CN116350758A - 肿瘤共享新抗原表位肽或其编码核酸在制备药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了一种肿瘤共享新抗原表位肽或其编码核酸在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。本发明通过分析TIMER和COSMIC数据库，表位预测和体内外免疫活性实验，鉴定获得了3个肿瘤共享新抗原CTNNB1、SMAD4、SMARCA4来源的5条HLA‑A2限制性CTL表位肽。该共享新抗原表位肽的患者覆盖率高，且能有效刺激、诱导产生新抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，特异性区分野生型和突变型，杀伤表达共享新抗原的肿瘤细胞。由此制备的药物可以包含共享新抗原表位肽或其编码核酸，或者包含特异性识别共享新抗原表位肽的T细胞受体、嵌合抗原受体或其编码核酸，具有较好的治疗潜力和应用前景。

Description

肿瘤共享新抗原表位肽或其编码核酸在制备药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种肿瘤共享新抗原表位肽或其编码核酸在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

背景技术

肿瘤免疫治疗近年来发展迅速，被认为是最有前景的治疗方法。研究表明，肿瘤免疫治疗的临床疗效很大程度上取决于肿瘤患者中存在的肿瘤抗原特异性的CD8⁺T淋巴细胞，而肿瘤抗原在其中扮演着重要的角色。理想的肿瘤抗原是仅在肿瘤细胞中表达而在正常细胞中不表达的肿瘤特异性抗原。新抗原是肿瘤特异性突变产生的一类肿瘤特异性抗原，因其在正常细胞中不表达而具有较高的免疫原性，可以通过激活CD4⁺T淋巴细胞和CD8⁺T淋巴细胞产生强烈的免疫反应，被认为是最理想的肿瘤免疫治疗靶点之一。

目前，基于新抗原的新表位疫苗以及新表位特异性的T淋巴细胞在实体瘤的治疗中展现出独特优势。然而，当下鉴定的绝大多数新抗原多为患者所特有，人群覆盖率较低，严重制约了基于新表位的肿瘤免疫疗法的临床应用。因此，具有广泛人群覆盖率的共享新抗原将是未来临床应用的关键。

随着二代测序技术和生物信息学技术的发展，大量肿瘤患者的突变信息被COSMIC、TIMER等在线数据库收录，并且结合不同算法的预测软件将为共享新抗原的筛选及其突变特异性的表位肽的预测提供便利。然而，表位肽预测的准确率较低，需要活性试验验证有效才具有实践意义。此外，HLA-A2亚型在中国人群中占比50％左右。因此，鉴定HLA-A2限制性共享新表位肽将具有广泛的人群覆盖率，并可为基于共享新抗原的肿瘤免疫治疗提供新的靶点和策略。

发明内容

为了克服新抗原人群覆盖率低的问题，本发明旨在鉴定在两种以上肿瘤类型中均具有高突变频率的共享新抗原，并以此鉴定新抗原表位肽。这些新抗原表位肽能够有效刺激并诱导产生新抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞，用于共享新抗原阳性表达的肿瘤细胞的杀伤，具有良好的临床应用价值。因此，本发明主要解决的技术问题是提供一种肿瘤共享新抗原表位肽或其编码核酸在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用。

同时，本发明还提供一种预防和/或治疗肿瘤的药物。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

一种肿瘤共享新抗原表位肽或其编码核酸在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用，所述肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸如SEQ ID NO：1-5中任一项所示。

具体的，所述肿瘤共享新抗原表位肽为3个肿瘤共享新抗原CTNNB1、SMAD4、SMARCA4来源的5条HLA-A2限制性CTL表位肽，其氨基酸序列如下所示：

CTNNB1-S37F：YLDSGIHFGA(SEQ ID NO：1)；

CTNNB1-S37F：Tyr-Leu-Asp-Ser-Gly-Ile-His-Phe-Gly-Ala。

CTNNB1-T41A：YLDSGIHSGATATA(SEQ ID NO：2)；

CTNNB1-T41A：Tyr-Leu-Asp-Ser-Gly-Ile-His-Ser-Gly-Ala-Thr-Ala-Thr-Ala。

CTNNB1-T41A：YLDSGIHSGATA(SEQ ID NO：3)；

CTNNB1-T41A：Tyr-Leu-Asp-Ser-Gly-Ile-His-Ser-Gly-Ala-Thr-Ala。

SMAD4-R361C：YVDPSGGDCFCL(SEQ ID NO：4)；

SMAD4-R361C：Tyr-Val-Asp-Pro-Ser-Gly-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys-Leu。

SMARCA4-T910M：LLMGTPLQNKLPEL(SEQ ID NO：5)；

SMARCA4-T910M：Leu-Leu-Met-Gly-Thr-Pro-Leu-Gln-Asn-Lys-Leu-Pro-Glu-Leu。

具体的，所述编码肿瘤共享新抗原表位肽的核酸包括DNA或RNA。在不改变编码的氨基酸序列的前提下，可以根据密码子的偏好性进行修饰改造。

作为本发明一种优选的实施方案，所述药物包括疫苗、细胞制剂等。

具体的，所述药物为可诱导机体产生肿瘤共享新抗原特异性T细胞克隆的疫苗或细胞制剂。所述疫苗可以为核酸疫苗，所述核酸疫苗包含编码肿瘤共享新抗原表位肽的核酸序列，如DNA疫苗、RNA疫苗；或者，所述疫苗为重组蛋白疫苗、合成长肽疫苗、混合肽池(peptide pool)疫苗等，所述重组蛋白疫苗、合成长肽疫苗或混合肽池疫苗均包含肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸序列。所述细胞制剂包含抗原提呈细胞(如树突细胞)，所述抗原提呈细胞包含肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸序列。

或者，所述药物为可预防和/或治疗共享新抗原阳性表达的肿瘤的细胞制剂。所述细胞制剂包含经修饰的细胞，例如，编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸转染的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(包括肿瘤浸润T淋巴细胞)，或者修饰有T细胞受体或嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等。所述T细胞受体或嵌合抗原受体能够特异性识别肿瘤共享新抗原表位肽。

作为本发明一种优选的实施方案，所述肿瘤共享新抗原表位肽可以采用化学合成法制备。所述化学合成法包括固相合成法、液相合成法、固-液相合成法等。合成策略如C-端合成、N-端合成、分段合成等，并在C-端或N-端进行常规修饰，包含修饰基团。

作为本发明一种优选的实施方案，所述肿瘤为表达共享新抗原的肿瘤，包括恶性肿瘤，如癌症。

具体的，所述肿瘤包括子宫内膜癌、肝细胞癌、结肠腺癌、直肠腺癌、胰腺癌、肺腺癌、食管癌、乳腺癌、低级别脑胶质瘤、肾乳头状细胞癌、结内帕利沙肌成纤维母细胞瘤、神经肌肉迷行瘤、硬纤维瘤、青少年血管纤维瘤、牙釉质型颅咽管癌、肝母细胞瘤、胰腺导管癌、胆道癌、脑血管瘤、皮肤默克尔细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、原位黑色素瘤、皮肤基底细胞癌肉瘤等。

一种预防和/或治疗肿瘤的药物，所述药物包含肿瘤共享新抗原表位肽或其编码核酸，或者包含特异性识别肿瘤共享新抗原表位肽的T细胞受体、嵌合抗原受体或其编码核酸，所述肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸如SEQ ID NO：1-5中任一项所示。

作为本发明一种优选的实施方案，所述药物为疫苗、细胞制剂等。

具体的，所述药物为可诱导产生新抗原特异性T细胞克隆的疫苗或细胞制剂。同上所述，所述疫苗包括核酸疫苗(如DNA疫苗、RNA疫苗)、重组蛋白疫苗、合成长肽疫苗、混合肽池疫苗等。所述细胞制剂包含抗原提呈细胞(如树突细胞)，所述抗原提呈细胞包含肿瘤共享新抗原表位肽。

或者，所述药物为可预防和/或治疗共享新抗原阳性表达的肿瘤的细胞制剂。同上所述，所述细胞制剂包含经修饰的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等。所述经修饰的细胞为编码T细胞受体或嵌合抗原受体的核酸转染的细胞，或者修饰有T细胞受体或嵌合抗原受体的细胞，所述T细胞受体或嵌合抗原受体特异性识别肿瘤共享新抗原表位肽。

作为本发明一种优选的实施方案，所述药物为疫苗时，还可以包括免疫调节剂或佐剂。

具体的，所述免疫调节剂或佐剂选自聚-ICLC(poly-ICLC)、1018ISS、Amplivax、MF59、AS03、AS04、AS15、BCG、CP-870、CP-893、CpG7909、CyaA、环二核苷酸(如STING)、dSLIM、GM-CSF、IL-2、IC30、IC31、Montanide ISA^TM(如Montanide ISA51)等中的一种或多种。

作为本发明一种优选的实施方案，所述药物可以通过局部给药的方式施用。

作为本发明一种优选的实施方案，所述药物的剂型为药物治疗学上可接受的剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、喷雾剂、注射用粉针剂、注射液等。基于此，所述药物还包含药学上可接受的辅料，包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH值调节剂、矫味剂等。辅料成分可根据药剂学常识合理选用。

作为本发明一种优选的实施方案，所述药物的剂量为药物治疗学上可接受的剂量。

本发明的有益效果：

本发明通过分析TIMER和COSMIC数据库，表位预测和体内外免疫活性实验，鉴定获得了3个肿瘤共享新抗原CTNNB1、SMAD4、SMARCA4来源的5条HLA-A2限制性CTL表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1-5所示，该共享新抗原表位肽能够有效刺激、诱导产生新抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞克隆，能够特异性地区分野生型和突变型序列，特异性地杀伤表达共享新抗原的肿瘤细胞。该新抗原表位肽患者覆盖率高，将其制备成预防和/或治疗肿瘤的药物(如疫苗、细胞制剂)具有较好的治疗潜力和应用前景。

本发明提供的预防和/或治疗肿瘤的药物包含肿瘤共享新抗原表位肽或其编码核酸，或者包含特异性识别肿瘤共享新抗原表位肽的T细胞受体、嵌合抗原受体或其编码核酸，该药物能够在体内外诱导产生具有肿瘤杀伤功能的突变肽特异性的CD8⁺T淋巴细胞，准确区分野生型和突变型，具有良好的临床应用价值。

附图说明

图1为三个共享新抗原来源的9条突变表位肽以肿瘤细胞系(MCF7-WT/MUT)为靶细胞的胞内因子染色实验结果图；

图2为本发明共享新抗原表位肽以荷载表位肽的T2A2细胞为靶细胞的胞内因子染色实验结果图；

图3为本发明共享新抗原表位肽体外诱导的特异性CTLs对荷载表位肽的T2A2细胞的杀伤作用实验结果图；

图4为本发明共享新抗原表位肽体外诱导的特异性CTLs对肿瘤细胞系(MCF7-WT/MUT)的杀伤作用实验结果图；

图5为本发明共享新抗原表位肽体外诱导的特异性CTLs对肿瘤细胞系(SW620-WT/MUT)的杀伤作用实验结果图；

图6为本发明共享新抗原表位肽SEQ ID NO：1-5以肽池(Peptide pool)形式联合CpG-ODN 1826免疫HLA-A2.1/K^b转基因小鼠获得的特异性CTLs的胞内因子染色实验结果图；

图7为本发明共享新抗原表位肽SEQ ID NO：1-5以肽池(Peptide pool)形式联合CpG-ODN 1826免疫HLA-A2.1/K^b转基因小鼠获得的特异性CTLs对肿瘤细胞系(MCF7-WT/MUT)的杀伤作用实验结果图。

以上附图中涉及的显著性分析标识，*表示p＜0.05、**表示p＜0.01、***表示p＜0.001。

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，以上对实验例中得到的附图进行简单地介绍。应当理解，上述附图仅示出了本发明的某些实验例，不应看作是对权利要求保护范围的任何限制。对于本领域的普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图得到其他相关的附图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例和实验例对本发明的技术方案进行清楚完整的描述。但本领域技术人员应当理解，实施例仅用于说明本发明的技术方案，而不应视为限制本发明的保护范围。基于下述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施方案，例如修改、变形或简单替换后得到的实施方案，均应属于本发明的保护范围。

下述实施例及实验例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的原料、试剂、仪器等如无特殊说明，均可通过商业途径获得；所涉名词、缩写均为本领域的常规含义，如PBS为磷酸盐缓冲液。

实施例1

本实施例提供了一种预防和治疗(共享新抗原阳性表达的)肿瘤的药物，所述药物为合成多肽疫苗，包含药效量的、采用Fmoc固相合成法制备的肿瘤共享新抗原表位肽，以及适量的佐剂和辅料；所述肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-5中任一项所示。

实施例2

本实施例提供了一种预防和治疗(共享新抗原阳性表达的)肿瘤的药物，所述药物为mRNA疫苗，包含药效量的、由脂质纳米颗粒(LNP)递送的mRNA，以及适量的佐剂和辅料；所述mRNA经密码子优化且能编码肿瘤共享新抗原表位肽，所述肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-5中任一项所示。

实施例3

本实施例提供了一种预防和治疗(共享新抗原阳性表达的)肿瘤的药物，所述药物为细胞制剂，包含药效量的、经修饰的T细胞，以及适量的佐剂和辅料；所述T细胞插入有能够特异性识别肿瘤共享新抗原表位肽的T细胞受体，所述T细胞受体经筛选获得，所述肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1-5中任一项所示。

实施例4

本实施例提供了一种肿瘤共享新抗原表位肽在制备预防和治疗肿瘤的药物中的应用，包括：将药效量的肿瘤共享新抗原表位肽与适量的佐剂按照一定的顺序混合，制备成预防和治疗共享新抗原阳性表达的肿瘤的药物；所述肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸如SEQ ID NO：1-5中任一项所示。

实验例

一、共享新抗原的突变频率分析

首先，通过TumorPortal数据库筛选存在热点突变位点的新抗原。随后，通过TIMER数据库分析这些新抗原在不同肿瘤类型中的突变频率，确定共享新抗原。最后，通过COSMIC数据库分析共享新抗原在不同肿瘤亚型中的突变频率和热点突变位点，选定共享新抗原和热点突变位点。以下实验例中使用的与共享新抗原及热点突变相关的抗原肽的信息如下表1所示，表位预测结果如下表2所示。

表1共享新抗原及热点突变相关的抗原肽序列

通过Fmoc固相合成法制备上述突变表位肽，质谱分析并证实其分子量符合理论值。

二、共享新抗原及热点突变相关抗原肽特异性T淋巴细胞的体外诱导

共享新抗原及热点突变相关抗原肽特异性T淋巴细胞的体外诱导方法，包括：

(1)通过密度梯度离心法分离健康供者外周血单个核细胞(PBMCs)，使用RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁶个/毫升，5毫升/孔铺于6孔板中，37℃、5％CO₂细胞培养箱中培养4h。

(2)培养4h后，吸取孔板中未贴壁的细胞，离心后以5×10⁶个/毫升的浓度冻存备用。贴壁细胞使用含有1000U/mLrhGM-CSF和500U/mL rhIL-4的RPMI-1640完全培养基诱导分化为树突状细胞(DCs)，第5天加入LPS(100ng/mL)诱导DCs成熟。

(3)使用突变表位肽负载成熟DCs 4小时后，按照DCs：T淋巴细胞＝1：10的比例，将负载突变表位肽的成熟DCs与T淋巴细胞共培养，每周刺激1次，共刺激3次，期间每2天半量换液，同时补加细胞因子IL-2(终浓度：100U/mL)和IL-7(终浓度：10ng/mL)。三轮刺激后，收集诱导获得的细胞毒性T淋巴细胞。以负载野生型或突变表位肽的T2A2细胞、表达野生型或突变型新抗原的肿瘤细胞系(MCF7-WT/MCF-7-MUT，SW620-WT/SW620-MUT)为靶细胞，通过胞内因子染色实验和LDH乳酸脱氢酶细胞毒性实验检测，结果如图1-4所示。

三、共享新抗原及热点突变相关抗原肽特异性T淋巴细胞的体内诱导

共享新抗原及热点突变相关抗原肽特异性T淋巴细胞的体内诱导方法，包括：

(1)将6-8周龄的HLA-A2.1/Kb转基因小鼠随机分组，实验分组分别为：CpG组(CpG-ODN 1826+溶解多肽用的生理盐水)和CpG+Peptide pool组(包含5条突变表位肽CTNNB1-S37F、CTNNB1-T41A(14aa)、CTNNB1-T41A(12aa)、SMAD4-R361C和SMARCA4-T910M以及CpG-ODN 1826)。CpG-ODN1826的给药剂量为30μg/只小鼠，多肽的给药量为100μg/只小鼠。

(2)突变表位肽和CpG-ODN 1826均稀释至终体积为200μL，免疫方式采用尾基根部皮下多点注射。小鼠共免疫三次，分别在第0天、第7天和第14天进行。

(3)第19天处死小鼠，获取小鼠脾脏和淋巴结，研磨并消化。随后通过已灭菌的滤网过滤细胞悬液至无菌离心管中，离心收集细胞。

(4)弃上清，加入5mL红细胞裂解液。裂解结束后使用PBS洗涤，离心收集细胞。离心结束后弃上清，用GT-T551培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5×10⁶个/毫升，铺入6孔板并于37℃、5％ CO₂细胞培养箱中培养。

(5)第1天加入突变表位肽(Peptide pool，2.5μg/mL)和mIL-2(50U/mL)。之后隔天半量换液并补加mIL-2。诱导第5天收集诱导的肽特异性T淋巴细胞.以表达野生型或突变型新抗原的肿瘤细胞系(MCF7-WT/MCF-7-MUT)为靶细胞，通过胞内因子染色实验和LDH乳酸脱氢酶细胞毒性实验检测，结果如图5-6所示，图5右侧柱状图中，蓝：MCF7-WT，红：MCF7-MUT。

四、检测方法

1、胞内因子染色实验

胞内因子染色实验方法，包括：

(1)靶细胞准备：离心收集T2细胞，将突变表位肽或者野生型表位肽以50μg/mL的终浓度负载T2细胞，37℃、5％ CO₂细胞培养箱内孵育4小时。对于肿瘤细胞系，胰酶消化重悬后使用无血清培养基洗涤。离心洗涤后调整细胞密度为2×10⁵个/毫升。

(2)突变表位肽特异性T淋巴细胞的准备：收集诱导获得的T淋巴细胞，使用无血清培养基洗涤后重悬，调整细胞密度为2×10⁶个/毫升。

(3)将肽特异性T淋巴细胞与靶细胞按照细胞数量10：1的比例，铺于96孔U型底孔板中，37℃、5％ CO₂细胞培养箱内孵育4小时。在共孵育4小时后每孔细胞加入阻断剂BFA继续培养3小时。

(4)收集各孔细胞至1.5毫升EP管中，离心洗涤后，加入50μL稀释好的细胞表面抗体(CD3、CD8和FasL)，涡旋混匀，4℃避光孵育30min。孵育结束PBS洗涤两次。设置空白对照组、CD3单阳组、CD8单阳组和同型对照组。

(5)每管细胞加入200μL固定剂并涡旋混匀，室温避光孵育30min。孵育结束后加入800μL已稀释的破膜剂，随后离心收集细胞。

(6)加入50μL破膜剂稀释的胞内因子抗体(IFN-γ，空白组、单阳组和同型对照组除外)，涡旋混匀后4℃避光孵育30min，孵育结束后PBS洗涤两次。

(7)弃上清，用200μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测分析。

2、LDH乳酸脱氢酶细胞毒性实验

LDH乳酸脱氢酶细胞毒性实验方法，包括：

(1)靶细胞准备：离心收集T2细胞，将突变表位肽或者野生型表位肽以50μg/mL的终浓度负载T2细胞，37℃、5％ CO₂细胞培养箱内孵育4小时。对于肿瘤细胞系，胰酶消化重悬后使用无血清培养基洗涤。将靶细胞离心洗涤后，调整细胞密度1×10⁵个/毫升。

(2)突变表位肽特异性T淋巴细胞的准备：收集诱导获得的T淋巴细胞，使用无血清培养基洗涤后重悬，调整细胞密度为5×10⁶个/毫升。

(3)将肽特异性T淋巴细胞与靶细胞按照效靶比(E：T)＝12.5：1、25：1、50：1分别铺于96孔U型底孔板中。靶细胞的细胞数为5000个/孔，每孔终体积为100μL。37℃、5％ CO₂细胞培养箱中共孵育4小时。

设置实验组：

靶细胞自发释放组：50μL靶细胞+50μL无血清培养基；

靶细胞最大释放组：50μL靶细胞+50μL无血清培养基+10μL裂解液；

背景对照组：100μL无血清培养基；

体积校正组：100μL无血清IMDM+10μL裂解液；

实验组：50μL靶细胞+50μL不同效靶比对应的T淋巴细胞。

(4)孵育结束前45min，在靶细胞最大释放组和体积校正组各加入10μL裂解液。抽取50μL上清至另一平底96孔板中，50μL/孔加入已稀释的底物混合液，室温避光孵育30min。50μL/孔加入终止液，去除气泡，1h内在490nm波长下检测。

五、实验结果与分析

表2共享新抗原及热点突变相关的抗原肽预测结果

表2为肿瘤共享新抗原表位肽的预测结果。从表2可以看出，对于CTNNB1S37F位点，SEQ ID NO：6-8与SEQ ID NO：1具有相当的预测亲和力。对于CTNNB1 T41A位点，SEQ ID NO：9与SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3相比具有更好的预测亲和力。

图1为三个共享新抗原来源的9条突变表位肽的胞内因子染色实验结果图，靶细胞为MCF7-WT和MCF7-MUT。从图1可以看出，SEQ ID NO：1-5这5条共享新抗原表位肽在3个健康供者中均能诱导获得突变表位肽特异性的细胞毒性T淋巴细胞。对于CTNNB1 S37F位点，SEQID NO：6-8与SEQ ID NO：1虽然有相当的预测亲和力，但是胞内结果显示这三条突变表位肽诱导获得CTLs并不能很好的区分野生型肿瘤细胞和突变型肿瘤细胞。对于CTNNB1 T41A位点，SEQ ID NO：9与SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3相比，虽然仅差一个氨基酸，预测亲和力也是三条突变表位肽中最好的，但是胞内因子染色结果显示SEQ ID NO：9诱导获得CTLs并不能很好的区分野生型肿瘤细胞和突变型肿瘤细胞。由此可见，仅通过表位肽预测方法获得的突变表位肽，绝大多数是无法区分野生型和突变型的。对于突变表位肽相关疫苗开发，活性试验验证有效才具有实践意义。

图2为本发明共享新抗原表位肽的胞内因子染色实验结果图，靶细胞为负载突变表位肽和负载野生型表位肽的T2A2细胞。从图2可以看出，与荷载野生型表位肽的T2A2细胞组相比，SEQ ID NO：1-5这5条共享新抗原表位肽诱导健康供者(HLA-A2⁺)PBMCs获得的CTLs与荷载突变型表位肽的T2A2细胞共孵育后具有更高的IFN-γ分泌水平和FasL的表达水平，两组之间存在显著性差异。实验结果表明SEQ ID NO：1-5这5条共享新抗原表位肽在体外具有良好的免疫原性。

图3为本发明共享新抗原表位肽体外诱导的特异性CTLs对荷载表位肽的T2A2细胞的杀伤作用实验结果图。从图3可以看出，SEQ ID NO：1-5这5条共享新抗原表位肽诱导健康供者(HLA-A2⁺)PBMCs获得的CTLs能够特异性杀伤负载突变表位肽的T2A2细胞，具有良好的免疫原性。

图4、图5为本发明共享新抗原表位肽体外诱导的特异性CTLs对野生型肿瘤细胞和突变型肿瘤细胞的杀伤作用实验结果图。从图中可以看出，SEQ ID NO：1-5这5条共享新抗原表位肽诱导健康供者(HLA-A2⁺)PBMCs获得的CTLs对突变型肿瘤细胞系MCF7-MUT、SW620-MUT的杀伤率显著高于对野生型肿瘤细胞系MCF7-WT、SW620-WT的杀伤率。该结果通过杀伤实验进一步发现SEQ ID NO：1-5这5条共享新抗原表位肽体外诱导产生的CTLs能够特异性的识别和杀伤共享新抗原阳性的肿瘤细胞。

图6为本发明共享新抗原表位肽SEQ ID NO：1-5以肽池(Peptide pool)形式联合CpG-ODN 1826免疫HLA-A2.1/K^b转基因小鼠获得的特异性CTLs胞内因子染色实验结果图。从图6可以看出，与单独CpG免疫组相比，CpG+肽池(Peptide pool)免疫组的脾脏和淋巴结中的CD8⁺T淋巴细胞能够特异性区分MCF7-MUT和MCF7-WT，具有显著高水平的IFN-γ⁺CD8⁺T细胞和FasL⁺CD8⁺T细胞。

图7为本发明共享新抗原表位肽SEQ ID NO：1-5以肽池(Peptide pool)形式联合CpG-ODN 1826免疫HLA-A2.1/K^b转基因小鼠获得的特异性CTLs对肿瘤细胞系(MCF7-WT/MUT)的杀伤作用实验结果图。从图7可以看出，与单独CpG免疫组相比，CpG+肽池(Peptidepool)诱导获得的CTLs对MCF7-MUT靶细胞组的杀伤效率显著高于MCF7-WT靶细胞组的杀伤效率，且杀伤效率随着效靶比的升高而升高。实验结果表明本发明肽池(Peptide pool)在体内诱导产生的CTLs，能够特异性识别和杀伤共享新抗原阳性的肿瘤细胞。

从以上实验结果可以看出，本发明通过分析TIMER和COSMIC数据库，表位预测和体内外免疫活性实验，鉴定获得了3个肿瘤共享新抗原CTNNB1、SMAD4、SMARCA4来源的5条HLA-A2限制性CTL表位肽(如SEQ ID NO：1-5所示)，该共享新抗原表位肽能够有效刺激、诱导产生新抗原特异性的细胞毒性T淋巴细胞克隆，能够特异性地区分野生型和突变型序列，特异性地杀伤表达共享新抗原的肿瘤细胞。

本发明鉴定获得的新抗原表位肽的患者覆盖率高，将其制备成预防和/或治疗肿瘤的药物(如疫苗、细胞制剂等，或者使药物包含特异性识别肿瘤共享新抗原表位肽的T细胞受体、嵌合抗原受体或其编码核酸)，能够在体内外诱导产生具有肿瘤杀伤功能的突变肽特异性的CD8⁺T淋巴细胞，准确区分野生型和突变型，具有较好的治疗潜力和临床应用前景。

虽然上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验例对本发明的技术方案做了详尽的描述，但需要说明的是，实施例和实验例仅用于说明本发明的技术方案和技术效果，而不应视为对本发明保护范围的任何限制。基于本发明技术构思所做的简单变形、修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种肿瘤共享新抗原表位肽或其编码核酸在制备预防和/或治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸如SEQ ID NO：1-5中任一项所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为可诱导机体产生肿瘤共享新抗原特异性T细胞克隆的疫苗或细胞制剂；

优选地，所述疫苗为核酸疫苗，所述核酸疫苗包含编码肿瘤共享新抗原表位肽的核酸序列；或者，所述疫苗为重组蛋白疫苗、合成长肽疫苗或混合肽池疫苗，所述重组蛋白疫苗、合成长肽疫苗或混合肽池疫苗均包含肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸序列；

优选地，所述细胞制剂包含抗原提呈细胞，所述抗原提呈细胞包含肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为可预防和/或治疗共享新抗原阳性表达的肿瘤的细胞制剂；

优选地，所述细胞制剂包含经修饰的细胞，所述经修饰的细胞为编码T细胞受体或嵌合抗原受体的核酸转染的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞，或者，所述经修饰的细胞为修饰有T细胞受体或嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞；所述T细胞受体或嵌合抗原受体特异性识别肿瘤共享新抗原表位肽。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述肿瘤共享新抗原表位肽采用化学合成法制备，合成策略包括C-端合成、N-端合成、分段合成；

优选地，采用化学合成法制备的肿瘤共享新抗原表位肽在C-端或N-端包含修饰基团。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为共享新抗原阳性表达的肿瘤，包括子宫内膜癌、肝细胞癌、结肠腺癌、直肠腺癌、胰腺癌、肺腺癌、食管癌、乳腺癌、低级别脑胶质瘤、肾乳头状细胞癌、结内帕利沙肌成纤维母细胞瘤、神经肌肉迷行瘤、硬纤维瘤、青少年血管纤维瘤、牙釉质型颅咽管癌、肝母细胞瘤、胰腺导管癌、胆道癌、脑血管瘤、皮肤默克尔细胞癌、皮肤鳞状细胞癌、原位黑色素瘤、皮肤基底细胞癌肉瘤。

6.一种预防和/或治疗肿瘤的药物，其特征在于：所述药物包含肿瘤共享新抗原表位肽或其编码核酸，或者包含特异性识别肿瘤共享新抗原表位肽的T细胞受体、嵌合抗原受体或其编码核酸，所述肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸如SEQ ID NO：1-5中任一项所示。

7.根据权利要求6所述的预防和/或治疗肿瘤的药物，其特征在于：所述药物为可诱导机体产生肿瘤共享新抗原特异性T细胞克隆的疫苗或细胞制剂；

优选地，所述疫苗为核酸疫苗，所述核酸疫苗包含编码肿瘤共享新抗原表位肽的核酸序列；或者，所述疫苗为重组蛋白疫苗、合成长肽疫苗或混合肽池疫苗，所述重组蛋白疫苗、合成长肽疫苗或混合肽池疫苗均包含肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸序列；

优选地，所述细胞制剂包含抗原提呈细胞，所述抗原提呈细胞包含肿瘤共享新抗原表位肽的氨基酸序列。

8.根据权利要求6所述的预防和/或治疗肿瘤的药物，其特征在于：所述药物为可预防和/或治疗共享新抗原阳性表达的肿瘤的细胞制剂；

优选地，所述细胞制剂包含经修饰的细胞，所述经修饰的细胞为编码T细胞受体或嵌合抗原受体的核酸转染的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞，或者，所述经修饰的细胞为修饰有T细胞受体或嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞；所述T细胞受体或嵌合抗原受体特异性识别肿瘤共享新抗原表位肽。

9.根据权利要求7所述的预防和/或治疗肿瘤的药物，其特征在于：所述药物为疫苗时，还可包括免疫调节剂或佐剂；

优选地，所述免疫调节剂或佐剂选自聚-ICLC、1018ISS、Amplivax、MF59、AS03、AS04、AS15、BCG、CP-870、CP-893、CpG7909、CyaA、环二核苷酸、dSLIM、GM-CSF、IL-2、IC30、IC31、Montanide ISA51中的一种或多种。

10.根据权利要求6所述的预防和/或治疗肿瘤的药物，其特征在于：所述药物的剂型为药物治疗学上可接受的剂型，包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、喷雾剂、注射用粉针剂、注射液；

和/或，所述药物可通过局部给药的方式施用；

和/或，所述药物的剂量为药物治疗学上可接受的剂量。

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