CN114790493A - 一种单纯疱疹病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用,所述MNP标记位点是指在单纯疱疹病毒I型和2型基因组上筛选的区分于其他物种且在亚型内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域,包括MNP‑1~MNP‑14的标记位点;所述引物如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.28所示。所述MNP标记位点能特异的鉴定并分型单纯疱疹病毒;所述引物互不干扰,综合多重扩增和测序技术,可一次性对多样本的所有标记位点进行序列分析,具有高通量、多靶点、高灵敏、高精准和监测变异的检测优势,可应用于大规模样本的单纯疱疹病毒的鉴定和遗传变异检测,对单纯疱疹病毒的科研和防疫监测均具有重要意义。
Description
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域,特别涉及一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用。
背景技术
单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)是一类DNA病毒,能引起类多种疾病,如龈口炎(gingivostomatitis)、角膜结膜炎(keratoconjunctivitis)、脑炎(encephalitis)以及生殖系统感染和新生儿的感染。妊娠妇女感染HSV-I,病毒有可能经胎盘感染胎儿,造成流产、死胎或先天性畸形,新生儿疱疹是临床上常见而又严重的感染。因此HSV筛查是妊娠期妇女必检的项目之一。
已有的检测和分型方法主要基于抗原抗体反应,将HSV分为HSV-1和HSV-2两个血清型,但这种检测分型方法存在灵敏度低,分型不准确的局限。近年来,分子生物学的发展迅速,以遗传物质为基础的检测分型系统得以发展,其中包括基于RCA方法、荧光PCR和宏基因测序的方法。基于RCA和荧光PCR一次只检测HSV-1和HSV-2中的一种,或者同时检测两种,但检测的标记数目有限,通常是一种型只检测一个标记,且不能检测变异,少数几个位点的检测容易检测失败,存在检测效率低和准确性低的局限。基于测序技术的方法,比如宏基因组测序技术往往包括大量的宿主测序数据,尤其对HSV低浓度的样本进行检测时,需要超深度的测序,想要检测变异进行分型,会导致超高的难以接受的测序成本。已有的方法主要通过检测SNP标记进行亚型的区分,但SNP标记存在多态性低,分型错误率高和物种区分能力弱的局限。单纯疱疹病毒为群体性生物,群体中个体的变异导致在一个标记位点会存在多个等位基因型且存在低频的基因型,SNP标记是二态性标记,难以捕获群体生物普遍存在的多等位基因型,存在标记多态性低、检测方法准确性和灵敏度低的缺陷。
因此,开发单纯疱疹病毒的高多态性的新型分子标记及其高效、准确和灵敏的检测技术,成为亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用,可以一次性对单纯疱疹病毒I型和2型进行鉴定和变异检测,具有多靶标、高通量、高灵敏和精细分型的效果。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
在本发明的第一方面,提供了一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点,所述MNP标记位点为在单纯疱疹病毒1型和2型基因组上筛选的物种特异的、且在亚型内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域,包括以NC_001806.2为参考基因组的MNP-1~MNP-7的标记位点和以LS480640.1为参考基因组的MNP-8~MNP-14的标记位点。
上述技术方案中,MNP-1~MNP-14的标记位点具体如说明书表1所示,表1中标注的所述MNP标记的起始和终止位置是分别基于表1中NC_001806.2和LS480640.1的序列确定的。
在本发明的第二方面,提供了一种用于检测所述MNP标记位点的多重PCR引物组合物,所述多重PCR引物组合物包括14对引物,所述14对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.28所示。
上述技术方案中,每个MNP标记位点的引物包括上引物和下引物,具体如说明书表1所示。
在本发明的第三方面,提供了一种用于检测所述单纯疱疹病毒MNP标记位点的检测试剂盒,所述试剂盒包括所述的引物组合物。
进一步地,所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
在本发明的第四方面,提供了所述的单纯疱疹病毒的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在单纯疱疹病毒的鉴定和制备单纯疱疹病毒鉴定产品中的应用。
