CN114277183A - 一种5种人肠病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 - Google Patents
一种5种人肠病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114277183A CN114277183A CN202111309311.2A CN202111309311A CN114277183A CN 114277183 A CN114277183 A CN 114277183A CN 202111309311 A CN202111309311 A CN 202111309311A CN 114277183 A CN114277183 A CN 114277183A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- artificial sequence
- mnp
- dna
- human
- marker
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于分子生物学技术领域，本发明公开了一种5种人肠病毒的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用，所述MNP标记组合包括人肠病毒基因参考序列上的52个标记，具体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑SEQ ID NO.52所示；所述引物核酸如SEQ ID NO.53‑SEQ ID NO.156所示。所述MNP标记组合能特异的鉴定5种人肠病毒并精细的区分每种人肠病毒不同的亚型；所述引物互不干扰，综合多重扩增和测序技术，可一次性对多样本的所有标记组合进行序列分析，具有高通量、多靶点、高灵敏和免培养的检测优势，可应用于医学、食品、环境、海关等领域大规模样本的人肠病毒的鉴定和流行株的监测，具有广泛的应用范围，对人肠病毒的监测和防治具有重要意义。
Description
技术领域
本发明实施例涉及生物技术领域，特别涉及一种5种人肠病毒的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用。
背景技术
人肠病毒是小RNA病毒科的一个属，其遗传物质为RNA病毒，已报道的有脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)、致肠细胞病变人孤儿病毒(ECHO，简称埃可病毒)和新型肠道病毒等共70 多个血清型。人是肠道病毒的唯一自然寄主，病毒通过人与人之间的密切接触(通过手指、餐具和食物)传播扩散。粪－口是主要的传播途径，偶然也可以通过飞沫传播。从粪中排病毒的时间较长，可持续几周。肠道病毒属病毒引起的传染病，临床表现轻者只有倦怠，乏力，低热等，重者可全身感染，脑，脊髓，心，肝等重要器官受损，预后较差，并可遗留后遗症或造成死亡。本类疾病分布于世界各地，在热带和亚热带全年都有，在温暖，潮湿，卫生条件差，人群拥挤的地区发病率高。
人肠病毒分布广泛，型类众多，已知的柯萨奇病毒分为a、b两组，a组有约24型病毒，b组有6型病毒；埃可病毒有34个型，除柯萨奇病毒和埃可病毒，人肠病毒还有其他的C型和D型以及68、 69、70、71、72型新型肠道病毒，这就对人肠病毒的检测技术提出了挑战。其中EV71型因为曾引起小儿手足口病的大流行而备受关注，是重点检疫和预防接种的对象。
现有的人肠病毒检测技术主要通过病毒的分离鉴定，依赖于检测病原和抗体进行血清型鉴定、间接或直接免疫荧光法和检测遗传物质的分子检测技术，包括PCR、核苷酸杂交和测序技术。这些技术各有优势，但在时长、操作复杂度、检测通量、检测变异的准确性和灵敏度、成本等方面也存在一个或多个局限。比如病毒分离鉴定操作复杂、耗时长；血清型鉴定、间接或直接免疫荧光法容易出现交叉反应，导致检测不准确，且不能监测变异；PCR检测技术主要是针对一种病毒的单个亚型的1到2个标记进行检测，效率低下，且容易由于病毒的变异导致检测失败。宏基因组测序技术是另一种检测人肠病毒的技术，但其往往包括大量的宿主测序数据，对低病毒载量的样本进行检测时，尤其需要超深度的测序，导致高的成本。因此，开发快速、准确的、一次性高通量的检测分型多种人肠病毒的人肠病毒检测分析方法对于人肠病毒的检测和防疫都具有重要意义。
本发明开发了新型分子标记-MNP标记，并融合超多重PCR扩增和高通量测序技术分析检测MNP标记，一次性对成百上千份样本的数万个MNP标记进行分型，实现对人肠病毒的高通量、灵敏检测和精准分型，具有样本需要量少、同时覆盖柯萨奇病毒、埃可病毒、C型、D型和EV71型人肠病毒，诊断结果精确，节约数据量、检测亚型的优势。
MNP标记是指在基因组上一段区域内由多个核苷酸引起的多态性标记。与传统的SSR标记和SNP标记相比，MNP标记具有以下优势：(1)等位基因型丰富，单个MNP标记上有2n种等位基因型，高于SSR和SNP；(2)物种区分能力强，只需要少量的MNP标记就能实现物种鉴定，减少了检测错误率。基于超多重PCR结合二代高通量测序技术检测MNP标记的MNP标记法具有以下优势：(1)输出的是碱基序列，无需平行实验，可构建标准化的数据库进行共享共用；(2)高效率，利用样品DNA条形码，突破测序样品数量的局限，可一次性对成百上千份样本的数万个MNP标记分型；(3)高灵敏度，利用多重PCR一次检测多个靶标，避免单个靶标扩增失败导致高的假阴性和低的灵敏度；(4)高准确性，利用二代高通量测序仪对扩增产物测序数百次。
鉴于以上优点和特性，MNP标记及其检测技术MNP标记法在同时鉴定分型多种病毒、指纹数据库构建、遗传变异检测等方面都具有应用潜力。目前在人肠病毒的检测中，尚未有关于MNP标记的报道，也缺乏相应的技术。本发明所开发的标记和引物组合也将用于制定病原体检测的国家标准(计划编号20201830-T-469)，该国家标准将于2021年底发布。
发明内容
本发明目的是提供一种5种人肠病毒的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用，可以一次性对柯萨奇病毒、埃可病毒、C 型、D型和EV71型合计5种人肠病毒进行鉴定和变异检测，具有多靶标、高通量、高灵敏、精细分型和免分离培养的效果。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种5种人肠病毒的MNP标记组合，所述MNP标记组合是指在人肠病毒基因组上分别筛选的保守的、区分于其他物种且在物种内部具有多个核苷酸多态性的基因组区域，包括人肠病毒参考序列上MNP-1～MNP-52的52个标记。
上述技术方案中，MNP-1～MNP-52的标记的具体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQID NO.52所示。
说明书表1对其进一步说明，表1中标注的所述MNP标记的起始和终止位置是基于表1中MNP同一行对应的参考序列确定的。
在本发明的第二方面，提供了一种用于检测所述MNP标记组合的多重PCR引物对组合，所述多重PCR引物对组合包括52对引物，具体的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.53-SEQID NO.156所示，其中 ID NO.53-SEQ ID NO.104为上引物ID NO.105-SEQ ID NO.156为下引物。
上述技术方案中，每个MNP标记的引物包括上引物和下引物，具体如说明书表1所示。
在本发明的第三方面，提供了一种用于检测所述5种人肠病毒 MNP标记组合的检测试剂盒，所述试剂盒包括所述的引物对组合。
进一步地，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
以及所述的5种人肠病毒的MNP标记组合、引物对组合、检测试剂盒在非疹断目的的人肠病毒检测中的应用，在制备人肠病毒检测产品中的应用。
在本发明的第四方面，提供了所述的5种人肠病毒的MNP标记组合或者所述的多重PCR引物对组合或者所述的检测试剂盒在人肠病毒的鉴定、遗传变异检测、MNP指纹数据库的构建和精细分型中的应用。
以上所述的应用中，首先是获取待测样本的病毒总RNA；利用商业化试剂盒对所述总RNA进行cDNA合成；利用本发明的试剂盒对所述cDNA和空白对照进行第一轮多重PCR扩增，循环数不高于 25个；对扩增产物进行纯化后，进行基于第二轮PCR扩增的样本标签和二代测序接头添加；对第二轮扩增产物纯化后定量；检测多个毒株时通过将第二轮扩增产物等量混合后进行高通量测序；测序结果比对到所述的人肠病毒的参考序列上，获取在所述cDNA中的检测序列数目和基因型数据。根据在所述cDNA和所述空白对照获得的人肠病毒测序序列数量和检出MNP标记的数目，对所述cDNA的测序数据进行数据质量控制和数据分析，获得在所述样本中检出的人肠病毒MNP标记数目、覆盖每个所述MNP标记的测序序列数目和所述MNP标记基因型数据。
当用于人肠病毒鉴定时，根据在待测样品和空白对照中检出的人肠病毒的测序序列数量和检出MNP位点的数目，进行质控后判定待测样品中是否含有人肠病毒的核酸。其中，所述的质控方案和判定方法是以拷贝数已知的人肠病毒的RNA为检测样本，评估所述试剂盒检测人肠病毒的灵敏度、准确性和特异性，制定所述试剂盒检测人肠病毒时的质控方案和判定方法。当用于人肠病毒遗传变异检测时，包括毒株间和毒株内部的遗传变异检测。毒株间的遗传变异检测包括利用所述的试剂盒和方法，获得待比较毒株各自在52所述部分或全部MNP标记的基因型数据。通过基因型比对，分析待比较毒株在52共同检出MNP标记上的主基因型是否存在差异。若待比较毒株在至少一个MNP标记的主基因型存在变异，则判定两者存在遗传变异。作为一种备选方案，也可以根据研究目的，通过单重PCR 对待比较毒株的部分或全部52个MNP标记分别进行扩增，然后对扩增出的产物进行Sanger测序，获得序列后，对待比较毒株共同检出MNP标记的基因型进行比对。如果存在主基因型不一致的MNP 标记，则待比较毒株之间存在变异。当检测毒株内部的遗传变异时，则通过统计模型判定在待测毒株所述的MNP标记是否检出主基因型以外的次基因型。若待测毒株在至少一个MNP标记存在次基因型，则判定待测毒株内部存在遗传变异。
当用于构建所述人肠病毒MNP指纹数据库时，将从样本中鉴定的所述人肠病毒的MNP标记的基因型数据，录入数据库文件，分别构成所述人肠病毒的MNP指纹数据库；每次鉴定不同的样本时，通过和所述人肠病毒的MNP指纹数据库比对，鉴定样本中的所述人肠病毒是否和数据库中的毒株在所述MNP标记存在主基因型(在一个 MNP标记具有超过50％测序片段支持的基因型)的差异，在至少1 个MNP标记存在主基因型差异的所述人肠病毒即为新的变异类型，收录进MNP指纹数据库。
当用于所述人肠病毒分型时，是对待测样本中的所述人肠病毒进行鉴定，获得每个所述MNP位点的基因型；收集网上公开的所述人肠病毒的基因组序列和已构建的所述人肠病毒MNP指纹数据库组成所述人肠病毒参考序列库；将待测样本中所述人肠病毒的基因型和所述人肠病毒的参考序列库进行比对，筛选遗传上一致或最接近的毒株，获得待测样本中所述人肠病毒的分型。根据同所述参考序列库的比对结果，鉴定样品中的所述人肠病毒是已有的型还是新的变型，实现对所述人肠病毒的精细分型。本发明在人肠病毒领域属于首创，并未见相关文献报道；MNP标记主要基于参考序列开发，根据已报道的近百万条的人肠病毒的重测序数据可以挖掘大规模的区分于其他物种、在人肠病毒亚型内部多态、两侧序列保守的MNP 标记；设计适用于多重PCR扩增的MNP标记检测引物；再通过阳性样本的测试，筛选出一套多态性最大、特异性最高、引物兼容性最好的一套MNP标记、多重PCR引物组合以及检测试剂盒，并用于人肠病毒的检测、MNP指纹图谱构建，遗传变异检测以及其他相关应用中，为人肠病毒的检测、科学研究和防治提供技术支撑。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明提供了用于鉴定分型5种人肠病毒的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用。所提供的人肠病毒的52个MNP标记和其引物组合，可进行多重PCR扩增，融合二代测序平台进行扩增产物的测序，满足一次性对5种人肠病毒进行高通量、高效率、高准确性和高灵敏度检测和区分的需求；满足准确检测人肠病毒遗传变异的需求；满足构建人肠病毒标准的、可共享的指纹数据库，用于流行株监测的需求。
