CN112410198A - 基于rpa和crispr技术的快速新冠病毒检测仪 - Google Patents

基于rpa和crispr技术的快速新冠病毒检测仪 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于RPA和CRISPR技术的快速新冠病毒检测仪，包括生物检测模块、光电探测模块以及报警显示模块，系统将新冠病毒RNA样本采集、核酸提取、扩增、荧光检测四步合一，选用唾液作为检测样本使得采集更便捷，采用无需纯化的RNA快速提取方法，利用RPA技术可在常温进行缩短扩增时间，基于CRISPR的荧光检测使得基因序列的检测灵敏度提升，采用共聚焦光路、LED光源、光电倍增管，利用微弱光放大电路将微弱荧光信号放大并减弱噪声，最后用LED亮灯进行检测阳性的报警，取消显示屏实时监测显示，使得整个装置结构简单，对温度要求低，成本低，灵敏度高，机器小便于携带，检测时间短，仅需约1h。

Description

基于RPA和CRISPR技术的快速新冠病毒检测仪
技术领域
本发明属于生物医学光电检测技术领域，具体涉及一种基于RPA和CRISPR 技术的快速新冠病毒检测仪。
背景技术
RPA技术即重组酶聚合酶扩增，RPA主要分为4个步骤：第一步，重组蛋 白酶在辅助因子uvs Y的协助下与上下游引物形成酶-引物复合体；第二步，复 合物在模板上定位后直接启动链交换反应，形成D状环；第三步，重组酶uvs X 解离后引物的3′端暴露，被链置换DNA聚合酶识别进行链延伸，形成新的互补 链；第四步，在链置换DNA聚合酶系的协同作用下，开始特异性片段的扩增， 30min内就可以将靶序列扩增到10～12数量级，达到检测水平；该反应最适温 度在37～42℃，低成本、耗时短，整个过程在10～30min内即可完成，可实现核 酸的快速检测。
与其他等温方法相比，RPA对抑制剂具有更大的耐受性，可用于更复杂的 样品，RPA引物探针设计较为简单，其荧光检测反应体系只需一对引物和一条 探针即可实现对目标基因的扩增并对整个扩增过程实时监控。此外RPA技术除 缓冲液及Mg2+外，其余体系组分均以干粉状态保存于反应管中，稳定且易于保 存，在封闭的反应体系中也减少了污染的可能性，RPA技术被认为有望取代PCR 的核酸检测技术。
CRISPR核酸检测技术的核心是一种叫做Cas13a的蛋白酶和与其结合的向 导RNA。根据新冠病毒的RNA序列，研究人员设计了能够靶向新冠病毒特异 性序列的向导RNA，它通过碱基对配对的方式，精准识别COVID-19中的RNA， 与此同时激活其上的Cas13a蛋白酶，Cas13a蛋白酶被激活后，会对周围的单链 RNA进行疯狂切割，当它切割可淬灭的荧光RNA，则以产生定量的荧光信号， 我们可以利用光电探测器探测试剂样品中是否发出荧光，来确定是否存在新冠 病毒。
当前的新冠肺炎呈现出一系列的临床症状，从轻度的流感症状到危及生命 的状况，在感染者早期进行快速且有效的检测以从其他疾病中识别出COVID-19 患者非常重要。遏制住疫情的重要方法是找到已感染人群、及时隔离，切断感 染源，目前的常用检测方法是核酸检测，相较于温度判断的不准确性、CT检测 的危害性、抗体免疫检测的滞后性，核酸检测更有效、安全、及时。
目前市场上的核酸检测方法及其优缺点如下：
(1)实时荧光定量PCR检测仪，现在市场上最常用的核酸检测是逆转录酶 聚合酶链式反应RT-PCR检测，需要经历咽拭子采集、RNA提取、扩增、荧光 检测四步，在咽拭子采集过程中对采集人员有严格的防护要求，RNA的提取和 扩增容易出现样本污染，步骤复杂，需要温度升高降低的反复循环，并且市场 上一台实时荧光定量PCR检测仪的价格超过了20万元，非常昂贵，检测的时间 在4～6小时，耗时长。
(2)雅培(Abbott)公司上市了一款运用等温扩增技术的称为ID NOW的快 速检测平台，阳性检测只需5min，阴性检测只需13min，但这并不包括咽拭子 的采集、RNA的提取步骤，且其检测的准确性并没有得到证实。