在本发明的第五方面,提供了所述的单纯疱疹病毒的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在检测单纯疱疹病毒毒株内部和毒株间遗传变异中的应用
在本发明的第六方面,提供了所述的单纯疱疹病毒的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在构建单纯疱疹病毒数据库中的应用。
在本发明的第七方面,提供了所述的单纯疱疹病毒的MNP标记位点或者所述的多重PCR引物组合物或者所述的检测试剂盒在单纯疱疹病毒分型检测中的应用。
以上所述的应用中,首先是获取待测样本的病毒总DNA;利用本发明的试剂盒对所述DNA和空白对照进行第一轮多重PCR扩增,循环数不高于25个;对扩增产物进行纯化后,进行基于第二轮PCR扩增的样本标签和二代测序接头添加;对第二轮扩增产物纯化后定量;检测多个毒株时通过将第二轮扩增产物等量混合后进行高通量测序;测序结果比对到所述的单纯疱疹病毒的参考序列上,获取在所述DNA中的检测序列数目和基因型数据。根据在所述DNA和所述空白对照获得的单纯疱疹病毒测序序列数量和检出MNP标记的数目,对所述DNA的测序数据进行数据质量控制和数据分析,获得在所述样本中检出的单纯疱疹病毒MNP标记数目、覆盖每个所述MNP标记的测序序列数目和所述MNP标记基因型数据。
当用于单纯疱疹病毒鉴定时,根据在待测样品和空白对照中检出的单纯疱疹病毒的测序序列数量和检出MNP标记的数目,进行质控后判定待测样品中是否含有单纯疱疹病毒的核酸。其中,所述的质控方案和判定方法是以拷贝数已知的单纯疱疹病毒的DNA为检测样本,评估所述试剂盒检测单纯疱疹病毒的灵敏度、准确性和特异性,制定所述试剂盒检测单纯疱疹病毒时的质控方案和判定方法。
当用于单纯疱疹病毒遗传变异检测时,包括毒株间和毒株内部的遗传变异检测。毒株间的遗传变异检测包括利用所述的试剂盒和方法,获得待比较毒株各自在检出的所述MNP标记的基因型数据。通过基因型比对,分析待比较毒株在所述MNP标记位点上的主基因型是否存在差异。若待比较毒株在至少一个MNP标记的主基因型存在变异,则判定两者存在遗传变异。作为一种备选方案,也可以通过单重PCR对待比较毒株的14个MNP标记位点分别进行扩增,然后对扩增产物进行Sanger测序,获得序列后,对待比较毒株每个MNP标记的基因型进行比对。如果存在主基因型(在一个MNP标记具有超过50%测序片段支持的基因型)不一致的MNP标记,则待比较毒株之间存在变异。当检测毒株内部的遗传变异时,则通过统计模型判定在待测毒株所述的MNP标记是否检出主基因型以外的次基因型。若待测毒株在至少一个MNP标记存在次基因型,则判定待测毒株内部存在遗传变异。
当用于构建单纯疱疹病毒DNA指纹数据库时,将从样本中鉴定的单纯疱疹病毒的所述MNP标记的基因型数据,录入数据库文件,构成单纯疱疹病毒的DNA指纹数据库;每次鉴定不同的样本时,通过和所述单纯疱疹病毒的DNA指纹数据库比对,鉴定样本中的单纯疱疹病毒是否和数据库中的毒株在所述MNP标记存在主基因型的差异,在至少1个MNP标记存在主基因型差异的单纯疱疹病毒即为新的变异类型,收录进DNA指纹数据库。
当用于单纯疱疹病毒分型检测时,是对待测样本中的单纯疱疹病毒进行鉴定,获得待测样本中单纯疱疹病毒在每个所述MNP标记的基因型;收集网上公开的单纯疱疹病毒的基因组序列和已构建的单纯疱疹病毒DNA指纹数据库组成单纯疱疹病毒参考序列库;将待测样本中单纯疱疹病毒的基因型和所述单纯疱疹病毒的参考序列库进行比对;根据同所述参考序列库的比对结果,鉴定待测样本中的单纯疱疹病毒属于已有的型还是新的变异类型,获得待测样本中单纯疱疹病毒的分型。
本发明在单纯疱疹病毒领域属于首创,并未见相关文献报道;MNP标记主要基于参考序列开发,根据已报道的单纯疱疹病毒代表株的重测序数据可以挖掘大规模的区分于其他物种、在单纯疱疹病毒亚型内部多态、两侧序列保守的MNP标记;通过MNP标记两侧的保守序列可以设计适用于多重PCR扩增的MNP标记检测引物;再根据标准品的测试结果,可筛选出一套多态性最大、特异性高的一套MNP标记和兼容性最好的一套标记检测引物组合物以及检测试剂盒。
本发明实施例中的一个或多个技术方案,至少具有如下技术效果或优点:
本发明提供了一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用,所提供的单纯疱疹病毒的14个MNP标记和其引物组合,可进行多重PCR扩增,融合二代测序平台进行扩增产物的测序,满足一次性对2种单纯疱疹病毒亚型进行高通量、高效率、高准确性和高灵敏度检测和区分的需求,满足单纯疱疹病毒标准的、可共享的指纹数据构建的要求;满足准确检测单纯疱疹病毒毒株间和毒株内部遗传变异的需求,为单纯疱疹病毒的科学研究、科学监测和防治提供技术支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明实施例的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为MNP标记多态性原理图;
图2为单纯疱疹病毒MNP标记位点的筛选和引物设计流程图;
图3为MNP标记位点的检测流程图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例,具体阐述本发明实施例,本发明实施例的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解,这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明实施例,而非限制本发明实施例。
在整个说明书中,除非另有特别说明,本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此,除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明实施例所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾,本说明书优先。
除非另有特别说明,本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等,均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题,总体思路如下:
本发明开发物种特异的新型分子标记-MNP标记。MNP标记是指在基因组上一段区域内由多个核苷酸引起的多态性标记。与SSR标记和SNP标记相比,MNP标记具有以下优势:(1)等位基因丰富,单个MNP标记上有2n种等位基因,高于SSR和SNP,适用于群体生物的鉴定;(2)物种区分能力强,只需要少量的MNP标记就能实现物种鉴定,减少了检测错误率。基于超多重PCR结合二代高通量测序技术检测MNP标记的MNP标记法具有以下优势:(1)输出的是碱基序列,无需平行实验,可构建标准化的数据库进行共享共用;(2)高效率,利用样品DNA条形码,突破测序样品数量的局限,可一次性对成百上千份样本的数万个MNP标记分型;(3)高灵敏度,利用多重PCR一次检测多个靶标,避免单个靶标扩增失败导致高的假阴性和低的灵敏度;(4)高准确性,利用二代高通量测序仪对扩增产物测序数百次。
鉴于以上优点和特性,MNP标记及其检测技术MNP标记法可实现群体生物多等位基因型的分类与溯源,在病原微生物的鉴定、指纹数据库构建、遗传变异检测等方面都具有应用潜力。目前在单纯疱疹病毒的检测中,尚未有关于MNP标记的报道,也缺乏相应的技术。
因此,本发明开发了单纯疱疹病毒的MNP标记位点,所述MNP标记位点为在单纯疱疹病毒基因组上筛选的区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域,包括以NC_001806.2为参考基因组的MNP-1~MNP-7的标记位点和以LS480640.1为参考基因组的MNP-8~MNP-14的标记位点。其中,MNP-1~MNP-7的标记位点为单纯疱疹病毒1型的MNP标记,MNP-8~MNP-14的标记位点为单纯疱疹病毒2型的MNP标记。
接着,本发明开发了所述单纯疱疹病毒MNP标记位点的多重PCR引物组合物,所述多重PCR引物组合物包括14对引物,所述14对引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1~SEQ IDNO.28所示。所述引物互相间不冲突,可以通过多重PCR进行高效的扩增。
所述多重PCR引物组合物可以作为单纯疱疹病毒MNP标记位点的检测试剂盒。
本发明所提供的试剂盒能准确、灵敏的检测到低至10拷贝/反应的单纯疱疹病毒1型和2型。
本发明重现性试验中每个样品不同文库间、不同建库批次间MNP标记主基因型的差异对数为0,重现率r=100%,准确率a=100%。
本发明的MNP标记和所述试剂盒在复杂模板中检测目标微生物具有高特异性。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用进行详细说明。
实施例1、单纯疱疹病毒MNP标记位点的筛选和多重PCR扩增引物的设计
S1、单纯疱疹病毒MNP标记位点的筛选
基于网上公开的17960个HSV不同血清型分离株的基因组序列,通过序列比对,获得7个HSV-1特异的、7个HSV-2特异的,共计14个MNP标记位点。对于网上不存在基因组数据的物种,也可以通过高通量测序获得待检测微生物物种代表分离株的基因组序列信息,其中高通量测序可以是全基因组或简化基因组测序。为了保证所筛选标记的多态性,一般使用至少10个遗传上具有代表性的分离株的基因组序列作为参考。筛选的14个MNP标记位点如表1所示:
表1-所述MNP标记位点以及检测引物在参考序列上的起始位置
所述步骤S1具体包括:
选择所述单纯疱疹病毒的一个代表株的基因组序列作为参考基因组,将所述基因组序列和所述参考基因组进行序列比对,获得所述单纯疱疹病毒各毒株的单核酸多态性位点;
在所述参考基因组上,以100~300bp为窗口,以1bp为步长进行窗口平移,筛选获得多个候选MNP标记区域,其中,所述候选MNP标记区域含有≥2个所述单核苷酸变异位点,且两端各30bp的序列上均不存在所述单核酸多态性位点;
在所述候选多核苷酸多态性位点区域中筛选区分度DP≥0.2的区域作为候选MNP标记位点;其中,DP=d/t,t是在所述候选多核苷酸多态性位点区域中所有小种两两比较时的比较对数,d是在所述候选多核苷酸多态性位点区域中至少两个单核酸多态性差异的样品对数。
作为一种可选的实施方式,在所述参考基因组上,以100~300bp为窗口进行筛选时,也可选用其他步长,本实施方式采用步长为1bp,有利于全面的筛选。
S2、多重PCR扩增引物的设计
通过引物设计软件设计所述候选MNP标记的多重PCR扩增引物,引物设计遵循引物间互不干扰,所有引物可以组合成引物池进行多重PCR扩增,即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增。
S3、引物组合的检测效率评估
将购买的HSV-1型(商品货号:BDS-BW-050,广州邦德盛生物科技有限公司)和2型(商品货号:BDS-BW-041,广州邦德盛生物科技有限公司)的DNA标准物质和等比例混合的混合样,分别加入到2ng/反应的人基因组DNA中,制备HSV模拟单样本和混合样本,通过所述的MNP标记检测试剂盒对模拟单样本和混合样本进行检测,每个样本构建3个重复的测序文库,对测序数据进行分析,根据检出的位点,筛选特异性高和区分度最高的一套MNP标记位点和一套亚型特异、兼容性最优的引物组合。单纯疱疹病毒MNP标记检测分析结果如表2所述;
表2-单纯疱疹病毒MNP标记检测分析
由表2可知,本发明所提供的引物组合(表1)在测试的2个HSV单样本中都检出了每种亚型的特异位点,在混合样本的3个重复中,所有混入的2个HSV类型也全部检出。
实施例2、MNP标记和引物鉴定单纯疱疹病毒的性能评估和阈值设置
本实施例中,将拷贝数已知的单纯疱疹病毒1型和2型的核酸分别加入到基因组DNA中,制备1拷贝/反应、10拷贝/反应和100拷贝/反应的3种单纯疱疹病毒模拟样本。同时设置等体积的无菌水作为空白对照。每种病毒检测4个样本,每个样本每天构建3个重复文库,连续检测4天,即每种病毒的每个样本获得12组测序数据,表3展示了单纯疱疹病毒1型的数据分析结果。根据在12次重复实验中,在空白对照和模拟样品中检出的单纯疱疹病毒1型和2型的MNP标记的测序片段数和位点数,评估检测方法的重现性、准确性、灵敏度,制定质控体系污染和目标病原体检出的阈值。MNP标记的检测流程如图3所示。
1、MNP标记和试剂盒检测单纯疱疹病毒的灵敏度和稳定性评估
表3-MNP标记和试剂盒检测HSV-1型的灵敏度、稳定性分析
如表3所示,所述MNP标记和试剂盒能在10拷贝/反应的样本的连续4天产生的12组检测中稳定的检出至少4个MNP标记,而在0拷贝/反应的样本中最多检出1个MNP标记,在1拷贝/反应的样本的12组检测中能检出2个以上MNP标记,表明所述MNP标记和试剂盒具有低至10拷贝/反应,甚至1拷贝/反应的检测灵敏度和技术稳定性。
2、MNP标记和试剂盒检测单纯疱疹病毒的重现性和准确性评估
基于两次重复中,共同检出位点的基因型是否可重现,评估MNP标记检测方法检测单纯疱疹病毒的重现性和准确性。具体地,对100拷贝/反应的样本的12组数据产生的基因型分别进行两两比较,结果如表4所示。
表4-MNP标记和试剂盒检测HSV-1型的重现性和准确率评估
由表4可知,主基因型存在差异的MNP标记数目都为0;依据2次重复实验间可重现的基因型认为是准确的原则,准确率a=1-(1-r)/2=0.5+0.5r,r代表重现率,即主基因型可重现的位点数目占共有位点数目的比率。本发明重现性试验中每个样品不同文库间、不同建库批次间MNP标记主基因型的差异对数为0,重现率r=100%,准确率a=100%。
3、MNP标记检测试剂盒检出单纯疱疹病毒的阈值设置
如表3所示,在1个拷贝/反应的样本中多数能检出2-4个单纯疱疹病毒的MNP标记。而在部分空白对照中也检出了单纯疱疹病毒的MNP标记。由于MNP标记检测方法的极度灵敏,因此检测过中的数据污染容易导致假阳性的产生。因此本实例中根据对连续4天不同拷贝数的阳性标准品的测试结果,制定如下质控方案和判定阈值。
质控方案具体如下:
1)测序数据量大于4.2百万碱基。测算依据是每个样品检测MNP标记的数目是14个,一条测序片段的长度是300个碱基左右,所以当数据量大于4.2百万碱基时,大部分样品一次实验可以保证覆盖每个位点的测序片段数量达到1000倍,保证对每个MNP标记碱基序列的精准分析。
2)根据测试样品中的单纯疱疹病毒的信号指数S和空白对照中单纯疱疹病毒的噪音指数P判定污染是否可接受,其中:
空白对照噪音指数P=nc/Nc,其中nc和Nc分别代表空白对照中,单纯疱疹病毒的测序片段的数量和总测序片段数目。
3)测试样品的信号指数S=nt/Nt,其中nt和Nt分别代表测试样品中,单纯疱疹病毒的测序片段的数量和总测序片段数目。
4)计算测试样品中MNP标记位点的检出率,指的是检出位点数和总设计位点数的比值。
表5-4个样本12次检测中HSV-1型病毒的信噪比
结果如表5所示,HSV-1型在空白对照中的噪音指数平均值是0.02%,而在1个拷贝的样品中的信号指数平均值是0.23%,1个拷贝的样品和空白对照的信噪比的平均值是11.5,因此,本发明规定当信噪比大于11.5倍时,可判定检测体系中的污染是可接受的。
在10个拷贝的样品和空白对照中HSV-1型的信噪比的平均值是118.5,在10拷贝/反应的12组数据中,能稳定的检出至少4个HSV-1型特异MNP标记,占总位点的57.1%。因此,在保证准确性并兼顾灵敏度的情况下,本发明对HSV-1型阳性的判定标准是:当样品中HSV-1型的信噪比大于60,且位点检出率大于等于29%时,判定样本中检出了HSV-1型的核酸。
在10个拷贝的样品中,HSV-2型的信噪比平均值为58.4,位点检出率42.8%,因此,在保证准确性并兼顾灵敏度的情况下,本发明对HSV-2型阳性的判定标准是信噪比大于30,且当位点检出率大于等于22%时,判定样本中检出了HSV-2型的核酸。
在此判定阈值下,本发明所提供的试剂盒能准确、灵敏的检测到低至10拷贝/反应的HSV-1和2型。
4、MNP标记检测方法检测单纯疱疹病毒的特异性评估
人为的将HSV-1,HSV-2和不动杆菌属菌株、百日咳鲍特菌、霍氏鲍特菌、肺炎衣原体、肺炎支原体、酿脓链球菌、肺炎链球菌、水痘-带状疱疹病毒、巨细胞病毒、人博卡病毒、肺炎克雷伯杆菌、军团菌属、卡他莫拉菌、立克次氏体属、金黄色葡萄球菌、、结核分枝杆菌的DNA按照等摩尔量的混在一起,制备混合模板,以无菌水模板作为空白对照,采用本发明所提供的方法对混合模板和空白对照中的HSV进行检测,进行3个重复实验。在3个重复实验中,都能检出HSV-1型和2型各自特异的7个MNP标记。按照本发明所述的质控方案和判定方案进行分析后,在3个重复实验中都判定2种HSV检出阳性,表明所述引物和检测方法在复杂模板中检测HSV的高特异性。
综上可知,获得了鉴定HSV的高效率的MNP标记引物组合及其检测方法,可以高灵敏度、高准确性、特异的检测样本中的HSV。
实施例3、单纯疱疹病毒毒株间的遗传变异检测
利用所述的试剂盒对湖北省疾病预防控制中心提供的HSV-1型和2型毒株各3份进行检测,样本依次命名为S1-S6,每个样品的每个标记的测序平均覆盖倍数达1202倍。其中HSV-1型的3个毒株是同一个毒株不同时期保存的3份子代株。结果如表6所示,每个毒株均可以检出7个MNP标记(表6)。将6个毒株的指纹图谱进行两两比对,可将6份毒株分成2个亚型,S1-S3属于一种亚型,S4-S6属于一种亚型。S1-S3是同一个毒株不同时期保存的3份子代株,S1和S2、S3均在2个标记存在主基因型差异(表6),表明存在毒株间变异。
表6-6个单纯疱疹病毒的检测分析
所述的MNP标记和试剂盒鉴定毒株间遗传变异的应用可以用于保证不同实验室相同命名单纯疱疹病毒毒株的遗传一致性,从而保证研究结果的可比较性,这对于单纯疱疹病毒的科学研究具有重要意义。而在临床上,可针对差异位点是否影响抗药性斟酌诊断方案。
实施例4、单纯疱疹病毒毒株内部的遗传变异检测
作为群体生物,单纯疱疹病毒群体内部部分个体发生变异,使群体不再纯合,形成异质的杂合群体,影响尤其是试验用微生物表型的稳定性和一致性。这种变异体在对群体进行分子标记检测时,表现为位点的主基因型外的等位基因型。当变异个体还未累积时,只占群体的极少部分,表现为低频率的等位基因型。低频率的等位基因型往往和技术错误混在一起,导致现有技术难以区分。本发明检测的是高多态性的MNP标记。基于多个错误同时发生的几率低于一个错误发生的几率,MNP标记的技术错误率显著低于SNP标记。
本实施例次等位基因型的真实性评估按如下进行:首先按照以下规则排除具有链偏好性(在DNA双链上覆盖的测序序列数的比值)的等位基因型:链偏好性大于10倍,或者与主等位基因型的链偏好性之差大于5倍。
不存在链偏好性的基因型基于表7测序序列数目和比例判定其真实性。表7列出了基于BINOM.INV函数计算在α=99.9999%的概率保障下,emax(n=1)和emax(n≥2)分别为1.03%和0.0994%时,在各个位点中次等位基因型测序序列数目的临界值,只有次等位基因型的测序序列数目超过临界值时判定为真实的次等位基因型。当存在多个候选次等位基因时,对各候选等位基因型的P值进行多重校正,FDR<0.5%的候选等位基因判定是真实的次等位基因型。
表7-部分测序深度下进行判定次等位基因型的临界值
表7涉及到的参数emax(n=1)和emax(n≥2)指的是携带n个SNP的错误等位基因的测序序列数占该位点总测序序列数的最高比例。emax(n=1)和emax(n≥2)分别为1.03%和0.0994%是根据在930个纯合MNP标记检测到的所有次等位基因型的频率获得。
按照上述参数,将S1和S2两个毒株的核酸按照以下8个比例1/1000,3/1000,5/1000,7/1000,1/100,3/100,5/100,7/100混合,制备人工杂合样本,每个样本检测3次重复,获得共计24个测序数据。通过和所述两个毒株的MNP标记的基因型进行精准比对,在24个人工杂合样本中均检测到了存在杂合基因型的位点,说明了所开发的单纯疱疹病毒的MNP标记检测方法在检测毒株群体内部遗传变异的适用性。
实施例5、单纯疱疹病毒DNA指纹数据库的构建
利用常规CTAB法、商业化试剂盒等方法提取用于构建单纯疱疹病毒DNA指纹数据库的所有毒株或是样本的DNA,采用琼脂糖凝胶和紫外分光光度计检测DNA的质量。若所提取的DNA在260nm与230nm处的吸光度值的比值大于2.0,260nm与520nm吸光度值比值介于1.6与1.8之间,DNA电泳主带明显,无明显降解和RNA残留,则说明基因组DNA达到相关的质量要求,可进行后续实验。
采用本发明提供的试剂盒,对表2和表6所示的单纯疱疹病毒的MNP标记进行检测,将获得测序数据同参考基因型库进行序列比对后获得每个毒株在每个标记位点的主基因型,形成每个毒株的MNP指纹图谱,并录入数据库文件,形成单纯疱疹病毒的DNA指纹数据库。每次检测的样本或毒株的MNP指纹图谱同构建的MNP指纹数据库进行比对后,主基因型存在差异的毒株的MNP指纹图谱均可录入所构建的MNP指纹数据库。因此,理论上,所构建的MNP指纹数据库可以不断的更新和充实。因为所构建的数据库是基于检测的毒株的基因序列,因此和所有的高通量测序数据兼容,具有完全可共建共享、随时可更新的特征。
实施例6、在单纯疱疹病毒分型中的应用
如表2所示,将单纯疱疹病毒的核酸混合在一起,以空白样品作为对照,采用本发明所提供的试剂盒对混合模板中的单纯疱疹病毒进行检测,进行3个重复实验。按照所述的质控方案和判定方案进行分析,3次重复实验中,HSV-1型特异的和HSV-2型各自特异的7个MNP标记均被检出,表明所述MNP标记和试剂盒能成功的同时鉴定并区分HSV的2种类型。在表6检测的6份菌株,也成功的将6份菌株分为2个亚型,表明所述MNP标记和试剂盒可以精细分型样本中的单纯疱疹病毒,从而可用于单纯疱疹病毒流行株的监测。
最后,还需要说明的是,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例,但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念,则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以,所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然,本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样,倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cactgcatgg agccggtc 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctgtggacg acggacaa 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gagttttccc cgcatccaga 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagggctttg caaaccagat attc 24
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gggaggagtt cgagaagctc t 21
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggttcaccgc gtctttgaac 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gccgtgggat ccaagactg 19
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggtctgcctc tccgacct 18
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcttcgaaac taccccaggg 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgtgggcta aataccggta gag 23
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggtttatata ttcagctacg acgca 25
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccaataaac aaaaggttac tcgga 25
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tagtccggct cgtaggcc 18
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaaggtcgaa catgaggagc tg 22
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtgcctccg agtctacg 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cggtcagggt cgtgttcaa 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctggtacacg gcgaggttg 19
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atcgaggggc gcaactttaa gttc 24
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgctacactg gtgggtgg 18
<210> 20
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
catggccacc cgatccga 18
<210> 21
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
caatggaaaa gcccgtcgg 19
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gctcctcctg tacgtgaaca tc 22
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gccgggtccg ttgtatctt 19
<210> 24
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cccggacctg cttcggag 18
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgctccacac atcgcttgtt 20
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cttcgaacac caaaaactgc gat 23
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgatctcccc gcttacgtc 19
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cgcaggtcct tacggatc 18
Claims (8)
1.一种单纯疱疹病毒的MNP标记位点,其特征在于,所述MNP标记位点为在单纯疱疹病毒I型和2型基因组上筛选的区分于其他物种且在亚型内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域,包括以NC_001806.2为参考基因组的MNP-1~MNP-17的标记位点和以LS480640.1为参考基因组的MNP-8~MNP-14的标记位点。
2.一种用于检测权利要求1所述单纯疱疹病毒MNP标记位点的多重PCR引物组合物,其特征在于,所述多重PCR引物组合物包括14对引物,所述14对引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.1~SEQ ID NO.28所示。
3.一种用于检测权利要求1所述单纯疱疹病毒MNP标记位点的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括权利要求2所述的引物组合物。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
5.一种权利要求1所述的单纯疱疹病毒的MNP标记位点或权利要求2所述的引物组合物或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在单纯疱疹病毒鉴定和制备单纯疱疹病毒鉴定产品中的应用。
6.一种权利要求1所述的单纯疱疹病毒的MNP标记位点或权利要求2所述的引物组合物或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在检测单纯疱疹病毒毒株内部和毒株间遗传变异中的应用。
7.一种权利要求1所述的单纯疱疹病毒的MNP标记位点或权利要求2所述的引物组合物或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在构建单纯疱疹病毒数据库中的应用。
8.一种权利要求1所述的单纯疱疹病毒的MNP标记位点或权利要求2所述的引物组合物或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在单纯疱疹病毒分型检测中的应用。
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