齢、性別、およびINRに関して差異がなかった(表2)。二患者においてのみGGに対してホモ接合であることが見出され、彼らは統計解析のためにAGを有する患者と一緒に集団化された。我々は食事または他の投薬等の他の混乱させる変数の有無に関係なくデータを解析した。表2に示されるように、AA集団は、AG/GG集団(一日当たり3.81mg)より有意に低い用量要求性(一日当たり2.61mg)を有していた。T検定(p<0.0001)またはWilcoxon Mann Whitney検定(p=0.0002)によって、AA集団とAG/GG集団との間の差異は優位なものとなった。
中国人および白人におけるVKORC1の−1639位のG>A多型およびCYP2C9変異の遺伝子型頻度
中国人集団は白人集団より極めて低いワルファリン維持量を要求することが知られていた。VKORC1の−1639位の遺伝子型における差異がワルファリン用量における民族間の差異を説明することが可能かどうか調べるために、95人の正常漢民族被験者および92人の正常白人被験者が遺伝子解析された。白人集団において、ホモ接合のAAは最も低い頻度を有したのに対して、AGおよびGG遺伝子型が多数の集団を構成した(表3、それぞれ14.2%、46.7%および39.1%)。逆に、中国人集団において、ホモ接合のAAが多数派集団を構成し(82.1%)、集団の残りは、ヘテロ接合のAG(17.9%)であった。無作為に選択されたこの集団においては、ホモ接合のGGは検出されなかった。また、この割合は79.8%がホモ接合のAAであり、18.3%がヘテロ接合のAGであり、残りの1.8%がホモ接合のGGであることが見出された104人のワルファリン患者における割合と同じであった。白人集団と二つの中国人集団との間の遺伝子型頻度における差異は、0.0001未満のp値を有して優位であった。二つの民族集団(白人および中国人)の間のこれらの差異、およびAAのワルファリン感受性との相関は、中国人集団が白人集団より低い用量を要求するという臨床的所見に従う。
また、CYP2C9の変異が中国人集団において遺伝子解析された。CYP2C9*1/*3の頻度は、中国人の正常集団において7.3%であり、ワルファリンを受けている無作為に選択された中国人患者において5.4%であった、CYP2C9*2の変異は中国人患者および対照において検出されなかった。白人におけるCYP2C9変異の頻度に関する刊行物のデータに比べて、白人集団は中国人よりはるかに高いCYP2C9変異の頻度を有し(30%未満対7%未満)、さらに白人がワルファリンに対してより抵抗性であった。ワルファリン感受性患者において検出された他のミスセンス変異である895位のA>G(T299A)および1145位のC>T(P382L)(表1)は無作為に選択された患者および対照のいずれにおいても見出されず、このことはこれらの変異が稀な変異であることを示唆している。
実施例4
VKORC1プロモータ活性
AA遺伝子型の患者とGG遺伝子型の患者との間のワルファリン感受性における差異は、VKORC1プロモータ活性における変化によって説明されることができよう。−1639位のプロモータSNPがE−BOX(CANNTG)の第二ヌクレオチドにおいて位置され、その結果、この多型はE−BOXコンセンサス配列を変化させ、VKORC1プロモータ活性における変化に通じるであろう。この仮説を調べるために、−1639位を網羅するVKORC1プロモータを、−1639位のAA遺伝子型またはGG遺伝子型を有する患者からPCR増幅し、pGL−3ベクター中にクローニングした。VKORC1が肝臓において最も高いレベルで発現されるので、HepG2細胞(ヒト肝臓癌細胞株)をプロモータ解析のために選択した。合計九回の実験を行い、全ての実験が(図2に示されるように)一貫した結果を示した。VKORC1プロモータの−1639位のGは、プロモータの−1639位のAと比べてより高いルシフェラーゼ活性(約44%高い)を示した。pGL−3 標準 ベクターは多重クローニング部位内に挿入されたプロモータを全く有さず、ごく少量のルシフェラーゼ活性を有していた。したがって、−1639位の配列はプロモータ活性にとって重要であり、より高いプロモータ活性(例えば、−1639位のG)がより高いワルファリン用量要求性と相関する。
VKORC1プロモータ活性
AA遺伝子型の患者とGG遺伝子型の患者との間のワルファリン感受性における差異は、VKORC1プロモータ活性における変化によって説明されることができよう。−1639位のプロモータSNPがE−BOX(CANNTG)の第二ヌクレオチドにおいて位置され、その結果、この多型はE−BOXコンセンサス配列を変化させ、VKORC1プロモータ活性における変化に通じるであろう。この仮説を調べるために、−1639位を網羅するVKORC1プロモータを、−1639位のAA遺伝子型またはGG遺伝子型を有する患者からPCR増幅し、pGL−3ベクター中にクローニングした。VKORC1が肝臓において最も高いレベルで発現されるので、HepG2細胞(ヒト肝臓癌細胞株)をプロモータ解析のために選択した。合計九回の実験を行い、全ての実験が(図2に示されるように)一貫した結果を示した。VKORC1プロモータの−1639位のGは、プロモータの−1639位のAと比べてより高いルシフェラーゼ活性(約44%高い)を示した。pGL−3 標準 ベクターは多重クローニング部位内に挿入されたプロモータを全く有さず、ごく少量のルシフェラーゼ活性を有していた。したがって、−1639位の配列はプロモータ活性にとって重要であり、より高いプロモータ活性(例えば、−1639位のG)がより高いワルファリン用量要求性と相関する。
実施例5
ワルファリン用量におけるVKORC1の−1639位のSNPとCYP2C9との組合せ
ワルファリン感受性を予想するためにVKORC1の−1639位のSNP単独で使用されることが可能であるが、このSNPは必要に応じて他の遺伝子マーカーと組み合わせられことが可能である。例えば、VKORC1遺伝子およびCYP2C9遺伝子の両方の配列がワルファリン用量において解析されることが可能である。以下の表にこれら二つの遺伝子がともに考慮される場合に各ハプロタイプに対するクマディンの推奨用量を示す。
ワルファリン用量におけるVKORC1の−1639位のSNPとCYP2C9との組合せ
ワルファリン感受性を予想するためにVKORC1の−1639位のSNP単独で使用されることが可能であるが、このSNPは必要に応じて他の遺伝子マーカーと組み合わせられことが可能である。例えば、VKORC1遺伝子およびCYP2C9遺伝子の両方の配列がワルファリン用量において解析されることが可能である。以下の表にこれら二つの遺伝子がともに考慮される場合に各ハプロタイプに対するクマディンの推奨用量を示す。
Claims (7)
- ヒト患者に対するワルファリンの投与範囲を予想する方法において、
前記患者のVKORC1遺伝子の−1639位のヌクレオチドを解析する工程であって、前記ヌクレオチドは前記VKORC1遺伝子のプロモータと特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを用いることによって解析される工程と、
前記−1639位のヌクレオチドに基づいて前記患者がワルファリン感受性か、またはワルファリン抵抗性かを決定する工程であって、前記−1639位におけるホモ接合のAA、ヘテロ接合のAG、およびホモ接合のGGは、それぞれ前記患者がワルファリン感受性、中間の感受性、およびワルファリン抵抗性であることを示す工程と、
前記患者のワルファリン感受性またはワルファリン抵抗性に基づいてワルファリンの投与範囲を予想する工程と
からなる方法。 - 前記オリゴヌクレオチドは前記VKORC1遺伝子の前記−1639位まで及ぶ少なくとも6ヌクレオチドと特異的にハイブリダイズする請求項1に記載の方法。
- 前記ヌクレオチドは前記患者の抹消血から調製されたDNAを用いることによって解析される請求項1または請求項2に記載の方法。
- 前記患者はアジア人である請求項1乃至請求項3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者は白人である請求項1乃至請求項3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記患者はアフリカ人、アフリカ系アメリカ人、またはヒスパニックである請求項1乃至請求項3のいずれか一項に記載の方法。
- CYP2C9遺伝子の配列を解析する工程と、前記VKORC1遺伝子の−1639位のヌクレオチドおよび前記CYP2C9遺伝子の配列に基づいてワルファリンの投与範囲を予想する工程とをさらに含む請求項1乃至請求項6のいずれか一項に記載の方法。
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