附图说明
图1为MNP标记多态性原理图；
图2为人肠病毒MNP标记的筛选和引物设计流程图；
图3为MNP标记的检测流程图；
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面结合附图和具体实施例，对本发明进行更详细的说明。附图中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本说明书所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
需要说明的是，除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是用于限制本发明。
除非另有特别说明，本发明实施例中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1人肠病毒MNP标记组合的筛选和多重PCR扩增引物的设计
S1、人肠病毒MNP标记组合的筛选
基于网上公开的26559柯萨奇病毒、12286埃可病毒、34192个人肠病毒A型、27718个人肠病毒B型、11526人肠病毒C型、4860 个人肠病毒D型和13969人肠病毒EV71型以及74637未分型的人肠病毒，共计205747个基因组或是部分片段的序列，通过序列比对，筛选柯萨奇病毒、埃可病毒、人肠病毒C型、D型和EV71型特异的区域和型间具有多态性、但多态性区域两端保守的区域；对这些区域设计多重PCR引物，并进行阳性参考品的测试，最终获得覆盖了柯萨奇病毒、埃可病毒、人肠病毒C型、D型和EV71型5种人肠病毒的52个MNP标记及其引物组合。
对于网上不存在基因组数据的物种，也可以通过高通量测序获得待检测微生物物种代表小种的基因组序列信息，其中高通量测序可以是全基因组或简化基因组测序。为了保证所筛选标记的多态性，一般使用至少10个遗传上具有代表性的分离株的基因组序列作为参考。
筛选的52个MNP标记如表1所示：
表1所述MNP标记以及检测引物在参考序列上的起始位置
所述步骤S1具体包括：
选择所述人肠病毒的一个代表株的基因组序列作为参考基因组，将所述基因组序列和所述参考基因组进行序列比对，获得所述人肠病毒的单核苷酸多态性标记；根据序列相似性将所述基因组序列分为若干个组别，然后在每个组别上筛选所述的MNP标记。
在所述参考基因组上，以100-300bp为窗口，以1bp为步长进行窗口平移，筛选获得多个候选MNP标记区域，其中，所述候选MNP标记区域含有≥2个所述单核苷酸变异标记，且两端各30bp的序列上均不存在所述单核苷酸多态性标记；
在所述候选多核苷酸多态性标记区域中筛选区分度DP≥0.2的区域作为MNP标记；其中，DP＝d/t，t是在所述候选多核苷酸多态性标记区域中所有小种两两比较时的比较对数， d是在所述候选多核苷酸多态性标记区域中至少两个单核苷酸多态性差异的样品对数。
作为一种可选的实施方式，在所述参考基因组上，以100-300bp为窗口进行筛选时，也可选用其他步长，本实施方式采用步长为1bp，有利于全面的筛选。
S2、多重PCR扩增引物的设计
通过引物设计软件设计所述MNP标记的多重PCR扩增引物，引物设计遵循引物间互不干扰，所有引物可以组合成引物池进行多重PCR扩增，即所有设计的引物可以在一个扩增反应中均正常扩增。
S3、引物组合的检测效率评估
将人肠病毒EV71型，C型、D型、柯萨奇病毒和埃可病毒的核苷酸阳性参考品单样和按浓度比例混合的混合样，分别加入到1ml的不含人肠病毒的咽拭子洗液基质中，制备人肠病毒模拟单样本和混合样本，通过所述的MNP标记检测试剂盒对模拟单样本和混合样本进行检测，每个样本构建3个重复的测序文库，对测序数据进行分析，根据检出的标记筛选物种特异、兼容性最高的引物组合。如表2所示，本发明所提供的引物组合(表1) 在测试的5个人肠病毒单样本中都检出了每种病毒的特异标记，在混合样本的3个重复中，所有混入的人肠病毒类型也全部检出。因为人肠病毒基因组的多样化，并没有检测出所有的特异标记，但是检出的特异标记在预期的病毒样本中均是特异检出，可以互相区分，可以鉴定到具体是那种病毒。。
表1人肠病毒MNP标记检测分析
实施例2所述MNP标记和引物鉴定人肠病毒的性能评估和阈值设置
本实施例中，将湖北省疾控预防控制中心提供的经数字PCR定量的人肠病毒EV71型、 C型、D型、柯萨奇病毒和埃可病毒的RNA，经商业化试剂盒反转录成cDNA后，分别加入到人基因组DNA中，制备1拷贝/反应、10拷贝/反应和100拷贝/反应的5种人肠病毒模拟样本，同时设置等体积的无菌水作为空白对照。每种病毒合计检测4个样本，每个样本每天构建3个重复文库，连续检测4天，即每种病毒的每个样本获得12组测序数据，表3 展示了人肠病毒EV71型的数据分析结果。根据在12次重复实验中，在空白对照和模拟样本中检出的所述每种人肠病毒的的测序片段数目和MNP标记数目，评估检测方法的重现性、准确性、灵敏度，制定质控体系污染和目标病原体检出的阈值。MNP标记的检测流程如图3所示。
1、MNP标记检测试剂盒检测人肠病毒的灵敏度和稳定性评估
如表3所示，所述试剂盒能在0拷贝/反应的少数样本中能检出1个MNP位点，在1拷贝/ 反应的样本中能检出2-4个MNP位点，而在10拷贝/反应的样本中稳定的检出7个以上MNP位点，表明所述试剂盒的检测灵敏度可低至10拷贝/反应，在检测10拷贝/反应及以上样品时，具有明显的技术稳定性。
表3 MNP标记检测试剂盒检测人肠病毒EV71型的的灵敏度、稳定性分析
3、MNP标记检测试剂盒检测人肠病毒的重现性和准确性评估
基于两次重复中，共同检出标记的基因型是否可重现，评估MNP标记检测方法检测人肠病毒的重现性和准确性。具体地，对100拷贝样品的12组数据分别进行两两比较，结果如表4所示，主基因型存在差异的MNP标记数目都为0；依据2次重复实验间可重现的基因型认为是准确的原则，准确率a＝1-(1-r)/2＝0.5+0.5r，r代表重现率，即主基因型可重现的标记数目占共有标记数目的比率。本项目重现性试验中每个样品不同文库间、不同建库批次间MNP标记主基因型的差异对数为0，重现率r＝100％，准确率a＝100％。
表4 MNP标记检测试剂盒检测人肠病毒EV71型的重现性和准确率评估
3、MNP标记检测试剂盒检出人肠病毒的阈值判定
如表3所示，在1个拷贝/反应的样本中多数能检出比对到人肠病毒的序列，而在部分空白对照中也检出了人肠病毒的序列。由于 MNP标记检测方法的极度灵敏，因此检测过中的数据污染容易导致假阳性的产生。因此本实例中根据对连续4天不同拷贝数的阳性标准品的测试结果，制定如下质控方案。
质控方案具体如下：
1)测序数据量大于16兆碱基。测算依据是每个样品检测MNP 标记的数目最多是52个，一条测序片段的长度是300个碱基，所以当数据量大于16兆碱基时，大部分样品一次实验可以保证覆盖每个标记的测序片段数量达到1000倍，保证对每个MNP标记碱基序列的精准分析。
2)根据测试样品中的人肠病毒的信号指数S和空白对照中人肠病毒的噪音指数P判定污染是否可接受，其中：
空白对照噪音指数P＝nc/Nc，其中nc和Nc分别代表空白对照中，人肠病毒的测序片段的数量和总测序片段数量。
测试样品的信号指数S＝nt/Nt，其中nt和Nt分别代表测试样品中，人肠病毒的测序片段的数量和总测序片段数量。
3)计算测试样品中MNP标记的检出率，指的是检出标记数和总设计标记数的比值。
如表5所示，人肠病毒EV71型在空白对照中的噪音指数平均值是0.04％，而在1个拷贝的样品中的信号指数平均值是0.27％，1个拷贝的样品和空白对照的信噪比的平均值是7.0，因此，本发明规定当信噪比大于10倍时，可判定检测体系中的污染是可接受的。
如表5所示，在10个拷贝的样品和空白对照中人肠病毒EV71 型的信噪比的平均值是69.4，在10拷贝/反应的12组数据中，能稳定的检出至少6个EV71型特异MNP标记，占总标记的42.9％。因此，在保证准确性并兼顾灵敏度的情况下，本专利对人肠病毒阳性的判定标准是：当样品中人肠病毒的信噪比大于34.7，且标记检出率大于等于21.5％时，判定样本中检出了人肠病毒的核苷酸。
表5 MNP标记检测试剂盒检测人肠病毒EV71型的信噪比
在10个拷贝的样品中，C型、D型人肠病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒的信噪比平均值分别为68.4、69.2、69.4和68；在10拷贝/ 反应的12组数据中，能稳定的检出的C型和D型人肠病毒、柯萨奇病毒和埃可病毒的特异标记分别占各自特异标记的80.0％、71.4％、66.7％和66.7％，因此，在保证准确性并兼顾灵敏度的情况下，本专利对人肠病毒阳性的判定标准是信噪比大于30％，且当标记检出率满足如下：
当样品中C型人肠病毒标记检出率大于等于40.0％时，判定样本中检出了C型人肠病毒的核酸。
当样品中D型人肠病毒的标记检出率大于等于35.7％时，判定样本中检出了D型人肠病毒的核酸。
当样品中柯萨奇病毒的标记检出率大于等于33.4％时，判定样本中检出了柯萨奇病毒的核酸。
当样品中埃可病毒的标记检出率大于等于33.4％时，判定样本中检出了埃可病毒的核酸。
在此判定阈值下，本发明所提供的试剂盒能准确、灵敏的检测到低至10拷贝/反应的5种人肠病毒。
4、MNP标记检测试剂盒检测人肠病毒的特异性评估
人为的将表2所示的5种人肠病毒和人副流感病毒、偏肺病毒、人鼻病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、禽流感病毒和寨卡病毒的RNA混在一起，制备混合模板，以空白模板作为对照，采用本发明所提供的试剂盒对混合模板中的病原体进行检测，进行3 个重复实验。如表6所示，在3个重复实验中都能特异的检出所述 5种人肠病毒的MNP标记位点，按照所述的质控方案和判定阈值进行分析后，在3个重复实验中均检出了5种所述人肠病毒的核酸，表明MNP标记和所述试剂盒在复杂模板中检测目标微生物的高特异性。
表6在空白对照和混合模板中检出的所述5种人肠病毒的MNP标记数目
实施例3、人肠病毒毒株间的遗传变异检测
利用所述的试剂盒对湖北省疾控预防控制中心提供的人肠病毒 EV71型的4份备份毒株进行检测，样本依次命名为S1-S4，每个样品的测序平均覆盖倍数达2325倍，每个毒株均可以检出10个MNP 标记(表6)。将4个毒株的指纹图谱进行两两比对，结果如表7 所示，有1份(S-2)和同批次一起检测的3份人肠病毒EV71型均存在部分标记的主基因型差异(表6)，存在毒株间变异。
所述的试剂盒通过检测MNP标记鉴定毒株间遗传变异的应用可以用于保证不同实验室相同命名人肠病毒毒株的遗传一致性，从而保证研究结果的可比较性，这对于人肠病毒的科学研究具有重要意义。而在临床上，可针对差异标记是否影响抗药性斟酌诊断方案。
表7 6个人肠病毒的检测分析
实施例4、人肠病毒毒株内部的遗传变异检测
作为群体生物，人肠病毒群体内部部分个体发生变异，使群体不再纯合，形成异质的杂合群体，影响尤其是试验用微生物表型的稳定性和一致性。这种变异体在对群体进行分子标记检测时，表现为标记的主基因型外的等位基因型。当变异个体还未累积时，只占群体的极少部分，表现为低频率的等位基因型。低频率的等位基因型往往和技术错误混在一起，导致现有技术难以区分。本发明检测的是高多态性的MNP标记。基于多个错误同时发生的几率低于一个错误发生的几率，MNP标记的技术错误率显著低于SNP标记。
本实施例次等位基因型的真实性评估按如下进行：首先按照以下规则排除具有链偏好性(在DNA双链上覆盖的测序序列数的比值) 的等位基因型：链偏好性大于10倍，或者与主等位基因型的链偏好性之差大于5倍。
不存在链偏好性的基因型基于表8测序序列数目和比例判定其真实性。表7列出了基于BINOM.INV函数计算在α＝99.9999％的概率保障下，emax(n＝1)和emax(n≥2)分别为1.03％和0.0994％时，在各个标记中次等位基因型测序序列数目的临界值，只有次等位基因型的测序序列数目超过临界值时判定为真实的次等位基因型。当存在多个候选次等位基因时，对各候选等位基因型的P值进行多重校正， FDR<0.5％的候选等位基因判定是真实的次等位基因型。
表8涉及到的参数emax(n＝1)和emax(n≥2)指的是携带n个SNP的错误等位基因的测序序列数占该标记总测序序列数的最高比例。 emax(n＝1)和emax(n≥2)分别为1.03％和0.0994％是根据在930个纯合MNP标记检测到的所有次等位基因型的频率获得。
表8部分测序深度下进行判定次等位基因型的临界值
按照上述参数，将基因型存在差异的两个毒株的核苷酸按照以下8个比例1/1000，3/1000，5/1000，7/1000，1/100，3/100，5/100， 7/100混合，制备人工杂合样本，每个样本检测3次重复，获得共计 24个测序数据。通过和所述两个毒株的MNP标记的基因型进行精准比对，在24个人工杂合样本中均检测到了存在杂合基因型的标记，说明了所开发的人肠病毒的MNP标记检测方法在检测毒株群体内部遗传变异的适用性。
实施例5人肠病毒MNP指纹数据库的构建
利用常规CTAB法、商业化试剂盒等方法提取用于构建人肠病毒 MNP指纹数据库的所有毒株或是样本的RNA，采用琼脂糖凝胶和紫外分光光度计检测RNA的质量。在进行MNP标记筛选时，获得了每种病毒在MNP标记的基因型，这些基因型组成了MNP标记的参考基因型库。采用本发明提供的试剂盒，对表2所示的5种人肠病毒进行MNP标记检测，将获得测序数据同参考基因型库进行序列比对后获得每个毒株每个标记的主基因型，形成每个毒株的MNP指纹图谱，并录入数据库文件，形成人肠病毒的MNP指纹数据库。每次检测的样本或毒株的MNP指纹图谱同构建的MNP指纹数据库进行比对后，主基因型存在差异的毒株的MNP指纹图谱均可录入所构建的MNP指纹数据库。因此，理论上，所构建的MNP指纹数据库可以不断的更新和充实。因为所构建的数据库是基于检测的毒株的基因序列，因此和所有的高通量测序数据兼容，具有完全可共建共享、随时可更新的特征。
实施例6、人肠病毒的精细分型
如表2所示，将人肠病毒的核苷酸混合在一起，以空白样品作为对照，采用本发明所提供的试剂盒对混合模板中的人肠病毒进行检测。3个重复实验的结果表明，按照所述的质控方案和判定方案进行分析，所述试剂盒可以检出类型特异的MNP标记，根据检出的类型特异的MNP标记可以成功的将鉴定到的人肠病毒分为5种类型。在3个重复实验中，类型特异的MNP标记都仅能特异的在所述类型中检出，表明所述试剂盒在混合模板中检测目标微生物的高特异性，可以用于人肠病毒各类型的精细分型，从而可用于人肠病毒流行株的监测。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明实施例的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明实施例范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明实施例进行各种改动和变型而不脱离本发明实施例的精神和范围。这样，倘若本发明实施例的这些修改和变型属于本发明实施例权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明实施例也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 江汉大学
<120> 一种5种人肠病毒的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及应用
<130> 20210925
<160> 156
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 1
ctggaatccc cctaagtcaa gcactggttt acccccatca atggatcaat ctacgaacta 60
ataactgcgc aaccattatt atgccatatg tcaatgcgct tccatttgat tcagcgctta 120
accactcaaa ttttggattg gttgt 145
<210> 2
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 2
actgattggt caagattcca tcctggagaa gtcccttaaa gccctggtca aaattatttc 60
agcactagtg attgtggtga gaaaccatga tgacctaata acagtgactg ccaccttggc 120
cctcattggc tgcacctcat caccgtgg 148
<210> 3
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 3
gtccacgttc gggtgtacat gagaattaag cacgtgagag cttgggtacc tagacccctt 60
cgatcccaag cttatatggt caagaattac ccgacataca gccaaacaat aactaacact 120
gcaaccgacc gtgcaagcat aaccaccac 149
<210> 4
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 4
agataagatc aagaagggga aatcccgctt aattgaagct agcagtttga atgactcagt 60
ttacctcaga atggccttcg gacatctcta tgaaactttc catgcaaacc ctgggactgt 120
gactggttcg gctgtgggat gtaa 144
<210> 5
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 5
cagcctgtgg gttgtaccca cccacagggc ccactgggcg ctagcacact gattctatgg 60
aatctttgtg cgcctgtttt ataacccctt ccccaaaact gtaacttaga agaatagcac 120
tctatcgatc aatagcaggc atgg 144
<210> 6
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 6
cgttagccaa taaacctgac cagaagagcc tgagcaatgg ggagactgcc aacatgttcg 60
aatcccaaaa ctccacaggg caaacagcag tccaagctaa tgtgattaat gccggcatgg 120
gggttggagt tggcaatctg accatattcc 150
<210> 7
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 7
cgtgtggttc gcttgtctga aaatgctact cgagaaactt ggttactcac acaaagagac 60
aagttacatt gactacttgt gtaattctca tcacctgtat aaagacaagc actactttgt 120
gcgtggtggt atgccctcag gatgctctg 149
<210> 8
<211> 145
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 8
tcataaagaa gatcagaagt gtcccagtgg gacgctgtct ggccttacct gcgttttcgg 60
ccctgcgcag gaaatggctg gactcctttt aaattagaga caatttgaga ataattcaaa 120
ttggcttaac cctaccgcac tcacc 145
<210> 9
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 9
cctattgagc tacaagagag tcctccggcc cctgaatgcg gctaatccca accacggagc 60
aggtgattgc aacccagcaa ctagcctgtc gtaacgcgca agtctgtggc ggaaccgact 120
actttgggtg tccgtgtttc cttttatcac 150
<210> 10
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 10
gtaggagttg tggaggtgaa ggactcgggc actagcctgg atgggtacac agtttggccc 60
atagatgtga tgggcttcgt gcaacagcgg cgcaagctag agctgtcaac atacatgcgc 120
tttgatgccg agttcacttt tgtg 144
<210> 11
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 11
gttagtagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcctaac tgcggagcgc atgccctcaa 60
tccagggggt ggtgtgtcgt aacgggcaac tctgcagcgg aaccgactac tttgggtgtc 120
cgtgtttcct tttattctta tattggctgc 150
<210> 12
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 12
acagggcgtg taccagcatt gcaagccgca gaaacgggag caagctctaa tgctagtgat 60
gagaacctta ttgagactcg ctgtgtgatg aatcgaaacg gggttaatga ggcgagtgtg 120
gaacactttt actctcgtgc agggctggta 150
<210> 13
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 13
aagaagacct tgaggcaatg tttgggaatg tatcgtatct cgctcacttc tgccgtaaat 60
accaaccact ttatgctaca gaagccaaaa gagtttatgc tttggaaaag aggatgaaca 120
attacatgca gttcaagagc aaacaccgta 150
<210> 14
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 14
cgcagttgag gctaaaagaa tttctaaatt ggaaaacacc atcaacaact acatccagtt 60
caagagcaaa caccgtattg aaccggtatg tatgttgata catggctccc caggaacagg 120
aaagtccatt gctacatcat tgattggt 148
<210> 15
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 15
gggccaccca agtttagacc tattaggatt agtcttgagg aggggccagc accagatgtt 60
attagtgatc ttcttgccag tgtggatagt gaagaggtgc gccaatactg tagagaccaa 120
ggttggatca taccagaaac ccctaccaac 150
<210> 16
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 16
cagagctggc caatgcggtg gtgttctcat gtccactggt aaagtgttgg gaatacacgt 60
tggtggaaac ggtcaccaag gcttctcagc agctctcctt aaacattatt tcaatgatga 120
acaaggcgag attgaattca ttga 144
<210> 17
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 17
accaaccaaa tttgtgaaca agtcaacctc ctcaaagagt cactaattgg acaagactcc 60
attttagaga agtcccttaa agcacttgtt aaaattatat cagcactggt cattgtagtg 120
agaaaccatg atgaccttat cacagtgacg 150
<210> 18
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 18
ttcaagtcca aatgccgtat tgaacctgta tgcttgcttt tgcacggaag ccctggagcc 60
ggaaaatcgg tcgccaccaa cctaattggg cgggcattag ctgagaaact caacagttca 120
gtatactcct tgccgcctga tccagaccac 150
<210> 19
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 19
gaaacctaaa gtgcctacct tgaggcaggc caaagtacaa ggcccagcgt tcgagttcgc 60
cgtggcgatg atgaaaagaa acgccagcac agtcaaaaca gagtacggtg aattcaccat 120
gcttggcatt tatgatagat gggcggtttt 150
<210> 20
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 20
gcccattgat gcctcgttgt tggctgaggc aggaaaagat tatggcttga tcatgactcc 60
agctgacaaa ggcgagtgtt ttaatgaagt tacctggaca aatgtgacct tcctgaaaag 120
gtattttagg gcagatgagc agtatcc 147
<210> 21
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 21
gcaaggtgag attgaattca tcgaaagctc aaaagacgca ggattcccag ttattaacac 60
gccgagtaag acaaaattag agcctagcgt gttccaccaa gtgttcgagg gcaacaaaga 120
accggcagtt ctcaggaacg gagaccc 147
<210> 22
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 22
ttcaatgaag agcaaggtga aatagaattc atcgagagtt caagggatgc aggctttcct 60
gtgatcaaca cccctagcaa aactaagctg gaaccaagtg tgttccatca ggtatttgaa 120
ggcaacaagg aaccagcagt cctcagaaat 150
<210> 23
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 23
ggatacccgt acgttgcgtt aggcatcaag aagagagaca tcttatctaa gaagaccaaa 60
gatctgacta aattgaagga gtgcatggac aagtatggtt tgaacctgcc gatggtgacc 120
tacgtgaagg atgagctcag gtctgcagat 150
<210> 24
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 24
acagtgttgg agcaaccctc gaagcattat tccaaggtcc accaatgtac agggagatca 60
aaatcagcgt cgcgcctgaa acccccccac cgccagcaat tgctgattta ctaaaatcag 120
tggatagcga agcggtgaga gagtactgc 149
<210> 25
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 25
gtgagttgtg cgctgtgttt agggctgacc ctggaagaga cggtccatgg cagtcaacga 60
tgctgggcca gttgtgtgga tactacaccc aatggtcagg gtcactagag gtcactttca 120
tgttcaccgg gtccttcatg g 141
<210> 26
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 26
cgctatacgc cacggaagct aaaagggttt atgccctgga gaagagaatg aataactata 60
tgcagttcaa gagcaaacac cgaattgaac ctgtatgtct cattattagg ggctcaccag 120
gcactgggaa gtctctagcc actggtatta 150
<210> 27
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 27
ggcaatacaa ttgaagcact attccaaggc ccgcccaagt tcagaccaat tagaatcagt 60
cttgaggaga agccagcccc agatgctatt agtgatctcc tcgctagtgt agacagtgag 120
gaagtgcgcc aatactgtag ggagcaagg 149
<210> 28
<211> 149
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 28
cttccaccag accctgacca ttttgacggg tacaaacagc aagtggttac agtcatggat 60
gatctgtgtc agaaccccga tggcaaggac atgtcattgt tctgccagat ggtgtctacc 120
gtggatttta tcccaccaat ggcttctct 149
<210> 29
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 29
catgttgggc acgcacgtca tctgggattt tgggctgcaa tcgtctgtta cccttgtaat 60
accatggatc agcaacactc attatagagc acatgcccga gatggagtgt ttgactacta 120
caccacaggg ttagtcagta tatggta 147
<210> 30
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 30
ttcagtgcca ttcatgtcac ctgcgagtgc ttatcaatgg ttttatgacg gatatcccac 60
attcggagaa cacaaacagg agaaagatct tgaatacggg gcatgtccta ataacatgat 120
gggcacgttc tcagtgcgga ctgtggggac 150
<210> 31
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 31
tttctaaacc cagcctcata tacgtggatg ctagcgaata ttaccccgct agataccaat 60
cgcacctgat gcttgcagcg ggccactctg agcccggcga ctgcgggggc atcttaaggt 120
gccaacatgg tgtagttggt atag 144
<210> 32
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 32
gatgcagttg aactggtgga tgagcaagga gtcaacctgg aattaaccct catcactctt 60
gacaccaacg aaaagtttag ggatatcacc aaattcatcc cagaaaatat tagcactgct 120
agtgatgcca ccctagtgat caacacggag 150
<210> 33
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 33
agcatccatt ttaggcatcc ctattgccca gaagcagagt gcttcttggc taaagaagtt 60
caatgatatg gcgagtgccg ccaagggttt agagtggata tccaacaaaa ttagtaagtt 120
cattgactgg ctcagagaga agattgttcc 150
<210> 34
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 34
gcgtcgtcgg catagtgtct actggtggca atgggctcgt tggctttgca gacgtcagag 60
acctcttgtg gttagatgaa gaagctatgg aacagggcgt gtccgactac atcaagggtc 120
tcggagatgc ttttggaaca ggcttc 146
<210> 35
<211> 148
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 35
cctacccatc gcaccatgat gtacaacttt cctactaaag caggacagtg tggaggagtg 60
gtgacatctg ttgggaaggt tgtcggtatt cacattggtg gcaatggcag acaaggtttt 120
tgcgcaggcc tcaaaaggag ttactttg 148
<210> 36
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 36
aatacctctc aaatgagcat ggaggaggcc tgctacggta ctgagaatct tgaggctatt 60
gatcttcaca ctagtgcagg ttacccctat agtgccttgg ggataaagaa aagagacatc 120
ttagacccta ctaccaggga cgtgagtaga 150
<210> 37
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 37
cccattacaa tcactctagc tccaatgtgc tctgagtttg ctggcctcag gcaggcggtc 60
acccagggct ttcccactga accaaaacca gggacgaacc aattcttgac caccgatgat 120
ggcgtctcag cacccatcct gccaaatttc 150
<210> 38
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 38
aagtttgtca tcgcatccac taatgccagt aatatcatag taccaacagt gtctgattct 60
gacgctattc gccgcaggtt ctacatggac tgtgacattg aagtgacaga ctcgtacaaa 120
acagatctag gtagactgga tgcagggcga 150
<210> 39
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 39
aaataataaa cctgcgcact aacaactgtg ctacgctagt attgccctat gtaaactcac 60
tctcaataga tagcatgaca aagcacaaca actgggggat cgctatcctc cccctggcgc 120
cactagactt tgccactgaa tcttccactg 150
<210> 40
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 40
caagagagtc ctccggcccc tgaatgcggc taatcccaac cacggagcag gtggttgcaa 60
tccagcaact agcctgtcgt aacgcgcaag tctgtggcgg aaccgactac tttgggtgtc 120
cgtgtttcct tttattctta caatggctgc 150
<210> 41
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 41
gcattacacc accaacagtg gcacacagtg acgcgctagc cagacgattt gcatttgaca 60
tggacattca agtcatgrgt gaatactcca gggatggaaa gttgaacatg gcgatggcta 120
cagagatgtg caagaattgc caccaaccag 150
<210> 42
<211> 146
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 42
cagcagattg ttttcggttt ggaaaataac ttacaaggac actgttcaat tgagacgcaa 60
actggaattt ttcacatatt cgagatttga catggagttc acttttgtgg tcacctcaaa 120
ctacactgat gcaaataacg gacatg 146
<210> 43
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 43
tacggtagat ggcctgaata catcagagat accgaggcaa atcctgtaga tcaaccaacc 60
gagcccgatg tagccgcgtg caggttctac acattagata ccgtcacttg gcgcaaggag 120
tccagagggt ggtggtggaa actaccagac 150
<210> 44
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 44
gaagccaaag catgtcagag tctggtgccc acgacctcca cgagcagtcc catacttcgg 60
accaggtgta gattacaaag atgggctcac cccactacca gaaaagggat taacgactta 120
tggatttgga caccaaaaca aagctgtgta 150
<210> 45
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 45
atggtgttaa ggagcctgca gtcttgacca agaatgaccc aagactcaca actgattttg 60
aagaagccat tttctcaaaa tatgtaggta acaagatcac agaggtggat gagtacatga 120
gggaagcagt ggatcactat gcaggacaac 150
<210> 46
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 46
actccaaggg cccacgtggc ggctagtact ctggtacttc ggtacctttg tacgcctgtt 60
ttatctccct tcccaatgta acttagaagc tcttaaatca aggctcaata ggtggggcgc 120
aaaccagcgc tctcatgagc aagcactcct 150
<210> 47
<211> 144
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 47
acactaaccc gtgtgtagct tgggtcgatg agtctggaca tacctcactg gcgacagtgg 60
tccaggctgc gttggcggcc tactcatggt gaaaaccatg agacgctaga catgaacaag 120
gtgtgaagag tctattgagc tact 144
<210> 48
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 48
atctgatagt ccccagtgaa tcctctgaca catgttcctt gatagggttc atagcagcaa 60
aagatgattt ctccctcaga ttaatgagag acagccctga cattggacaa ctagaccatt 120
tacaggcagc agaggcagcc taccagatcg 150
<210> 49
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 49
cttggtgtgg tccctagctt aaatgcagtt gaaacaggtg caacttctaa cactgaacca 60
gaagaagcca tacaaactcg cacagtgata aatcagcacg gtgtatccga gactctagtg 120
gagaattttc tcagtagagc agctttggta 150
<210> 50
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 50
gcaaggactg aaaagggtga gttcaccatg ctgggtgtat atgatagggt agcggtcatc 60
cccacacacg catctgttgg agaaaccatt tacattaatg atgtagagac tagagtttta 120
gatgcgtgtg cacttagaga cttgactgat 150
<210> 51
<211> 150
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 51
tgccaccttt gtatcaatag ctggtgtagt ttatgttata tacaaacttt ttgctggcat 60
tcagggtcca tacacaggaa tccccaatcc taaacctaaa gtaccctctc tcagaacagc 120
taaagtgcaa ggaccagggt tcgattttgc 150
<210> 52
<211> 143
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 52
tggttagata ctgatgctat ggaacaaggc attactgatt atattcaaaa tcttggtaat 60
gcctttggag cagggtttac agaaacaatc tctaataaag ccaaggaagt acaagatatg 120
ctaattggag agagttcact att 143
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 53
ctggaatccc cctaagtcaa gc 22
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 54
actgattggt caagattcca tcctg 25
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 55
gtccacgttc gggtgtacat 20
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 56
agataagatc aagaagggga aatcc 25
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 57
cagcctgtgg gttgtacc 18
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 58
cgttagccaa taaacctgac caga 24
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 59
cgtgtggttc gcttgtctga 20
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 60
tcataaagaa gatcagaagt gtccc 25
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 61
cctattgagc tacaagagag tcctc 25
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 62
gtaggagttg tggaggtgaa gg 22
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 63
gttagtagtc ctccggcccc 20
<210> 64
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 64
acagggcgtg taccagca 18
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 65
aagaagacct tgaggcaatg ttt 23
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 66
cgcagttgag gctaaaagaa tttct 25
<210> 67
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 67
gggccaccca agtttagac 19
<210> 68
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 68
cagagctggc caatgcgg 18
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 69
accaaccaaa tttgtgaaca agtca 25
<210> 70
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 70
ttcaagtcca aatgccgtat tgaac 25
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 71
gaaacctaaa gtgcctacct tgagg 25
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 72
gcccattgat gcctcgttgt 20
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 73
gcaaggtgag attgaattca tcgaa 25
<210> 74
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 74
ttcaatgaag agcaaggtga aataga 26
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 75
ggatacccgt acgttgcgtt 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 76
acagtgttgg agcaaccctc 20
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 77
gtgagttgtg cgctgtgttt ag 22
<210> 78
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 78
cgctatacgc cacggaagc 19
<210> 79
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 79
ggcaatacaa ttgaagcact attcc 25
<210> 80
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 80
cttccaccag accctgacca t 21
<210> 81
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 81
catgttgggc acgcacgt 18
<210> 82
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 82
ttcagtgcca ttcatgtcac ct 22
<210> 83
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 83
tttctaaacc cagcctcata tacgt 25
<210> 84
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 84
gatgcagttg aactggtgga tg 22
<210> 85
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 85
agcatccatt ttaggcatcc ctatt 25
<210> 86
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 86
gcgtcgtcgg catagtgt 18
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 87
cctacccatc gcaccatgat 20
<210> 88
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 88
aatacctctc aaatgagcat gga 23
<210> 89
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 89
cccattacaa tcactctagc tccaa 25
<210> 90
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 90
aagtttgtca tcgcatccac taatg 25
<210> 91
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 91
aaataataaa cctgcgcact aacaa 25
<210> 92
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 92
caagagagtc ctccggcc 18
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 93
gcattacacc accaacagtg 20
<210> 94
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 94
cagcagattg ttttcggttt ggaa 24
<210> 95
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 95
tacggtagat ggcctgaata catca 25
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 96
gaagccaaag catgtcagag tct 23
<210> 97
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 97
atggtgttaa ggagcctgc 19
<210> 98
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 98
actccaaggg cccacgtg 18
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 99
acactaaccc gtgtgtagct 20
<210> 100
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 100
atctgatagt ccccagtgaa tcctc 25
<210> 101
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 101
cttggtgtgg tccctagctt aaat 24
<210> 102
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 102
gcaaggactg aaaagggtga gt 22
<210> 103
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 103
tgccaccttt gtatcaatag ctgg 24
<210> 104
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 104
tggttagata ctgatgctat ggaac 25
<210> 105
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 105
acaaccaatc caaaatttga gtggt 25
<210> 106
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 106
ccacggtgat gaggtgca 18
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 107
gtggtggtta tgcttgcacg 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 108
ttacatccca cagccgaacc 20
<210> 109
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 109
ccatgcctgc tattgatcga tag 23
<210> 110
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 110
ggaatatggt cagattgcca actc 24
<210> 111
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 111
cagagcatcc tgagggcata c 21
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 112
ggtgagtgcg gtagggttaa 20
<210> 113
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 113
gtgataaaag gaaacacgga cacc 24
<210> 114
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 114
cacaaaagtg aactcggcat caa 23
<210> 115
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 115
gcagccaata taagaataaa aggaaaca 28
<210> 116
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 116
taccagccct gcacgaga 18
<210> 117
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 117
tacggtgttt gctcttgaac tg 22
<210> 118
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 118
accaatcaat gatgtagcaa tggac 25
<210> 119
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 119
gttggtaggg gtttctggta tgatc 25
<210> 120
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 120
tcaatgaatt caatctcgcc ttgtt 25
<210> 121
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 121
cgtcactgtg ataaggtcat catg 24
<210> 122
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 122
gtggtctgga tcaggcgg 18
<210> 123
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 123
aaaaccgccc atctatcata aatgc 25
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 124
ggatactgct catctgccct aaaat 25
<210> 125
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 125
gggtctccgt tcctgagaa 19
<210> 126
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 126
atttctgagg actgctggtt cctt 24
<210> 127
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 127
atctgcagac ctgagctcat c 21
<210> 128
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 128
gcagtactct ctcaccgctt c 21
<210> 129
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 129
ccatgaagga cccggtgaa 19
<210> 130
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 130
taataccagt ggctagagac ttccc 25
<210> 131
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 131
ccttgctccc tacagtattg gc 22
<210> 132
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 132
agagaagcca ttggtgggat aaaat 25
<210> 133
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 133
taccatatac tgactaaccc tgtgg 25
<210> 134
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 134
gtccccacag tccgcact 18
<210> 135
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 135
ctataccaac tacaccatgt tggca 25
<210> 136
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 136
ctccgtgttg atcactaggg tg 22
<210> 137
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 137
ggaacaatct tctctctgag ccag 24
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 138
gaagcctgtt ccaaaagcat ctc 23
<210> 139
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 139
caaagtaact ccttttgagg cctg 24
<210> 140
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 140
tctactcacg tccctggtag tag 23
<210> 141
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 141
gaaatttggc aggatgggtg c 21
<210> 142
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 142
tcgccctgca tccagtcta 19
<210> 143
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 143
cagtggaaga ttcagtggca aag 23
<210> 144
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 144
gcagccattg taagaataaa aggaa 25
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 145
ctggttggtg gcaattcttg 20
<210> 146
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 146
catgtccgtt atttgcatca gtgta 25
<210> 147
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 147
gtctggtagt ttccaccacc ac 22
<210> 148
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 148
tacacagctt tgttttggtg tccaa 25
<210> 149
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 149
gttgtcctgc atagtgatcc a 21
<210> 150
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 150
aggagtgctt gctcatgaga g 21
<210> 151
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 151
agtagctcaa tagactcttc acacc 25
<210> 152
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 152
cgatctggta ggctgcctc 19
<210> 153
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 153
taccaaagct gctctactga gaaaa 25
<210> 154
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 154
atcagtcaag tctctaagtg cacac 25
<210> 155
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 155
gcaaaatcga accctggtcc tt 22
<210> 156
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列( Artificial Sequence)
<400> 156
aatagtgaac tctctccaat tagca 25
Claims (9)
1.一种5种人肠病毒的MNP标记组合，其特征在于，所述MNP标记组合包括52个标记，具体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.52所示。
2.一种用于检测权利要求1所述5种人肠病毒MNP标记组合的多重PCR引物对组合，其特征在于，所述多重PCR引物对组合包括52对引物，具体的引物核苷酸序列如SEQ ID NO.53-SEQ ID NO.156所示。
3.一种用于检测权利要求1所述5种人肠病毒MNP标记组合的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的引物对组合。
4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括多重PCR预混液。
5.权利要求1所述的5种人肠病毒的MNP标记组合或权利要求2所述的引物对组合或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在非疹断目的的人肠病毒检测中的应用。
6.权利要求1所述的5种人肠病毒的MNP标记组合或权利要求2所述的引物对组合或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在制备人肠病毒检测产品中的应用。
7.权利要求1所述的5种人肠病毒的MNP标记组合或权利要求2所述的引物对组合或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在检测人肠病毒毒株内部和毒株间遗传变异中的应用。
8.权利要求1所述的5种人肠病毒的MNP标记组合或权利要求2所述的引物对组合或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在构建人肠病毒数据库中的应用。
9.权利要求1所述的5种人肠病毒的MNP标记组合或权利要求2所述的引物对组合或权利要求3-4任一所述的检测试剂盒在人肠病毒精细分型检测中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111309311.2A CN114277183B (zh) | 2021-11-06 | 2021-11-06 | 一种5种人肠病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202111309311.2A CN114277183B (zh) | 2021-11-06 | 2021-11-06 | 一种5种人肠病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114277183A true CN114277183A (zh) | 2022-04-05 |
| CN114277183B CN114277183B (zh) | 2023-09-08 |
Family
ID=80868807
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202111309311.2A Active CN114277183B (zh) | 2021-11-06 | 2021-11-06 | 一种5种人肠病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114277183B (zh) |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20020142293A1 (en) * | 2000-11-29 | 2002-10-03 | Institut Pasteur | Enteroviral polynucleotides, methods of detecting enteroviruses and kits containing the polynucleotides |
| US6846621B1 (en) * | 1999-03-31 | 2005-01-25 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Typing of human enteroviruses |
| WO2012060779A1 (en) * | 2010-11-02 | 2012-05-10 | Singapore Polytechnic | Method for detection of enterovirus ev71 |
| US20150292041A1 (en) * | 2011-10-25 | 2015-10-15 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods and compositions for identifying enterovirus |
| US20190024194A1 (en) * | 2017-07-21 | 2019-01-24 | The Translational Genomics Research Institute | Methods for the Detection of Enterovirus D68 in Complex Samples |
| CN111662997A (zh) * | 2020-05-14 | 2020-09-15 | 湖南杂交水稻研究中心 | 一种鉴定水稻稻瘟病菌的引物组及其筛选方法和应用 |
| RU2743352C1 (ru) * | 2020-05-19 | 2021-02-17 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B |
| CN112501343A (zh) * | 2020-12-19 | 2021-03-16 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 油菜品种及其实质性派生品种鉴定的mnp标记引物组合及应用 |
| CN112593011A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-02 | 中山大学 | 一组检测柯萨奇病毒b组的引物和探针 |
-
2021
- 2021-11-06 CN CN202111309311.2A patent/CN114277183B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6846621B1 (en) * | 1999-03-31 | 2005-01-25 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Typing of human enteroviruses |
| US20020142293A1 (en) * | 2000-11-29 | 2002-10-03 | Institut Pasteur | Enteroviral polynucleotides, methods of detecting enteroviruses and kits containing the polynucleotides |
| WO2012060779A1 (en) * | 2010-11-02 | 2012-05-10 | Singapore Polytechnic | Method for detection of enterovirus ev71 |
| US20150292041A1 (en) * | 2011-10-25 | 2015-10-15 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Methods and compositions for identifying enterovirus |
| US20190024194A1 (en) * | 2017-07-21 | 2019-01-24 | The Translational Genomics Research Institute | Methods for the Detection of Enterovirus D68 in Complex Samples |
| CN111662997A (zh) * | 2020-05-14 | 2020-09-15 | 湖南杂交水稻研究中心 | 一种鉴定水稻稻瘟病菌的引物组及其筛选方法和应用 |
| RU2743352C1 (ru) * | 2020-05-19 | 2021-02-17 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ дифференциальной амплификации фрагмента области VP1 генома энтеровирусов видов Enterovirus A и Enterovirus B |
| CN112501343A (zh) * | 2020-12-19 | 2021-03-16 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 油菜品种及其实质性派生品种鉴定的mnp标记引物组合及应用 |
| CN112593011A (zh) * | 2020-12-25 | 2021-04-02 | 中山大学 | 一组检测柯萨奇病毒b组的引物和探针 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| HAMIDREZA 等: ""Functionalization of anti-Brucella antibody based on SNP and MNP nanoparticles for visual and spectrophotometric detection of Brucella"", 《SPECTROCHIM ACTA A MOL BIOMOL SPECTROSC . 》 * |
| ZHIWEI FANG 等: ""Multiple nucleotide polymorphism DNA markers for the accurate evaluation of genetic variations"", 《BIORXIV》 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN114277183B (zh) | 2023-09-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN113718057B (zh) | 一种eb病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及应用 | |
| CN114277183B (zh) | 一种5种人肠病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
| CN114277187B (zh) | 一种呼吸道合胞病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
| CN114277184B (zh) | 一种人冠状病毒HCoV-HKU1的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
| CN115044703B (zh) | 一种人冠状病毒HCoV-OC43的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 | |
| WO2023077484A1 (zh) | 一种5种人肠病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
| CN115044705B (zh) | 一种人冠状病毒HCoV-NL63的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 | |
| CN115029479B (zh) | 一种寨卡病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 | |
| CN115044704B (zh) | 一种人冠状病毒HCoV-229E的MNP标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 | |
| CN114836573B (zh) | 一种麻疹病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 | |
| CN114836572B (zh) | 一种副肠孤病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 | |
| WO2023077483A1 (zh) | 一种人冠状病毒HCoV-HKU1的MNP标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
| CN115029477B (zh) | 一种人鼻病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 | |
| CN114836574B (zh) | 一种流行性腮腺炎病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 | |
| CN114107562B (zh) | 一种人类副流感病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 | |
| CN114790494B (zh) | 一种水痘-带状疱疹病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 | |
| CN114277163B (zh) | 一种肺炎衣原体的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
| WO2023077491A1 (zh) | 一种呼吸道合胞病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
| CN114214435B (zh) | 一种肺炎支原体的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
| CN114107563B (zh) | 一种人偏肺病毒的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 | |
| WO2023077482A1 (zh) | 一种结核分枝杆菌的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
| WO2023077490A1 (zh) | 一种甲、乙和丙型流感病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
| WO2023077486A1 (zh) | 一种肺炎支原体的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 | |
| CN114836550B (zh) | 一种肺炎克雷伯菌的mnp标记位点、引物组合物、试剂盒及其应用 | |
| CN114277185B (zh) | 一种腺病毒的mnp标记组合、引物对组合、试剂盒及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |