CN116350760A - 新抗原esr1来源的ctl表位肽或其编码核酸在制备药物中的应用 - Google Patents

新抗原esr1来源的ctl表位肽或其编码核酸在制备药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116350760A
CN116350760A CN202310335632.2A CN202310335632A CN116350760A CN 116350760 A CN116350760 A CN 116350760A CN 202310335632 A CN202310335632 A CN 202310335632A CN 116350760 A CN116350760 A CN 116350760A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
esr1
vaccine
antigen
epitope peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202310335632.2A
Other languages
English (en)
Inventor
吴亚红
王明霜
李朵
孔亚南
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University
Original Assignee
Zhengzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University filed Critical Zhengzhou University
Priority to CN202310335632.2A priority Critical patent/CN116350760A/zh
Publication of CN116350760A publication Critical patent/CN116350760A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了一种新抗原ESR1来源的CTL表位肽或其编码核酸在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明通过分析COSMIC数据库、表位预测和体内外免疫活性实验，鉴定获得了新抗原ESR1来源的HLA‑A2限制性CTL表位肽。该突变表位肽来源于ESR1的高频突变，能够有效刺激、诱导产生新表位特异性的细胞毒性T淋巴细胞，特异性区分野生型和突变型序列，杀伤表达突变表位的肿瘤细胞，具有良好的抗肿瘤效果。由此制备的治疗肿瘤的药物可包含新抗原ESR1来源的CTL表位肽或其编码核酸，或者包含特异性识别该突变表位肽的T细胞受体、嵌合抗原受体或其编码核酸，具有较好的治疗潜力和临床应用前景。

Description

新抗原ESR1来源的CTL表位肽或其编码核酸在制备药物中的 应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种新抗原ESR1共享/热点突变来源的CTL表位肽或其编码核酸在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
背景技术
乳腺癌是全球女性癌症死亡的主要原因之一，其发病率和死亡率仍在逐年上升。其中，雌激素受体(Estrogen receptor，ER)阳性乳腺癌患者约占乳腺癌总病例的70％。对于ER+乳腺癌患者，内分泌疗法(抗雌激素疗法)是临床上的主要治疗手段。然而，内分泌疗法耐药是ER+乳腺癌患者所面临的主要问题，最终导致复发和转移。
研究表明，ESR1的获得性体细胞突变是ER+转移性乳腺癌患者内分泌治疗耐受的一个关键驱动因素，导致持续的转录活性和降低的内分泌治疗敏感性。这些突变对转移性乳腺癌(metastatic breast cancer，MBC)是非常不利的，且在高达36％的转移性乳腺癌患者中存在。
ESR1是编码ER的基因，ESR1基因异常通常包括基因的扩增、重排及突变等几种形式。研究显示，ESR1的错义突变通常与乳腺癌耐药和转移性乳腺癌的疾病进展相关，且大多数的突变集中在ESR1的配体结合区域(ligand-binding domain，LBD)。
近年来，肿瘤免疫治疗因其能够诱导和激活患者自身肿瘤特异性的免疫细胞来识别和杀伤肿瘤，建立免疫记忆，被认为是最有前景的治疗方法。肿瘤免疫治疗的临床疗效依赖于患者中的肿瘤抗原特异性T淋巴细胞，而肿瘤抗原在其中扮演着重要角色。理想的肿瘤抗原是仅在肿瘤细胞中表达而在正常细胞中不表达的肿瘤特异性抗原。新抗原(neoantigen)是肿瘤细胞特异性突变产生的一类肿瘤特异性抗原，由于这些突变产生的抗原是后天产生的，在正常组织中不表达，因而具有很强的免疫原性和肿瘤特异性，被认为是目前最理想的肿瘤抗原之一。新抗原中能够特异性激活T淋巴细胞的表位又称新表位(neoepitopes)，已在肿瘤免疫治疗中显现出独特的优势。
然而，目前鉴定的绝大多数新抗原多为患者所特有，人群覆盖率较低，严重制约了基于新表位的肿瘤免疫疗法的临床应用。因此，具有广泛人群覆盖率的共享新抗原将是未来临床应用的关键。
随着二代测序技术和生物信息学技术的发展，大量肿瘤患者的突变信息被COSMIC、TIMER等在线数据库收录，并且结合不同算法的预测软件将为ESR1来源的共享/热点突变位点特异性的新抗原的筛选及其突变特异性的表位肽的预测提供便利。但与此同时，表位肽预测的准确率较低，需要活性试验验证有效才具有实践意义。此外，HLA-A2亚型在中国人群中占比50％左右。因此，鉴定HLA-A2限制性共享新表位肽具有广泛的人群覆盖率，可为基于新抗原的肿瘤免疫治疗提供新的候选和策略。
