NO332174B1 - Nukleinsyre som koder for humant parkin, polypeptid, antistoff, sammensetning, probe, fremgangsmate, vektor, celle, ikke-humant pattedyr samt anvendelse - Google Patents

Abstract

Nukleinsyrer som koder for muterte eller avskårene former av det humane parkin gen eller former som omfatter multiplikasjoner av exoner, og de tilsvarende proteiner og antistoffer. Det beskrives videre metoder og sett for å identifisere mutasjoner av parkin genet og for å studere forbindelsene for terapeutiske formål.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en nukleinsyre som koder for en mutert form av humant parkin, nukleotidprobe som hybridiserer spesifikt til nevnte nukleinsyre samt vektor som omfatter nevnte nukleinsyre. Videre vedrører oppfinnelsen polypeptid som kodes for av den nevnte nukleinsyre samt antistoff som spesifikt binder nevnte polypeptid. Sammensetning som omfatter nevnte polypeptid eller antistoffer og en del av foreliggende oppfinnelse. Videre vedrører oppfinnelsen også fremgangsmåte for å identifisere en genetisk alterasjon i parkin genet samt fremgangsmåte for å diagnostisere mottakelighet for Parkinsonian syndrom. Celle, ikke-humant pattedyr samt anvendelser derav er og en del av foreliggende oppfinnelse.

Parkinson's sykdom er en hyppig, neurodegenerativ affeksjon hvis prevalens er nær 2% efter en alder på 65 år [de Rijk et al., 1997]. Hovedtegnene på sykdommen er stivhet, bradykinesi, skjelving under hvile og god reaktivitet, i det minste til å begynne med, ovenfor levodopa. Problemene skyldes et massivt tap av dopaminergiske neuroner i nigra substansia. Årsakene for sykdommen er fremdeles ukjente men intervensjonen av faktorer av genetiske suseptibilitet er sterkt mistenkt [Wood, 1997]. Tallrike familiære former med en dominant transmisjon er rapportert. Mutasjoner av gener som koder for synuklein alfa, lokalisert ved 4q21-q23, er beskrevet hos et lite antall familier med en tidlig utvikling og hurtig aggravering [Polymeropoulos et al., 1997; Kriiger et al., 1998]. En andre locus befinner seg ved 2pl3 [Gasser et al., 1998]. Et parkinson syndrom med ressesiv autosomiske transmisjoner (AR-JP) er beskrevet i Japan [Yamamura et al., 1973; Ishikawa og Tsuji, 1996]. Den manifesterer seg med hovedsignalene for parkinsons sykdom med visse særegenheter: i) tidlig begynnelse, som regel før 40 år; ii) nærvær av en dystoni, hyppig i forbindelse med de inferiøre lemmer; iii) fluktueringer i løpet av dagen; og iv) langsom progressiv utvikling men hele tiden forbundet med dyskinesier under levodopa. Den neuropatologiske undersøkelse viser et massivt tap av neuroner i nigra substansia pars kompakta men uten Lewy legeme, et histopatologisk stigmat for idiopatisk parkinsons sykdom [Yamamura et al., 1973; Takahashi et al., 1994]. En genetisk forbindelse mellom sykdommen i de japanske familier og markørene ved 6q25.2-27 er påvist som definert ved locus PARK2 [Matsumine et al., 1997]. To team har derefter beskrevet PARK2 familiene utenfor Japan, særlig i USA, Europa og den midtre orient [Jones et al., 1998; Tassin et al., 1998]. I den senere tid har Kitada et al [Kitada et al., 1998] påvist delesjoner av exoner (3-7) eller exon 4 av et nytt gen kalt parkin, i 4 japanske familier.

Foreliggende søknad beskriver påvisningen og karakteriseringen, i 77 familier og 102 isolerte, prinsipalt Europeiske tilfeller med et parkinson syndrom med tidlig utbrudd, av nærværet av nye genetiske endringer som affekterer parkin genet. Videre viser foreliggende oppfinnelse at disse genetiske endringer er tilstede ikke bare i parkinsonske syndromer med tidlig utbrudd men også i de senere eller atypiske parkinsonske syndromer. Disse nye endringer gir nu nye verktøy for samtidig både diagnose og behandling av parkinsons sykdom.

Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en nukleinsyre som koder for humant parkin, kjennetegnet ved at den omfatter delesjon av en adenosin (A) i posisjon 202 og en guanin (G) i posisjon 203.

I en utførelsesform ifølge det første aspekt ved ofreliggende oppfinnelse forårsaker delesjonen en Gln34Arg endring og en leserammeforskyvning med et stop kodon i posisjon 37.

Uttrykket nukleinsyre slik det her benyttes angir desoksyriboukleinsyrer (DNA) og ribonukleinsyrer (RNA). Blant slike DNA kan det videre dreie seg om genomisk DNA eller gDNA, eller også komplementær DNA eller cDNA. Nukleinsyrene i følge oppfinnelsen kan være naturlige eller syntetiske. De kan generelt fremstilles ved klassiske teknikker innen molekylær biologien inkludert avsøking av banker, kunstig syntese, ligering, restriksjon og så videre. Posisjonene som er gitt i foreliggende søknad er beregnet i forhold til sekvensene til human parkin som vist i figur 1 (SEQ ID No:l). Denne sekvens viser cDNA sekvensen som koder for human parkin. I forhold til sekvensen som er beskrevet av Kitada et al., omfatter den en modifikasjon i nukleotid 768 (C->T).

Foreliggende oppfinnelse angår også enhver vektor som omfatter en nukleinsyre som beskrevet ovenfor. Det kan dreie seg om en plasmidisk vektor, et kosmid, en viral vektor, et episom, et kunstig kromosom og så videre. Helt spesielt omfatter en slik vektor også et promoter område som tillater ekspresjon av nukleinsyren.

Slike vektorer kan benyttes for å fremstille betydelige mengder nukleinsyrer i følge oppfinnelsen eller for å fremstille de tilsvarende polypeptider, i en egnet cellulær vert (for eksempel prokaryotisk, eukaryotisk, animalsk eller vegetabilsk celle). Foretrukne cellulære verter er særlig bakterieceller (for eksempel E.coli) eller gjærceller, eller også mammifære celler av animalsk eller human opprinnelse.

I denne forbindelse angår oppfinnelsen også enhver rekombinant celle omfattende en nukleinsyre eller en vektor som beskrevet ovenfor.

Oppfinnelsen angår også enhver mammifær celle, særlig human celle, omfattende en nukleinsyre eller en vektor som beskrevet ovenfor, i erstatning for villgenet av parkin.

Cellene i følge oppfinnelsen kan benyttes særlig for studium av parkins egenskaper samt som modeller for forskning på forbindelser som kan være i stand til å kompensere de genetiske endringer av genet av parkin.

Foreliggende oppfinnelse angår videre ethvert ikke-humant pattedyr omfattende en nukleinsyre som beskrevet ovenfor i sine celler. Fortrinnsvis oppnås disse pattedyr ved "knock-in" av de ovenfor identifiserte endringer, ved homolog rekombinasjon, eller også ved "knock-out" av villgenet, erstattet med den endrede versjon i følge oppfinnelsen.

Slike pattedyr (gnagere, hunder, kaniner og så videre) er særlig anvendelige for studium av egenskapene hos parkin og identifisering av forbindelser med henblikk på for eksempel terapi.

Foreliggende oppfinnelse angår videre ethvert polypeptid som kodes av en nukleinsyre som beskrevet ovenfor. Slike polypeptider eller de tilsvarende nukleinsyrer, er brukbare for å identifisere og/eller studere forbindelser som kan være i stand til å restaurere en normal fenotype i cellene som uttrykker dem. Særlig kan nukleinsyrene som beskrevet ovenfor overføres i egnede vertsceller, fortrinnsvis eukaryotiske celler (pattedyr, for eksempel gjør), for å benyttes i en screening test på forbindelser som er i stand til å motvirke deres aktivitet når det dreier seg om kjemiske, biokjemiske eller genetiske forbindelser. Slike polypeptider kan likeledes benyttes som antigener, for fremstilling av spesifikke antistoffer for detektering av varianter. Slike antistoffer kan være polyklonale eller monoklonale (fremstilt for eksempel ved fusjon av celler fra milten av dyr som er immunisert med antigenene, med myelom celler og derefter seleksjon av kloner som produserer monoklonale antistoffer).

I denne forbindelse angår oppfinnelsen likeledes ethvert antistoff som er spesifikt for et polypeptid som beskrevet ovenfor eller et område som er spesifikt for et slikt polypeptid. Uttrykket "spesifikt antistoff' angir et antistoff med en affinitet som er spesielt overlegen for det gitte antigen i forhold til ethvert annet antigen.

Oppfinnelsen angår likeledes ethvert preparat omfattende et polypeptid eller et antistoff eller også en vektor eller en vertscelle som er transformert med en nukleinsyre i følge oppfinnelsen, som beskrevet ovenfor. Disse preparater kan være kondisjonert i forskjellige typer medier (saltoppløsninger, isotoniske oppløsninger og så videre) i nærvær av for eksempel stabilisatorer eller konserveringsmidler. Preparatene kan være oppbevart kalde eller dypfryste i en hvilken som helst egnet innretning (rør, flaske, flakong, ampulle etc).

