CN116574824A - 一种血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌pcr定量检测的内参基因引物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌荧光定量内参基因的筛选及应用。本发明筛选了5个内参基因，并通过综合分析筛选到最优用于血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌荧光定量的内参基因是gyrB基因，为血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌目的基因的表达分析提供了有效的内参基因。新开发的内参基因不仅有利于提高血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌目的基因表达水平研究的稳定性和可靠性，而且对伊丽莎白菌属其它物种基因表达量校正提供了重要的候选基因资源。

Description

一种血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌PCR定量检测的内参基 因引物

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行PCR定量检测的内参基因引物，本发明还涉及一种在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行PCR定量检测的方法和试剂盒。

背景技术

米尔伊丽莎白菌是一种临床条件致病菌，可感染蛙类，导致蛙暴发性歪头病，该病传染性强，致死率高，是危害我国养殖蛙类最主要的病害之一，严重限制了我国蛙类养殖业的健康发展。研究表明，米尔伊丽莎白菌能在血液中生存和增殖，引起菌血症并导致蛙全身性感染。血清中含有多种杀菌和抑菌物质，是机体重要的免疫防线。研究血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌的响应有助于了解该菌在血清中的存活机制，为揭示米尔伊丽莎白菌的致病机理提供依据。

利用实时荧光定量PCR技术研究目的基因的表达情况是生物抗逆响应机制研究的重要手段，通常需要稳定表达的内参基因作为校正和标准化。原核生物常用的内参基因有16S rRNA、gyrB、rpoB、recA等，然而当原核生物处于不同的生长条件时，这些内参基因的表达可能发生变化，从而影响目的基因检测的准确性。因此有必要针对不同物种，筛选其在特定环境条件下稳定表达的内参基因。目前还没有米尔伊丽莎白菌在血清胁迫条件下进行PCR定量检测的内参基因。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行荧光定量检测的内参基因及其引物，所述内参基因在血清中稳定表达，检测准确性高，为研究血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌目的基因的表达提供了可靠的分析依据。

为解决上述技术难题，本发明提供如下技术方案：

根据已报道的内参基因，选择其中4个传统内参基因，16s rRNA(SEQ ID NO.1)、gyrB(SEQ ID NO.2)、rpoB(SEQ ID NO.3)、recA(SEQ ID NO.4)作为候选内参基因；同时，基于本课题组已有的米尔伊丽莎白菌的转录组数据，筛选出在不同温度下稳定表达的PYK(SEQ ID NO.5)作为候选内参基因。利用Premier 6.0软件对上述五个候选内参基因进行引物设计，引物序列长度在18-22bp，扩增的产物大小范围在120-240p。将米尔伊丽莎白菌加入黑斑蛙血清共孵育，然后提取总RNA并反转录成cDNA，利用上述引物分别进行实时荧光定量PCR检测，分析五个候选内参基因的表达稳定性。综合GeNorm分析、NormFinder软件分析和BestKeeper软件分析结果，筛选出血清胁迫条件下表达稳定性最高的gyrB作为PCR定量检测内参基因。

利用筛选到的内参基因对4个米尔伊丽莎白菌抗血清杀伤相关基因(rpoB、recQ、copB、murE)进行实时荧光定量PCR检测，结果显示4个目的基因在血清中的表达均高于培养基，从而验证了gyrB作为内参基因在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行PCR定量检测的准确性。

本发明提供的内参基因(gyrB基因)引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的反向引物。

本发明进一步提供所述的内参基因引物用于在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行PCR定量检测的用途。

本发明还提供一种用于在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行PCR定量检测的试剂盒，该试剂盒中包含所述的内参基因引物。

本发明还提供一种在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行PCR定量检测的方法，该方法包括以下步骤：提取样品总RNA并反转录为cDNA作为扩增模板，向反应体系中加入所述的内参基因引物进行实时荧光定量PCR扩增。

本发明的有益效果是：

本发明对血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌荧光定量检测的候选内参基因进行筛选，并通过综合分析得到最佳内参基因是gyrB基因，该基因在血清胁迫条件下稳定表达，准确实现了目的基因的检测，为血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌目的基因的定量表达分析提供了可靠的保障，也为今后揭示米尔伊丽莎白菌致病机理提供了可靠依据。

附图说明

图1是5个候选内参基因的实时荧光定量PCR扩增曲线。

图2是5个候选内参基因的实时荧光定量PCR溶解曲线。

图3是5个候选内参基因的实时荧光定量PCR标准曲线。

图4是5个候选内参基因在蛙血清孵育条件下基因表达的Ct值。

图5是GeNorm软件对5个候选内参基因表达稳定值(M)的排序。

图6是GeNorm软件对5个候选内参基因表达最佳内参基因数量(V值)。

图7是NormFinder软件对5个候选内参基因表达稳定值的排序。

图8是BestKeeper软件对5个候选内参基因表达稳定值的排序。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1：血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌荧光定量内参基因筛选

选择常用于原核生物RT-qPCR实验的16s rRNA(SEQ ID NO.1)、gyrB(SEQ IDNO.2)、rpoB(SEQ ID NO.3)、recA(SEQ ID NO.4)作为候选内参基因，同时基于本课题组已有的米尔伊丽莎白菌在不同温度(28℃；37℃)下的转录组数据，找到1个稳定表达的PYK(SEQ ID NO.5)作为候选内参基因(表1)。

利用Premier 6.0软件设计并合成用于实时荧光定量PCR检测的引物，利用琼脂糖胶和凝胶成像系统观察PCR产物的条带，检测产物特异性。选择条带大小正确，条带特异性好，没有引物二聚体的引物，筛选后得到的引物序列如表1所示。

表1 5对相对定量PCR的引物序列信息

实施例2：候选内参基因的表达稳定性分析

米尔伊丽莎白菌在28℃、180r/min条件下于BHI培养基中过夜培养，震荡培养至对数期后用PBS洗涤，并用PBS稀释，加入黑斑蛙血清至血清终浓度分别为10％、30％、50％共3个梯度，以未进行血清处理(0％)的病原菌作对照。共4个水平，每个水平3个重复。培养2h后，离心3min，弃去上清，用新鲜BHI培养基清洗细胞2次彻底去除血清，离心收集菌体用于后续实验。

样品使用细菌RNA快速提取试剂盒(EASYspin Plus RN43)进行RNA提取，并使用核酸蛋白仪检测RNA浓度和OD值，利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性；采用Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(Yeasen)试剂盒进行cDNA的合成。以获得的cDNA产物作为PCR扩增的模板，内参基因采用表1的引物组合，试剂为Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒。

分别对5个候选基因进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR反应总体系为20μL，包含10μL的Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix，正向引物/反向引物各0.4μL，cDNA模板1μL，灭菌蒸馏水8.2μL；

反应程序为95℃预变性30s，95℃持续10s、60℃持续30s，循环40次。循环结束后绘制溶解曲线：65℃加热至95℃，每0.5℃收集一次荧光信号；每次反应重复三次；在PCR完成后，获得相应的域值循环数，即Ct值(图4)。

通过对米尔伊丽莎白菌5个候选参考基因的qRT-PCR数据进行分析，发现3次重复的扩增曲线相对一致(图1)；溶解曲线3次重复溶解温度具有一致性，均出现单一特异峰，均为特异性扩增，符合qRT-PCR分析的引物标准(图2)；当相关系数R2≥0.99时标准曲线的线性关系较好，表明5个候选参考基因的线性整体上比较符合要求(图3)。

GeNorm软件分析：通过计算出每个内参基因表达稳定性的M值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为M值越小则内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差；软件默认值为1.5，M值小于1.5的基因可以作为内参基因使用，且M值越低表示基因越稳定。利用GeNorm分析了5个候选内参基因在米尔伊丽莎白菌血清胁迫条件下基因表达稳定性的M值，虽然geNorm会给出两个排名第一的内参基因，但根据先后顺序依次评为1分和2分。结果显示5个候选内参基因的M值最小的为gyrB；按M值对其稳定性进行排序，依次为gyrB>recA>rpoB>16s rRNA>PYK(图5)。此外，GeNorm软件分析后推荐的最佳内参基因数量为4个(图6)。

NormFinder软件分析：通过获得每个内参基因表达稳定性S值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为S值越小内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差。利用NormFinder分析了5个候选内参基因在米尔伊丽莎白菌血清胁迫条件下基因表达稳定性的S值，结果显示5个候选内参基因的S值最小的为gyrB；根据S值对其稳定性进行排序，依次为gyrB>rpoB>recA>PYK>16s rRNA(图7)。

BestKeeper软件分析：通过分析和评估每个内参基因表达的标准差(SD)值和变异系数(CV)值来筛选出稳定性较好的内参基因，判定标准为SD值和CV值越小内参基因稳定性越好，反之，则稳定性越差。利用BestKeeper分析了5个候选内参基因在米尔伊丽莎白菌血清胁迫条件下基因表达的SD值和CV值，结果显示5个候选内参基因按SD及CV值对其稳定性进行排序，依次为gyrB>rpoB>PYK>recA>16s rRNA(图8)。

综合GeNorm分析、NormFinder软件分析和BestKeeper软件分析结果，gyrB均表现最佳，该基因在米尔伊丽莎白菌血清胁迫条件下的表达稳定性高于其它候选基因，因此选用gyrB作为血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌荧光定量内参基因。

实施例3：gyrB作为血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌荧光定量内参基因的应用

米尔伊丽莎白菌在28℃、180r/min条件下于BHI培养基中过夜培养，震荡培养至对数期并用PBS洗涤后，于28℃条件下分别在BHI和50％黑斑蛙血清中培养，每组3个重复。培养2h后，离心弃上清，收集菌体用于后续实验。

样品使用细菌RNA快速提取试剂盒(EASYspin Plus RN43)进行RNA提取，并使用核酸蛋白仪检测RNA浓度和OD值，利用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性；采用Ⅲ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(Yeasen)试剂盒进行cDNA的合成。内参基因采用表2的引物组合，试剂为Hieff/>Universal Blue qPCR SYBRGreen Master Mix试剂盒。

选取本课题组筛选的3个米尔伊丽莎白菌抗血清杀伤相关基因：recQ(SEQ IDNO.16)、copB(SEQ ID NO.17)、murE(SEQ ID NO.18)作为目的基因。

以获得的cDNA产物作为PCR扩增的模板，对gyrB、copB和3个目的基因进行实时荧光定量PCR。实时荧光定量PCR反应总体系为20μL，包含10μL的 UniversalBlue qPCR SYBR Green Master Mix，正向引物/反向引物(表2)各0.4μl，cDNA模板1μL，灭菌蒸馏水8.2μL；

反应程序为95℃预变性30s，95℃持续10s、60℃持续30s，循环40次。循环结束后绘制溶解曲线：65℃加热至95℃，每0.5℃收集一次荧光信号；每次反应重复三次；在PCR完成后，获得相应的域值循环数，即Ct值。

表2 3个目的基因相对定量PCR的引物序列信息

同时以gyrB作为内参基因，计算3个目的基因(recQ、copB、murE)在BHI和血清的相对表达，结果显示3个目的基因在血清中的表达显著提高，这与我们预测的结果保持一致；以rpoB作为内参基因，计算3个目的基因(recQ、copB、murE)在BHI和血清的相对表达，结果显示只有2个目的基因(recQ、copB)在血清中的表达显著提高，而murE在BHI培养基和黑斑蛙血清中的表达水平无显著差异(表3)。

表3 3个目的基因的相对表达测定结果

注：与BHI相比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.005.

以上结果表明，gyrB作为血清胁迫条件下米尔伊丽莎白菌荧光定量内参基因可以准确为目的基因的定量表达分析提供可靠依据。

Claims (6)

1.一种用于在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行PCR定量检测的内参基因引物，其特征在于：所述内参基因为gyrB基因，用于扩增该内参基因的引物包括核苷酸序列如SEQID NO.8所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的反向引物。

2.权利要求1所述的内参基因引物用于在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行PCR定量检测的用途。

3.一种用于在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行PCR定量检测的试剂盒，该试剂盒中包含权利要求1所述的内参基因引物。

4.一种在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行PCR定量检测的方法，其特征在于包括以下步骤：提取样品总RNA并反转录为cDNA作为扩增模板，向反应体系中加入权利要求1所述的内参基因引物进行PCR扩增。

5.如权利要求4所述在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行PCR定量检测的方法，其特征在于：所述反应体系是10μL的HieffUniversal Blue qPCR SYBR GreenMaster Mix，正向引物/反向引物各0.4μL，cDNA模板1μL，灭菌蒸馏水8.2μL。

6.如权利要求4所述在血清胁迫条件下对米尔伊丽莎白菌进行PCR定量检测的方法，其特征在于：所述PCR扩增的程序是95℃预变性30s，95℃持续10s、60℃持续30s，循环40次。