发明内容
为了克服新抗原人群覆盖率低的问题，本发明通过COSMIC在线数据库分析，发现内分泌治疗耐药的样本中ESR1的突变率为76.06％，通过对ESR1点突变分析发现，ESR1突变主要集中在303、380、537和538四个位点，且一些肿瘤样本中同时存在两个或者两个以上的突变位点。ESR1四个突变位点能够覆盖80％以上的耐药突变样本，具有广泛的人群覆盖率，是免疫治疗的理想靶点。
本发明提供的新抗原表位肽来源于ESR1的高频突变，能够有效刺激、诱导产生新表位特异性的细胞毒性T淋巴细胞克隆，特异性区分野生型和突变型序列，杀伤表达突变表位的肿瘤细胞，具有良好的抗肿瘤效果，并且该新抗原表位肽患者覆盖率高，具有良好的治疗潜力和应用前景。因此，本发明主要解决的技术问题是提供一种新抗原ESR1来源的CTL表位肽或其编码核酸在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
同时，本发明还提供一种治疗肿瘤的药物。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
一种新抗原ESR1来源的CTL表位肽或其编码核酸在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14中任一项或多项所示。
本发明通过分析COSMIC数据库和表位预测，获得了与新抗原ESR1及热点突变相关的14条抗原肽，其氨基酸序列如下所示：
ESR1-K303R：RNSLALSLTADQMV(SEQ ID NO：1)；
ESR1-K303R：Arg-Asn-Ser-Leu-Ala-Leu-Ser-Leu-Thr-Ala-Asp-Gln-Met-Val。
ESR1-E380Q：LLQCAWLEI(SEQ ID NO：2)；
ESR1-E380Q：Leu-Leu-Gln-Cys-Ala-Trp-Leu-Glu-Ile。
ESR1-E380Q(10aa)：HLLQCAWLEI(SEQ ID NO：3)；
ESR1-E380Q(10aa)：His-Leu-Leu-Gln-Cys-Ala-Trp-Leu-Glu-Ile。
ESR1-Y537S：VPLSDLLLEM(SEQ ID NO：4)；
ESR1-Y537S：Val-Pro-Leu-Ser-Asp-Leu-Leu-Leu-Glu-Met。
ESR1-Y537S-D538G(1)：VPLSGLLLEM(SEQ ID NO：5)；
ESR1-Y537S-D538G(1)：Val-Pro-Leu-Ser-Gly-Leu-Leu-Leu-Glu-Met。
ESR1-Y537S-D538G(2)：NVVPLSGLLL(SEQ ID NO：6)；
ESR1-Y537S-D538G(2)：Asn-Val-Val-Pro-Leu-Ser-Gly-Leu-Leu-Leu。
ESR1-Y537N：VPLNDLLLEM(SEQ ID NO：7)；
ESR1-Y537N：Val-Pro-Leu-Asn-Asp-Leu-Leu-Leu-Glu-Met。
ESR1-Y537N-D538G(1)：NVVPLNGLLL(SEQ ID NO：8)；
ESR1-Y537N-D538G(1)：Asn-Val-Val-Pro-Leu-Asn-Gly-Leu-Leu-Leu。
ESR1-Y537N-D538G(2)：VPLNGLLLEM(SEQ ID NO：9)；
ESR1-Y537N-D538G(2)：Val-Pro-Leu-Asn-Gly-Leu-Leu-Leu-Glu-Met。
ESR1-Y537C：VPLCDLLLEM(SEQ ID NO：10)；
ESR1-Y537C：Val-Pro-Leu-Cys-Asp-Leu-Leu-Leu-Glu-Met。
ESR1-Y537C-D538G(1)：VPLCGLLLEM(SEQ ID NO：11)；
ESR1-Y537C-D538G(1)：Val-Pro-Leu-Cys-Gly-Leu-Leu-Leu-Glu-Met。
ESR1-Y537C-D538G(2)：NVVPLCGLLL(SEQ ID NO：12)；
ESR1-Y537C-D538G(2)：Asn-Val-Val-Pro-Leu-Cys-Gly-Leu-Leu-Leu。
ESR1-D538G(10aa)：VPLYGLLLEM(SEQ ID NO：13)；
ESR1-D538G(10aa)：Val-Pro-Leu-Tyr-Gly-Leu-Leu-Leu-Glu-Met。
ESR1-D538G：LYGLLLEML(SEQ ID NO：14)；
ESR1-D538G：Leu-Tyr-Gly-Leu-Leu-Leu-Glu-Met-Leu。
其中，除SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14所示突变表位肽外，其他几条突变肽不具有特异性或者免疫原性较低。
具体的，所述编码新抗原ESR1来源的CTL表位肽的核酸包括DNA或RNA。在不改变编码的氨基酸序列的前提下，可以根据密码子的偏好性进行修饰改造。
作为本发明一种优选的实施方案，所述药物包括治疗性肿瘤疫苗、细胞制剂等。