(3)来自加州大学旧金山分校及Mammoth Biosciences公司的研究人员开 发了一种基于CRISPR-Cas12分析技术的叫做SARS-CoV-2DETEDTR的检测方 法，仅需30min的侧向层析检测，可直接通过试纸可视化判断，更迅速直接， 但是咽拭子RNA的提取步骤仍需单独进行。
发明内容
针对现有核酸检测仪器存在的检测步骤复杂、人员专业水平要求高、检测 不灵敏的问题，本发明提出了一种基于RPA和CRISPR技术的快速新冠病毒检 测仪，其装置结构简单，对温度要求低，成本低，灵敏度高，仪器小便于携带， 检测时间短，仅需约1h。
一种基于RPA和CRISPR技术的快速新冠病毒检测仪，包括：
生物检测模块，用于检测被测者的唾液中是否存在新冠病毒，当唾液中存 在新冠病毒，则产生定量的荧光；
光电探测模块，用于探测所述荧光并将其转换为电流信号；
报警显示模块，用于对所述电流信号进行驱动放大后，以控制LED亮灯的 形式警示新冠病毒检测为阳性的病例。
进一步地，所述生物检测模块包括：
收集装置，用于收集被测者的唾液；
新冠病毒检测试剂，用于与唾液进行反应且基于RPA以及CRISPR技术检 测出唾液中是否存在新冠病毒；当唾液中存在新冠病毒，与试剂反应后的唾液 样本便会产生定量的荧光。
进一步地，所述收集装置包括漏斗和试管，利用漏斗作为辅助工具将被测 者的唾液样本收集至试管中，用于新冠病毒检测。
进一步地，所述光电探测模块包括光源、透镜L1～L2、二向色镜、滤光片 P1～P2以及光电倍增管,光源发射出的激光依次通过透镜L1以及滤光片P1并 经二向色镜折射后打到与试剂反应后的唾液样本上，受到激发后唾液样本所产 生的荧光便会射向二向色镜，经二向色镜透射后依次通过透镜L2以及滤光片 P2，最后由光电倍增管探测采集得到并将荧光转换为电流信号。
进一步地，所述光源采用中心波长符合荧光染料的激发波长，带宽±5nm的 LED冷光源，所述光电倍增管采用侧窗环形聚焦光电倍增管。
进一步地，所述报警显示模块包括：
电流放大电路，用于对光电探测模块产生的微弱电流信号进行放大，得到 能够驱动LED的电压信号；
警示电路，利用所述电压信号驱动LED点亮，以警示新冠病毒检测为阳性 的病例。
进一步地，所述电流放大电路包括两个电容C1～C2、三个电阻R1～R3以及 两个电压放大器U1～U2，其中：电压放大器U1的正相输入端接地，电压放大 器U1的反相输入端与电容C1的一端以及电阻R1的一端相连并接光电倍增管 产生的电流信号，电压放大器U1的输出端与电容C1的另一端、电阻R1的另 一端以及电压放大器U2的正相输入端，电压放大器U2的反相输入端与电容C2 的一端、电阻R2的一端以及电阻R3的一端相连，电阻R2的另一端接地，电 压放大器U2的输出端与电容C2的另一端以及电阻R3的另一端相连并输出电 压信号。
进一步地，所述警示电路包括LED、电阻R0和R以及NMOS管，其中： LED的阳极接工作电压VDD，LED的阴极与电阻R0的一端相连，电阻R0的 另一端与NMOS管的漏极相连，NMOS管的源极接地，NMOS管的栅极与电阻 R的一端相连，电阻R的另一端接电流放大电路输出的电压信号。
本发明系统将新冠病毒RNA样本采集、核酸提取、扩增、荧光检测四步合 一，选用唾液作为检测样本使得采集更便捷，采用无需纯化的RNA快速提取方 法，利用重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)可在常温进行缩短扩增时间，基于 CRISPR的荧光检测使得基因序列的检测灵敏度提升，采用共聚焦光路、LED光 源、光电倍增管，利用微弱光放大电路将微弱荧光信号放大并减弱噪声，最后 用LED亮灯进行检测阳性的报警，取消显示屏实时监测显示，使得整个装置结 构简单，对温度要求低，成本低，灵敏度高，机器小便于携带，检测时间短， 仅需约1h，可适用于普通人群的大规模检查，也适用于人群的家用自检查，可 填补目前市场上廉价、便携、准确且快速的新冠检测的空白，减轻医疗检测人 员的负担，提高检测效率。
附图说明
图1为本发明新冠病毒检测仪的检测流程示意图。
图2为本发明共聚焦型光路模块的结构示意图。
图3为电流放大器的电路结构示意图。
图4为LED报警电路的结构示意图。
具体实施方式
为了更为具体地描述本发明，下面结合附图及具体实施方式对本发明的技 术方案进行详细说明。
如图1所示，本发明新冠病毒检测仪的整个检测过程如下：
(1)从唾液中快速提取新冠病毒RNA。
首先打开仪器上的开关，使一支洁净的小试管弹出；然后打开试管盖，配 合医用漏斗，待测者朝其中吐出一口唾液；最后将试管盖盖上，按回仪器内。 本实施方式使用市面上已有的QuickExtractTMRNA Extraction Kit，即 QuickExtractTMRNA提取试剂盒来提取新冠病毒RNA，采用在常温22℃下反应 10分钟的方式提取RNA。
(2)使用重组酶聚合酶扩增技术恒温扩增RNA片段。
RPA分为四步：第一步，重组蛋白酶在辅助因子uvs Y的协助下与上下游 引物形成酶-引物复合体；第二步，复合物在模板上定位后直接启动链交换反应， 形成D状环；第三步，重组酶uvs X解离后引物的3′端暴露，被链置换DNA聚 合酶识别进行链延伸，形成新的互补链；第四步，在链置换DNA聚合酶系的协 同作用下，开始特异性片段的扩增，30min内就可以将靶序列扩增到10～12数 量级，达到检测水平，该反应最适温度在37～42℃，低成本、耗时短，整个过程 在10～30min内即可完成，可实现核酸的快速检测。
与其他等温方法相比，RPA对抑制剂具有更大的耐受性，可用于更复杂的 样品，RPA引物探针设计较为简单，其荧光检测反应体系只需一对引物和一条 探针即可实现对目标基因的扩增并对整个扩增过程实时监控。此外RPA技术除 缓冲液及Mg2+外，其余体系组分均以干粉状态保存于反应管中，稳定且易于保 存，在封闭的反应体系中也减少了污染的可能性，RPA技术被认为有望取代PCR 的核酸检测技术。
(3)基于CRISPR荧光检测。
根据新冠病毒的RNA序列，研究人员设计了能够靶向新冠病毒特异性序列 的向导RNA，它通过碱基对配对的方式，精准识别COVID-19中的RNA，与此 同时激活其上的Cas13a蛋白酶。Cas13a蛋白酶被激活后，会对周围的单链RNA 进行疯狂切割，当它切割可淬灭的荧光RNA，则以产生定量的荧光信号。本发 明利用光电探测器探测试剂样品中是否发出荧光，来确定是否存在新冠病毒； 等待一个小时左右的核酸反应，如若仪器上的LED发红光则说明待测者已经感 染了新冠病毒，否则未感染。
本发明检测仪中光电探测器部分包括光学系统模块以光电探测报警模块， 其中光学系统模块采用共聚焦型光路，光源和聚焦的样品点关于荧光激发光路 共轭，样品点和探测器关于荧光收集光路共轭，结构简单易懂；同时，窄带滤 光片能够有效消除杂散光。基于共焦光路的多通道光学系统设计不仅提高了检 测效率，而且检测装置的体积大大减小，从而可以获得更好的荧光检测效果。
光路选择LED冷光源作为荧光检测光源，其价格便宜，性能更稳定；其需 要的电压很低、功耗小、发热量小、使用的寿命长；其小巧轻便耐振动，每个 单元LED小片是3～5mm正方形，能够有效减少检测仪空间，无有害金属汞， 是环境友好型器件。
荧光激发光路主要由LED光源、透镜、滤光片、二向色镜组成，选择中心 波长符合荧光染料的激发波长，带宽±5nm的LED灯作为光源，采用凸透镜把 LED灯转化为平行光，选用合适滤光片滤去多余波段，提高荧光激发效率，利 用二向色镜使得入射光路与发射光路共用一套光学系统而互不影响，最终平行 单色光均匀照射到样品上，激发荧光染料发出荧光。
荧光收集光路如图2虚线部分所示，主要由二向色镜、滤光片、透镜、滤 光片、PMT组成，荧光通过二向色镜，经过滤光片消除杂散光，通过透镜聚焦 到光电倍增管PMT，光信号转换为电信号处理。
本实施方式采用侧窗环形聚焦倍增管，使用锂电池作为系统电源尽量避免 供电电源带来的干扰，选用前置放大电路、电压放大器构成电流放大器，如图3 所示，用以放大输入信号；最后使用NMOS管作为驱动电路软开关，如图4所 示，当核酸检测为阳性时，NMOS管导通，LED灯亮。
本实施方式光电探测器部分的工作原理为：①电路系统通电，LED光源经 过共焦光路系统后将单色光入射到试管中；②试管中被激发的荧光通过光路共 焦系统会聚到光电探测器中；③光电探测器把探测到的光信号转化为电流信号， 通过微弱光放大电路转化为放大电压信号；④放大后的电压信号大于阈值，报 警LED灯亮起，说明检测到了新冠病毒序列。
上述对实施例的描述是为便于本技术领域的普通技术人员能理解和应用本 发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对上述实施例做出各种修改，并 把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此， 本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，对于本发明做 出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于RPA和CRISPR技术的快速新冠病毒检测仪，其特征在于，包括：
生物检测模块，用于检测被测者的唾液中是否存在新冠病毒，当唾液中存在新冠病毒，则产生定量的荧光；
光电探测模块，用于探测所述荧光并将其转换为电流信号；
报警显示模块，用于对所述电流信号进行驱动放大后，以控制LED亮灯的形式警示新冠病毒检测为阳性的病例。
2.根据权利要求1所述的快速新冠病毒检测仪，其特征在于：所述生物检测模块包括：
收集装置，用于收集被测者的唾液；
新冠病毒检测试剂，用于与唾液进行反应且基于RPA以及CRISPR技术检测出唾液中是否存在新冠病毒；当唾液中存在新冠病毒，与试剂反应后的唾液样本便会产生定量的荧光。
3.根据权利要求2所述的快速新冠病毒检测仪，其特征在于：所述收集装置包括漏斗和试管，利用漏斗作为辅助工具将被测者的唾液样本收集至试管中，用于新冠病毒检测。
4.根据权利要求1所述的快速新冠病毒检测仪，其特征在于：所述光电探测模块包括光源、透镜L1～L2、二向色镜、滤光片P1～P2以及光电倍增管,光源发射出的激光依次通过透镜L1以及滤光片P1并经二向色镜折射后打到与试剂反应后的唾液样本上，受到激发后唾液样本所产生的荧光便会射向二向色镜，经二向色镜透射后依次通过透镜L2以及滤光片P2，最后由光电倍增管探测采集得到并将荧光转换为电流信号。
5.根据权利要求4所述的快速新冠病毒检测仪，其特征在于：所述光源采用中心波长符合荧光染料的激发波长，带宽±5nm的LED冷光源，所述光电倍增管采用侧窗环形聚焦光电倍增管。
6.根据权利要求1所述的快速新冠病毒检测仪，其特征在于：所述报警显示模块包括：
电流放大电路，用于对光电探测模块产生的微弱电流信号进行放大，得到能够驱动LED的电压信号；
警示电路，利用所述电压信号驱动LED点亮，以警示新冠病毒检测为阳性的病例。
7.根据权利要求6所述的快速新冠病毒检测仪，其特征在于：所述电流放大电路包括两个电容C1～C2、三个电阻R1～R3以及两个电压放大器U1～U2，其中：电压放大器U1的正相输入端接地，电压放大器U1的反相输入端与电容C1的一端以及电阻R1的一端相连并接光电倍增管产生的电流信号，电压放大器U1的输出端与电容C1的另一端、电阻R1的另一端以及电压放大器U2的正相输入端，电压放大器U2的反相输入端与电容C2的一端、电阻R2的一端以及电阻R3的一端相连，电阻R2的另一端接地，电压放大器U2的输出端与电容C2的另一端以及电阻R3的另一端相连并输出电压信号。
8.根据权利要求6所述的快速新冠病毒检测仪，其特征在于：所述警示电路包括LED、电阻R0和R以及NMOS管，其中：LED的阳极接工作电压VDD，LED的阴极与电阻R0的一端相连，电阻R0的另一端与NMOS管的漏极相连，NMOS管的源极接地，NMOS管的栅极与电阻R的一端相连，电阻R的另一端接电流放大电路输出的电压信号。
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