CN111378786A - 一种CRISPR-based核酸检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种CRISPR-based核酸检测试剂盒及其应用 Download PDF

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杨朝
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Abstract

本发明涉及一种CRISPR‑based核酸检测试剂盒及SHERLOCK CRISPR系统在病原体检测中的应用，所述的核酸检测试剂盒包括针对病原体的gRNA序列。本发明的试剂盒及检测方法快速准确、灵敏度高、便携、方便运输、可实现冷冻运输，价格低廉，整个检测时间在2小时以内；检测的准确性与PCR平台一致；检测灵敏度在1‑1000copies/μl；从而使其能够大规模推广应用，能够在疫情爆发初期对当地居民，特别是落后地区的居民，实现实时实地的快速检测，最大程度遏止病毒的传播。

Description

一种CRISPR-based核酸检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明具体涉及一种CRISPR-based核酸检测试剂盒及其应用。
背景技术
目前肺炎病原体的检测主要依靠PCR技术及其他以PCR为基础的技术，PCR相关检测技术存在快速准确、灵敏度高等优点，因此是最常用的病毒检测方法，也是目前病毒检测的金标准。但是，目前主流的PCR检测平台，都需要专业的仪器设备和相关技术人员，限制了其大规模推广应用，特别是在边远落后地区的应用。例如，近期在武汉爆发的新型冠状病毒，具有极强的传染性和致病性，严重威胁人类的生命和财产安全。目前对于新型冠状病毒及其他病毒的检测，主要依靠PCR技术及其他以PCR为基础的技术。而由于PCR，需要专业的设备和相关技术人员，检测费用相对较高，因此，在落后地区无法使用，导致某些地区新冠的确诊难度增大，不利于疫情的控制
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种CRISPR-based核酸检测试剂盒及其应用，该试剂盒基于CRISPR核酸检测技术。
为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
本发明一方面提供一种CRISPR-based核酸检测试剂盒，所述的核酸检测试剂盒包括针对病原体的gRNA序列。
优选地，所述的病原体包括肺炎病原体。
优选地，所述的病原体包括新型冠状病毒COVID-19以及其他病毒。
优选地，所述的核酸检测试剂盒包括针对一种或多种病原体设计的gRNA序列。
优选地，所述的核酸检测试剂盒包括针对每种病原体的一个或多个基因设计的一个或多个gRNA序列。
优选地，所述的核酸检测试剂盒还包括Cas13a蛋白和/或探针。
本发明的第二方面提供一种SHERLOCK CRISPR系统在病原体检测中的应用，检测时采用所述的CRISPR-based核酸检测试剂盒。
本发明的第三方面提供一种利用SHERLOCK CRISPR系统及所述的CRI SPR-based核酸检测试剂盒进行病原体检测的方法，包括如下步骤：
(1)对待测样本进行预处理；
(2)通过RPA扩增及转录；
(3)加入Cas13a蛋白、gRNA序列以及探针进行检测。
优选地，进行所述的检测时，采用酶标仪检测荧光信号，或者，基于链霉亲和素反应进行检测。
优选地，所述的待测样本为体液。
本发明的试剂盒和检测方法对仪器的依赖程度低，甚至可以实现无需仪器的试纸条检测。
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
本发明的试剂盒及检测方法快速准确、灵敏度高、便携、方便运输、可实现冷冻运输，价格低廉，整个检测时间在2小时以内；检测的准确性与PCR平台一致；检测灵敏度在1-1000copies/μl；从而使其能够大规模推广应用，能够在疫情爆发初期对当地居民，特别是落后地区的居民，实现实时实地的快速检测，最大程度遏止病毒的传播。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。
目前的CRISPR核酸检测系统主要有两种：SHERLOCK(Specific High-sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)和DETECTR(DNA Endonuclease TargetedCRISPR Trans Reporter)。在SHERLOCK系统中，首先对核酸样品进行一次恒温扩增(RPA)或恒温反转录扩增(RT-RPA)，随后对扩增产物进行转录产生ssRNA样本。Cas13a/gRNA能够识别样品中存在的ssRNA靶序列，并对带有荧光信号的非靶序列小片段ssRNA进行切割，释放出荧光基团，产生可读信号。在后续的SHERLOCKv2系统中，通过不同CRISPR蛋白的组合及优化，实现了多重检测(一个反应检测4个样品)及灵敏度的提升，通过将基于荧光信号的检测替换为基于链霉亲和素反应的检测，实现了无需仪器的试纸条检测，提升了系统的便携性。而通过HUDSON(heating unextracted dia gnostic samples to obliterate nucleases)方法在反应前对样品进行处理，SHE RLOCK系统实现了直接在体液中(血液或唾液)对病毒进行高灵敏性检测。在DETECTR系统中，经过RPA或RT-RPA以后，Cas12a/gRNA能够识别样品中存在的dsDNA靶序列，并对带有荧光信号的非靶序列小片段ssDNA进行切割，释放出荧光基团，产生可读信号。本项目拟通过对SHERLOCK CRISPR检测体系的优化，构建一个适用于新型冠状病毒及其他病毒的检测平台。
实施方案：
(1)通过文献中提到的HUDSON处理方法或其他样品处理方法，对临床样本进行处理，使得样品满足后续实验要求。
(2)根据SHERLOCK检测系统，针对新型冠状病毒基因组序列，设计8-10个gRNA序列及相应的报告探针。用提取的病毒基因组RNA对CRISPR蛋白及设计的gRNA序列进行评估和优化，确定最优的检测方案及其检测灵敏度。
(3)将确定的CRISPR检测方案用于临床样本检测。将临床样本进行处理后，经过RPA扩增，加入CRISPR蛋白/gRNA及相应报告探针，检验该系统在实际临床样本中的检测能力。
(4)通过对检测体系及报告探针的优化，实现无需仪器的便携式试纸条检测。
本发明的方案具有如下优势：
1、将CRISPR-based核酸检测技术应用于新型冠状病毒的检测。
目前针对新型冠状病毒及其他病毒的检测，主要依赖于PCR相关技术，市场上基于CRISPR的检测技术相对少见。本项目希望通过对SHERLOCK系统的研发，创制出适合新型冠状病毒及其他病毒的检测平台。
2、无需仪器，通过试纸条反应即可实现检测。操作方便，价格低廉，便于运输。
目前主流的PCR检测平台，都需要专业的仪器设备和相关技术人员，限制了其大规模推广应用，特别是在边远落后地区的应用。本项目旨在通过SH ERLOCK系统创制出一种不依赖仪器的、便携式的、廉价的检测方法，为不具体PCR检测条件的地区或单位提供可替代的检测方案。
3、实现对病原体核酸SNP检测，能够对病毒进行分型检测。
目前已知新型冠状病毒具有很强的突变能力，能产生不同的变异株。由于CRISPR系统中gRNA对靶序列的高度特异性识别，SHERLOCK系统能够实现对单碱基SNP差异的检测，从而鉴别不同的病毒变异株，实现对病毒的精准检测。
实施例：
本发明人使用SHERLOCK系统，针对流感病毒A H7N9 HA gene和M gene分别设计了3条gRNA序列，将临床样本进行预处理，释放核酸，随后通过RPA进行扩增及转录。随后加入Cas13a蛋白/gRNA及报告探针，用酶标仪检测荧光信号。整个检测时间在2小时内，其中HA基因可以检测出明显信号，证明SHERLOCK CRISPR系统可以应用于肺炎病原体的检测。
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种CRISPR-based核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的核酸检测试剂盒包括针对病原体的gRNA序列。
2.根据权利要求1所述的CRISPR-based核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的病原体包括肺炎病原体。
3.根据权利要求1所述的CRISPR-based核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的病原体包括新型冠状病毒COVID-19以及其他病毒。
4.根据权利要求1所述的CRISPR-based核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的核酸检测试剂盒包括针对一种或多种病原体设计的gRNA序列。
5.根据权利要求1所述的CRISPR-based核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的核酸检测试剂盒包括针对每种病原体的一个或多个基因设计的一个或多个gRNA序列。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的CRISPR-based核酸检测试剂盒，其特征在于：所述的核酸检测试剂盒还包括Cas13a蛋白和/或探针。
7.一种SHERLOCK CRISPR系统在病原体检测中的应用，其特征在于：检测时采用权利要求1至6中任一项所述的CRISPR-based核酸检测试剂盒。
8.一种利用SHERLOCK CRISPR系统及权利要求1至6中任一项所述的CRISPR-based核酸检测试剂盒进行病原体检测的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)对待测样本进行预处理；
(2)通过RPA扩增及转录；
(3)加入Cas13a蛋白、gRNA序列以及探针进行检测。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：进行所述的检测时，采用酶标仪检测荧光信号，或者，基于链霉亲和素反应进行检测。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述的待测样本为体液。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112410198A (zh) * 2020-09-27 2021-02-26 浙江大学 基于rpa和crispr技术的快速新冠病毒检测仪
CN113736628A (zh) * 2021-08-29 2021-12-03 香港中文大学（深圳） 一体式便携核酸检测装置、检测系统和检测方法
WO2022147340A1 (en) * 2020-12-31 2022-07-07 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Specific detection of nucleic acid sequences using activate cleave & count (acc) technology

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