CN117778631B - 可快速检测虾黄头病毒的rt-rpa引物探针组合及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种可快速检测虾黄头病毒的RT‑RPA引物探针组合及检测方法。本发明根据虾黄头病毒RNA聚合酶基因保守序列，优化得到了所述的RT‑RPA引物探针组合。该引物探针组合能特异性检测虾黄头病毒，与虾虹彩病毒等其他病毒无交叉反应；且检测限可达100 copies模板量。配合便携式荧光RPA仪，反应时间只需20分钟左右，可实现现场快速检测。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种可快速检测虾黄头病毒的RT-RPA引物探针组合及检测方法。
背景技术
虾黄头病毒（Yellow head virus，YHV）是一种对虾产业具有重大影响的病毒。它属于黄头组病毒（Taura syndrome virus，TSV）家族，主要感染对虾（特别是白对虾）的肠胃系统和其他组织。这种病毒引起的感染可导致虾苗和成虾的死亡率极高，给养殖业带来严重的经济损失。
及早发现和确诊YHV感染可以在养殖过程中采取控制措施——包括隔离感染区域、采取合适的治疗方法，以减少病害的传播和扩散，将有利于保护虾类养殖的健康发展。同时，通过准确的YHV检测，也可以提前检测并排除感染病毒的虾苗，确保种苗的质量和健康性，为虾养殖提供健康的种源，进而提高养殖效益。此外，YHV感染不仅对虾类养殖业有害，还可能对其他水生动物和环境造成威胁。因此，检测和监控YHV也有助于保护其他水生生物的健康和生态平衡。
在YHV的实际检测中，当前较为常见的技术为RT-PCR和荧光RT-PCR，但其反应时间较长，RT-PCR需要2小时左右才能完成全部反应，荧光RT-PCR也需要1～1.5小时左右。而且，其均无法实现现场检测，RT-PCR需要PCR仪、电泳仪和凝胶成像仪；荧光RT-PCR需要荧光PCR仪。这些仪器都比较昂贵，且只能在实验室使用，无法用于样品的现场检测。
在CN107828915A公开了一种虾黄头病毒(YHV)RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒，并提到该试剂盒特异性强，检测灵敏度高，可达到0.10fg/μLL，整个扩增只需20-30min即可完成。但是将该试剂盒应用于实际检测中时，扩增效果不够稳定，仍然会出现非特异性扩增，且其核酸扩增效率也存在进一步改进空间。此外，“fg/μL”一般用来表示样品总核酸的质量浓度，而样品总核酸中包含YHV核酸和宿主本身所具有的其他核酸，由于无法确认YHV核酸在不同样品总核酸所占的比例，因此使用fg/μL这一单位表示检测限也不够准确，无法在检测限方面为实际应用提供指导意义。
重组酶聚合酶等温扩增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）技术是近年来基于重组聚合酶开发出的新型核酸恒温扩增技术。其原理为重组酶与引物结合形成蛋白-DNA复合物，能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与单链DNA结合蛋白（SSB）结合，防止进一步替换。该方法反应时间可进一步减少到30分钟以内，非常适合病原的现场快速检测。目前RPA技术在病原检测领域得到广泛研究发展，已有猪瘟病毒、非洲马瘟病金黄色葡萄球菌等病原的RPA检测技术报道，但在水生动物病原检测领域研究较少。
发明内容
本发明首先提供一种RT-RPA引物探针组合，其用于检测虾黄头病毒（YeIIow headvirus,YHV），其含有上游引物、下游引物及探针，其中，所述上游引物的核苷酸序列如下所示：
5'- CCTGCGCATCTATCTATCCACATGAAGAC -3'；
所述下游引物的核苷酸序列如下所示：
5'- GTGTCTGCTCCTGTACCGATGTCAATGTTG -3'；
所述探针经修饰后的核苷酸序列如下所示：
5'- CACCAACCTACTTTCGACTCCTATCTCAACT /荧光基团-dT/C/无碱基间隔物//荧光淬灭基团-dT/ GCTTGTCACAGAGCG /烷基碳间隔物/-3'。
进一步的，本发明还提供所述的RT-RPA引物探针组合在制备试剂或试剂盒中的应用，其中，所述试剂或试剂盒被应用于以下至少一方面：
