CN113881683A - 一种飞蝗zen基因dsRNA及其应用 - Google Patents

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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
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    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

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Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于飞蝗zen基因片段合成的dsRNA及其在提高丁醚脲防治飞蝗效果中的应用。一种飞蝗zen基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示的序列。一种两端均融合有T7启动子的所述飞蝗zen基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示的序列。本发明将一种基于飞蝗zen基因片段合成的dsRNA，用显微操作系统将该dsRNA注射入飞蝗新生卵中，可检测到飞蝗zen基因的mRNA表达水平下降，同时将丁醚脲对飞蝗卵的致死率提高至12.78倍。

Description

一种飞蝗zen基因dsRNA及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于飞蝗zen基因片段合成的 dsRNA及其在提高丁醚脲防治飞蝗效果中的应用。
背景技术
飞蝗(Locusta migratoria)是一种重要的作物害虫，昆虫纲，俗名蚂蚱。蝗虫是农、林、牧业生态系统的重要组成部分，不少有害蝗种对农、林、牧业可造成不同程度危害。大发生时可严重危害牧草和农作物并直接影响农牧业的发展。根据我国几千年来史籍的记载，造成农业上毁灭性灾害的蝗虫，主要就是飞蝗，并认为干旱与飞蝗同年发生的机遇率或相关性最大，其次为前一年干旱以及先涝后旱，蚂蚱成片；蝗虫灾害与水、旱灾害常此起彼伏，交替发生，一直是严重威胁我国农业生产、影响人民生活的三大自然灾害。2020年9月15日，飞蝗被农业农村部列入一类农作物病虫害名录。目前主要防治措施是使用农药。昆虫卵具有形态小、相对静止、发育周期长和防治所需农药较少等特点，是早期害虫防治的理想阶段。其早期胚胎发育和干燥适应机制相关研究，可为早期害虫防治靶标研究提供基础。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指内源或外源双链RNA，在诱导沉默复合物与Dicer酶的作用下，专一性的诱导靶基因表达沉默的现象。由于RNA 干扰可以有效沉默分子靶标基因，且对环境和高等动物安全，所以该技术被广泛地应用于生物学中特定基因功能的研究。
Zerknüllt基因是有翅昆虫中起源的Hox3基因的同源基因，其简写为zen。 zen在部分完全变态类鞘翅目、双翅目和渐变态类半翅目中参与浆膜形成、形态变化和浆膜表皮形成，飞蝗是低等渐变态类直翅目昆虫，其卵具有完整的浆膜和浆膜表皮；飞蝗仅有1个zen基因，分别参与浆膜细胞多核化、浆膜表皮形成和表皮几丁质合成酶基因表达等多个过程。
丁醚脲是一种具有触杀、胃毒、内吸和熏蒸作用得新型硫脲类高效杀虫杀螨剂，且具有一定的杀卵效果，对蔬菜上已产生严重抗药性的害虫具有较强的活性。脲类农药可抑制浆膜表皮的形成，对进行RNAi后的卵使用农药可显著提高飞蝗卵的死亡率。
根据以上技术可研究飞蝗zen基因在胚胎早期发育阶段对浆膜形成的影响，在飞蝗胚胎中注射zen基因的dsRNA后，可干扰zen的表达，抑制细胞多核化基因fizzy-related(fzr)的表达，使得胚胎出现多核化浆膜细胞未形成和小体积的浆膜细胞显著增多的表型；同时飞蝗zen基因抑制几丁质合成酶CHS1的表达，诱发浆膜表皮形成受阻的表型，最终抑制了胚胎早期发育过程；对注射了飞蝗zen 基因的dsRNA的卵进行丁醚脲浸泡，导致飞蝗致死率提高。根据飞蝗zen基因片段合成的dsRNA及其应用而进行的一系列研究，不仅能获得飞蝗早期发育关键基因和调控机制，而且能为害虫早期防治提供科学依据和理论参考。
发明内容
本发明针对上述问题提供了一种飞蝗zen基因dsRNA及其应用。
为达到上述目的本发明采用了以下技术方案：
本发明提供的一种飞蝗zen基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1 所示的序列。该基因核苷酸序列是通过生物信息学分析法获得，首先通过blastx 软件对飞蝗转录组数据库进行比对与注释，再通过搜索转录组注释数据库，获得飞蝗zen基因的待定核苷酸序列，再用Primer软件设计全长上游引物SEQ ID NO：2和全长下游引物SEQ ID NO：3；以飞蝗胚胎cDNA为模板，通过PCR 扩增获得一条长度为1587bp的DNA片段；将经过琼脂糖凝胶电泳分离，胶回收试剂盒纯化后的PCR产物与Pet-32a载体连接，热激法转入Trans1-T1感受态细胞，在琼脂平板挑取菌落，在含有氨苄霉素抗性的LB液体培养基中培养12 小时后，送上海生工公司测序；测序获得飞蝗zen基因全长为1587bp，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。
本发明提供一种飞蝗zen基因编码的氨基酸序列，该氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示的序列；该氨基酸序列的获得是根据三联密码子原则，将SEQ ID NO： 1通过Translatetool软件翻译为相应的氨基酸，并通过ProtParam软件对其相对分子量和等电点进行预测，预测结果表明飞蝗zen基因编码528个氨基酸，蛋白预测相对分子量为57.3KD，理论等电点为6.05。采用SMART在线软件对其功能域进行预测，结果显示飞蝗zen基因含有HOX结构域。
本发明提供一种两端均融合有T7启动子序列的飞蝗zen基因片段，以及基于该片段合成的dsRNA和基于该片段合成的dsRNA在提高丁醚脲防治飞蝗卵效果中的应用；基于飞蝗zen基因序列，设计5’端含有T7启动子的上游引物 SEQ ID NO：5和5’端含有T7启动子的下游引物SEQ ID NO：6，以飞蝗DNA 为模板，通过PCR反应扩增获得目的片段SEQ ID NO：7；将该目的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段切割回收，胶回收试剂盒纯化后，用T7RNA聚合酶体外转录试剂盒合成dsRNA；之后利用显微操作系统将该dsRNA注射入飞蝗新生卵种，检测飞蝗zen基因的mRNA表达水平的下降程度，浆膜细胞多核化和浆膜形成受阻，影响浆膜表皮形成和CHS1表达，以及该dsRNA提高丁醚脲对飞蝗卵防治效果的能力。
本发明的有益成果：将一种基于飞蝗zen基因片段合成的dsRNA，用显微操作系统将该dsRNA注射入飞蝗新生卵中，可检测到飞蝗zen基因的mRNA表达水平下降，同时将丁醚脲对飞蝗卵的致死率提高至12.78倍。
附图说明
图1为分别在飞蝗新生卵中注射飞蝗zen基因的dsRNA和dsGFP后，培养发育2d后检测发现实验组中飞蝗zen基因的表达水平显著降低。
图2为分别在飞蝗新生卵中注射飞蝗zen基因的dsRNA和dsGFP后，通过利用品红染色飞蝗胚胎，可以清晰的看到在dsGFP组中有多核化浆膜细胞形成，而在注射飞蝗zen基因的dsRNA中出现大量小体积而未多核化的浆膜细胞和多核化浆膜细胞未形成的表型(黑色箭头所指)，造成浆膜形成受阻，由此推测飞蝗zen基因可能在浆膜形成的不同阶段行使不同功能，可能具有精确的调控模式。
图3为分别在飞蝗新生卵中注射飞蝗zen基因的dsRNA和dsGFP后，用 50％的次氯酸钠清洗处理，与dsGFP相比，两个实验组均有胚胎外膜破裂，内容物流出，表明飞蝗zen基因影响浆膜表皮形成。
图4为分别在飞蝗新生卵中注射飞蝗zen基因的dsRNA和dsGFP后，发育至4d时，使用50％的次氯酸钠清洗处理后，实验组与对照组胚胎外膜破裂的比例，表明飞蝗zen基因影响浆膜表皮形成。
图5为分别在飞蝗新生卵中注射飞蝗zen基因的dsRNA和dsGFP后，对部分注射飞蝗zen基因的dsRNA和dsGFP后的卵使用200ng/μL丁醚脲处理后，各组卵的死亡率。
具体实施方式
为了进一步阐述本发明的技术方案，下面通过实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1：飞蝗zen基因的全长cDNA获得以及氨基酸序列预测。
1.飞蝗zen基因的生物信息学搜索。
用Formatdb程序将飞蝗转录组Unigene序列转化为比对数据库，通过blastx 软件将比对数据库与非冗余蛋白数据库进行逐条比对注释，搜索注释结果获得飞蝗仅有1个zen基因。经过序列分析及比对后，获得飞蝗zen基因的待定序列。
2.飞蝗zen基因的全长cDNA获得。
采用primer premier5.0软件设计全长上游引物(SEQ ID NO：2)和全长下游引物(SEQ ID NO：3)。将设计好的引物发往生工生物工程(上海)有限公司合成。利用Trizol试剂盒提取提取飞蝗卵的总RNA；采用Oligotex mRNA Mini Kit提取试剂盒和RevertAidTM HMinus Reverse Transcriptase逆转录酶反转录合成cDNA，从而获得PCR反应所需模板。经PCR后，将得到的产物进行纯化、克隆转化到大肠杆菌中，然后采用质粒小提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取质粒后，送生工生物工程(上海)股份有限公司送去测序。结果分析后，获得飞蝗zen基因的cDNA全长序列，其序列为SEQ ID NO:1.
3.飞蝗zen基因的氨基酸序列预测。
采用Translate tool对飞蝗zen基因所编码的氨基酸进行预测，结果表明飞蝗zen基因编码528个氨基酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5所示的序列，预测相对分子量为57.3KD，理论等电点为6.05；采用SMART在线软件对其功能域进行预测，结果显示飞蝗zen基因含有HOX结构域。
实施例2：飞蝗zen基因的dsRNA合成。
1.飞蝗zen基因dsRNA合成所需模板制备。
基于测序获得的飞蝗zen基因的DNA序列SEQ ID NO：1，采用Oligo软件设计一对合成dsRNA所需引物；所示序列(SEQ ID NO:5)和(SEQ ID NO:4)，dsRNA合成所需上下游引物均含有T7启动子；将设计好的dsRNA引物送往生工生物工程(上海)股份有限公司。
2.飞蝗zen基因片段dsRNA的合成。
基于上述制备的用于合成dsRNA的模板，采用T7 RiboMAXTM Express RNAiSystem(Promega)试剂盒说明，通过T7 RNA聚合酶体外转录合成dsRNA。然后采用NaNoDrop2000测定其合成的dsRNA浓度，最终使其浓度达到1.0 μg/μL，置于-20℃的冰箱中备用。
实施例3：飞蝗zen基因的dsRNA影响浆膜表皮形成和LmCHS1表达。
通过分别在飞蝗新生卵中注射飞蝗zen基因的dsRNA和dsGFP，培养发育 2d后检测发现实验组中zen基因的表达水平显著降低。通过表型观察发现浆膜胚胎形态均有发生异常，推测飞蝗zen基因通过影响浆膜形成进而对胚胎发育造成影响。用50％的次氯酸钠清洗处理，与dsGFP相比，两个干扰组均有胚胎外膜破裂，内容物流出，表明飞蝗zen基因影响浆膜表皮形成。
实施例4：飞蝗zen基因的dsRNA影响胚胎生长。
通过在飞蝗新生卵中注射飞蝗zen基因的dsRNA和dsGFP，在培养箱中培养4d后对部分注射飞蝗zen基因的dsRNA和dsGFP后的卵使用200ng/μL丁醚脲处理，继续在培养箱中培养12h后，统计丁醚脲对飞蝗卵的致死率；结果如图5所示：农药处理后的组均有胚胎外膜破裂，内容物流出，表明注射飞蝗zen 基因的dsRNA后进行农药处理可将丁醚脲对飞蝗卵的致死率提高至12.78倍。
以上显示和描述了本发明的主要特征和优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 山西大学
<120> 一种飞蝗zen基因dsRNA及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1587
<212> DNA
<213> 飞蝗(Locusta migratoria)
<400> 1
atggcctctg cagaggtggc ctacttcgcg caggactctt accagtacag gatggactgg 60
cagccggcgc cggaacacca gcaccaggtg caccagtacc aacaacagct gcacgagcag 120
caccagcaac acctgcagct gcaacagcac gcgcacctgg cggcgaacgc ggcagccagc 180
ccgctggtcg cgggcggcgc cggaggctgc aacaacgtaa acaacggcgg cggcaacaac 240
agcgacgacg agaacaacgc gccggccgcg ctcgacaacg gcagcagcac cagcagcgga 300
ggcagcggca gcgcgggcgg agaccgcaac aacctcgtca ccgtcgtttc cttcaccgac 360
ctgcagcagc gcaacgccga gtacgcgaac catatatctg caagctcgat tgcgacgtcg 420
ttgggccgtg tcagcttgtc cgccaccagc ctcatcaaca cgcactctgt ggaggccctg 480
aagccgccag ctccttccag tagccgcagc gtcagagcgg tgacgaccgt cacttcgtcg 540
agccaggcga caccgtcgac cagtgcggcc cccacgatca gcaagcgggc gaggacggcg 600
tacacgtcgc agcagctgat agagctcgag aaggagttca gtatcaacaa gtacctctgt 660
cgccctcggc gcatcgagct ggcggctcag ttgggtctga ccgagcgcca gattaaaata 720
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gtcgaggcat cagtcagtga tcaggagcga acgactcacc gccgcccacc atccgtgcgc 840
aacacgctcc cccagcagaa aagcgcgtct tcgccgcccc tccaaggccc agtcgtctcg 900
gggccgtcag ctgccctatg tgcccccatg ccaacagtag ttggaggtgg tgccggatgt 960
actctagacg gataccagaa ccctggtcca gaatttaatg agctgttggc gatgcacaag 1020
cccctcaatc agacaccaca tatatcgccc gaccttctag caccgcacaa actaacccac 1080
cagtcgccat ccatttcacc tccggaacag atgaatccga actatgcacc agccgagaca 1140
ttagacgcct cttcgattta tgcacagcaa cagatgcagt acgattactc gctggcactg 1200
ccgaatatgt cccaggacag attgccccag taccagatgc aagccacgcc accgctctac 1260
cacgcgcctt acccgtcgat gttgccaggt ggttactcgc agaccgacga cttcctgtcg 1320
gtgctaccca gttcttcgat ggaccaaggt caagatgtca aaccacattt ggtgcacaag 1380
atggaacctc ccgaagcgta tcaggagcct tcacattcgg gctcagtaac gaaaggagat 1440
gagtacctgc cggcgtacaa gcaggagatg tactgggatc accaacagca gtgcccgcca 1500
ccaccctcgt atccggacaa ctatgccgag aataacagtg gtgctcctta ctcgactgtg 1560
tcaccaccga gcttaacaga attgtaa 1587
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcctctg cagaggtgg 19
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccgagctt aacagaattg taa 23
<210> 4
<211> 528
<212> PRT
<213> 飞蝗(Locusta migratoria)
<400> 4
Met Ala Ser Ala Glu Val Ala Tyr Phe Ala Gln Asp Ser Tyr Gln Tyr
1 5 10 15
Arg Met Asp Trp Gln Pro Ala Pro Glu His Gln His Gln Val His Gln
20 25 30
Tyr Gln Gln Gln Leu His Glu Gln His Gln Gln His Leu Gln Leu Gln
35 40 45
Gln His Ala His Leu Ala Ala Asn Ala Ala Ala Ser Pro Leu Val Ala
50 55 60
Gly Gly Ala Gly Gly Cys Asn Asn Val Asn Asn Gly Gly Gly Asn Asn
65 70 75 80
Ser Asp Asp Glu Asn Asn Ala Pro Ala Ala Leu Asp Asn Gly Ser Ser
85 90 95
Thr Ser Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ala Gly Gly Asp Arg Asn Asn Leu
100 105 110
Val Thr Val Val Ser Phe Thr Asp Leu Gln Gln Arg Asn Ala Glu Tyr
115 120 125
Ala Asn His Ile Ser Ala Ser Ser Ile Ala Thr Ser Leu Gly Arg Val
130 135 140
Ser Leu Ser Ala Thr Ser Leu Ile Asn Thr His Ser Val Glu Ala Leu
145 150 155 160
Lys Pro Pro Ala Pro Ser Ser Ser Arg Ser Val Arg Ala Val Thr Thr
165 170 175
Val Thr Ser Ser Ser Gln Ala Thr Pro Ser Thr Ser Ala Ala Pro Thr
180 185 190
Ile Ser Lys Arg Ala Arg Thr Ala Tyr Thr Ser Gln Gln Leu Ile Glu
195 200 205
Leu Glu Lys Glu Phe Ser Ile Asn Lys Tyr Leu Cys Arg Pro Arg Arg
210 215 220
Ile Glu Leu Ala Ala Gln Leu Gly Leu Thr Glu Arg Gln Ile Lys Ile
225 230 235 240
Trp Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Tyr Lys Lys Glu Lys Lys Ala Arg
245 250 255
Glu Ala Glu Gly Val Glu Ala Ser Val Ser Asp Gln Glu Arg Thr Thr
260 265 270
His Arg Arg Pro Pro Ser Val Arg Asn Thr Leu Pro Gln Gln Lys Ser
275 280 285
Ala Ser Ser Pro Pro Leu Gln Gly Pro Val Val Ser Gly Pro Ser Ala
290 295 300
Ala Leu Cys Ala Pro Met Pro Thr Val Val Gly Gly Gly Ala Gly Cys
305 310 315 320
Thr Leu Asp Gly Tyr Gln Asn Pro Gly Pro Glu Phe Asn Glu Leu Leu
325 330 335
Ala Met His Lys Pro Leu Asn Gln Thr Pro His Ile Ser Pro Asp Leu
340 345 350
Leu Ala Pro His Lys Leu Thr His Gln Ser Pro Ser Ile Ser Pro Pro
355 360 365
Glu Gln Met Asn Pro Asn Tyr Ala Pro Ala Glu Thr Leu Asp Ala Ser
370 375 380
Ser Ile Tyr Ala Gln Gln Gln Met Gln Tyr Asp Tyr Ser Leu Ala Leu
385 390 395 400
Pro Asn Met Ser Gln Asp Arg Leu Pro Gln Tyr Gln Met Gln Ala Thr
405 410 415
Pro Pro Leu Tyr His Ala Pro Tyr Pro Ser Met Leu Pro Gly Gly Tyr
420 425 430
Ser Gln Thr Asp Asp Phe Leu Ser Val Leu Pro Ser Ser Ser Met Asp
435 440 445
Gln Gly Gln Asp Val Lys Pro His Leu Val His Lys Met Glu Pro Pro
450 455 460
Glu Ala Tyr Gln Glu Pro Ser His Ser Gly Ser Val Thr Lys Gly Asp
465 470 475 480
Glu Tyr Leu Pro Ala Tyr Lys Gln Glu Met Tyr Trp Asp His Gln Gln
485 490 495
Gln Cys Pro Pro Pro Pro Ser Tyr Pro Asp Asn Tyr Ala Glu Asn Asn
500 505 510
Ser Gly Ala Pro Tyr Ser Thr Val Ser Pro Pro Ser Leu Thr Glu Leu
515 520 525
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
taatacgact cactataggg tcgtcaccgt cgtttccttc 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
taatacgact cactataggg ctgcttccct tgccttcttc 40
<210> 7
<211> 441
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcgtcaccgt cgtttccttc accgacctgc agcagcgcaa cgccgagtac gcgaaccata 60
tatctgcaag ctcgattgcg acgtcgttgg gccgtgtcag cttgtccgcc accagcctca 120
tcaacacgca ctctgtggag gccctgaagc cgccagctcc ttccagtagc cgcagcgtca 180
gagcggtgac gaccgtcact tcgtcgagcc aggcgacacc gtcgaccagt gcggccccca 240
cgatcagcaa gcgggcgagg acggcgtaca cgtcgcagca gctgatagag ctcgagaagg 300
agttcagtat caacaagtac ctctgtcgcc ctcggcgcat cgagctggcg gctcagttgg 360
gtctgaccga gcgccagatt aaaatatggt tccagaaccg ccgcatgaag tacaagaaag 420
agaagaaggc aagggaagca g 441

Claims (3)

1.一种飞蝗zen基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列。
2.一种两端均融合有T7启动子的所述飞蝗zen基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:7所示的序列。
3.权利要求2所述两端均融合有T7启动子的飞蝗zen基因片段合成的dsRNA在提高丁醚脲防治飞蝗效果中的应用。
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