En av anvendelsene av oppfinnelsen ligger i detektering av nærværet av mutasjoner i genet av parkin, og deres korrelering med tendensen til for eksempel parkinsons sykdom. I denne forbindelse angår oppfinnelsen likeledes forskjellige verktøy (prober, prober, antistoffer og så videre), som benyttes ved slike detekteringsmetoder.

Særlig angår oppfinnelsen enhver probe eller oligonukleotid som hybriderer spesifikt med en nukleinsyre som beskrevet ovenfor.

Probene eller nukleotidene som er spesifikke for oppfinnelsen omfatter generelt mindre enn 500 basepar, fortrinnsvis mindre enn 300 basepar. Karakteristisk omfatter et oligonukleotid som er spesifikt for oppfinnelsen 5 til 100 basepar og helst 5 til 50 basepar. Lengden av oligonukleotidet kan selvfølgelig justeres av fagmannen. Probene eller oligonukleotidene i følge oppfinnelsen er videre generelt merket for å tillate deres detektering. Forskjellige typer merking som velkjent av fagmannen kan benyttes (radioaktiv, fluorescent, enzymatisk, kjemisk, terminal- eller internmerking og så videre). Til slutt har probene eller oligonukleotidene i følge oppfinnelsen evnen til å hybridere spesifikt med nukleinsyrer som beskrevet ovenfor, det vil si med de forskjellige endrede former av genet av parkin. Hybrideringen kalles spesifikk når proben eller oligonukleotidet hybriderer under betingelser for høy stringens, med nukleinsyren som bærer den tilsiktede endring, og ikke eller kun lite med den samme nukleinsyre som ikke bærer endringen. Hybrideringen kalles således spesifikk når differansene mellom spesifikt signal og bakgrunnsstøy er tilstrekkelig stor til å kunne detekteres.

Probene eller oligonukleotidene i følge oppfinnelsen er således generelt komplementære til minst et området av genet av parkin som bærer de genetiske endringer a) til d) som beskrevet ovenfor. Komplementæriteten er generelt perfekt for å sikre en best mulig hybrideringsselektivitet. Disse prober eller oligonukleotider kan syntetiseres ved en hvilken som helst teknikk som er kjent for fagmannen, for eksempel ved spalting ut fra nukleinsyrer som er beskrevet ovenfor eller ved kunstig syntese, eller en kombinasjon av disse teknikker. Disse prober eller oligonukleotider kan benyttes for identifisering, på biologiske prøver, av nærværet av genetiske endringer i genet av parkin.

Oppfinnelsen angår også et probepar ("amorce") for å forsterke hele eller en del av en nukleinsyre som beskrevet ovenfor og som karakteriseres ved at det omfatter: - en første probe komplementær til et område av genet av parkin som befinner seg ved 5' av en genetisk endring, og - en andre probe komplementær til et området av genet av parkin som befinner seg ved 3' av den genetiske endring.

Probene i følge oppfinnelsen er generelt komplementære til et område av genet av parkin og omfatter fortrinnsvis mindre enn 30 basepar.

Oppfinnelsen angår likeledes en fremgangsmåte for identifisering av en genetisk endring i genet av parkin og særlig detekteringen av en eller flere delesjoner og/eller multiplikasjoner (for eksempel duplikasjon, triplikasjon) av exoner i homozygotisk eller heterozygotisk tilstand.

Denne fremgangsmåte i følge oppfinnelsen omfatter:

i) å tilveiebringe en prøve omfattende genet av parkin,

ii) amplifisering (semi-kvantitativ) av minst en del av genet i det delen

omfatter en genetisk endring som beskrevet ovenfor, og

iii) påvisning av nærværet av den genetiske endring.

Fortrinnsvis er, i denne fremgangsmåte i følge oppfinnelsen, prøven en blod-, vev-, plasma- eller cellekultur prøve fra et individ og særlig et pattedyr og helst et menneske. I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen er prøven forbehandlet for å gjøre genet av parkin, eller en del av dette, tilgjengelig for amplifisering. Denne forbehandling kan omfatte lysering av cellene, en enzymatisk behandling, en denaturering og så videre. Fortrinnsvis gjennomføres amplifiseringen ved hjelp av et probepar som beskrevet ovenfor eller beskrevet av Kitada et al. hvortil det henvises når det gjelder detaljer.

Påvisningen av en genetisk endring som beskrevet ovenfor kan gjennomføres ved forskjellige teknikker og særlig ved sekvensering, PCR/restriksjon, ASO, PAGE, ved PCR/multipleks semi-kvantitativ som beskrevet detaljert i forsøksdelen. Kort sagt er denne metode basert på amplifisering ved semi-kvantitativ PCR og i eksponensiell fase av matrise DNA. I henhold til denne metode er sammenligningen med den relative grad av matrise DNA tilstrekkelig for å påvise et tap av DNA mengden (delesjon av et eller flere exoner) eller tvert imot en økning av DNA mengden (multiplikasjon av et eller flere exoner).

Oppfinnelsen angår videre et kit for gjennomføring av fremgangsmåtene i følge oppfinnelsen omfattende en probe eller et oligonukleotid eller et probepar som nettopp beskrevet. Oppfinnelsens kit omfatter fortrinnsvis de egnede reaktanter for en amplifisering- og/eller hybrideringsreaksjon og, eventuelt, en bærer for slike reaksjoner (filtere, membraner, chips og så videre).

Foreliggende oppfinnelse er særlig tilpasset diagnose av en tilbøyelighet til parkinsons sykdom, ved forskning på en genetisk endring som beskrevet ovenfor i parkin genet.

Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelsen av de verktøy som er beskrevet

ovenfor (nukleinsyrer, prober, polypeptider, antistoffer, celler, dyr) for identifisering av forbindelser som er i stand til å motvirke, i det minste delvis, virkningene av en genetisk endring av parkin genet, særlig for et terapeutisk formål. Således kan slike forbindelser benyttes for påvisning ved kontakt med en testblanding (eller et testprodukt) i nærvær av en celle eller et dyr som beskrevet tidligere og detektering av en fenotypisk eller genotypisk effekt.

Fremgangsmåten i følge oppfinnelsen tillater særlig identifisering av forbindelser som kan benyttes, alene eller i kombinasjon med andre produkter eller behandlinger for behandling (det vil si reduksjon) av parkinsons sykdom.

Andre fordeler og anvendelser av oppfinnelsen vil fremgå ved et studium av eksemplene som følger i det disse kun skal illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPLER

A - figurforklaring

Figur 1: Sekvens av det cDNA som koder for human parkin. Forbindelsene mellom exonene er antydet. Initiatorkodonet (atg) og stoppkodonet (tag) er i fet skrift. Endringen OT i posisjon 768 er i fet skrift og understreket. Figur 2: Familier som oppviser punktmutasjoner i parkin genet. Den fullstendige kosegregering av mutasjonene med sykdommer er vist. De sorte kvadrater (menn) og sirkler (kvinner) viser påvirkede individer med alderen for opptreden (i år) indikert under pasientens symbol. Gjennomstrekede symboler antyder avdøde pasienter. Antallet ikke-analyserte, ikke-påvirkede brødre og søstre er vist i ruter. For hver mutasjon (endring av aminosyre) er genotypen av familiemedlemmet antydet (+/+ vill homozygot, +/- heterozygot for mutasjonen; -/- homozygot for mutasjonen). Under hver genotype er detekteringsresultatene vist. PAGE: elektroforgrammer med allelens størrelse i pb; ASO: autoradiogrammer av muterte og vill alleler; PCR/restriksjon: PCR produkter efter digestering med egnede restriksjonsenzymer. Lengden av fragmentene er gitt i bp. Mut: mutert; nd: alderen for opptredenen ikke bestemt fordi pasienten ikke var seg symptomene bevisst. Figur 3: Presentasjon og lokalisering av punktmutasjon av parkin genet. Sekvensen som koder for genet er vist med sine 12 exoner (inndelt). Exonene er nummerert 1 til 12. 8 kausale punktmutasjoner er posisjonert i henhold til sin virkning på proteinet (tronkering mot gal retning). Det ubikitin-lignende området og ring-delen ("Ring Finger") er skravert. For mutasjonene Thr415Asn og Trp453Stop, er polyfosforyleringssetene (P) og myristoyleirngssetene (M) antydet. UTR; ikke traduktert område. Figur 4: Resultater av påvisningen av delesjonen av heterozygot exoner i en familie som viser parkinsons syndrom med tidlig begynnelse og (FPD-GRE-WAG-155) i henhold til oppfinnelsens semi-kvantitative PCR/multipleks metode. Sorte kvadrater (menn) og sirkler (kvinner) representerer de affekterte individer.

Toppene viser exoner produsert ved semi-kvantitativ PCR/multipleks. De innrammede tall antyder høyden av toppene. Den inndelte lineal over elektroforogrammene antyder størrelsen av baseparene av PCR produktene.

Tabell 1: Oligonukleotider som benyttes for ASO teknikken. Endringen av nukleotid i sekvensen av oligonukleotidene er representert i fet skrift og understreket. WT = vill type; V = variant.

Tabell 2: Rekapitulativ for mutasjonene som er påvist. Posisjonene for nukleotidene er gitt i henhold til cDNA sekvensene som er publisert i den Japanske DNA databank (DDBJ; aksessnummer AB009973) og er vist i figur 1. PAGE = elektroforese på polyakrylamid gel; ASO = deteksjonsteknikk for mutasjoner som anvender et oligonukleotid som er spesifikt for en allel.

Tabell 3: Kliniske karakteristika for pasienter som funksjon av den genetiske endringstype. Pasientene fra familien IT-020 som er kompositt heterozygoter for en gal-retnings mutasjon og en avskjæringsmutasjon figurerer ikke i tabellen, a: p<0,05 for sammenligningen mellom pasientene med en homozygot delesjon og pasientene med avskj æringsmutasj oner.

Tabell 4: Frekvens og konsekvenser av delesjoner/multiplikasjoner av exoner

del = delesjon, het = heterozygot; hom = homozygot

Tabell 5: Forhold mellom resultatene oppnådd i figur 4. Høyden av toppene er gitt for hver exon i den venstre del av tabellen, verdiene for dobbelt-toppene er addert. Den høyre del av tabellen viser beregningen av forholdet mellom topp-verdiene. Italique = normalverdi; souligné = patologisk verdi sammenlignet med kontrollen. I den andre linje av tabellen er for hvert tilfelle forholdet mellom sammenligningen dividert med tilfellets forhold. De patologiske verdier er enten <0,625 eller >1,6 (=1/0,625). Delesjonene av exonene er detektert for individene FR 155 5 (exon 3), FR 155 6 (exon 2), FR 155 8 og FR 155 9 (exonene 2 + 3). For disse to siste individer som ble prøvet er verdien for exon forholdet 3/2 normalt gitt at de to exoner er deletert på heterozygotisk måte.

B - Materiell og metoder

1. Familier og pasienter

I en første serie forsøk ble 38 familier seleksjonert i henhold til de følgende kriterier: levodopa reaktivt parkinsons syndrom, ii) alder ved begynnelsen mer enn 45 år for minst en av de angjeldende medlemmer, og iii) transmisjon som er kompatibel med en recessiv autosomisk hereditet.

I en første serie forsøk velges 77 familier i henhold til de følgende kriterier (som antydet hos Liicking et al, 1998; Abbas et al, 1999): i) nærværet av et parkinsons syndrom med en god respons mot levodopa (>30% forbedring) hos minst to medlemmer av en familiegruppe (eller en enkelt hvis det er en nosjon for blodsfellesskap); ii) fravær av eksklusjonskriterier som Babinski tegn, oftalmoflegi, demens eller dysautonomi som opptrer før to års utvikling; iii) debut < 45 år hos minst en av de angjeldende; iv) hereditet sammenlignbar med en recessiv autosomisk transmisjon (flere pasienter i en enkelt generasjon med eller uten konsanguinitetsnosjon). Familienes opprinnelse er Frankrike (n=20), Italia (n=19), Storbritannia (n=14), Nederland (n=9), Tyskland (n=9), Libanon (n=2), Algeri (n=l), Marokko (n=l), Portugal (n=l), Vietnam (n=l).

Til sammen ble 102 isolerte tilfeller uten kjent konsanguinitet eller blodsslektsskap seleksjonert med de samme kliniske kriterier. Disses opprinnelse var Frankrike (n=31), Italia (n=23) og Storbritannia (n=26), Tyskland (n=21) og Nederland (n=l).

Alle pasientene ble bedømt i henhold til en standard protokoll. Enighet og aksept fra alle deltagere ble mottatt skriftlig.

2. Analyse av parkin genet.

DNA'en på 12 exoner som koder for parkin genet forsterkes ved PCR fra perifere blod leukocytter, for hvert indeks tilfelle, i henhold til de betingelser som er beskrevet av Kitada et al. Kort sagt gjennomføres forsterkningen på 100 ng DNA i nærvær av 350 \ iM av hver dPNT, 350 uM av hver probe og Taq polymerase. Forsterkningsbetingelsene er 35 cykler ved 94°C i 30 sekunder, fra 55-61 °C i 30 sekunder, deretter ved 68°C i 30 sekunder. For exonene 4 og 7 benyttes det kun det introniske probepar. Sekvensen på 12 exoner gjennomføres på to strenger med prober benyttet for forsterkning ved PCR med et sekvenseringskit "Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction" (ABIPRISM) og analyseres efter elektroforese på en ABI 377 sekvensør med programmet "Sequence Analysis 3.0" (ABI PRISM).

Detekteringen av mutantene i prøven og analysen av en populasjon på 45 kontrollerte individer gjennomføres ved tre teknikker som kan benyttes alene eller i en hvilken som helst kombinasjon: PCR/restriksjon med et egnet restriksjonsenzym; ASO ("Allele Specific Oligonucleotide") teknikken, og elektroforese på polyakrylamid gel ("PAGE"), som vist i tabell 2. Mer spesielt gjennomføres disse teknikker som beskrevet nedenfor.

ASO teknikken: Denne vei består i å hybridisere to oligonukleotidiske prober på en forsterket prøve (for eksempel ved PCR), den første spesifikt for og dekkende en genetisk endring, den andre spesifikt for og dekkende det tilsvarende vill område. Derefter og i nærvær av et mutert gen tillater kun den første probe hybridering med DNA fragmentet mens i nærvær av et ikke-mutert gen tillater den andre probe hybridering med DNA fragmentet. Når det gjelder et heterozygot gen oppnås en hybridering med hver av probene. Denne teknikk kan likeledes realiseres samtidig med en forsterkning i det man anvender to probepar, den første omfattende en probe spesifikk og dekkende det tilsvarende vill området. I denne utførelsesform og i nærvær av et mutert gen tillater kun det første paret forsterkning av et DNA fragment mens, ved nærvær av et ikke-mutert gen, kun det andre probeparet tillater forsterkning av et DNA fragment. Når det gjelder et heterozygot gen oppnås et forsterkningsprodukt med hvert av probeparene.

For gjennomføring av denne teknikk blir 10 ul PCR produkt denaturert ved 95°C i 5 minutter, anbrakt på nylon Hybond N+ membraner (Amersham), og fiksert med mikrobølger ved 600W i 2 minutter. De spesifikke prober (eller oligonukleotider) som benyttes for detekteringen (eller eventuelt for forsterkningen) er beskrevet i eksemplene (se tabell 1). For exon 3 benyttes de exoniske prober Ex3iFor (foran) og Ex3iRev (bak) benyttes. Sekvensen for probene er de følgende:

Disse oligonukleotider (derunder probene i det tilfellet det gjelder en samtidig forsterkning), merket med dCTP32 ved hjelp av en kit Terminal Transferase (Boehringer Mannheim) hybrideres til membraner ved 44°C over natten i en buffer bestående av 5 X SSC, 5 X Denhardts og 0,1% SDS. Membranene vaskes derefter to ganger i løpet av 30 minutter med et 2 X SSC medium ved 59°C og eksponeres til en MP film (Amersham) i 3-6 timer.

PCR/restriksjonsteknikk: Denne teknikk er basert på anvendelsen av restriksjonsenzymer hvis digestreringsprofil er modifisert når det gjelder genetisk endring. Fortrinnsvis anvender denne teknikk restriksjonsenzymer hvis sete er modifisert (destruert eller dannet) ved genetisk endring. I henhold til digesteringsprofilen for nukleinsyren (generelt forsterkningsprodukt) er det således mulig å atskille eventuelt nærvær av tilsiktet genetisk endring. Det skal være klart at denne teknikk er helt spesielt tilpasset leting etter karakteristiske genetiske endringer som medfører en modifikasjon i et enzymatisk kuttesete. For gjennomføring blir 15 ui forsterkningsprodukt brakt til digerering i nærvær av egnede restriksjonsenzymer i henhold til fabrikantenes anbefalinger. De enzymer som særlig benyttes i eksemplene og størrelsen på de ventede restriksjonsfragmenter er gitt i tabell 2.

Elektroforeseteknikk på polyakrylamid gel ("PAGE"): Denne teknikk tillater å detektere nærværet av mutasjoner ved å måle størrelsen av forsterkningsproduktene. Den er således helt spesielt tilpasset detektering av genetiske endringer av typen innskudd eller delesjon. For gjennomføring benyttes en på forhånd merket probe (5'-fluorescente, Hex) for å forsterke exon 2 av parkin genet. Nærværet av endringen 202-203delAG, og som resulterer i et kortere PCR produkt (306 mot 308 pb) fastslås ved måling av størrelsen av det forsterkede fragment under anvendelse av en automatisk ABI377 sekvensør utstyrt med programmene "Genescan 2.0.2" og "Genotyper 1.1.1" (ABI PRISM).

Nummereringen av de benyttede nukleotider i følge søknaden er gitt ved referanse til cDNA sekvensen som vises i DNA Data Bank of Japan (DDBJ; aksessnummer: AB009973). Sekvensen er representert i figur 1. Denne sekvens skiller seg fra den sekvens som er beskrevet av Kitada et al. i nukleotid 768. Sekvensen som vises i figur 1 tilsvarer vill proteinet man møter i de europeiske populasjoner. 3. Semi- kvantitativ PCR/ multipleks for detekterin<g>av delesioner/ multiplikasioner av exoner i homozygot- og heterozygot tilstand.

a) Prinsipper

Detekteringen av heterozygot delesjoner eller multiplikasjoner av exoner i Parkin genet

kan ikke realiseres ikke-kvantitativt ved PCR. Således er en semi-kvantitativ PCR som

sammenligner de relative mengder av matrise DNA er tilstrekkelig til å vite om det mangler 50% av DNA matrisen for et eller flere exoner eller, tvert i mot når det gjelder en heterozygot- eller homozygot multiplikasjon, om det er for eksempel 50%

(heterozygot duplikasjon), 100% (homozygot duplikasjon eller heterozygot triplikasjon) eller 200% (homozygot triplikasjon) for mye DNA for et eller flere exoner. For å realisere denne sammensetning blir firer exoner fra et og samme individ forsterket samtidig i en PCR reaksjon (PCR multipleks) i det de samtidig forsterkede exoner tjener som indre standard for mengden. PCR gjennomføres med fluorescente prober på en slik måte at mengden av PCR produkt kan måles ved hjelp av høyden av toppen på en automatisk sekvensør (ABI Prism 377), slik det anvendes for eksempel i LOH Assay (Loss of Heterozygosity) fra Applied Biosystems. Mengden PCR produkt (topphøyde) henger direkte sammen med mengden matrise DNA når PCR er i sin eksponensielle fase, noe som signifikerer et fravær av begrensingen av disponible substrater. Hver PCR multipleks gir, for en gitt kombinasjon av exoner, en typisk fordeling av høyden av toppene for et sammenligningsindivid og således bestemte forhold mellom de forskjellige topper.

En homozygot delesjon av en exon vises ved fravær av den tilsvarende topp. Hvis en exon er deletert i heterozygot tilstand vil den tilsvarende topp ha halvparten av sin vanlige høyde, noe som endrer forholdet mellom deleterte og ikke-deleterte exoner med en faktor 2 i forhold til en sammenligning (sammenligning av den høyeste verdi med den laveste verdi; figur 4 og tabell 4 relativ figur 4). For duplikasjoner av exoner endres forholdet med en faktor 1,5 for heterozygoter og en faktor 2 for homozygoter (alltid ved sammenligning med høyeste verdi og laveste verdi). Således er faktorene for en heterozygot- eller homozygot triplikasjon respektivt 2 eller 3 (alltid ved sammenligning med høyeste og laveste verdi). For likeledes å kunne detektere en delesjon eller en multiplikasjon av hele Parkin genet forsterkes et PCR produkt på 328 basepar (C328) av et gen som befinner seg i en viss avstand { Transtyretin genet) og tjener så som ytre standard i en multipleks PCR. Det faktum at kun høydeforholdene mellom toppene sammenlignes gjør i en første tilnærming metoden uavhengig av mengden og kvaliteten for det angjeldende DNA.

b) Opprettelse av egnede tilstander for multipleks PCR

Under de preliminære forsøk er det vist at exonene som forsterkes best kan innvirke

negativt på forsterkningen av andre exoner der effektiviteten er mindre god. Således blir exonene hvis forsterkningseffektivitet er sammenlignbar, regrupperte. Som størrelse for

PCR produktet som innvirker på forsterkningsutbyttet (de korte sekvenser forsterkes som regel bedre enn de lange), gjennomføres det en regruppering av PCR produktene med sammenlignbar størrelse i multipleks reaksjonen. Således velges det tre exon kombinasjoner:

De benyttede prober er de som er beskrevet av Kitada et al (1998). For exon 3 benyttes det et exonisk probepar:

Probene for C328 er:

For å oppnå høye topper som er sammenlignbare i hver multipleks PCR og for å befinne seg i eksponensiell fase for hver exon, justeres PCR betingelsene på en permanent måte (ved å følge delvis anbefalinger av Henegariu et al (Henegariu et al, 1997). Særlig reduseres temperaturene for hybridering og forlengelse og konsentrasjonen av MgCfe og varigheten av forlengelsen økes. Videre justeres probe konsentrasjonene fra en standard konsentrasjon på 0,8 uM i henhold til forsterkningseffektiviteten (konsentrasjonene av prober reduseres for de exoner som forsterkes godt og økes for de andre).

Hver kombinasjon av exoner ble testet for å verifisere at man befant seg i den eksponensielle fase og dette, i to multipleks PCR i parallell for de tre probe kombinasjoner, på et sammenligningsindivid med 22,23 og 24 cykler. Høyden av toppene korrigeres for avsetningsvariasjoner i henhold til den interne molekylvektsmarkør (TAMRA 500 XL fra Applied Biosystems). Høydene av de korrigerte topper sammenlignes med antallet cykler og representerer, i en logaritmisk skala, en stigende rett linje som viser at man befinner seg i den eksponensielle fase for de følgende betingelser:

5 minutter ved 95°C for en cyklus,

30 sekunder ved 95°C, 45 sekunder ved 53°C og 2,5 minutter ved 68°C i 23 cykler,

5 minutter ved 68°C i en cyklus.

Reaksjonen gjennomføres med 40 ng DNA i et volum på 25 ul PCR oppløsning med 3 mM MgCfe, 0,2 mM dTNP og 1U Taq/25 ul. Konsentrasjonen av hver primer er: Ex 2 (0,8 uM), Ex 3 (0,4 uM), Ex 4 (1.0 uM), Ex 5 (0,6 uM), Ex 6 (1,4 uM), Ex 7 (0,44 uM), Ex 8 (i kombinasjon 1: 1,0 uM og i kombinasjon 2: 0,8 uM), Ex 9 (0,4 uM), Ex 10 (1,04 uM), Ex 11 (0,8 uM), Ex 12 (1,2 uM) og C328 (1,92 uM).

c) Applikasjoner av multipleks PCR, indre kontroller og elektroforese

Generelt gjennomføres multipleks PCR ved to parallelle reaksjoner for hvert individ.

For hver pasientserie behandles minst en positiv kontroll (med en kjent heterozygot delesjon av exoner) og en negativ kontroll (sammenligningsindivid) i parallell for å oppnå normale og patologiske verdier for hver reaksjons forblanding for derved å unngå feilaktige resultater på grunn av mulige forskjeller i forblandingen (pipeteringsvariasjon). To ytterligere sammenligninger føyes til som ikke inneholder matrise DNA. 1,5 til 2,5 ul av PCR produktet blandes med 4 ul ladningsbuffer (inkludert 0,3 ul størrelsesmarkør TAMRA 500 XL fra Applied Biosystems). 1,5 ul av denne blanding fylles på en 4% denaturerende polyakrylamid gel inneholdende 96 brønner og en automatisk sekvensør ABI377. Gelene analyseres ved programmene GeneScan 3.1 og Genotyper 1.1.1 (Applied Biosystems). Høyden av toppene måles som antydet i Genotyperen. For dobbelt-toppene med et par av forskjellige baser (på grunn av det faktum at Taq polymerase av og til føyer til en A til hver ende) adderes høydene av de to topper. Forholdene mellom hver kombinasjon av topper beregnes for hver reaksjon i det man benytter programmet Excel 5.0 (tabell 5) og middelverdiene beregnes for to reaksjoner.

d) Interpretasjoner

For delesjonene interpreteres resultatene som patologiske tilfeller hvis

forholdsforskjellen er en faktor minst 1,6 eller <0,625 (=1/1,6) i alle de respektive forhold mellom sammenligningen og det angjeldende tilfellet (forholdet individ/kontrollforhold - tabell 5 i forhold til figur 4). Når forholdsdifferansene mellom parallelle reaksjoner er diskordante (for eksempel på grunn av en lav forsterkning i en PCR) blir forholdene som oppnås med en tilfredsstillende forsterkning tatt i betrakning forutsatt at de er normale.

For duplikasjonene interpreteres en forandring av forholdet med en faktor 1,30-1,65 eller >1,75 som respektivt en heterozygot- eller homozygot duplikasjon (under sammenligning av høyeste verdi med laveste verdi).

For en triplikasjon interpreteres en forandring i forholdene med en faktor 1,6-2,4 eller

>2,6 som en heterozygot- henholdsvis homozygot triplikasjon (under sammenligning av høyeste verdi med laveste verdi).

Efter hvert som imidlertid betingelsene justeres permanent under utviklingen av metodene er enkelte av resultatene oppnådd under noe varierende betingelser. Disse resultater tas i betraktning når de klart er normale eller patologiske og reproduserbare. I tvilsomme tilfeller gjentas forsøket under tilpassede betingelser.

4. Analyse av kosegregeringer og en sammenligningspopulasjon

a) Punktmutasjoner

Varianter i sekvensen av Parkin testes for deres kosegregering i familiene (i henhold til

disponibiliteten av andre prøver) og på nærvær i en populasjon av sammenligninger uten parkinsons syndrom (61 til 73 individer). Som grunn til en viss patogen karakter av mutasjonen 1142-1143delGA, blir sammenligningene ikke testet på denne mutasjon. Teknikkene som benyttes er PCR og digestering med egnede restriksjonsenzymer eller elektroforese på polyakrylamid gel (PAGE = polyakrylamid gel elektroforese) (se tabell 2). Når varianten ikke fremtvinger noen endring i restriksjonssete av seg selv blir et kunstig sete skapt ved hjelp av en probe med en mismatch. Probene konsiperes for å innføre endring av en base der posisjonen for sekvensvarianten for å skape et

restriksjonssete som inkluderer denne variant. Probene som benyttes er antydet i

tabellen nedenfor.

Modifiserte prober (ikke komplimentære av vill sekvensen for en base) for PCR:

Endringen i baseparene som innføres er understreket i sammenligning med vill sekvensen.

b) Delesjoner eller multiplikasjoner av homozygot- eller heterozygot exoner

Kosegregeringen av en delesjon eller en multiplikasjon av exoner i familiene analyseres

ved hjelp av metodene som beskrevet ovenfor. En kontroll populasjon er ikke testet på grunn av den meget sannsynlige patogene karakter av mutasjonene som medfører en intern delesjon i proteinet med eller uten forskyvning av leserammen.

5. Analyse av genetiske bindinger

For å teste bindingen til locus PARK2 blir fire markører av typen mikrosatellitt, og som befinner seg nær denne locus, testet (D6S1579, D6S411, D6S1550 og D6S305) som beskrevet av Tassin et al (1998).

C - Resultater

a) I en første serie forsøk gjennomføres en analyse av genet av parkin i indeks tilfellet for 38 familier med AR- JP som omfatter 87 pasienter.

1.Detektering av delesionen av exoner

Forsterkningen av exonene påviser ved nærvær av en delesjon i homozygot tilstand i tre familier: delesjon av exon 3 i en fransk familie (SAL-024) og en portugisisk (SAL-711), og exonene 8 og 9 i en algeir familie (DEL-001). Disse delesjoner overføres med sykdommen fordi de er detektert i hver familie i homozygot tilstand hos alle pasienter men ikke hos tilsynelatende fremhevede friske (figur 2).

2. Detektering av punktmutasjoner

Sekvensanalysen i familien uten homozygot delesjon avdekket nærværet av 16 varianter av nukleinsekvensen: 12 i exonene og 4 i intronene (tabellene 2 og 3, figur 3). Tre varianter medfører en forskyvning av leserammen og syntesen av et avskåret protein. Det dreier seg om mutasjonene 202-203delAG (Gln34Arg(Stop37)) og 255delA (Asn52Met(Stop81)) i exon 2 og 321-322insGT (Trp74Cys(Stop81)) i exon 3 som respektivt befinner seg i familiene IT-020 og UK-086, TOU-096, LYO-119. Disse mutasjoner er bortsett fra 202-203delAG i homozygot tilstand. En ikke-retningsmutasjon 1459G>A (Trp453Stop) i exon 12 er tilstede i homozygot tilstand i familien IT-006. Åtte av variantene er av gal-retnings type. I exon 4 er 584A>T (Lysl61 Asp) og 601G>A (Serl67Asn) i heterozygot tilstand hos pasientene fra familiene respektivt IT-020 og SAL-730.1 exon 7 finnes variantene 8670T (Arg256Cys) og 9240T (Arg275Trp) i heterozygot tilstand i familiene respektivt DE-012 og IT-015.1 exon 10 finnes varianten 1239G>C (Val380Leu) i heterozygot-og homozygot tilstand i 11 familier (IT-014, IT-020, IT-058, SAL-017, GRE-029, SAL-038, TOU-096, SAL-431, UK-006, UK-086, DE-022). I exon 11 detekteres varianten 1281G>A (Asp394Asn) i heterozygot tilstand i familien UK-046 og 13450A (Thr415Asn) i homozygot tilstand i familien IT-014. Til slutt er varianten 7680T (Pro223Ser) ikke patogen fordi den detekteres i homozygot tilstand hos alle individer som er sekvensert, noe som antyder at det dreier seg om en typografisk feil i parkin sekvensen [Kitada et al., 1998]. Forskningen på disse varianter i sammenligningspopulasjonen viste at tre blant disse representerte polymorfismer (tabell 2): Serl67Asn, Val380Leu og Asp394Asn. De andre varianter utgjør meget sannsynligvis kausale mutasjoner fordi de medfører syntese av avskårede parkin eller ikke-konservative substitusjoner eller substitusjoner som bæres på en av aminosyrene som kan fosforyleres. Videre segregerer de med sykdommen i familiene og detekteres ikke i 90 sammenligningskromosomer.

Variantene som er identifisert i intronene 2, 3,6 og 7 (1VS2+25T>C (272+25T>C), IVS3-20OT (514-20OT), IVS6+19T>C (835+19T>C) og IVS7-35A>G (973-35A>G)) utgjør polymorfismer (tabell 2). De er ikke lokalisert nær spleisesetene og detekteres i sammenligningskromosomene.

3. Funksjonelle Parkin domener

En studie av de funksjonelle domener av parkin er gjennomført ved analyse og sammenligning av sekvensene. Denne studie viser at en konservativ endring av aminosyren Thr415Asn er lokalisert i konsensus sekvensen av et cAMP- og cGMP-avhengig kinaseprotein (KKTT) og i forsoryleirngssete av et kinaseprotein C (TTK). Denne studie viser videre at ikke-retnings mutasjonen Trp453Stop er lokalisert i et N-terminalt myristoylerings sete (GCEWNR).

4. Fenotype- genotype korrelasjoner

Homozygot delesjonene og punktmutasjonene er detektert i 12 familier som omfatter 26 pasienter. Den midlere begynnelsesalder er 36,7 år med ekstremer på 7 henholdsvis 56 år (tabell 3). Sammenligningen mellom familiene i henhold til de funksjonelle konsekvenser av mutasjoner (homozygot delesjon, avskjærende mutasjon og gal-retnings mutasjon) avdekker ikke signifikative differanser når det gjelder begynnelsesalder, alvor eller frekvens av assosierte tegn bortsett fra for skjelvingen som er signifikant mindre hyppig i familiene med en homozygot delesjon sammenlignet med familier med avskjærende mutasjoner (tabell 3).

b) Detektering av nye punktmutasjoner

Åtte nye punktmutasjoner er identifisert i exonene hvorav seks er gal-retningsmutasjoner, en er avskjærende og en er ikke-retnings: 734A>T (Lys211 Asn) i exon 6, 905T>A (Cys268Stop), 939G>A (Asp280Asn) og 966T>G (Cys289Gly) i exon 7, 1084G>A (Gly328Glu), 1142-1143delGA og, 1101OT (Arg334Cys) i exon 9 og 1390G>A (Gly430Asp) i exon 12. Fem av gal-retningsmutasjonene fører til ikke-

konservative endringer i aminosyrene og en til en konservativ endring (Cys289Gly). Videre er en delesjon av fem basepar i intron 8, lokalisert til posisjonene -21 til -17 i forhold til exon 9, påvist. Alle disse varianter av sekvensene er ikke detektert hos 61 til 73 sammenligningsindivider (mutasjon 1142-1143delGA er ikke testet) og representerer således ikke polymorfismer. Resultatene er detaljert i tabell 2.

c) Detektering av nye homozygot delesjoner i exoner

Homozygot delesjoner hos exoner er detektert i tre familier i tillegg til delesjonene som

er rapportert tidligere av Hattori et al (1998a) og Liicking et al (1998) for exon 3 og av Hattori et al (1998a) for exonene 3+4. Delesjonene angår exonene 3 (FDP-ANG-GEO-141), 3+4 (IT-064) og 5+6 (SPD-LIB-HAG-076). Konsekvensene av exon delesjonene på leserammen og deres frekvens i forhold til prøvene er antydet i tabell 4.

d) Detektering av homozygot- og heterozygot ditplikasjoner/ triplikasjoner

Fem nye typer exon duplikasjoner er detektert: en duplikasjon i exon 3 i homozygot

tilstand (SPD-NIC-AIT-091) og en duplikasjon i exon 3 i heterozygot tilstand (SAL 399 213). I tillegg er heterozygot duplikasjoner i exon 6 (FPD-LIL-CHA-171), i exon 7 (DE 4001) og i exon 11 (SAL 399 213) detektert. To typer triplikasjoner er detektert: en triplikasjon i exon 2 i homozygot tilstand (RM 347) og en i heterozygot tilstand (RM 330).

e) Detektering av nye heterozygot delesjoner

Tretten forskjellige kombinasjoner av heterozygot delesjoner av exoner er påvist i 21

familier. De følgende delesjoner er observert: exonene 2,2+3, 2+3+4, 3, 3+4, 3-6, 3-9, 4,5, 6, 6+7, 7+8+9 og 8. Delesjonene i exonene 2, 2+3, 2+3+4, 3-6, 3-9, 6, 6+7, 7+8+9 og 8 er nye.

For to familier (Sal-Hab-436 og UK 12416), har det ikke kunnet fastslås med sikkerhet om heterozygot mutasjonene i exonene 2+3 henholdsvis 6-7 befinner seg på det samme kromosom eller om det dreier seg om kompositt heterozygoter på grunn av fraværet av DNA for andre medlemmer av disse familier. Konsekvensene av delesjonene og multiplikasjonene i de beskrevne exoner på leserammen og deres relative frekvens i vår prøve er antydet i tabell 4.

f) Gjenopptredene punktmutasjoner

Fem punktmutasjoner er påvist i mer enn en familie. Disse mutasjoner er 202-203delAG

(i heterozygot- eller homozygot tilstand i 5 familier), 255delA (i heterozygot- eller homozygot tilstand i 6 familier), Lys211 Asn (i heterozygot tilstand i 2 familier), og Arg275Trp (i heterozygot tilstand i 5 familier).

g) Frekvenser avforskjellige typer mutasjoner og kompositt heterozygoter

Blant familier med mutasjoner av Parkin er homozygot delesjoner i exoner detektert i 8

familier, punktmutasjoner i homozygot tilstand i 10 familier, en duplikasjon i homozygot exon i en familie og en exon triplikasjon i en familie. Pasientene fra 21 familier er kompositt heterozygoter for to forskjellige mutasjoner (3 ganger for forskjellige punktmutasjoner, 6 ganger for en punktmutasjon og en exon delesjon, to ganger for en punktmutasjon og en duplikasjon, en gang for en triplikasjon og en exon delesjon, en gang for to duplikasjoner av forskjellige exoner og 6 ganger for to forskjellige delesjoner i exoner; se eksempel figur 4). I to tilfeller har det ikke vært mulig å bestemme om det dreier seg om heterozygoter ved flere tilstøtende kompositt delesjoner og i 13 tilfeller er kun en mutasjon i heterozygot tilstand (6 punktmutasjoner og 7 exon mutasjoner) detektert.

D) Diskusjon

Foreliggende oppfinnelse angår varianter av Parkin genet, deres diagnostiske og/eller terapeutiske anvendelse samt teknikkene for detektering av endringer (særlig delesjoner i heterozygot exoner og multiplikasjoner i exoner) av Parkin genet.

Påvisningen av de forskjellige genetiske endringer (særlig homozygot delesjonene, punktmutasjonene, innskudd og exon multiplikasjoner) av kausal type viser at anomaliene av parkin genet utgjør en hyppig årsak til AR-JP.

1. Første studium på 38 europeiske familier

En første studie har tillatt å påvise eksistensen av delesjoner, mutasjoner og innskudd i parkin genet.

Den patogene rolle for homozygot delesjonene synes lett å fastslå. I de to beskrevne mutasjoner, delesjon av exon 3 og exonene 8-9, ledsages tapet av exonet av en forskyvning av leserammen som fører til opptredenen av en prematur avslutningskodon. I fravær av alternative spleiser resulterer dette i et avskåret protein.

Åtte exoniske varianter utgjør kausale mutasjoner. For det første segregerer disse mutasjoner med sykdommen i familien. For det andre er disse varianter ikke detektert ved ASO, PAGE eller PCR/restriksjon i 90 sammenligningskromosomer. For det tredje synes de funksjonelle mutasjonskonsekvenser å utebli. Det er lett å anta at de 4 avskjærende punktmutasjoner (Gln34Arg(Stop37), Asn52Met(Stop81), Trp74Cys(Stop81), Trp453Stop), detektert i homozygot tilstand hos pasienter fra 3 av de 5 familier, vil forårsake et tap av parkin funksjonen i overensstemmelse med den recessive autosomiske transmisjon av sykdommen. Tre av de fire gal-retningsmutasjoner medfører ikke konservative endringer av aminosyrene. En av disse (Lysl61 Asp) er assosiert med en avskjærende mutasjon på den andre allel som forsterker hypotesen om en patogen rolle. En gal-retningsmutasjon er konservativ (Thr415Asn), men påvirker et potensielt fosforyleirngssete. Tre av gal-retningsmutasjonene er tilstede i heterozygot tilstand hos pasienten hvis andre mutasjon ikke erkarakterisert. Det er sannsynlig at det dreier seg om delesjoner av et eller flere exoner i heterozygot tilstand som ikke kan visualiseres med de teknikker som benyttes for denne studie.

Anomaliene i parkin genet som påvises er varierte og det foreligger ingen mutasjons hot spot. Det er vert å merke seg at de avskjærende punktmutasjoner preferensielt tilsvarer de N- og C-terminale områder av parkin (omfattende særlig de ubiquitin-lignende deler respektivt ringen "RING-finger") samt at mutasjonene av gal-retnings typen påvirker det sentrale området. Kun to av de el ve mutasjoner som er beskrevet i denne første studie møtes i de fleste familier. Homozygot delesjonen av exon 3 detekteres i den franske familie SAL-024 og den portugisiske SAL-711. Mutasjonen med forskyvning av leserammen 202-203delAG (Gln34Arg(Stop37)) visualiseres i heterozygot tilstand i den italienske familie IT-020 og engelske UK-086. Forskjellig opprinnelse av familiene er i favør av hypotesen om uavhengig opptreden av disse mutasjoner.

De beskrevne mutasjoner påvirker familier som kommer fra 6 land: Algeri, Tyskland, England, Frankrike, Italia og Portugal. Studien av fenotypen i disse familier med en mutasjon viser at det kliniske spektrum forbundet med anomalien av parkin er mer utpreget enn i de japanske familier [Kitada et al., 1998]. Disse resultater bekrefter de observasjoner som er gjort i disse Europeiske og Nord-Afrikanske familier som er studert for genetiske forbindelser [Tassin et al., 1998]. Debut alderen er over 50 år hos de fleste pasienter og går helt til 56 år. Visse kliniske tegn som dystoni eller pyramidale tegn i de inferiøre lemmer er ikke alltid tilstede hos bærerne av mutasjonene selv efter en utviklingstid på flere decennier. Globalt forblir denne fenotypen meget lik mellom grupper av pasienter klassifisert i henhold til de funksjonelle konsekvenser av mutasjonene. Imidlertid synes nærværet av smertefulle dystoni episoder å møtes utelukkende hos pasienter som bærer homozygot delesjoner. Fraværet av signifikant differanse for debut alder, alvor og frekvens ved tegn assosiert med avskjærende punktmutasjoner og gal-retningsmutasjoner antyder at de modifiserte aminosyrer i de sistnevnte tilfeller spiller en viktig rolle ved parkins fysiologi.

Som en konklusjon understreker denne første studie frekvensen av mutasjonene av parkin genet i familiære parkinsonske syndrom av tidlig debut i Europa. Anomalier av dette gen hører også til opprinnelsen av de senere eller atypiske opprinnelser for parkinsonske syndromer. Det står tilbake å bestemme rollen for mutasjonene av parkin eller disses polymorfismer i de isolerte tilfeller. De detekterte mutasjoner er meget forskjellige både hva angår art og lokalisering. Studie av deres lokalisering i parkin antyder at tallrike områder av proteinet deltar i funksjonen, fremdeles ukjent.

2. Metode for detektering av delesjoner av exoner og multiplikasjoner av exoner

For første gang er detekteringen av delesjoner av exoner i heterozygot tilstand og multiplikasjoner av exoner (for eksempel duplikasjoner, triplikasjoner) i homozygot- og heterozygot tilstand i Parkin genet, beskrevet. Dette aspekt er interessant fordi delesjoner av exoner er relativt hyppige (se nedenfor). Som metode for detektering velges det en semi-kvantitativ multipleks PCR protokoll. Denne metode har tidligere vært nyttig for genetiske bestemmelser, for eksempel for detektering av delesjoner av genet PMP22 (Poropat og Nicholson, 1998), på betingelse av at forsterkningen ved PCR er i den eksponensielle fase. I alle disse forslag er valget av medforsterkede sammenligninger som tjener som standard for kvantifiseringen, avgjørende (Prior, 1998). I forsøkene tjente ikke deleterte exoner som indre sammenligninger ved forsterkning ved multipleks PCR hos det samme individ. Kombinasjonene av 4 eller 5 exoner velges slik at de ikke inneholder mer enn 2 tilstøtende exoner da slike exoner ikke kan tjene som kontroller hvis begge er deletert. Exonet av et annet gen ( Transtyretin) medforsterkes i en av de tre kombinasjoner for å identifisere heterozygot delesjonene i hele Parkin genet. Denne eksterne kontroll er indirekte vist i de to andre kombinasjoner som inkluderer exoner ved og andre enn exon 9; i det dette sistnevnte testes med Transtyretin.

Resultatene som oppnås ved denne metode er meget reproduserbare og de anormale resultater viser forskjeller i forholdene med en faktor som tilsvarer den man når teoretisk. Disse resultater viser at det dreier seg om en enkel og gyldig metode for en hurtig avsøking. Videre kan små delesjoner eller innskudd i PCR produktet og som er relativt hyppige (se nedenfor) detekteres samtidig ved denne metode.

3. Delesjoner av exoner og multiplikasjoner av exoner

Det har vært mulig å identifisere fire duplikasjoner av exoner og en triplikasjon av exoner som aldri har vært beskrevet i parkin genet tidligere men hvis relative frekvens er lav. Videre er ti nye kombinasjoner av delesjoner av exoner identifisert med, for første gang, påvisning av delesjonene som omfatter exon 2. Den relative frekvens for punktmutasjonene og delesjonene av exonene er estimert til rundt 50%. Således kan delesjonene av exoner (heterozygoter eller homozygoter) representere opptil 50% av mutasjonene i parkin, noe som understreker viktigheten av den her beskrevne teknikk. Således tillater denne teknikk å deletere mutasjoner i 26 av de 53 familier. I den studerte prøve har videre punktmutasjonene og delesjonene i parkin genet den samme frekvens men delesjoner av exoner er majoritære i den japanske populasjon (Hattori et al, 1998). De funksjonelle konsekvenser av delesjonene eller multiplikasjonene av exoner som beskrevet (forskyvning av leserammen eller delesjon/multiplikasjon i fase) har vært deduserte fra de publiserte DNA sekvenser av parkin (Kitada et al, 1998) og er spekulative fordi fraværet av PCR produkt ikke antyder at det har vært fremtvunget noen delesjon av exoner i totaliteten (se ovenfor). Imidlertid er den patologiske rolle for de detekterte modifikasjoner meget sannsynlig fordi de viser seg med sykdommen i familier som har kunnet testes, de er assosiert med punktmutasjoner hos kompositt heterozygoter og delesjonene er identifisert med en frekvens tilsvarende den til punktmutasjonene. På samme måte er, i isolerte tilfeller, frekvensen av heterozygot delesjoner og punktmutasjoner tilsvarende. Når det gjelder exon 3 har exoniske prober vært benyttet, noe som viser endringen av dette exon når det ikke er noe PCR produkt. Videre har i en del av tilfellene flere nær hverandre posisjonerte exoner vært deletert samtidig, noe som er et argument for en stor genomisk delesjon.

Heterozygot delesjonene eller-multiplikasjonene i totaliteten av parkin genet har ikke vært observert. Det dreier seg sannsynligvis om et sjeldent evenement tatt i betraktning den meget store størrelse (cirka 500 kb) for dette gen (Kitada et al, 1998).

De observerte delesjoner av exoner berører hyppig exonene 3 til 5. Denne observasjon bekreftes i de europeiske familier. Videre er det vist at exon 2 alene eller forbundet med andre meget hyppig er implikert i de europeiske familier (tabell 2).

4. Nye punktmutasjoner

Identifikasjonen av 8 nye punktmutasjoner (6 av gal-retnings typen, 1 avskjærende og 1 av ikke-retnings typen) øker diversiteten av punktmutasjonene i parkin genet. De beskrevne mutasjoner er patogene slik segregeringen med sykdommen har vist, og er ikke detektert hos 122 til 147 kromosomer hos sammenligningene (mutasjon 1142-1143delGA ikke inkludert). Selv om forandringen Cys289Gly er konservativ kan endringen av aminosyren ha betydelige skadelige konsekvenser hvis cysteinet i posisjon 289 er implikert i en disulfid bro, noe som er viktig for proteinets funksjon.

På interessant måte viser 2 pasienter fra familien UK-040 3 forskjellige mutasjoner (se tabell 5): en gal-retnings mutasjon Arg334Cys i exon 9 i homozygot tilstand, en homozygot delesjon på 5 basepar i posisjon -17 til -21 i intron 8 og en ikke konservativ gal-retningsmutasjon Asp280Asn i heterozygot tilstand. Man kunne mistenke at mutasjonen Arg334Cys i homozygot tilstand er kausal men delesjonen av fem basepar i homozygot tilstand, nær akseptor spleisesete av exon 9, kan også ha funksjonelle konsekvenser.

Fem punktmutasjoner er tilstede i flere analyserte familier. De tre hyppigste er 255delA (detektert i 6 familier) og 202-203delAG (funnet i 5 familier) samt Arg275Trp (detektert i 5 familier). En grunnleggende effekt kan midtenkes for mutasjon 255delA som berører 5 franske familier. Imidlertid har denne hypotese ikke kunnet verifiseres ved analyse av haplotypene.

5. Epidimiologisk genetikk

De oppnådde resultater viser at 34 av de 77 familier med et parkinson syndrom med tidlig debut oppviser mutasjoner i parkin genet, noe som understreker betydningen av dette gen i de europeiske familier. Detekteringen av mutasjonen i 18 av 102 isolerte og analyserte tilfeller er meget vanskelig å interpretere fordi effekten er meget liten og analysen av visse tilfeller ikke er fullstendig. Imidlertid er det slående å fastslå at debut alderen for de 7 tilfeller for hvilke det er kjent er spesielt tidlig (13 til 22 år) og at det er meget få debut tilfeller så tidlig uten mutasjon i parkin genet (for eksempel IT-NA-JMP-3). Dette resultat antyder at frekvensen av mutasjoner av parkin gen i de isolerte tilfeller øker når alderen synker, spesielt før en alder av 25 år. Observasjonen av mutasjoner av parkin gen i de isolerte tilfeller er ikke overraskende hvis man antar at i små familier har en recessiv autosomisk sykdom alle sjanser til å opptre som et isolert tilfelle. Analysen av en større prøve vil være nyttig for nøyaktig å bestemme frekvensen av mutasjoner av parkin i isolerte tilfeller i henhold til debut alder.

Mutasjonene er identifisert i familier med meget varierende opprinnelse: Frankrike, Italia, Storbritannia, Tyskland, Nederland, Algeri og Portugal. Disse resultater viser at mutasjoner i parkin genet er påvist i alle populasjoner som er testet inntil i dag.

6. Pasienter med en anomali i parkin gener i heterozygot tilstand

Selv om detekteringsteknikken for heterozygot delesjoner av exoner eller multiplikasjoner av exoner har tillatt å identifisere kompositt heterozygot tilfeller er i rundt en fjerdedel av familiene (13 av 53) en enkelt mutasjon detektert. Det dreier seg om 6 tilfeller med en punktmutasjon i heterozygot tilstand og 7 med en exon delesjon i heterozygot tilstand. Den patogene rolle for disse mutasjoner er meget sannsynlig fordi de forårsaker en endring av den ikke konservative aminosyre eller et avskåret protein. Videre er en av disse mutasjoner av gal-retnings typen (Arg275Trp) assosiert med en annen heterzygot punktmutasjon (Gly430Asp) og med heterozygot exon delesjoner (exon 3-6 eller exon 5+6), båret av den andre allel i tre forskjellige familier. Fraværet av detekteringen av en mutasjon på den andre allel i 13 familier antyder at den andre ikke-detekterte mutasjon påvirker et annet område av genet. Denne hypotese forsterkes av det faktum at de 6 familier som sannsynligvis er forbundet til locus PARK2, fordi pasienten er haploidentiske for 4 markører i området, er ingen mutasjon detektert. Således kan andre områder av genet være affektert, for eksempel promoter områdene, de ikke-tradukterte områder 5' og 3', eller introniske sekvenser.

7. Genetisk heterogenitet i de recessive autosomiske parkinson syndromer med tidlig debut

I 5 av 77 familier har en genetisk binding til parkin locus kunnet utelukkes. Videre har ingen mutasjon kunnet identifiseres i 21 familier for hvilke denne locus ikke formelt har kunnet utelukkes. Disse resultater antyder at det kan eksistere minst en annen locus for familiene med et recessivt autosomisk parkinson syndrom med tidlig debut i Europa. Denne hypotese er foreslått av Leroy et al (1998), som rapporterer en familie med to grener der den ene oppviser delesjoner i parkin genet mens den andre ikke oppviser verken disse delesjoner eller den samme haplotype, noe som ekskluderer en binding til denne locus.

8. Konklusjoner

En ny metode for detektering av heterozygot delesjoner av exoner eller multiplikasjoner av exoner er rapportert. Særlig er duplikasjonene/triplikasjonene av exoner og delesjoner av exon 2 og andre kombinasjoner av exoner, nye. I kombinasjon med sekvensering av exoner har man kunnet identifisere 8 nye punktmutasjoner og en intronisk delesjon som kan påvirke et spleisesete. Således presenterer 34 av 77 analyserte familier (cirka 50%) mutasjoner av parkin genet. Videre er disse mutasjoner i genet detektert i 19 isolerte tilfeller. I den europeiske populasjon synes andelene av punktmutasjoner og delesjoner av exoner, identiske. To varme mutasjonspunkter som tilsvarer delesjonene i exonene 3 og 5 og tre punktmutasjoner (202-203delAG, 255delA og Arg275Trp) er i tillegg påvist.

Bibliografiske referanser:

Abbas N, Liicking CB, Ricard S, Durr A, Bonifati V, De Michele G, Bouley S, Vaughan JR, Gasser T, Marconi R, Broussolle E, Brefel-Courbon C, Harhangi BS, Oostra BA, Fabrizio E, Bohme GA, Pradier L, Wood NW, Filla A, Meco G, Denefle P, Agid Y, Brice A, "The French Parkinson's Disease Genetics Study Group and The European Consortium on Genetic Susceptibility in Parkinson's Disease". " A wide variety of mutations in the parkin gene are responsible for autosomal recessive parkinsonism in Europe". Hum Mol Genet (1999), 8: 567-574.

de Rijk MC, Tzourio C, Breteler MED MER, Dartigues JF, Amaducci L, Lopez-Pousa S, Manubens-Bertran JM, Alperovitch A og Rocca WA. "Prevalence of parkinsonism and Parkinson's disease in Europe: the EUROPARKJNSON Collaborative Study". "European Community Concerted Action on the Epidemiology of Parkinson's disease".

J Neurol Neurosurg Psvchiatrv (1997), 62: 10-5

Gasser T, Myller-Myhsok B, Wszolek ZK, Oehlmann R, Calne DB, Bonifati V, Bereznai B, Fabrizio E, Vieregge P og Horstmann RD. "A susceptibility locus for Parkinson's disease maps to chromosome 2pl3". Nature Genetics (1998),

Hattori N, Kitada T, Matsumine H, Asakawa S, Yamamura Y, Yoshino H, Kobayashi T, Yokochi M, Wang M, Yoritaka A, Kondo T, Kuzuhara S, Nakamura S, Shimizu N og Mizuno Y. " Molecidar genetic analysis of a novel Parkin gene in Japanese families with autosomal recessive juvenile parkinsonism: evidence for variable homozygous deletions in the Parkin gene in affected individuals". Ann Neurol (1998a), 44: 935-41

Hattori N, Matsumine H, Asakawa S, Kitada T, Yoshino H, Elibol B, Brookes AJ, Yamamura Y, Kobayashi T, Wang M, Yoritaka A, Minoshima S, Shimizu N og Mizuno Y. " Point mutations ( Thr240Arg and GlnSllStop) [ correction ofThr240Arg and Ala311Stop] in the Parkin gene Jpublished erratum appears in Biochem Biophys Res Commun 1998 Oet 20;251( 2) :666J\ Biochem Biophys Res Commun (1998b), 249: 754-8

Henegariu O, Heerema NA, Dlouhy SR, Vance GH og Vogt PH. " Multiplex PCR: Critical Parameters and Step- by- Step ProtocoV\ BioTechniaues (1997), 23: 504-511

Ishikawa A og Tsuji S. "Clinical analysis of 17 patients in 12 Japanese families with autosomal- recessive type juvenile parkinsonism". Neurolo<g>y (1996), 47:160-6

Jones AC, Yamamura Y, Almasy L, Bohlega S, Elibol B, Hubble J, Kuzuhara S, Uchida M, Yanagi T, Weeks DE og Nygaard TG. " Autosomal Recessive Juvenile Parkinsonism Maps to 6q25. 2- q27 in Four Ethnic groups: Detailed Genetic Mapping of the Linked Region". Am J Hum Genet (1998), 63: 80-87

Kitada T, Asakawa S, Hattori N, Matsumine H, Yamamura Y, Minoshima S, Yokochi M, Mizuno Y og Shimizu N. " Mutations in the parkin gene cause autosomal recessive juvenile parkinsonism [ se kommentarerJ\ Nature (1998), 392: 605-8

Kryger R, Kuhn W, Miiller T, Woitalla D, Graeber M, Kssel S, Przuntek H, Epplen JT, Schsls L og Riess O. "Ala30Pro mutation in the gene encoding alpha-synuclein in Parkinson's disease". Nature Genetics (1998), 18: 106-108

Leroy E, Anastasopoulos D, Konitsiotis S, Lavedan C og Polymeropoulos MH. " Deletions in the Parkin gene and genetic heterogeneity in a Greek family with early onset Parkinson ' s disease". Hum Genet (1998), 103: 424-7

Lucking CB, Abbas N, Durr A, Bonifati V, Bonnet AM, de Broucker T, De Michele G, Wood NW, Agid Y, Brice A. "The European Consortium on Genetic Susceptibility in Parkinson's Disease and The French Parkinson's Disease Genetics Study Group". " Homozygous deletions in parkin gene in European and North African families with autosomal recessive juvenile parkinsonism". Lancet (1998), 352: 1355-1356

Matsumine H, Saito M, Shimoda Matsubayashi S, Tanaka H, Ishikawa A, Nakagawa Hattori Y, Yokochi M, Kobayashi T, Igarashi S, Takano H, Sanpei K, Koike R, Mori H, Kondo T, Mizutani Y, Schaffer AA, Yamamura Y, Nakamura S, Kuzuhara S, Tsuji S og Mizuno Y. "Localization of a gene for an autosomal recessive form of juvenile Parkinsonism to chromosome 6q25.2-27". Am J Hum Genet (1997), 60: 588-596

Polymeropoulos MH, Lavedan C, Leroy E, Ide SE, Dehejia A, Durra A, Pike B, Root H, Rubenstein J, Boyer R, Stenroos ES, Chandrasekharappa S, Athanassiadou A, Papapetropoulos T, Johnson WG, Lazzarini AM, Duvoisin RC, Di Iorio G, Golbe LI og Nussbaum RL. "Mutation in the alpha-Synuclein Gene Identified in Families with Parkinson's Disease". Science (1997), 276: 2045-2047

Poropat RA og Nicholson GA. " Determination of gene dosage at the PMP22 and androgen receptor loci by quantitative PCR". Clinical Chemistrv (1998), 44: 724-730

Prior TW. " Determining Gene Dosage ( editorial)". Clinical Chemistrv (1998), 44: 703-704

Sunada Y, Saito F, Matsumura K og Shimizu T. " Differential expression of the parkin gene in the human brain andperipheral leukocytes". Neurosci Lett (1998), 254: 180-182

Takahashi H, Ohama E, Suzuki S, Horikawa Y, Ishikawa A, Morita T, Tsuji S og Ikuta F. "Familial juvenile parkinsonism: clinical and pathologic study in a family".

Neuroloev (1994), 44: 437-41

Tassin J, Durr A, de Broucker T, Abbas N, Bonifati V, De Michele G, Bonnet AM, Broussolle E, Pollak P, Vidailhet M, De Mari M, Marconi R, Medjbeur S, Filla A, Meco G, Agid Y og Brice A. " Chromosome 6- Linked Autosomal Recessive Early- Onset Parkinsonism: Linkage in European andAlgerian Families, Extension of the Clinical Spectrum, and Evidence of a Small Homozygous Deletion in One Family". Am J Hum Genet (1998), 63: 88-94

Wood N. "Genes and parkinsonism [editorial]". J Neurol Neurosurg Psvchiatry (1997), 62: 305-9

Yamamura Y, Sobue I, Ando K, lida M og Yanagi T. "Paralysis agitans of early onset with marked diumal fluctuation of symptoms". Neurology (1973), 23: 239-44

Claims (16)

1. Nukleinsyre som koder for humant parkin,karakterisertv e d at den omfatter delesjon av en adenosin (A) i posisjon 202 og en guanin (G) i posisjon 203.

2. Nukleinsyre ifølge krav 1,karakterisert vedat delesjonen forårsaker en Gln34Arg endring og en leserammeforskyvning med et stop kodon i posisjon 37.

3. Polypeptid,karakterisert vedat det kodes for av en nukleinsyre ifølge krav 1 eller krav 2.

4. Antistoff,karakterisert vedat det er spesifikt for et polypeptid ifølge krav 3.

5. Sammensetning,karakterisert vedat den omfatter et polypeptid ifølge krav 3 eller et antistoff ifølge krav 4.

6. Nukleotidprobe,karakterisert vedat den hybridiserer spesifikt til en nukleinsyre ifølge krav 1.

7. Fremgangsmåte for å identifisere en genetisk alterasjon som resulterer i en Gln34Arg endring og en leserammeforskyvning med et stop kodon i posisjon 37 i parkin genet,karakterisert vedat den omfatter: - å tilveiebringe en testprøve som omfatter parkin genet; - å amplifisere den delen av det nevnte gen som poteniselt omfatter nevnte alterasjon; og - å påvise tilstedeværlse av den genetiske alterasjon.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat prøven er en blod, vev eller plasmaprøve eller en cellekultur.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat prøven er forbehandlet for å gjøre parkin genet, eller en del derav, tilgjengelig for amplifikasjon.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat amplifiseringen utføres ved bruk av et primerpar for amplifisering av hele eller en del av en nukleinsyre som definert i krav 1, hvor nevnte primerpar omfatter: - en første primer som er kompementær til et område på parkin genet som er lokalisert 5' for nevnte mutasjon; og - en andre primer som er komplementær til et område på parkin genet som er lokalisert 3' for nevnte mutasjon.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 7,karakterisert vedat påvisningen utføres ved sekvensering, PCR/restriksjon, ASO, PAGE eller semikvantitativ multipleks PCR.

12. Fremgangsmåte for å diagnostisere mottakelighet for Parkinsonian syndrom,karakterisert vedat den omfatter å lete etter en mutasjon i parkin genet definert ved krav 1 eller krav 2.

13. Vektor,karakterisert vedat den omfatter en nukleinsyre som definert i hvilket som helst av krav 1 og krav 2.

14. Celle,karakterisert vedat den omfatter en vektor som definert i krav 13.

15. Ikke-humant pattedyr,karakterisert vedat det omfatter, i cellene derav, en nukleinsyre som definert i hvilket som helst av kravene 1 og 2.

16. Anvendelse av en celle ifølge krav 14 eller et ikke-humant pattedyr ifølge krav 15, for å identifisere forbindelser som er i stand til å motvirke effektene av en genetisk alterasjon i parkin genet.