1）用于检测虾黄头病毒（YeIIow head virus,YHV）；
2）用于诊断或辅助诊断与虾黄头病毒（YeIIow head virus,YHV）感染相关的疾病。
进一步的，本发明还提供一种试剂，其含有所述的RT-RPA引物探针组合。
进一步的，本发明还提供一种试剂盒，其含有所述的RT-RPA引物探针组合或所述的试剂。
进一步的，本发明还提供一种非诊断目的检测虾黄头病毒（YeIIow head virus,YHV）的方法，其包括：使用所述的RT-RPA引物探针组合、或所述的试剂、或所述的试剂盒，对待测样品的核酸进行荧光RT-RPA，而后对反应产物进行分析。
本发明根据虾黄头病毒RNA聚合酶基因保守序列，优化得到了所述的RT-RPA引物探针组合。该引物探针组合能特异性检测虾黄头病毒，与虾虹彩病毒等其他病毒无交叉反应；且检测限可达100 copies模板量。配合便携式荧光RPA仪，反应时间只需20分钟左右，可实现现场快速检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例中筛选5对引物探针的检测结果，图中，N为阴性对照的扩增曲线，1~5分别依次为采用F1/R1/P1、F2/R2/P2、F3/R3/P3、F4/R4/P4、F5/R5/P5进行荧光RT-RPA扩增的扩增曲线。
图2为本发明实施例中虾黄头病毒荧光RT-RPA检测方法的特异性结果，图中，1为虾黄头病毒（YHV）的扩增曲线，2~7分别为中华鳖虹彩病毒（STIV）、虾虹彩病毒（SHIV）、鲫造血器官坏死病毒（GFHNV）、锦鲤疱疹病毒（KHV）、流行性造血器官坏死病毒（EHNV）和虾肝肠胞虫（EHP）的扩增曲线。
图3为本发明实施例中虾黄头病毒荧光RT-RPA检测方法的检测限；图中，1~7依次分别为：模板量10 copies、100 copies、103copies、104copies、105copies、106copies、107copies的扩增曲线。
图4为本发明实施例中的重复性检测结果；图中，N为阴性对照的扩增曲线，1~3分别为3次重复试验的扩增曲线。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
本发明中涉及浓度数值，其含义包括在一定范围内的波动。比如，可以在相应的精度范围内波动。比如2%，可以允许±0.1%范围内波动。对于数值较大或无需过于精细控制的数值，还允许其含义包括更大波动。比如100mM，可以允许±1%、±2%、±5%等范围内的波动。涉及分子量，允许其含义包括±10%的波动。
本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。
本发明中，“任选地”、“任选的”、“任选”、“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“任选”或“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“任选”或“可选”各自独立。
本发明中，术语“RT-RPA”指反转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcription-Recycling Polymerase Amplification），是一种用于快速检测病原体核酸的技术，其原理是利用逆转录酶将RNA模板转录成互补的DNA，然后利用聚合酶在特定温度下进行连续扩增产生大量的目标DNA段。
本发明涉及一种RT-RPA引物探针组合，其用于检测虾黄头病毒（YeIIow headvirus,YHV），其含有上游引物、下游引物及探针，其中，所述上游引物的核苷酸序列如下所示：
5'- CCTGCGCATCTATCTATCCACATGAAGAC -3'；
所述下游引物的核苷酸序列如下所示：
5'- GTGTCTGCTCCTGTACCGATGTCAATGTTG -3'；
所述探针经修饰后的核苷酸序列如下所示：
5'- CACCAACCTACTTTCGACTCCTATCTCAACT /荧光基团-dT/C/无碱基间隔物//荧光淬灭基团-dT/ GCTTGTCACAGAGCG /烷基碳间隔物/-3'。
本发明发现，上述引物探针组合能明显改善对虾黄头病毒的RT-RPA检测效果，具有高度的特异性，且能确保在等温条件下的高效性能。
在一些实施方式中，所述荧光基团-dT选自iFAM（Fluorescein amidite）-dT、iHEX（Hexachloro-fluorescein）-dT、iTET（Tetrachlorofluorescein）-dT、iCyanine dye（菁类染料）-dT、iROX（Carboxy-X-rhodamine）-dT、iTexas Red（德克萨斯红）-dT中的一种。
在一些实施方式中，所述荧光淬灭基团-dT选自iBHQ（Black Hole Quencher）-dT、iIowa Black-dT、iBBQ（Blackberry Quencher）-dT中的一种。
在一些实施方式中，所述无碱基间隔物选自idSp、iSp9、iSp18中的一种。
在一些实施方式中，所述烷基碳间隔物选自iSpC3、iSpC6、iSpC12中的一种。
在一些实施方式中，所述荧光基团-dT为i6FAM-dT；和/或，所述荧光淬灭基团-dT为iBHQ1-dT；和/或，所述无碱基间隔物为idSp；和/或，所述烷基碳间隔物为iSpC3。这样能够进一步改善检测效果。
在一些优选的实施方式中，所述探针经修饰后的核苷酸序列如下所示：
CACCAACCTACTTTCGACTCCTATCTCAACT/i6FAMdT/C/idSp//iBHQ1dT/GCTTGTCACAGAGCG/iSpC3/。
进一步的，本发明还提供所述的RT-RPA引物探针组合在制备试剂或试剂盒中的应用，其中，所述试剂或试剂盒被应用于以下至少一方面：
1）用于检测虾黄头病毒（YeIIow head virus,YHV）；
2）用于诊断或辅助诊断与虾黄头病毒（YeIIow head virus,YHV）感染相关的疾病。
在一些实施方式中，所述与虾黄头病毒（YeIIow head virus,YHV）感染相关的疾病包括但不限于虾黄头病（Yellow Head Disease，YHD）、黄头病综合征（Yellow headdisease syndrome，YHDS）。
进一步的，本发明还提供一种试剂，其含有所述的RT-RPA引物探针组合。
进一步的，本发明还提供一种试剂盒，其含有所述的RT-RPA引物探针组合或所述的试剂。
在一些实施方式中，所述试剂盒还含有选自逆转录酶、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、NTPs、镁离子、阳性标准品中的至少一种。
在一些实施方式中，所述阳性标准品含有如SEQ ID No.16所示的序列。
在一些实施方式中，所述试剂盒还含有直径为1.5~1.6mm的钢珠。在一些具体的实施方式中，所述钢柱的直径为1.588mm。通过添加该尺寸的钢珠，能够在不影响反应效果的同时，进一步提高核酸扩增效率。
在一些具体的实施方式中，所述阳性标准品为虾黄头病毒RNA。
在一些具体实施方式中，所述试剂盒还含有选自如下组分中的至少一种：
-螯合剂（Chelating agent）：如EDTA，用于结合金属离子，以避免对酶活性的抑制；
-缓冲剂（Buffering agent）：用于维持适宜的反应酶活性和稳定性的酸碱平衡；
-钾离子（Potassium ions）：作为聚合链式反应（RPA）酶的催化剂和反应条件的调节剂；
-都醌类化合物（Quencher compound）：在反应开始之前，通过抑制酶活性，以避免非特异性扩增的发生；
-蛋白质酶抑制剂（Proteinase inhibitor）：抑制可能存在的核酸酶，以保护RNA/DNA模板和扩增产物的完整性；
-辅酶（Cofactors）：提供酶活性所需的辅助因子。
本发明中所提到的试剂盒中的其他组分均可以通过市售途径获得，其可以单独或组合的形式提供于多个或一个试剂中。
进一步的，本发明还提供一种非诊断目的检测虾黄头病毒（YeIIow head virus,YHV）的方法，其包括：使用所述的RT-RPA引物探针组合、或所述的试剂、或所述的试剂盒，对待测样品的核酸进行荧光RT-RPA，而后对反应产物进行分析。
在本发明的一种典型的检测虾黄头病毒（YeIIow head virus,YHV）的方法中，引物探针与重组酶结合形成蛋白-DNA复合物，复合物定位了同源序列，就会发生链交换反应形成并启动DNA合成，对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与单链DNA结合蛋白(SSB)结合，防止进一步替换。
在一些优选的实施方式中，每50μL反应体系中含有12±2 pmoL的上游引物、12±2pmoL的下游引物以及6±1 pmoL的探针。
在一些优选的实施方式中，每50μL反应体系中含有1颗直径为1.5~1.6mm的钢珠。
在一些优选的实施方式中，反应温度为42±1℃。
通过进一步优化反应体系和/或反应温度，进一步优化检测效果，加强了特异性，同时也降低了检测限。
在一些优选的实施方式中，反应时间为20±2min。
在一些具体的实施方式中，每隔一段时间（如20~40s）采集一次荧光基团对应通道的荧光值。
在一些具体的实施方式中，所述对反应产物进行分析具体包括：根据是否出现扩增曲线（当试剂盒中含有阳性标准品时，可以根据是否出现与阳性标准品相同或相近的扩增曲线），分析待测样本中是否含有虾黄头病毒；出现相应的扩增曲线表示待测样本含有虾黄头病毒，表现为阳性结果；不出现扩增曲线或扩增曲线低于检测阈值表示待测样本中未检测到虾黄头病毒，表现为阴性结果。
实施例
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
1.RT-RPA引物探针组合的优化
本实施例根据虾黄头病毒RNA聚合酶基因保守序列，设计了多条荧光RT-RPA引物探针，设计好引物和探针后，通过BLAST比对确定其特异性，然后再用于后续试验筛选，引物和探针具体序列如表1所示。
表1引物及探针序列
2. 反应体系和反应条件
使用安普未来RNA恒温快速扩增试剂盒（荧光型）配制反应体系，如下表2所示：
表2 反应体系
其中，反应缓冲液和启动缓冲液为安普未来RNA恒温快速扩增试剂盒（荧光型）中的试剂，反应缓冲液主要成分：逆转录酶，重组酶，单链结合蛋白，链置换DNA聚合酶，Tris-HCl，NTPs，BSA，DMSO，DTT等。启动缓冲液为含有Mg2+的溶液。
在每个反应体系中加入1颗直径1.588mm钢珠。
使用恒温荧光检测仪（型号：WL-16-II）运行扩增程序。
反应条件：恒温42℃；每30 s采集一次FAM通道荧光值，反应时间20 min。
3. 检测效果
（1）引物和探针筛选
分别采用表1中5对引物探针组合进行荧光RT-RPA扩增，以虾黄头病毒（YHV）RNA为模板。扩增结果见图1及表3，该结果显示：F-1、R-1和P-1所组成的引物探针组合CT值最低，荧光强度最高，可产生明显的荧光曲线。其余4对引物探针荧光强度较低，且荧光曲线线性不好。
表3 引物探针筛选结果
因此，本发明采用F-1、R-1和P-1所组成的引物探针组合。该引物探针组合所对应的目标序列（SEQ ID No.16，190bp）如下：
CCTGCGCATCTATCTATCCACATGAAGACATGACAATTCATCAGTACAAAGAAGCATTCGCACTCTACACTACAGAATTGAACACAGAAGTCACTCTCAAACACCAACCTACTTTCGACTCCTATCTCAACTTCATGCTTGTCACAGAGCGTCACAACATCAACATTGACATCGGTACAGGAGCAGACAC。
（2）特异性检测
采用表1中F-1、R-1和P-1所组成的引物探针组合及前述提到的“2.反应体系和反应条件”，分别以中华鳖虹彩病毒（STIV）、虾虹彩病毒（SHIV）、鲫造血器官坏死病毒（GFHNV）、锦鲤疱疹病毒（KHV）、流行性造血器官坏死病毒（EHNV）和虾肝肠胞虫（EHP）的核酸作为模板，进行荧光RT-RPA扩增，以虾黄头病毒（YHV）RNA为阳性对照。扩增结果见图2，该扩增结果显示：所建立的检测方法只在虾黄头病毒（YHV）RNA为模板时才显示阳性，与其他病毒无交叉反应。
（3）检测限检测
采用表1中F-1、R-1和P-1所组成的引物探针组合及前述提到的“2.反应体系和反应条件”，将含有目标序列的重组质粒10倍梯度稀释，以每稀释度的重组质粒溶液作为模板，进行荧光RPA扩增，以水为阴性对照。扩增结果见表4和图3，扩增结果显示：模板量为100copies，检测结果仍然为阳性；模板量为10 copies，扩增曲线很弱，判定为阴性。因此本发明所建立的虾黄头病毒荧光RPA检测方法的检测限为100 copies的模板量。
表4 检测限扩增结果
（4）重复性检测
采用104稀释浓度的重组质粒为模板，同时采用表1中F-1、R-1和P-1所组成的引物探针组合，按“2.反应体系和反应条件”进行RPA试验，重复检测三次分析其稳定性。重复性检测结果如图4和表5所示，可见3次重复实验检测结果一致，在相同位置均可观察到相对应的荧光曲线，说明本例RT-RPA方法重复性良好。
表5 重复性实验扩增结果
（5）样品检测
采用表1中F-1、R-1和P-1所组成的引物探针组合，按“2.反应体系和反应条件”对本实验室保存的20份对虾样品（采集于北京、河北、广东等地）进行检测，并设置阳性对照和阴性对照。同时，采用行业标准推荐的RT-PCR法同步对20份对虾样品进行检测。其中，各样品均采用市售核酸释放剂快速提取RNA后直接进行检测。
样品检测结果显示，采用本发明的引物和探针对20份对虾样品进行RT-RPA检测，阳性对照出现荧光扩增曲线，阴性对照无扩增曲线出现，2份样品检测结果为阳性，18份样品检测结果为阴性，与行业标准推荐的RT-PCR法检测结果相同。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (12)
1. 一种RT-RPA引物探针组合，其用于检测虾黄头病毒（YeIIow head virus），其含有上游引物、下游引物及探针，其中，
所述上游引物的核苷酸序列如下所示：
5'- CCTGCGCATCTATCTATCCACATGAAGAC -3'；
所述下游引物的核苷酸序列如下所示：
5'- GTGTCTGCTCCTGTACCGATGTCAATGTTG -3'；
所述探针经修饰后的核苷酸序列如下所示：
5'-CACCAACCTACTTTCGACTCCTATCTCAACT /荧光基团-dT/C/无碱基间隔物//荧光淬灭基团-dT/GCTTGTCACAGAGCG /烷基碳间隔物/-3'。
2.根据权利要求1所述的RT-RPA引物探针组合，其中，
所述荧光基团-dT选自iFAM-dT、iHEX-dT、iTET-dT、iCyanine dye-dT、ROX-dT、iTexasRed-dT中的一种；
和/或，所述荧光淬灭基团-dT选自iBHQ-dT、iIowa Black-dT、iBBQ-dT中的一种；
和/或，所述无碱基间隔物选自idSp、iSp9、iSp18中的一种；
和/或，所述烷基碳间隔物选自iSpC3、iSpC6、iSpC12中的一种。
3.根据权利要求1所述的RT-RPA引物探针组合，其中，所述探针经修饰后的核苷酸序列如下所示：
5’-CACCAACCTACTTTCGACTCCTATCTCAACT/i6FAMdT/C/idSp//iBHQ1dT/GCTTGTCACAGAGCG/iSpC3/-3’。
4.权利要求1~3中任一项所述的RT-RPA引物探针组合在制备试剂或试剂盒中的应用，其中，所述试剂或试剂盒被应用于以下至少一方面：
1）用于检测虾黄头病毒；
2）用于诊断或辅助诊断与虾黄头病毒感染相关的疾病。
5.一种试剂，其含有权利要求1~3中任一项所述的RT-RPA引物探针组合。
6.一种试剂盒，其含有权利要求1~3中任一项所述的RT-RPA引物探针组合或权利要求5所述的试剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其还含有选自逆转录酶、结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白、链置换DNA聚合酶、NTPs、镁离子、阳性标准品中的至少一种；
其中，所述阳性标准品含有如SEQ ID No.16所示的序列。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其还含有直径为1.5~1.6mm的钢珠。
9.一种非诊断目的检测虾黄头病毒的方法，其包括：
使用权利要求1~3中任一项所述的RT-RPA引物探针组合、或权利要求5所述的试剂、或权利要求6~8中任一项所述的试剂盒，对待测样品的核酸进行荧光RT-RPA，而后对反应产物进行分析。
10. 根据权利要求9所述的非诊断目的检测虾黄头病毒的方法，其中，每50μL反应体系中含有12±2pmoL的上游引物、12±2 pmoL的下游引物以及6±1 pmoL的探针。
11.根据权利要求9或10所述的非诊断目的检测虾黄头病毒的方法，其中，每50μL反应体系中含有1颗直径为1.5~1.6mm的钢珠。
12.根据权利要求9所述的非诊断目的检测虾黄头病毒的方法，其中，反应温度为42±1℃，反应时间为20±2min。
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