具体的，所述药物为可诱导机体产生新抗原特异性T细胞克隆的治疗性肿瘤疫苗或细胞制剂。所述治疗性肿瘤疫苗可以为核酸疫苗，所述核酸疫苗包含编码新抗原ESR1来源的CTL表位肽的核酸序列，如DNA疫苗、RNA疫苗；或者，所述治疗性肿瘤疫苗为多肽疫苗、重组蛋白疫苗、合成长肽疫苗、混合肽池(peptide pool)疫苗、包含抗原偶联物的疫苗等，所述多肽疫苗、重组蛋白疫苗、合成长肽疫苗等均包含新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列。所述细胞制剂包含抗原提呈细胞(如树突细胞)，所述抗原提呈细胞包含新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列。
作为本发明一种优选的实施方案，所述药物为治疗性肿瘤疫苗时，还可以包括免疫调节剂或佐剂。
具体的，所述免疫调节剂或佐剂选自聚-ICLC(poly-ICLC)、1018ISS、Amplivax、铝盐、PLGA微粒子、病毒体或其他病毒样粒子、β-葡聚糖、SRL172、MF59、AS03、AS04、AS15、BCG、CP-870、CP-893、CpG7909、CyaA、环二核苷酸(如STING)、dSLIM、GM-CSF、IL-2、IC30、IC31、Montanide ISATM(如Montanide ISA51)等中的一种或多种。
作为本发明一种优选的实施方案，所述药物为细胞制剂时，还可以包括靶向抗原提呈细胞(如DC细胞)的亲和肽。
第二种情况，所述药物为可治疗新抗原ESR1阳性表达的肿瘤的细胞制剂。所述细胞制剂包含经修饰的细胞，例如，编码T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的核酸转染的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(包括肿瘤浸润T淋巴细胞)，或者修饰有T细胞受体或嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等。所述T细胞受体或嵌合抗原受体能够特异性识别新抗原ESR1来源的CTL表位肽。该细胞制剂也可采用上述疫苗制备得到。
作为本发明一种优选的实施方案，所述新抗原ESR1来源的CTL表位肽可以采用化学合成法制备。所述化学合成法包括固相合成法、液相合成法、固-液相合成法等。合成策略包括C-端合成、N-端合成和分段合成，合成时在C-端或N-端进行常规修饰，进而包含修饰基团。
作为本发明一种优选的实施方案，所述肿瘤为新抗原ESR1阳性表达的肿瘤，包括恶性肿瘤，如癌症。
具体的，所述肿瘤包括乳腺癌、子宫内膜癌、肝细胞癌、甲状腺癌、宫颈癌、前列腺癌等。
一种治疗肿瘤的药物，所述药物包含新抗原ESR1来源的CTL表位肽或其编码核酸，或者包含特异性识别新抗原ESR1来源的CTL表位肽的T细胞受体、嵌合抗原受体或其编码核酸，所述新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14中任一项或多项所示。
具体的，所述编码新抗原ESR1来源的CTL表位肽的核酸包括DNA或RNA。在不改变编码的氨基酸序列的前提下，可以根据密码子的偏好性进行修饰改造。
作为本发明一种优选的实施方案，所述药物为治疗性肿瘤疫苗、细胞制剂等。
第一种情况，所述药物为可诱导机体产生新抗原特异性T细胞克隆的治疗性肿瘤疫苗或细胞制剂。同上所述，所述治疗性肿瘤疫苗包括核酸疫苗(如DNA疫苗、RNA疫苗)、多肽疫苗、重组蛋白疫苗、合成长肽疫苗、混合肽池疫苗、包含抗原偶联物的疫苗等。所述细胞制剂包含抗原提呈细胞(如树突细胞)，所述抗原提呈细胞包含新抗原ESR1来源的CTL表位肽。
作为本发明一种优选的实施方案，所述药物为治疗性肿瘤疫苗时，还可以包括免疫调节剂或佐剂。
具体的，所述免疫调节剂或佐剂选自聚-ICLC(poly-ICLC)、1018ISS、Amplivax、铝盐、PLGA微粒子、病毒体或其他病毒样粒子、β-葡聚糖、SRL172、MF59、AS03、AS04、AS15、BCG、CP-870、CP-893、CpG7909、CyaA、环二核苷酸(如STING)、dSLIM、GM-CSF、IL-2、IC30、IC31、Montanide ISATM(如Montanide ISA51)等中的一种或多种。
作为本发明一种优选的实施方案，所述药物为细胞制剂时，还可以包括靶向抗原提呈细胞(如DC细胞)的亲和肽。
第二种情况，所述药物为可治疗新抗原ESR1阳性表达的肿瘤的细胞制剂。同上所述，所述细胞制剂包含经修饰的细胞，如修饰的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞等。所述经修饰的细胞为编码T细胞受体或嵌合抗原受体的核酸转染的细胞，或者修饰有T细胞受体或嵌合抗原受体的细胞，所述T细胞受体或嵌合抗原受体特异性识别新抗原ESR1来源的CTL表位肽。该细胞制剂也可采用上述疫苗制备得到。
作为本发明一种优选的实施方案，所述药物可以通过局部给药的方式施用。
作为本发明一种优选的实施方案，所述药物的剂型为药物治疗学上可接受的剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、喷雾剂、注射用粉针剂、注射液等。
作为本发明一种优选的实施方案，为制备成特定的剂型，所述药物还包含药学上可接受的辅料，包括但不限于包衣材料、溶剂、增溶剂、粘合剂、稳定剂、抗氧化剂、pH值调节剂、矫味剂等。辅料成分可根据药剂学常识合理选用。
作为本发明一种优选的实施方案，所述药物的剂量为药物治疗学上可接受的剂量。
本发明的有益效果：
本发明通过分析COSMIC数据库、表位预测和体内外免疫活性实验，鉴定获得了新抗原ESR1来源的8条HLA-A2限制性CTL表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14所示。该突变表位肽来源于ESR1的高频突变，能够有效刺激、诱导产生新表位特异性的细胞毒性T淋巴细胞，特异性区分野生型和突变型序列，特异性杀伤表达突变表位的肿瘤细胞，具有良好的抗肿瘤效果。该突变表位肽的患者覆盖率高，是理想的免疫治疗的靶点。将(利用)其制备成治疗肿瘤的药物如肿瘤疫苗、细胞制剂等，具有较好的治疗潜力和广泛的应用前景。
本发明提供的治疗肿瘤的药物包含新抗原ESR1来源的CTL表位肽或其编码核酸，或者包含特异性识别突变表位肽的T细胞受体、嵌合抗原受体或其编码核酸。该药物能够在体内外诱导产生具有肿瘤杀伤功能的突变肽特异性的CD8+T淋巴细胞，准确区分野生型和突变型，具有较高的临床应用价值。
附图说明
图1为新抗原ESR1来源的14条突变表位肽以荷载突变/野生型表位肽的T2A2细胞为靶细胞的胞内因子染色实验结果图；
图2为新抗原ESR1来源的8条突变表位肽体外诱导的特异性CTLs以荷载突变/野生型表位肽的T2A2细胞为靶细胞的杀伤作用实验结果图；
图3为新抗原ESR1来源的8条突变表位肽体外诱导的特异性CTLs以肿瘤细胞系(MDA-MB-231-WT/MUT)为靶细胞的杀伤作用实验结果图；
图4为新抗原ESR1来源的8条突变表位肽以肽池(Peptide pool)形式联合CpG-ODN1826免疫HLA-A2.1/Kb转基因小鼠获得的特异性CTLs以荷载突变/野生型表位肽池的T2A2细胞为靶细胞的胞内因子染色实验和杀伤作用实验结果图；
图5为新抗原ESR1来源的8条突变表位肽以肽池(Peptide pool)形式联合CpG-ODN1826免疫HLA-A2.1/Kb转基因小鼠获得的特异性CTLs以荷载单条突变/野生型表位肽的T2A2细胞为靶细胞的杀伤作用实验结果图；
图6为新抗原ESR1来源的8条突变表位肽以肽池(Peptide pool)形式联合CpG-ODN1826免疫HLA-A2.1/Kb转基因小鼠获得的特异性CTLs以肿瘤细胞系(MDA-MB-231-WT/MUT)为靶细胞的胞内因子染色实验结果图；
图7为新抗原ESR1来源的8条突变表位肽诱导获得的CTLs过继回输荷瘤的NOD/SCID小鼠的体内抗肿瘤作用实验结果图。
以上附图中涉及的显著性分析标识，*表示p＜0.05、**表示p＜0.01、***表示p＜0.001。
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，以上对实验例中得到的附图进行简单地介绍。应当理解，上述附图仅示出了本发明的某些实验例，不应看作是对权利要求保护范围的任何限制。对于本领域的普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图得到其他相关的附图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例和实验例对本发明的技术方案进行清楚完整的描述。但本领域技术人员应当理解，实施例仅用于说明本发明的技术方案，而不应视为限制本发明的保护范围。基于下述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施方案，例如修改、变形或简单替换后得到的实施方案，均应属于本发明的保护范围。
下述实施例及实验例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的原料、试剂、仪器等如无特殊说明，均可通过商业途径获得；所涉名词、缩写均为本领域的常规含义，如PBS为磷酸盐缓冲液。
实施例1
本实施例提供了一种治疗肿瘤(即新抗原ESR1来源的CTL表位肽阳性表达的肿瘤)的药物，所述药物为合成多肽疫苗，所述疫苗包含药效量的、采用Fmoc固相合成法制备的新抗原ESR1来源的CTL表位肽，以及适量的佐剂等；所述新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14中任一项所示。
实施例2
本实施例提供了一种治疗肿瘤(即突变表位肽阳性表达的肿瘤)的药物，所述药物为mRNA疫苗，所述疫苗包含药效量的、由脂质纳米颗粒(LNP)递送的mRNA，以及适量的佐剂、递送系统等；所述mRNA经密码子优化且能编码新抗原ESR1来源的CTL表位肽，所述新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14中任一项所示。
实施例3
本实施例提供了一种治疗肿瘤(即突变表位肽阳性表达的肿瘤)的药物，所述药物为细胞制剂，所述细胞制剂包含药效量的、经修饰的T细胞，以及适量的佐剂等；所述经修饰的T细胞插入有能够特异性识别新抗原ESR1来源的CTL表位肽的T细胞受体，所述新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14中任一项所示，所述T细胞受体经筛选获得。
实施例4
本实施例提供了一种新抗原ESR1来源的CTL表位肽在制备治疗肿瘤的药物中的应用，所述应用包括：将药效量的、采用Fmoc固相合成法制备的新抗原ESR1来源的CTL表位肽与适量的佐剂等按照一定的顺序混合，制备成治疗肿瘤(即突变表位肽阳性表达的肿瘤)的混合肽池疫苗；所述新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14所示。
实验例
一、新抗原ESR1的突变分析
首先，通过COSMIC数据库分析ESR1的热点突变位点以及突变氨基酸，进一步分析ESR1在不同肿瘤亚型中的突变频率。最后，利用公认的表位预测网站对新抗原ESR1来源的HLA-A2限制性的CTL表位肽进行预测。以下实验例中使用的与新抗原ESR1及热点突变相关的抗原肽的信息如下表1所示，表位预测结果如下表2所示。
表1新抗原ESR1及热点突变相关的抗原肽
Figure SMS_1
通过Fmoc固相合成法制备上述突变表位肽，质谱分析并证实其分子量符合理论值。
二、新抗原ESR1及热点突变相关抗原肽特异性T淋巴细胞的体外诱导
新抗原ESR1及热点突变相关抗原肽特异性T淋巴细胞的体外诱导方法，包括以下操作：
(1)通过密度梯度离心法分离健康供者外周血单个核细胞(PBMCs)，使用RPMI-1640培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/毫升，5毫升/孔铺于6孔板中，37℃、5％CO2细胞培养箱中培养4h。
(2)培养4h后，吸取孔板中未贴壁的细胞，离心后以5×106个/毫升的浓度冻存备用。贴壁细胞使用含有1000U/mL GM-CSF和500U/mL rhIL-4的RPMI-1640完全培养基诱导分化为树突状细胞(DCs)，第5天加入LPS(100ng/mL)诱导DCs成熟。
(3)使用突变表位肽负载成熟DCs 4小时后，按照DCs：T淋巴细胞＝1：10的比例，将负载突变表位肽的成熟DCs与T淋巴细胞共培养，每周刺激1次，共刺激3次，期间每2天半量换液，同时补加细胞因子IL-2(终浓度：100U/mL)和IL-7(终浓度：10ng/mL)。三轮刺激后，收集诱导获得的细胞毒性T淋巴细胞。以负载野生型或突变表位肽的T2A2细胞、表达野生型或突变型新抗原的肿瘤细胞系(MDA-MB-231-WT/MDA-MB-231-MUT)为靶细胞，通过胞内因子染色实验和LDH乳酸脱氢酶细胞毒性实验检测，结果如图1-3所示。
三、新抗原ESR1及热点突变相关抗原肽特异性T淋巴细胞的体内诱导
新抗原ESR1及热点突变相关抗原肽特异性T淋巴细胞的体内诱导方法，包括以下操作：
(1)将6-8周龄的HLA-A2.1/Kb转基因小鼠随机分组，实验分组分别为：CpG组(CpG-ODN 1826+溶解多肽用的生理盐水)和CpG+Peptide pool组(包含8条突变表位肽SEQ IDNO：1、3、6、8、11、12、13、14以及CpG-ODN 1826)。
(2)突变表位肽采用100μg/只小鼠的剂量，CpG-ODN 1826采用30μg/只小鼠的剂量，免疫方式采用尾基根部皮下多点注射。小鼠共免疫三次，分别在第0天、第7天和第14天进行。
(3)第19天处死小鼠，获取小鼠脾脏和淋巴结，研磨并消化。随后通过已灭菌的滤网过滤细胞悬液至无菌离心管中，离心收集细胞。
(4)弃上清，加入5mL红细胞裂解液。裂解结束后使用PBS洗涤，离心收集细胞。离心结束后弃上清，用GT-T551培养基重悬细胞，调整细胞浓度为5×106个/毫升，铺入6孔板并于37℃、5％ CO2细胞培养箱中培养。
(5)第1天加入突变表位肽(Peptide pool，2.5μg/mL)和mIL-2(50U/mL)。之后隔天半量换液并补加mIL-2。诱导第5天收集诱导的肽特异性T淋巴细胞。以负载野生型或突变表位肽的T2A2细胞、表达野生型或突变型新抗原的肿瘤细胞系(MDA-MB-231-WT/MDA-MB-231-MUT)为靶细胞，通过胞内因子染色实验和LDH乳酸脱氢酶细胞毒性实验检测，结果如图4-6所示。
四、抗肿瘤活性实验
抗肿瘤活性实验方法，包括以下操作：
(1)选取6-8周龄的NOD/SCID小鼠，将MDA-MB-231-MUT肿瘤细胞悬液(5×106个细胞/只)以皮下注射的方式接种于小鼠右侧背部。待肿瘤体积生长至80-100mm3，将小鼠随机分为3组；
(2)通过尾静脉注射的方式对NOD/SCID小鼠进行3次过继回输，一周一次，回输体系均为200μL，PBS组回输PBS缓冲液，T cell组回输5×106个未经表位肽诱导过的T细胞；Induced T cell组回输5×106个由表位肽池诱导的T细胞。完成第3次过继回输5天后处死小鼠。过继回输期间每3天记录小鼠体重，使用数字卡尺对小鼠肿瘤的长、宽、高进行测量，并计算肿瘤体积V＝1/2×a(长)×b(宽)×c(高)。结果如图7所示。
五、检测方法
1、胞内因子染色实验
胞内因子染色实验方法，包括以下操作：
(1)靶细胞准备：离心收集T2细胞，将突变表位肽或者野生型表位肽以80μg/mL的终浓度负载T2细胞，37℃、5％ CO2细胞培养箱内孵育4小时。对于肿瘤细胞系，胰酶消化重悬后使用无血清培养基洗涤。离心洗涤后调整细胞密度为2×105个/毫升。
(2)突变表位肽特异性T淋巴细胞的准备：收集诱导获得的T淋巴细胞，使用无血清培养基洗涤后重悬，调整细胞密度为2×106个/毫升。
(3)将肽特异性T淋巴细胞与靶细胞按照细胞数量10：1的比例，铺于96孔U型底孔板中，37℃、5％ CO2细胞培养箱内孵育4小时。在共孵育4小时后，每孔细胞加入阻断剂BFA继续培养1小时。
(4)收集各孔细胞至1.5毫升离心管中，离心洗涤后，加入50μL稀释好的细胞表面抗体(CD3、CD8和FasL)，涡旋混匀，4℃避光孵育30min。孵育结束用PBS洗涤两次。设置空白对照组、CD3单阳组、CD8单阳组和同型对照组。
(5)每管细胞加入200μL固定剂并涡旋混匀，室温避光孵育30min。孵育结束后加入800μL已稀释的破膜剂，随后离心收集细胞。
(6)加入50μL破膜剂稀释的胞内因子抗体(IFN-γ，空白组、单阳组和同型对照组除外)，涡旋混匀后4℃避光孵育30min，孵育结束后用PBS洗涤两次。
(7)弃上清，用200μL PBS重悬细胞，流式细胞仪检测分析。
2、LDH乳酸脱氢酶细胞毒性实验
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性实验方法，包括以下操作：
(1)靶细胞准备：离心收集T2细胞，将突变表位肽或者野生型表位肽以80μg/mL的终浓度负载T2细胞，37℃、5％ CO2细胞培养箱内孵育4小时。对于肿瘤细胞系，胰酶消化重悬后使用无血清培养基洗涤。将靶细胞离心洗涤后，调整细胞密度1×105个/毫升。
(2)突变表位肽特异性T淋巴细胞的准备：收集诱导获得的T淋巴细胞，使用无血清培养基洗涤后重悬，调整细胞密度为5×106个/毫升。
(3)将肽特异性T淋巴细胞与靶细胞按照效靶比(E：T)＝12.5：1、25：1、50：1分别铺于96孔U型底孔板中。靶细胞的细胞数为5000个/孔，每孔终体积为100μL。37℃、5％ CO2细胞培养箱中共孵育4小时。
设置实验组：
靶细胞自发释放组：50μL靶细胞+50μL无血清培养基；
靶细胞最大释放组：50μL靶细胞+50μL无血清培养基+10μL裂解液；
背景对照组：100μL无血清培养基；
体积校正组：100μL无血清IMDM+10μL裂解液；
实验组：50μL靶细胞+50μL不同效靶比对应的T淋巴细胞。
(4)孵育结束前45min，在靶细胞最大释放组和体积校正组各加入10μL裂解液。抽取50μL上清至另一平底96孔板中，50μL/孔加入已稀释的底物混合液，室温避光孵育30min。50μL/孔加入终止液，去除气泡，1h内在490nm波长下检测。
六、实验结果与分析
结合表1，本发明通过COSMIC在线数据库分析，发现内分泌治疗耐药的样本中ESR1的突变率为76.06％，通过对ESR1点突变分析发现，ESR1突变主要集中在303、380、537和538四个位点，且一些肿瘤样本中同时存在两个或者两个以上的突变位点。ESR1四个突变位点能够覆盖80％以上的耐药突变样本，具有广泛的人群覆盖率，是免疫治疗的理想靶点。
表2新抗原ESR1来源的HLA-A2限制性突变表位肽的预测结果
Figure SMS_2
如表2所示，基于ESR1的四个热点突变位点K303R、E380Q、Y537S/N/C和D538G，利用Net MHC 4.0Server和IEDB在线网站进行ESR1来源HLA-A2限制性表位肽的预测，结合两个网站的预测结果，获得14条突变表位肽。
图1为新抗原ESR1来源的14条突变表位肽以荷载突变/野生型表位肽的T2A2细胞为靶细胞的胞内因子染色实验结果图。分别以荷载突变/野生型表位肽的T2A2细胞为靶细胞，以突变表位肽诱导健康供者来源的PBMCs获得的CD8+T淋巴细胞为效应细胞。从图1可以看出，SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14这8条突变表位肽能够在体外诱导产生突变表位肽特异性的CD8+T淋巴细胞，且产生的CD8+T淋巴细胞能够显著区分突变表位肽和野生型表位肽。对于E380Q位点，尽管SEQ ID NO：2与SEQ ID NO：3相比，预测亲和力较好，但是胞内因子染色结果显示SEQ ID NO：2诱导获得的CTLs中IFN-γ+CD8+T和FasL+CD8+T细胞的比例较低，且不能很好的区分荷载突变/野生型表位肽的T2A2细胞。SEQ ID NO：9与SEQ ID NO：8相比，预测亲和力较好，但是胞内因子染色结果显示SEQ ID NO：9诱导获得的CTLs中IFN-γ+CD8+T和FasL+CD8+T细胞的比例较低，且不能很好的区分荷载突变/野生型表位肽的T2A2细胞。由此可见，仅通过表位肽预测方法获得的突变表位肽，绝大多数是无法区分野生型和突变型的。对于突变表位肽相关疫苗开发，活性实验验证有效才具有实践意义。
图2为新抗原ESR1来源的8条突变表位肽体外诱导的特异性CTLs以荷载突变/野生型表位肽的T2A2细胞为靶细胞的杀伤作用实验结果图。分别以荷载突变或野生型表位肽的T2A2细胞为靶细胞，以突变表位肽诱导健康供者来源的PBMCs获得的CD8+T淋巴细胞为效应细胞，通过乳酸脱氢酶细胞毒杀伤实验来检测效应细胞对靶细胞的杀伤效率。从图2可以看出，与荷载野生型表位肽的T2A2靶细胞组相比，SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14这8条突变表位肽诱导健康供者(HLA-A2+)PBMCs获得的CTLs能够特异性杀伤负载突变表位肽的T2A2细胞，且杀伤效率随着效靶比的升高而升高，说明这8条突变表位肽具有良好的免疫原性。
图3为新抗原ESR1来源的8条突变表位肽体外诱导的特异性CTLs以肿瘤细胞系(MDA-MB-231-WT/MUT)为靶细胞的杀伤作用实验结果图。从图3可以看出，SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14这8条表位肽体外诱导产生的CD8+T淋巴细胞能够特异性杀伤过表达突变型新抗原的肿瘤细胞系MDA-MB-231-MUT，且产生的CD8+T淋巴细胞能够显著区分肿瘤细胞表面的突变表位和野生型表位。
图4-6为新抗原ESR1来源的8条CTL突变表位肽以肽池(Peptide pool)形式联合CpG-ODN 1826免疫HLA-A2.1/Kb转基因小鼠获得的特异性CTLs，以荷载突变/野生型表位肽池的T2A2细胞、荷载单条突变/野生型表位肽的T2A2细胞、肿瘤细胞系(MDA-MB-231-WT/MUT)为靶细胞的胞内因子染色实验和杀伤作用实验结果图。从图4-6可以看出，与单独CpG免疫组相比，CpG+肽池(Peptide pool)免疫组的脾脏和淋巴结中的CD8+T淋巴细胞能够特异性杀伤MDA-MB-231-MUT肿瘤细胞和荷载突变表位肽的T2A2细胞，且具有更高比例的IFN-γ+CD8+T细胞和FasL+CD8+T细胞。表明突变表位肽在体内同样具有良好的免疫原性，表位肽池(Peptide pool)体内诱导产生的CTLs，能够特异性识别和杀伤新抗原阳性的肿瘤细胞。
图7为新抗原ESR1来源的8条突变表位肽诱导获得的CTLs过继回输荷瘤的NOD/SCID小鼠的体内抗肿瘤作用实验结果图。在NOD/SCID小鼠中建立MDA-MB-231-MUT肿瘤细胞的移植瘤模型，将突变肽池体内诱导获得的CTLs过继回输到荷瘤NOD/SCID小鼠体内，探究突变肽诱导的T淋巴细胞的体内抗肿瘤活性。从图7可以看出，与PBS组和未经肽诱导的T细胞组相比，突变肽池诱导获得的CTLs能够显著抑制肿瘤的生长。
从以上实验结果可以看出，本发明通过分析COSMIC数据库、表位预测和体内外免疫活性实验，鉴定获得了新抗原ESR1来源的8条HLA-A2限制性CTL表位肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14所示。该突变表位肽来源于ESR1的高频突变，能够有效刺激、诱导产生新表位特异性的细胞毒性T淋巴细胞，特异性区分野生型和突变型序列，特异性杀伤表达突变表位的肿瘤细胞，具有良好的抗肿瘤效果。
本发明鉴定的突变表位肽的患者覆盖率高，将其制备成治疗肿瘤的药物(如肿瘤疫苗、细胞制剂等，或者使药物包含特异性识别该突变表位肽的T细胞受体、嵌合抗原受体或其编码核酸)，能够在体内外诱导产生具有肿瘤杀伤功能的突变肽特异性的CD8+T淋巴细胞，准确区分野生型和突变型，具有较好的治疗潜力和广泛的应用前景。
虽然上文中已经用一般性说明、具体实施方式及实验例对本发明的技术方案做了详尽的描述，但需要说明的是，实施例和实验例仅用于说明本发明的技术方案和技术效果，而不应视为对本发明保护范围的任何限制。基于本发明技术构思所做的简单变形、修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种新抗原ESR1来源的CTL表位肽或其编码核酸在制备治疗肿瘤的药物中的应用，其特征在于：所述新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14中任一项或多项所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为可诱导机体产生新抗原特异性T细胞克隆的治疗性肿瘤疫苗或细胞制剂；
优选地，所述治疗性肿瘤疫苗为核酸疫苗，所述核酸疫苗包含编码新抗原ESR1来源的CTL表位肽的核酸序列；或者，所述治疗性肿瘤疫苗为多肽疫苗、重组蛋白疫苗、合成长肽疫苗、混合肽池疫苗或包含抗原偶联物的疫苗，所述疫苗均包含新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列；
优选地，所述细胞制剂包含抗原提呈细胞，所述抗原提呈细胞包含新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物为可治疗新抗原ESR1阳性表达的肿瘤的细胞制剂；
优选地，所述细胞制剂包含经修饰的细胞，所述经修饰的细胞为编码T细胞受体或嵌合抗原受体的核酸转染的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞，或者，所述经修饰的细胞为修饰有T细胞受体或嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞；所述T细胞受体或嵌合抗原受体特异性识别新抗原ESR1来源的CTL表位肽。
4.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于：所述药物包含新抗原ESR1来源的CTL表位肽或其编码核酸，或者包含特异性识别新抗原ESR1来源的CTL表位肽的T细胞受体、嵌合抗原受体或其编码核酸，所述新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1、3、6、8、11、12、13、14中任一项或多项所示。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：所述药物为可诱导机体产生新抗原特异性T细胞克隆的治疗性肿瘤疫苗或细胞制剂；
优选地，所述治疗性肿瘤疫苗为核酸疫苗，所述核酸疫苗包含编码新抗原ESR1来源的CTL表位肽的核酸序列；或者，所述治疗性肿瘤疫苗为多肽疫苗、重组蛋白疫苗、合成长肽疫苗、混合肽池疫苗或包含抗原偶联物的疫苗，所述疫苗均包含新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列；
优选地，所述细胞制剂包含抗原提呈细胞，所述抗原提呈细胞包含新抗原ESR1来源的CTL表位肽的氨基酸序列。
6.根据权利要求4所述的药物，其特征在于：所述药物为可治疗新抗原ESR1阳性表达的肿瘤的细胞制剂；
优选地，所述细胞制剂包含经修饰的细胞，所述经修饰的细胞为编码T细胞受体或嵌合抗原受体的核酸转染的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞，或者，所述经修饰的细胞为修饰有T细胞受体或嵌合抗原受体的T细胞、NK细胞、NK-T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或肿瘤浸润淋巴细胞；所述T细胞受体或嵌合抗原受体特异性识别新抗原ESR1来源的CTL表位肽。
7.根据权利要求5所述的药物，其特征在于：所述药物为治疗性肿瘤疫苗时，还可包括免疫调节剂或佐剂；
优选地，所述免疫调节剂或佐剂选自聚-ICLC、1018ISS、Amplivax、铝盐、PLGA微粒子、病毒体或其他病毒样粒子、β-葡聚糖、SRL172、MF59、AS03、AS04、AS15、BCG、CP-870、CP-893、CpG7909、CyaA、环二核苷酸、dSLIM、GM-CSF、IL-2、IC30、IC31、Montanide ISA51中的一种或多种；
所述药物为细胞制剂时，还可包括靶向抗原提呈细胞的亲和肽。
8.根据权利要求5-7中任一项所述的药物，其特征在于：所述药物的剂型为药物治疗学上可接受的剂型，包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、散剂、丸剂、喷雾剂、注射用粉针剂、注射液。
9.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述药物可通过局部给药的方式施用。
10.根据权利要求8所述的药物，其特征在于：所述药物的剂量为药物治疗学上可接受的剂量。
CN202310335632.2A 2023-03-31 2023-03-31 新抗原esr1来源的ctl表位肽或其编码核酸在制备药物中的应用 Pending CN116350760A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310335632.2A CN116350760A (zh) 2023-03-31 2023-03-31 新抗原esr1来源的ctl表位肽或其编码核酸在制备药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310335632.2A CN116350760A (zh) 2023-03-31 2023-03-31 新抗原esr1来源的ctl表位肽或其编码核酸在制备药物中的应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116350760A true CN116350760A (zh) 2023-06-30

Family

ID=86941529

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310335632.2A Pending CN116350760A (zh) 2023-03-31 2023-03-31 新抗原esr1来源的ctl表位肽或其编码核酸在制备药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116350760A (zh)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9694059B2 (en) Ex vivo, fast and efficient process to obtain activated antigen-presenting cells that are useful for therapies against cancer and immune system-related diseases
CN109923121B (zh) 多肽及其应用
CN116350758B (zh) 肿瘤共享新抗原表位肽或其编码核酸在制备药物中的应用
CN110214144B (zh) 多肽及其应用
WO2017177907A1 (zh) 抗免疫检查点pd-l1和pd-l2肿瘤疫苗
CN100392074C (zh) 树突状细胞肿瘤疫苗及其制法和用途
CN109803978A (zh) 多肽及其应用
CN112972666B (zh) 个性化基因修饰肿瘤dc疫苗的制备方法
CN116350760A (zh) 新抗原esr1来源的ctl表位肽或其编码核酸在制备药物中的应用
CN109963862B (zh) 多肽及其应用
CN110167956B (zh) 多肽及其应用
CN110139875B (zh) Col14a1衍生的肿瘤抗原多肽及其应用
US11548925B2 (en) CACNA1H-derived tumor antigen polypeptide and use thereof
CN111777677A (zh) 一种egfr t790m 新抗原表位肽及其在治疗肿瘤中的应用
CN107286245B (zh) Pd-l1和pd-l2重组蛋白及其用途
CN111116728B (zh) 肿瘤特异性抗原ctl表位肽及其应用
CN110072876B (zh) 多肽及其应用
CN110191893B (zh) 多肽及其应用
WO2018098636A1 (zh) 多肽及其应用
CN114790248B (zh) MUC1-PDL1-IgG1 Fc肿瘤疫苗及其制备方法和应用
CN114805607B (zh) EGFRvIII-PDL1-GMCSF肿瘤疫苗及其制备方法和应用
CN111748017A (zh) 一种抗原多肽及其表达载体、组合药物、试剂盒和应用
CN111116734A (zh) 肿瘤相关基因c-kit突变相关抗原短肽及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination