CN117210541A - 一种基于环介导等温扩增的体系及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生化分析和分子诊断领域。本发明为一种基于环介导等温扩增的防污染分子诊断方法及其应用，包括多重病原微生物核酸检测。本发明描述了ZO5DNA聚合酶突变体、热敏UDG酶、自制缓冲液、dUTP等组分可以加入LAMP反应体系中，起到防止LAMP产物气溶胶污染的作用，应用于核酸、蛋白等靶标的快速、高灵敏检测。以病原体人乳头瘤病毒16亚型和18亚型为例，检测灵敏度达到单拷贝。本发明的优点：高效防气溶胶污染、操作简单方便、费用低、多重、高灵敏等。
Description
技术领域
本发明涉及生化分析和生物技术中的环介导等温扩增技术领域，具体为一种基于环介导等温扩增的体系及其应用。
背景技术
传统的酶切方法、DNA芯片杂交、质谱技术以及荧光定量PCR等方法在生化分析和分子诊断领域的核酸和蛋白检测中广泛使用，但这些方法仍受限于昂贵的设备投入、复杂的操作和专业人员的培训，并不适合于大多数临床医院在常规临床检验中的推广使用。传统的聚合酶链式反应也需要昂贵的热循环仪器，需要多个不同的热循环步骤等多种操作，耗时长，限制了现场检测的应用。相较于传统的核酸检测技术，等温扩增技术因其扩增不受温度循环的限制而备受关注，并且越来越多的应用于核酸检测领域，最为常见的方法包括：重组聚合酶扩增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA)、环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、依赖核酸序列的扩增(Nucleic acidsequence-based amplification，NASBA)和解旋酶依赖的扩增(Helicase-dependentamplification，HDA)等。
其中，LAMP的原理是针对目标基因的6个或8个区域设计4种或6种引物，在特定的DNA聚合酶的作用下以恒定温度进行反应。该技术不需要昂贵仪器，而且反应速度快，具有高特异性和扩增速率，节省了变温过程所耗费的时间、且不需要升降温反复循环，就可实现指数扩增。
由于LAMP具有非常高的扩增效率和灵敏度，极其微量的模板污染就会造成假阳性的结果。污染的主要原因包括：(1)标本间交叉污染；(2)LAMP反应试剂的污染；(3)LAMP扩增产物污染；(4)气溶胶污染：空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。由于一个气溶胶颗粒内包含104-105拷贝，因而由其造成的污染是一个值得特别重视的问题。此外，由于LAMP扩增的引物较多，导致LAMP的非特异性扩增难以消除，因此LAMP防产物污染的问题亟待解决。
UNG-dUTP系统是在PCR污染引起假阳性结果的问题出现后被发明的用于防产物污染的方法，在美国专利(US 5536649).该方法可以达到彻底消除污染源的效果，UNG(Uracil-DNAGlycosylase，尿嘧啶DNA糖基化酶)可以在PCR反应管内共存反应。UNG-dUTP防污染的技术原理是：在PCR反应体系中加入dUTP代替dTTP，或者按照一定的比例同时加入dUTP和dTTP，使PCR的反应产物中掺入大量的dUTP(或加入含有dUTP的扩增引物)，在再次PCR之前用UNG处理PCR反应体系即可消除上一次PCR产物(dU-DNA)的残留污染。UNG在一定温度条件下可以裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架之间的N-糖基键，除去上一次PCR产物双链上的dUTP，阻止了DNA聚合酶对dU-DNA为模版进行延伸，而UNG对于不含dUTP的模板的扩增无任何影响。UNG在PCR循环中的变性步骤中经高温被灭活，因此不会影响新一轮PCR产物dU-DNA的生成。
目前已公开了许多基于PCR技术消除产物污染的方法。例如专利CN1940087A公开了用于血液中基因组DNA提取后的UNG-dUTP系统，用于PCR反应的防污染；此外，为了解决上述专利中存在的血液基因组DNA提取过程繁琐、无法避免样本间交叉污染的问题，专利CN102321611A提供了一种UNG-dUTP防污染系统在全血PCR反应体系中的应用。然而，目前的研究中并没有基于LAMP的高效防污染系统，也无法将防污染装置应用到开放便携式的检测装置中，因此无法广泛应用于现场即时检测。
发明内容
针对现有技术中上述技术问题，本发明提供了一种基于环介导等温扩增的体系及其应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种基于环介导等温扩增的体系，等温扩增体系(PureU-UDG-LAMP)，所述PureU-UDG-LAMP防污染系统包括如下a1)-a3)；
a1)含dUTP、dATP、dGTP和dCTP的四种脱氧核苷酸混合液；
a2)ZO5 DNA聚合酶突变体、热敏UDG酶和缓冲液；
a3)待检测样品LAMP混合引物。
所述PureU-UDG-LAMP防污染体系成分为每个体系内加入2-10μL缓冲液、LAMP混合引物(10×)、10-20mM四种脱氧核苷酸混合液、热敏UDG酶、ZO5 DNA聚合酶突变体、20×EvaGreen(20×in water)、MgSO4(100mM)、NF Water、待测靶标。
所述缓冲液由2-5μL KOH(1M),10-12μL(NH4)2SO4(1M)、20-30μL KCl(2M)、1-5μLTween 20以及250-300μL ddH2O充分混合配制。优选，所述缓冲液由4μL KOH(1M),10μL(NH4)2SO4(1M)、25μLKCl(2M)、1μL Tween 20以及280μL ddH2O充分混合配制合成。
所述四种脱氧核苷酸混合液为2-5nMdATP，2-5nMdCTP，2-5nMdGTP，5-10nMdUTP以及165-180μL ddH2O配制合成。优选，所述四种脱氧核苷酸混合液为2.5nMdATP，2.5nMdCTP，2.5nMdGTP，7.5nMdUTP以及165-180μL ddH2O配制合成。
一种所述的体系的应用，所述体系在作为环介导等温扩增体系中的应用。
所述体系在作为环介导等温扩增体系检测病原体中的应用。
所述病原体例如病原体人乳头瘤病毒16亚型(HPV16)或18亚型(HPV18)。
所述待检测样品为人乳头瘤病毒16亚型或18亚型时，基于环介导等温扩增的体系为包括如下a1)-a3)；
a1)含dUTP、dATP、dGTP和dCTP的四种脱氧核苷酸混合液；
a2)ZO5 DNA聚合酶突变体、热敏UDG酶和缓冲液；
a3)待检测样品LAMP混合引物。
针对含有待检测的HPV16靶标的样本，LAMP混合引物包括两条外部引物F3(SEQ IDNO:3)和B3(SEQ ID NO:4)，两条内部引物FIP(SEQ ID NO:5)和BIP(SEQ ID NO:6)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:7)和Loop B(SEQ ID NO:8)；
针对含有待检测的HPV18靶标的样本，LAMP混合引物包括两条外部引物F3(SEQ IDNO:9)和B3(SEQ ID NO:10)，两条内部引物FIP(SEQ ID NO:11)和BIP(SEQ ID NO:12)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:13)和Loop B(SEQ ID NO:14)；
一种利用所述的体系防污染分子诊断方法：
(1)采集含待检测细胞的拭子固定液；
(2)将固定液和洗脱液按照1:1体积比在试管中进行充分混匀，静置10min；
(3)取洗脱液的上清液1-5ul加入预置上述权利要求1所述的PureU-UDG-LAMP反应液混匀30-40秒；
(4)反应管37℃恒温孵育10min；65℃恒温扩增30-60min；每60s读取一次信号，检测通道为FAM；观察荧光曲线变化，判断扩增结果；
(5)取1-5ul步骤(4)反应产物稀释100000倍，重复PureU-UDG-LAMP反应；观察荧光曲线变化，以判断是否出现污染子的扩增曲线。
所述洗脱液为所述洗脱液为一种商用DNA提取溶液：QuickExtract DNA提取溶液(Lucigen,#QE09050)，其主要成份包含混合的伪酰胺盐，清洁剂和PH稳定剂。
一种利用所述体系可视化的开放式核酸检测试剂盒，反应体系和核酸检测试纸；反应体系为所述体系，待检测样品、待检测引物和探针、CRISPR-Cas12a侧流层析系统体系。
所述CRISPR-Cas12a侧流层析系统体系为每15μL体系内加入0.1μL LbaCas12a蛋白(50-200uM)、3μL CRISPR RNA(crRNA)(2-5uM)、3μL报告DNA探针(2-10uM)、NEB反应缓冲液2.1(10×)、5-10μL无核酶水、1.5μL待测靶标。
所述Cas12a购自New England BioLabs(NEB)Inc(USA)，所述CRISPR RNA购自金斯瑞生物科技公司(南京，中国)，所述报告DNA探针购自擎科生物公司(北京，中国)。所述检测试纸条购自北京宝盈同汇生物科技公司(北京，中国)。
上述防污染分子诊断方法，所述的PureU-UDG-LAMP防污染体系解决了现有技术中LAMP扩增产物中的气溶胶污染导致的假阳性结果，并进一步在开放环境下验证了该体系有效消除LAMP产物中气溶胶污染导致的假阳性结果(见图1)。
上述所述ZO5 DNA聚合酶突变体可以高效利用只含有dUTP、dATP、dCTP、dGTP四种脱氧核苷酸的dNTPs，并可以达到很好的等温扩增效果。该聚合酶参见专利号为ZL202210495569.4公开文献中报道获得，同时其由该专利申请人上海众启生物科技有限公司馈赠。
所述热敏UDG酶(尿嘧啶DNA糖基化酶)，被证实可以在37℃，10min的最佳活性温度时间条件下孵育，消除上一次LAMP产物中的dUTPs，进而阻碍LAMPDNA聚合酶对上一次LAMP产物的延伸，从而起到消除产物污染的作用。在后续的循环中，UDG酶通过高温变性失活，从而不对后续的LAMP产物生成影响。
上述，热敏UDG酶(尿嘧啶DNA糖基化酶)购自New England BioLabs(NEB)Inc(USA)公司。
一种所述试剂盒检测方法：
1)提取待测样本的核酸，利用所述体系和引物进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；
2)将LAMP扩增产物和所述crRNA、所述LbaCas12a(Cpf1)蛋白在含有所述报告DNA探针的体系中孵育5min，得到反应产物；
所述Cas12a购自New England BioLabs(NEB)Inc(USA)，所述CRISPR RNA购自金斯瑞生物科技公司(南京，中国)，所述报告DNA探针购自擎科生物公司(北京，中国)。
3)在2)所述反应产物中加无核酶水补足体积至50μL并加入核酸检测试纸条，静置观察5min；所述检测试纸条购自北京宝盈同汇生物科技公司(北京，中国)。
4)若试纸没有T线显现且有C线显现，或者试纸只有T线显现，则待测样本含有待检测样品；若试纸仅有C线显现，则待测样本不含待检测样品。
所述可视化的开放式核酸检测试剂盒用于检测病原体样品中的应用。
所述病原体样品为病原体人乳头瘤病毒16亚型或18亚型。
一种病原体(人乳头瘤病毒16亚型或18亚型)试剂盒，反应体系和核酸检测试纸；反应体系为所述体系，待检测样品、待检测引物和探针、CRISPR-Cas12a侧流层析系统体系。所述CRISPR-Cas12a侧流层析系统体系为每15μL体系内加入0.1μL LbaCas12a蛋白(50-200uM)、3μL CRISPR RNA(crRNA)(2-5uM)、3μL报告DNA探针(2-10uM)、NEB反应缓冲液2.1(10×)、5-10μL无核酶水、1.5μL待测靶标。其中，针对HPV16靶标的crRNA序列为SEQ ID NO:15，针对HPV18靶标的crRNA序列为SEQ ID NO:16；报告DNA探针，其由TTATT组成，且所述报告RNA的序列5’端和3端分别标记FAM和生物素；所述HPV-16和HPV-18报告NA探针的序列为SEQ ID NO:17。
其具体检测方法为：
(1)提取含有待侧核酸靶标的宫颈上皮细胞样本的固定液，针对HPV-16和HPV-18两组靶序列，分两管进行Pure uracil-LAMP反应，最终分别得到对应的含dU的HPV-16和HPV-18等温扩增产物；上述的反应条件为：37度，15-40分钟。
针对含有待检测的HPV16靶标的样本，LAMP混合引物包括两条外部引物F3(SEQ IDNO:3)和B3(SEQ ID NO:4)，两条内部引物FIP(SEQ ID NO:5)和BIP(SEQ ID NO:6)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:7)和Loop B(SEQ ID NO:8)；
针对含有待检测的HPV18靶标的样本，LAMP混合引物包括两条外部引物F3(SEQ IDNO:9)和B3(SEQ ID NO:10)，两条内部引物FIP(SEQ ID NO:11)和BIP(SEQ ID NO:12)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:13)和Loop B(SEQ ID NO:14)；
(2)将所述LAMP扩增产物(含dU的HPV-16和HPV-18的LAMP扩增产物)、所述crRNA(针对HPV16的crRNA(SEQ ID NO:15)或针对HPV18的crRNA(SEQ ID NO:16)、所述LbaCas12a蛋白在含有所述报告DNA探针(SEQ ID NO:17)的体系中分管进行反应，得到反应产物；上述反应的条件为：37℃，5-10分钟。
(3)将所述试纸条加入所述反应产物与无核酸酶水的混合液中，静置观察；静置时间为试纸浸入反应管中1-5分钟；
所述Cas12a购自New England BioLabs(NEB)Inc(USA)，所述CRISPR RNA购自金斯瑞生物科技公司(南京，中国)，所述报告DNA探针购自擎科生物公司(北京，中国)。所述检测试纸条购自北京宝盈同汇生物科技公司(北京，中国)。
分别观察检测HPV16靶标和HPV18靶标的试纸，若试纸条上没有T线显现且有C线显现，或者仅有T线显现，则待测样本含有或候选含有HPV16或者HPV18病毒；若试纸仅有C线显现无T线显现，则待测样本不含有或候选不含有HPV16或者HPV18病毒。
本发明与现有技术相比具有下列优点和效果：
本发明所述PureU-UDG-LAMP防污染体系，通过优化LAMP反应体系中的DNA聚合酶、热敏UDG酶、反应缓冲液，将体系中的dTTP全部替换为dUTP后仍可实现快速高灵敏的等温扩增，并通过UDG酶高效消除环境中可能存在的含dU扩增子的气溶胶污染；相较于目前的UNG-dUTP系统，扩增dUTP的效率大大提高，显著减轻了LAMP反应中极易出现的气溶胶污染和假阳性结果，扩大了UDG-dUTP防污染系统的使用范围，具有高效防气溶胶污染、操作简单方便、快速肉眼可视、费用低、多重、高灵敏、适用现场即时检测等优点。
同时，利用上述基于环介导等温扩增体现可进行高效防污染核酸检测，基于CRISPR-Cas12a核酸检测技术，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于HPV病毒检测的靶点序列及能靶向该靶点序列的特异性crRNA，并提供一种基于消线法的侧向流试纸，该试纸可通过CRISPR-Cas12a系统实现对HPV病毒核酸的超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测，证实了含dU的LAMP扩增子在开放式CRISPR-Cas12a侧流层析体系中可以实现快速高灵敏的可视化检测，同时验证了在开放式便携化检测也可以防止LAMP气溶胶污染，扩大了UDG-dUTP防污染系统的使用范围，具有高效防气溶胶污染、操作简单方便、快速肉眼可视、费用低、多重、高灵敏、适用现场即时检测等优点，灵敏度达到1copies/test。
附图说明
图1为PureU-UDG-LAMP防污染体系原理图。a.PureU-UDG-LAMP反应流程图；b.UDG切割尿嘧啶原理。
图2为各自最优条件下三种不同酶(ZO5 DNA聚合酶突变体、Bst 2.0Warmstart、BstLongFragmentDNA聚合酶)的PureU-LAMP反应效率对比。(实例1.1)
图3为凝胶电泳下，UDG酶在PureU-LAMP反应体系中清除HPV-18dU-DNA的产物。(注：不同泳道加样梯度从左到右：1.UDG(+)-105扩增产物；2.UDG(+)-104扩增子；3.UDG(-)-105扩增子；4.UDG(-)-104扩增子；NC：空白对照组。)(实例-1.2)
图4为PureU-UDG-LAMP检测HPV16-E7和HPV18-L1的扩增灵敏度。
图5为PureU-UDG-LAMP体系检测HPV-16和HPV18的特异度(实例-1.4)(注：Mg：生殖衣原体；CRKP：耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌；CT：沙眼衣原体；O157:大肠杆菌O157:H7；NG：淋病奈瑟菌；NTC：阴性对照)
图6为PureU-UDG-LAMP体系检测唾液中HPV-16和HPV18(实例-2)。
图7为PureU-UDG-LAMP体系检测临床样本中HPV-16和HPV18(实例-3)
图8为基于环介导等温扩增的体系的超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法的原理图。
图9为基于环介导等温扩增的体系的CRISPR-Cas12a侧流层析试纸条检测HPV16-E7(图a)和HPV18-L1(图b)结果。
图10为基于环介导等温扩增的体系的超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法检测HPV16-E7和HPV18-L1的扩增灵敏度。图a：HPV16和HPV18侧流层析试纸检测结果；图b：ImageJ分析试纸条T线/C线颜色比值。
图11为基于环介导等温扩增的体系的超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法检测HPV-16和HPV18的特异度。1-11分别为：HPV16，HPV18，HPV68，HPV39，HPV51，HPV58，HPV45，生殖支原体病毒，淋病奈瑟菌，沙眼衣原体病毒)和对照组(H2O)检测结果。
图12为基于环介导等温扩增的体系的超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法检测唾液中HPV-16和HPV18。1:HPV16阳性加标唾液样本检测结果；2:HPV18阳性加标唾液样本检测结果；3，4:阴性对照唾液样本检测结果。
图13为基于环介导等温扩增的体系的可视化的开放式核酸检测试剂盒检测临床样本中HPV-16和HPV18。样本1：HPV16(+)；样本2：HPV18(+)；样本3：HPV16(+)+18(+)；样本4：HPV58(+)；样本5，样本6：HPV阴性。
具体实施方式
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明LAMP反应体系中采用特定的DNA聚合酶、热敏UDG酶、反应缓冲液，从而在体系中的dTTP全部替换为dUTP后仍可实现快速高灵敏的等温扩增，并通过UDG酶高效消除环境中可能存在的含dU扩增子的气溶胶污染；同时该方法证实了含dU的LAMP扩增子在开放式CRISPR/Cas12a侧流层析体系中实现快速高灵敏的可视化检测，且不会出现气溶胶污染。相较于目前的UNG-dUTP系统，扩增dUTP的效率大大提高，显著减轻了LAMP反应中极易出现的气溶胶污染和假阳性结果，同时验证了在开放式便携化检测也可以防止LAMP气溶胶污染，扩大了UDG-dUTP防污染系统的使用范围，具有高效防气溶胶污染、操作简单方便、快速肉眼可视、费用低、多重、高灵敏、适用现场即时检测等优点。
以下结合人乳头瘤病毒16亚型的E7基因或人乳头瘤病毒18亚型的L1基因检测的实例对本发明的具体实施措施做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明；具体为
以人乳头瘤病毒高危亚型HPV-16或HPV-18为例，包括以下步骤：
(1)获取针对HPV-16E7基因和HPV-18L1基因的靶序列和引物组；
(2)针对两组基因靶序列，分两管进行PureU-UDG-LAMP反应，最终分别得到对应的含dU的HPV-16和HPV-18等温扩增产物；
对于实验结果的分析主要包括：
(1)使用RocheLightCycler 480qPCR软件进行荧光数据的分析；
(2)运用GraphPad Prism9、AdobeIllustrator、Biorender、PowerPoint等进行流程图和结果图的绘制。
实施例1：人乳头瘤病毒16亚型的PureU-UDG-LAMP检测
本实施以人工构建的HPV16-E7质粒为例，用于对PureU-UDG-LAMP防污染反应体系的构建。
1.1对比三种LAMPDNA聚合酶(ZO5 DNA聚合酶突变体/Bst 2.0WarmstartDNA聚合酶/BstLargeFragmentDNA聚合酶)在各自最佳反应条件下对dUTP的扩增效率具体步骤如下：
步骤1：获取针对HPV-16中的E7基因位点(SEQ ID NO:1)的LAMP引物组，该LAMP引物组包括两条外部引物F3(SEQ ID NO:3)和B3(SEQ ID NO:4)，两条内部引物FIP(SEQ IDNO:5)和BIP(SEQ ID NO:6)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:7)和Loop B(SEQ ID NO:8)；
步骤2：针对三种LAMPDNA聚合酶(ZO5 DNA聚合酶突变体/Bst 2.0Warmstart/BstLargeFragment)，分单管进行针对HPV16-E7的PureU-LAMP反应；最终得到HPV16-E7的LAMP产物和实时荧光PCR扩增曲线；对比三种酶扩增HPV16-E7的反应效率。
针对HPV16-E7的检测，在三组不同酶条件下的LAMP反应管中加入以下物质：2-10μL三组不同缓冲液、LAMP混合引物(10×)、10-20mM dU plus dNTP Mixture、热敏UDG酶、三组不同DNA聚合酶、20×EvaGreen(20×in water)、MgSO4(100mM)、NF Water、待测靶标等。
其中，ZO5 DNA聚合酶突变体为上海上海众启生物科技有限公司提供，Bst2.0Warmstart和BstLargeFragment购自New England BioLabs(NEB)Inc(USA)公司。UDG为New England BioLabs(NEB)Inc(USA)公司生产的热敏UDG酶(尿嘧啶DNA糖基化酶)。
步骤3：LAMP扩增程序：反应均在The480Instrument Real-Time PCRDetection System(Roche,USA)上进行；反应条件为65℃，60min，每60s收集一次荧光信号；95℃2min。
以上实验平行重复三次，收集实时荧光PCR的信号曲线，并由Graphad Prism 9进行扩增曲线和统计分析图的绘制。
如图2可见，三组最优条件下的PureU-LAMP扩增实验中，四个不同浓度的HPV16-E7模板(102，104，106，108)下，ZO5 DNA聚合酶突变体在dUplus dNTP Mixture条件下扩增效率最好，Bst 2.0Warmstart和BstLargeFragment酶在dUplus dNTP Mixture条件下扩增效率都很差。证明ZO5 DNA聚合酶突变体对于dUplus dNTP Mixture反应条件下扩增效率最佳。
1.2以人工构建的HPV16-E7质粒为例，用于验证UDG酶在PureU-UDG-LAMP防污染反应体系中清除dU-DNA产物的效果
1.2.1制备HPV16-E7dU-DNA扩增子
具体步骤如下：
步骤1：获取针对HPV-16中的E7基因位点(SEQ ID NO:1)的LAMP引物组，该LAMP引物组包括两条外部引物F3(SEQ ID NO:3)和B3(SEQ ID NO:4)，两条内部引物FIP(SEQ IDNO:5)和BIP(SEQ ID NO:6)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:7)和Loop B(SEQ ID NO:8)；
步骤2：针对ZO5 DNA聚合酶突变体，分单管进行扩增HPV16-E7的PureU-LAMP反应；最终得到相应的HPV16-E7的LAMP产物和实时荧光PCR扩增曲线。
针对HPV16-E7的检测在ZO5 DNA聚合酶突变体的PureU-LAMP反应管中加入以下物质：
2.4μL缓冲液、1.8μL LAMP混合引物(10×)、1.8μL dU plus dNTP Mixture(10mM)、1.8μL热敏UDG酶、0.6μL ZO5 DNA聚合酶突变体(8U/μL)、0.5μL 20×EvaGreen(20×in water)、1.5μL MgSO4(100mM)、2.8μL NF Water、1.5μL待测靶标。
其中，缓冲液为自制缓冲液，由4μL KOH(1M),10μL(NH4)2SO4(1M)、25μL KCl(2M)、1μL Tween 20以及280μL ddH2O充分混合配制；混合引物即为步骤1中记载。
步骤3：LAMP扩增程序：反应均在The480Instrument Real-Time PCRDetection System(Roche,USA)上进行；反应条件为37℃，10min恒温孵育；65℃，60min，每60s收集一次荧光信号；95℃2min。
1.2.2验证UDG酶在PureU-LAMP反应体系中清除dU-DNA的产物
步骤1：凝胶电泳及产物分析
取上述1.2.1的HPV16-E7的dU-DNA产物分别放入不同的PCR反应管作为对照组和实验组，在实验组的PCR管中加入热敏UDG酶消化dU-DNA产物，对照组加入NFWater作为空白对照，进行37℃，10min恒温孵育，然后采用凝胶电泳系统对上述孵育后产物做凝胶电泳，对比反应体系经UDG酶处理与否的HPV16-E7LAMP产物在凝胶电泳上是否会被UDG酶切割。得到的凝胶电泳图如图3所示。
由图3中泳道1和泳道2中UDG酶的加入，可以将拷贝数为109-1010copies的HPV16-E7dU-DNA扩增子基本完全消除，而泳道3和泳道4无UDG酶的加入，因此出现HPV16-E7dU-DNA的扩增条带，故可知UDG酶在PureU-LAMP中可以消除dU-DNA的扩增子。
1.3PureU-UDG-LAMP防污染体系对HPV16、HPV-18的检测灵敏度
具体步骤如下：
步骤1:获取待检测HPV16-E7(SEQ ID NO:1)和HPV18-L1(SEQ ID NO:2)合成质粒不同浓度的样本(1、10、102、103、104、105、106Copies/μL)：
步骤2：配制LAMP体系所需反应底物：
(1)HPV16-E7/HPV18-L1引物的配制：
所述LAMPPrimerMix为40nMF3/B3和60nM环导引物LoopF/LoopB，和160nM对应外部引物的内部引物FIP/BIP，以及80μLddH2O配制合成。
针对含有待检测的HPV16-E7靶标的样本，LAMP混合引物包括两条外部引物F3(SEQID NO:3)和B3(SEQ ID NO:4)，两条内部引物FIP(SEQ ID NO:5)和BIP(SEQ ID NO:6)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:7)和Loop B(SEQ ID NO:8)；
针对含有待检测的HPV18-L1靶标的样本，LAMP混合引物包括两条外部引物F3(SEQID NO:9)和B3(SEQ ID NO:10)，两条内部引物FIP(SEQ ID NO:11)和BIP(SEQ ID NO:12)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:13)和Loop B(SEQ ID NO:14)；
(2)PureU-UDG-LAMP反应体系的dU plus dNTP Mixture配制
所述dU plus dNTP Mixture为2.5nMdATP，2.5nMdCTP，2.5nMdGTP，7.5nMdUTP以及160μL ddH2O配制合成。
(3)PureU-UDG-LAMP反应体系的反应缓冲液配制
所述缓冲液为由4μL KOH(1M),10μL(NH4)2SO4(1M)、25μL KCl(2M)、1μLTween 20以及280μL ddH2O充分混合配制。
步骤3：针对不同浓度的HPV-18模板(1、10、102、103、104、105、106Copies/μL)实验组和对照组(H2O)的检测在LAMP反应管中加入以下物质：
2.4μL步骤(3)所述缓冲液、1μL Tween 20以及280μL ddH2O充分混合配制)、1.8μLLAMP混合引物(10×)、1.8μL dU plus dNTP Mixture(10mM)、1.8μL热敏UDG酶、0.6μL ZO5DNA聚合酶突变体(8U/μL)、0.5μL 20×EvaGreen(20×in water)、1.5μLMgSO4(100mM)、2.8μL NF Water、1.5μL待测靶标。
步骤4：PureU-UDG-LAMP扩增程序：反应均在The480InstrumentReal-Time PCR Detection System(Roche,USA)上进行；反应条件为37℃，10min；65℃，60min，每60s收集一次荧光信号；95℃2min。
以上实验平行重复三次，收集实时荧光PCR的信号曲线，并由Graphad Prism 9进行扩增曲线和统计分析图的绘制(参见图4)。
由图4可见，与对照组相比，实验组中1、10、102、103、104、105、106Copies/μL组产生扩增曲线；表明这五组实验组均发生了扩增，即本防污染体系对于HPV16和HPV-18的检测灵敏度可达到1Copy/μL。
1.4PureU-UDG-LAMP防污染反应体系对HPV16和HPV18的检测特异度
具体步骤如下：
步骤1:获取待检测病原菌的样本(包括HPV16，HPV18，HPV68，HPV 16+18，HPV 43，HPV 39+51+53，HPV43，生殖支原体Mg，淋病奈瑟菌NG，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌CRKP，沙眼衣原体CT，大肠杆菌O157：H7)作为实验组模板，H2O作为对照组模板。共12组。
上述各病原体样品从上海交通大学医学院附属仁济医院妇产科获得，符合临床伦理审查标准(伦理号：KY2021-111-B-CR-01)。
步骤2：配制LAMP体系所需反应底物：
(1)HPV16/HPV18引物的配制：
所述LAMP Primer Mix为40nM F3/B3和60nM环导引物LoopF/LoopB，和160nM对应外部引物的内部引物FIP/BIP，以及80μLddH2O配制合成。
针对含有待检测的HPV16靶标的样本，LAMP混合引物包括两条外部引物F3(SEQ IDNO:3)和B3(SEQ ID NO:4)，两条内部引物FIP(SEQ ID NO:5)和BIP(SEQ ID NO:6)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:7)和Loop B(SEQ ID NO:8)；
针对含有待检测的HPV18靶标的样本，LAMP混合引物包括两条外部引物F3(SEQ IDNO:9)和B3(SEQ ID NO:10)，两条内部引物FIP(SEQ ID NO:11)和BIP(SEQ ID NO:12)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:13)和Loop B(SEQ ID NO:14)；
(2)PureU-UDG-LAMP反应体系的dU plus dNTP Mixture配制
所述dU plus dNTP Mixture为所述四种脱氧核苷酸混合液,具体由2.5nM dATP，2.5nM dCTP，2.5nM dGTP，7.5nM dUTP以及160μL ddH2O配制合成。
(3)PureU-UDG-LAMP反应体系的反应缓冲液配制：所述缓冲液由4μL KOH(1M),10μL(NH4)2SO4(1M)、25μL KCl(2M)、1μL Tween 20以及280μL ddH2O充分混合配制。
步骤3：针对不同种类的病原菌样本(包括HPV16，HPV18，HPV68，HPV39，HPV51，HPV53，HPV43，生殖支原体病毒，淋病奈瑟菌，耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌，沙眼衣原体病毒，脑膜炎奈瑟菌NM，大肠杆菌O157：H7)实验组和对照组(H2O)，在含有HPV16和HPV18引物的LAMP反应管中分别加入以下反应底物：
2.4μL上述PureU-UDG-LAMP反应体系的缓冲液、1.8μL LAMP混合引物(10×)、1.8μL dU plus dNTP Mixture(10mM)、1.8μL热敏UDG酶、0.6μL ZO5 DNA聚合酶突变体(8U/μL)、0.5μL 20×EvaGreen(20×in water)、1.5μL MgSO4(100mM)、2.8μL NF Water、1.5μL待测靶标。
步骤4：PureU-UDG-LAMP扩增程序：反应均在The480InstrumentReal-Time PCR Detection System(Roche,USA)上进行；反应条件为37℃，10min；65℃，60min，每60s收集一次荧光信号；95℃2min。
以上实验平行重复三次，收集实时荧光PCR的信号曲线，并由Graphad Prism 9进行扩增曲线和统计分析图的绘制(参见图5)。
由图5可见，与对照组相比，实验组中只有HPV16组产生扩增曲线；表明该发生了扩增，而其他病原菌都无扩增，即证明了该反应对HPV16的特异度；同理图5证明了该反应对HPV18的特异度。
实施例2：唾液样本中人乳头瘤病毒16亚型、18亚型的检测
本实施例以人乳头瘤病毒16亚型-E7基因和18亚型-L1基因合成的质粒为样本，进行10倍梯度稀释，以103作为模板投入，并加入5μL唾液作为杂质。
具体步骤如下：
步骤1:收集人体口腔中的唾液，将待检测的HPV16-E7和HPV18-L1的质粒模板(104和105copies)加入5μL唾液作为实验组模板，将H2O加入5μL唾液作为对照组模板。
步骤2：配制LAMP体系所需反应底物：
(1)HPV16/HPV18引物的配制：
所述LAMPPrimerMix为40nM F3/B3和60nM环导引物LoopF/LoopB，和160nM对应外部引物的内部引物FIP/BIP，以及80μLddH2O配制合成。
针对含有待检测的HPV16靶标的样本，LAMP混合引物包括两条外部引物F3(SEQ IDNO:3)和B3(SEQ ID NO:4)，两条内部引物FIP(SEQ ID NO:5)和BIP(SEQ ID NO:6)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:7)和Loop B(SEQ ID NO:8)；
针对含有待检测的HPV18靶标的样本，LAMP混合引物包括两条外部引物F3(SEQ IDNO:9)和B3(SEQ ID NO:10)，两条内部引物FIP(SEQ ID NO:11)和BIP(SEQ ID NO:12)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:13)和Loop B(SEQ ID NO:14)；
(2)PureU-UDG-LAMP反应体系的dU plus dNTP Mixture配制
所述dU plus dNTP Mixture为所述四种脱氧核苷酸混合液,具体由2.5nM dATP，2.5nM dCTP，2.5nM dGTP，7.5nM dUTP以及165-180μL ddH2O配制合成。
(3)PureU-UDG-LAMP反应体系的反应缓冲液配制为由4μL KOH(1M),10μL(NH4)2SO4(1M)、25μL KCl(2M)、1μL Tween 20以及280μL ddH2O充分混合配制。
步骤3：针对实验组和对照组，在含有HPV16和HPV18引物的LAMP反应管中分别加入以下反应底物：2.4μL上述PureU-UDG-LAMP反应体系的缓冲液、1.8μL LAMP混合引物(10×)、1.8μL dU plus dNTP Mixture(10mM)、1.8μL热敏UDG酶、0.6μL ZO5DNA聚合酶突变体(8U/μL)、0.5μL 20×EvaGreen(20×in water)、1.5μL MgSO4(100mM)、2.8μL NF Water、1.5μL待测靶标。
步骤4：PureU-UDG-LAMP扩增程序：反应均在The480InstrumentReal-Time PCR Detection System(Roche,USA)上进行；反应条件为37℃，10min；65℃，60min，每60s收集一次荧光信号；95℃2min。
以上实验平行重复三次，收集实时荧光PCR的信号曲线，并由Graphad Prism 9进行扩增曲线和统计分析图的绘制。
实验结果如图6所示，实验组中唾液样本中的HPV16-E7和HPV18-L1有扩增，而对照组唾液样本中无扩增。证明PureU-UDG-LAMP体系可以应用于唾液中病毒的检测，具有现场检测的价值。
实施例3：宫颈上皮细胞中人乳头瘤病毒16亚型、18亚型的检测
本实施例用于PureU-UDG-LAMP防污染反应体系对宫颈上皮细胞中HPV16、HPV18的检测。
具体步骤如下：
步骤1：获取临床样本
宫颈上皮细胞拭子样本来自上海交通大学医学院附属仁济医院东院(qPCR结果已知)。
步骤2:样本中人乳头瘤病毒的DNA提取：
使用Blood&Tissue Kit进行宫颈上皮细胞中人乳头瘤病毒的DNA提取，并保存在-20摄氏度中待用。实验组在反应管中加入阳性临床样本，对照组加入等体积H2O。
步骤3：配制LAMP体系所需反应底物：
(1)HPV16/HPV18引物的配制：所述LAMPPrimerMix为40nM F3/B3和60nM环导引物LoopF/LoopB，和160nM对应外部引物的内部引物FIP/BIP，以及80μLddH2O配制合成。
针对含有待检测的HPV16靶标的样本，LAMP混合引物包括两条外部引物F3(SEQ IDNO:3)和B3(SEQ ID NO:4)，两条内部引物FIP(SEQ ID NO:5)和BIP(SEQ ID NO:6)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:7)和Loop B(SEQ ID NO:8)；
针对含有待检测的HPV18靶标的样本，LAMP混合引物包括两条外部引物F3(SEQ IDNO:9)和B3(SEQ ID NO:10)，两条内部引物FIP(SEQ ID NO:11)和BIP(SEQ ID NO:12)，和两条环导引物Loop F(SEQ ID NO:13)和Loop B(SEQ ID NO:14)；
(2)PureU-UDG-LAMP反应体系的dU plus dNTP Mixture配制
所述dU plus dNTP Mixture为所述四种脱氧核苷酸混合液,具体由2.5nM dATP，2.5nM dCTP，2.5nM dGTP，7.5nM dUTP以及160μL ddH2O配制合成。
(3)PureU-UDG-LAMP反应体系的反应缓冲液配制为由4μL KOH(1M),10μL(NH4)2SO4(1M)、25μL KCl(2M)、1μL Tween 20以及280μL ddH2O充分混合配制。
步骤3：针对实验组和对照组，在含有HPV16和HPV18引物的LAMP反应管中分别加入以下反应底物：2.4μL上述PureU-UDG-LAMP反应体系的缓冲液、1.8μL LAMP混合引物(10×)、1.8μL dU plus dNTP Mixture(10mM)、1.8μL热敏UDG酶、0.6μL ZO5DNA聚合酶突变体(8U/μL)、0.5μL 20×EvaGreen(20×in water)、1.5μL MgSO4(100mM)、2.8μL NF Water、1.5μL待测靶标。
步骤4：PureU-UDG-LAMP扩增程序：反应均在The480InstrumentReal-Time PCR Detection System(Roche,USA)上进行；反应条件为37℃，10min；65℃，60min，每60s收集一次荧光信号；95℃2min。
以上实验平行重复三次，收集实时荧光PCR的信号曲线，并由Graphad Prism 9进行扩增曲线和统计分析图的绘制。
实验结果如图7所示，HPV16和HPV18阳性的患者都可以通过PureU-UDG-LAMP成功扩增，而HPV58阳性患者和HPV阴性患者则无法扩增。实验结果和qPCR结果一致。表明该方法具有临床实际应用价值。
实施例4
本实例为基于环介导等温扩增的体系的CRISPR-Cas12a侧流层析试纸条检测HPV16和HPV18 PureU-LAMP扩增产物，具体步骤如下：
步骤1:获取待检测的不同浓度HPV16-E7质粒(SEQ ID NO:1)和HPV18-L1质粒(SEQID NO:2)模板和对照组(H2O)，进行Pure-uracil LAMP扩增得到扩增子；
步骤2：针对HPV16-E7质粒和HPV18-L1质粒，分别将其Pure-uracil LAMP阳性/阴性管扩增产物加入CRISPR-Cas12a反应管中，37℃，5-10min恒温孵育，具体步骤如下：
所述CRISPR-Cas12a侧流层析系统体系为每15μL体系内加入0.1μL LbaCas12a蛋白(100uM)、3μL CRISPR RNA (crRNA)(1uM)、3μL报告DNA探针(200nM)、1.5μLNEB反应缓冲液2.1(10×)、10.05μL无核酶水、1.5μL待测靶标。其中，针对HPV16靶标的crRNA序列为SEQID NO:15，针对HPV18靶标的crRNA序列为SEQ ID NO:16；报告DNA探针，其由TTATT组成，且所述报告RNA的序列5’端和3端分别标记FAM和生物素；所述HPV-16和HPV-18报告DNA探针的序列为SEQ ID NO:17。所述Cas12a购自New England BioLabs(NEB)Inc(USA)，所述CRISPRRNA购自金斯瑞生物科技公司(南京，中国)，所述报告DNA探针购自擎科生物公司(北京，中国)。
步骤3:将CRISPR-Cas12a恒温孵育产物中加入35ul无核酶水后插入商业化Cas12专用核酸检测试纸条，1-2分钟后目视化读取基因型结果。所述检测试纸条购自北京宝盈同汇生物科技公司(北京，中国)。
以上实验平行重复三次，观察试纸条的显色变化，由Image J进行试纸条色度分析,Prism 9(Graphpad)统计分析图的绘制。
如图9可见，实验组中的105Copies/μL的HPV16-E7和HPV18-L1的PureU LAMP扩增子在T线和C线上显色，重复性良好；对照组样本的试纸条上只在C线上有显色，未出现假阳性结果，由此可见超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法构建成功。
实施例5
本实例为基于环介导等温扩增的体系的超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法检测HPV16-E7和HPV18-L1的扩增灵敏度。具体步骤如下：
步骤1:获取待检测的不同浓度HPV16-E7质粒(SEQ ID NO:1)和HPV18-L1质粒(SEQID NO:2)模板和对照组(H2O)，进行Pure-uracil LAMP扩增得到扩增子；
步骤2：针对HPV16-E7质粒和HPV18-L1质粒，分别将其Pure-uracil LAMP阳性/阴性管扩增产物加入CRISPR-Cas12a反应管中，37℃，5-10min恒温孵育，具体步骤如下：
所述CRISPR-Cas12a侧流层析系统体系为每15μL体系内加入0.1μL LbaCas12a蛋白(100uM)、3μL CRISPR RNA(crRNA)(1uM)、3μL报告DNA探针(200nM)、1.5μL NEB反应缓冲液2.1(10×)、10.05μL无核酶水、1.5μL待测靶标。其中，针对HPV16靶标的crRNA序列为SEQID NO:15，针对HPV18靶标的crRNA序列为SEQ ID NO:16；报告DNA探针，其由TTATT组成，且所述报告RNA的序列5’端和3端分别标记FAM和生物素；所述HPV-16和HPV-18报告DNA探针的序列为SEQ ID NO:17。
步骤3:将CRISPR-Cas12a恒温孵育产物中加入35ul无核酶水后插入商业化Cas12专用核酸检测试纸条，1-2分钟后目视化读取基因型结果。
以上实验平行重复三次，观察试纸条的显色变化，由Image J进行试纸条色度分析,Prism 9(Graphpad)统计分析图的绘制。
由图10可见，与对照组相比，实验组中1，10、102、103、104、105、106Copies/μL组的HPV16-E7和HPV18-L1的PureU LAMP扩增子在T线和C线上显色，重复性良好；对照组样本的试纸条上只在C线上有显色，未出现假阳性结果，由此可见超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法的检测灵敏度可达到1Copies/μL。
实施例6
本实施例为基于环介导等温扩增的体系的超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法检测临床样本中的HPV-16和HPV18的特异性。具体步骤如下：
步骤1:在宫颈上皮细胞拭子样本中提取人乳头瘤病毒的全基因组DNA，同时针对不同种类的病原菌样本(包括HPV16，HPV18，HPV68，HPV39，HPV51，HPV58，HPV45，生殖支原体病毒，淋病奈瑟菌，沙眼衣原体病毒)和对照组(H2O)，进行Pure-uracil LAMP扩增得到扩增子；
宫颈上皮细胞拭子样本来自上海交通大学医学院附属仁济医院东院，已通过伦理审查(伦理号：KY2021-111-B-CR-01)，并通过qPCR检测明确检测结果。
步骤2：分别将临床样本的Pure-uracil LAMP扩增产物加入CRISPR-Cas12a反应管中，37℃，5-10min恒温孵育，具体步骤如下：
所述CRISPR-Cas12a侧流层析系统体系为每15μL体系内加入0.1μL LbaCas12a蛋白(100uM)、3μL CRISPR RNA(crRNA)(1uM)、3μL报告DNA探针(200nM)、1.5μLNEB反应缓冲液2.1(10×)、10.05μL无核酶水、1.5μL待测靶标。其中，针对HPV16靶标的crRNA序列为SEQ IDNO:15，针对HPV18靶标的crRNA序列为SEQ ID NO:16；报告DNA探针，其由TTATT组成，且所述报告RNA的序列5’端和3端分别标记FAM和生物素；所述HPV-16和HPV-18报告DNA探针的序列为SEQ ID NO:17。
步骤3:将CRISPR-Cas12a恒温孵育产物中加入35ul无核酶水后插入商业化Cas12专用核酸检测试纸条，1-2分钟后目视化读取基因型结果。
以上实验平行重复三次，观察试纸条的显色变化，由Image J进行试纸条色度分析,Prism 9(Graphpad)统计分析图的绘制。
图11为基于环介导等温扩增的体系的超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法检测HPV-16和HPV18的特异度。1-11分别为：HPV16，HPV18，HPV68，HPV39，HPV51，HPV58，HPV45，生殖支原体病毒，淋病奈瑟菌，沙眼衣原体病毒)和对照组(H2O)检测结果。由图11a可得，与对照组相比，实验组中只有HPV16组的PureU LAMP扩增子在T线和C线上显色；表明该发生了扩增，而其他病原菌都无扩增，对照组样本的试纸条上只在C线上有显色，未出现假阳性结果。即证明了该反应对HPV16的特异度；同11a证明了该反应对HPV18的特异度。11b的ImageJ结果同样证明该特异性结果。
实施例7
本实施例以人乳头瘤病毒16亚型-E7基因合和18亚型-L1基因合成的质粒为样本，进行10倍梯度稀释，以103copies/μL作为模板投入，并加入5μL唾液作为杂质，用于基于环介导等温扩增的体系的超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法检测唾液样本中的HPV-16和HPV18病毒。具体步骤如下：
步骤1:收集人体口腔中的唾液，将待检测的HPV16和HPV18的质粒模板(103copies/μL)加入5μL唾液作为实验组模板，将H2O加入5μL唾液作为对照组模板。进行Pure-uracil LAMP扩增得到HPV-16和HPV18扩增子；
步骤2：针对HPV16-E7和HPV18-L1HPV-16的crRNA，分别将临床样本的Pure-uracilLAMP扩增产物和阴性质控加入CRISPR-Cas12a反应管中，37℃，5-10min恒温孵育，具体步骤如下：
所述CRISPR-Cas12a侧流层析系统体系为每15μL体系内加入0.1μL LbaCas12a蛋白(100uM)、3μL CRISPR RNA(crRNA)(1uM)、3μL报告DNA探针(200nM)、1.5μLNEB反应缓冲液2.1(10×)、10.05μL无核酶水、1.5μL待测靶标。其中，针对HPV16靶标的crRNA序列为SEQ IDNO:15，针对HPV18靶标的crRNA序列为SEQ ID NO:16；报告DNA探针，其由TTATT组成，且所述报告RNA的序列5’端和3端分别标记FAM和生物素；所述HPV-16和HPV-18报告DNA探针的序列为SEQ ID NO:17。
步骤3:将CRISPR-Cas12a恒温孵育产物中加入35ul无核酶水后插入商业化Cas12专用核酸检测试纸条，1-2分钟后目视化读取基因型结果。
以上实验平行重复三次，观察试纸条的显色变化，由Image J进行试纸条色度分析,Prism 9(Graphpad)统计分析图的绘制。
由图12可见，试纸条1为HPV16阳性加标唾液样本检测结果；试纸条2为HPV18阳性加标唾液样本检测结果；试纸条3和试纸条4为阴性对照唾液样本检测结果。结果显示，唾液中含有HPV16和HPV18的样本都可以通过本超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法检测成功，而阴性对照组的样本则无法扩增。
实施例8
本实施例为基于环介导等温扩增的体系的超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法检测临床样本中的HPV-16和HPV18病毒。具体步骤如下：
步骤1:在宫颈上皮细胞拭子样本中提取人乳头瘤病毒的全基因组DNA和对照组(H2O)，进行Pure-uracil LAMP扩增得到HPV-16和HPV18扩增子；
宫颈上皮细胞拭子样本来自上海交通大学医学院附属仁济医院东院，已通过伦理审查(伦理号：KY2021-111-B-CR-01)，并通过qPCR检测明确检测结果。
步骤2：针对HPV16和HPV18的crRNA，分别将临床样本的Pure-uracil LAMP扩增产物和阴性质控加入CRISPR-Cas12a反应管中，37℃，5-10min恒温孵育，具体步骤如下：
所述CRISPR-Cas12a侧流层析系统体系为每15μL体系内加入0.1μL LbaCas12a蛋白(100uM)、3μL CRISPR RNA(crRNA)(1uM)、3μL报告DNA探针(200nM)、1.5μL NEB反应缓冲液2.1(10×)、10.05μL无核酶水、1.5μL待测靶标。其中，针对HPV16靶标的crRNA序列为SEQID NO:15，针对HPV18靶标的crRNA序列为SEQ ID NO:16；报告DNA探针，其由TTATT组成，且所述报告RNA的序列5’端和3端分别标记FAM和生物素；所述HPV-16和HPV-18报告DNA探针的序列为SEQ ID NO:17。
步骤3:将CRISPR-Cas12a恒温孵育产物中加入35ul无核酶水后插入商业化Cas12专用核酸检测试纸条，1-2分钟后目视化读取基因型结果。
以上实验平行重复三次，观察试纸条的显色变化，由Image J进行试纸条色度分析,Prism 9(Graphpad)统计分析图的绘制。
图13为超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法检测临床样本中HPV-16和HPV18。样本1：HPV16(+)；样本2：HPV18(+)；样本3：HPV16(+)+18(+)；样本4：HPV58(+)；样本5，样本6：HPV阴性。由图13可见，HPV16和HPV18阳性的患者都可以通过本超灵敏高精确免污染可视化的开放式核酸检测方法检测成功，而HPV58阳性患者和HPV阴性患者则无法扩增。实验结果和qPCR结果一致。表明该方法具有临床实际应用价值。
序列表
Claims (10)
1.一种基于环介导等温扩增的体系，其特征在于：等温扩增体系(PureU-UDG-LAMP)，所述PureU-UDG-LAMP防污染系统包括如下a1)-a3)；
a1)含dUTP、dATP、dGTP和dCTP的四种脱氧核苷酸混合液；
a2)ZO5 DNA聚合酶突变体、热敏UDG酶和缓冲液；
a3)待检测样品LAMP混合引物。
2.按权利要求1所述的基于环介导等温扩增的体系，其特征在于：所述PureU-UDG-LAMP防污染体系成分为每个体系内加入2-10μL缓冲液、LAMP混合引物(10×)、10-20mM四种脱氧核苷酸混合液、热敏UDG酶、ZO5 DNA聚合酶突变体、20×EvaGreen(20×in water)、MgSO4(100mM)、NF Water、待测靶标。
3.按权利要求1或2所述的基于环介导等温扩增的体系，其特征在于：所述缓冲液由2-5μL KOH(1M),10-12μL(NH4)2SO4(1M)、20-30μL KCl(2M)、1-5μL Tween 20以及250-300μLddH2O充分混合配制。
4.按权利要求1或2所述的基于环介导等温扩增的体系，其特征在于：所述四种脱氧核苷酸混合液为2-5nMdATP，2-5nMdCTP，2-5nMdGTP，5-10nMdUTP以及165-180μL ddH2O配制合成。
5.一种权利要求1所述的体系的应用，其特征在于：所述体系在作为环介导等温扩增体系中的应用。
6.按权利要求5所述的体系的应用，其特征在于：所述体系在作为环介导等温扩增体系检测病原体中的应用。
7.一种利用权利要求1所述的体系防污染分子诊断方法，其特征在于：
(1)采集含待检测细胞的拭子固定液；
(2)将固定液和洗脱液按照1:1的体积比在试管中进行充分混匀，静置10min；
(3)取洗脱液的上清液1-5ul加入预置上述权利要求1所述的PureU-UDG-LAMP反应液混匀30-40秒；
(4)反应管37℃恒温孵育10min；65℃恒温扩增30-60min；每60s读取一次信号，检测通道为FAM；观察荧光曲线变化，判断扩增结果；
(5)取1-5ul步骤(4)反应产物稀释100000倍，重复PureU-UDG-LAMP反应；观察荧光曲线变化，以判断是否出现污染子的扩增曲线。
8.一种利用权利要求1所述体系可视化的开放式核酸检测试剂盒，其特征在于：反应体系和核酸检测试纸；反应体系为权利要求1所述体系，待检测样品、待检测引物和探针、CRISPR-Cas12a侧流层析系统体系。
9.按权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述CRISPR-Cas12a侧流层析系统体系为每15μL体系内加入0.1μL LbaCas12a蛋白(50-200uM)、3μL CRISPR RNA(crRNA)(2-5uM)、3μL报告DNA探针(2-10uM)、NEB反应缓冲液2.1(10×)、5-10μL无核酶水、1.5μL待测靶标。
10.一种权利要求8所述试剂盒检测方法，其特征在于：
1)提取待测样本的核酸，利用权利要求1所述体系和引物进行LAMP扩增，得到LAMP扩增产物；
2)将LAMP扩增产物和所述crRNA、所述LbaCas12a(Cpf1)蛋白在含有所述报告DNA探针的体系中孵育5min，得到反应产物；
3)在2)所述反应产物中加无核酶水补足体积至50μL并加入核酸检测试纸条，静置观察5min；
4)若试纸没有T线显现且有C线显现，或者试纸只有T线显现，则待测样本含有待检测样品；若试纸仅有C线显现，则待测样本不含待检测样品。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |