CN101671745A - 一种检测星状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测星状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列，具体涉及一组检测星状病毒的寡核苷酸，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.6所示的寡核苷酸序列，含有这些寡核苷酸的试剂盒及其检测方法，本发明所述的试剂盒灵敏度高、特异性强、成本低、操作简便。检测时，在核酸大量合成时，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，有极高的特异性，只要用肉眼观察扩增产物浊度就能够判断扩增与否。

Description

一种检测星状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列

技术领域

本发明涉及一种检测星状病毒的试剂盒和寡核苷酸，更具体地说，是一种检测星状病毒的反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测试剂盒，具体而言是指利用RT-LAMP原理快速检测星状病毒的寡核苷酸序列、试剂盒和方法，属生物技术领域。

背景技术

星状病毒是引起婴幼儿、老年人及免疫功能低下者急性病毒性肠炎的重要病原之一，可散发或暴发流行。病毒颗粒呈球形，无包膜，直径为28nm～30nm，具有5～6个小角，使整个病毒粒子呈星状结构；属无衣壳的单股正链RNA病毒，病毒基因长6.8kb，包括一个5’非编码区(5’non-coding region，NCR)，三个开放读码框架(openreading frams，ORFs)ORF1a、ORF1b和ORF2，80个核苷酸的3’非编码区和一个大约30个核苷酸的多聚腺苷酸尾。

星状病毒作为一种重要的食源性病毒，可通过粪-口途径传播，污染的水和食物尤其贝类是传播的主要载体。贝类作为滤过性摄食动物，很容易富集病毒。目前贝类养殖和收获后所使用的净化方法，只对细菌性污染起作用，对病毒基本无效。另外，为保持口感鲜嫩，人们喜欢食用生的或半熟的贝类。因此进食生的或者未经适当烹制的贝类，极易引起病毒性腹泻病的暴发和流行，同时也会给水产业带来巨大的经济损失。

因此，研究开发针对星状病毒的快速检测方法，可广泛应用于临床诊断、卫生防御、食品安全检测以及水产养殖等领域，对保护人民健康，促进我国水产和食品贸易的发展都具有重要的意义。

以往星状病毒的检验主要采用电镜观察、分离培养和酶联免疫方法(ELISA)。然而，由于电镜设备昂贵，检测灵敏度低，在很大程度上限制了其应用；分离培养方法灵敏度较低，需要特殊培养条件，而且周期长，不适于星状病毒的快速检测；ELISA方法操作简便，价格低廉，但其检测依赖于特异性抗原-抗体反应，容易受到环境条件和样品中干扰物质的影响，在用于水和食品中星状病毒检测时存在一定的局限性。

近年来以核酸扩增为基础的分子生物学技术已成为星状病毒检测的主要手段，但仍存在不同的缺陷。如RT-PCR，通常需要4～5个小时，检测结果需要通过核酸电泳、紫外观察，不但容易造成对环境的交叉污染，对操作人员也具有一定的毒性作用。实时荧光RT-PCR因其灵敏度高、特异性强、可用于定量检测而倍受欢迎，但同时也对仪器设备和操作人员的技术条件提出了更高的要求，而且试验中所用试剂和探针等费用较为昂贵，这些都为星状病毒检测的广泛开展带来了一定的困难。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术是是2000年由Notomi等人开发的一种新颖的核酸扩增方法。其特点是针对靶基因的6～8个区域设计4～6种特异性引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)，在等温条件(65℃左右)保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。该方法不依赖于模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程，亦不需要精密的仪器与昂贵的检测试剂。因其操作简单、结果直观、灵敏度高、特异性强，已被广泛地应用于病原微生物的检测和传染性疾病的诊断，在开展研究病原体快速检测手段上已经显示出了令人鼓舞的应用前景。

近年来我国已开始着手于致病性细菌的LAMP检测技术研究，如结核分支杆菌、痢疾志贺氏菌、大肠艾希氏菌、肺炎链球菌、耶氏菌以及食品中常见的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌以及副溶血性弧菌等，取得了显著的成效；而针对病毒的LAMP检测主要见于国外的部分报道，如乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒、腺病毒等DNA病毒以及流感病毒、SARS冠状病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞病毒、西尼罗河病毒等RNA病毒。目前国内外均未见利用RT-LAMP技术对星状病毒进行检测的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一组特异性强、灵敏度高的用于检测星状病毒的RT-LAMP寡核苷酸。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种操作简单、结果准确的星状病毒RT-LAMP快速检测试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一组检测星状病毒的寡核苷酸，由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQID No.6所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No.1为外侧上游引物，SEQ IDNo.2为外侧下游引物，SEQ ID No.3为内侧上游引物，SEQ ID No.4为内侧下游引物，SEQ ID No.5为环状上游引物，SEQ ID No.6为环状下游引物。详见表1。

表1星状病毒RT-LAMP引物序列

本发明所提供的引物具有以下优点：(1)高效灵敏。近年来的研究显示引入环状引物将有助于提高检测灵敏度，缩短反应时间。本发明设计出星状病毒特异的环状引物(LF和LB)，有效提高了检测灵敏度，在60min的时间内，扩增效率可达到10⁹～10¹⁰个数量级，扩增模板极限可达60拷贝星状病毒核酸。(2)特异性强，采用6条引物，共识别星状病毒靶基因的8个不同位点，充分保证扩增反应的特异性。

本发明提供一种检测星状病毒的试剂盒，由以下试剂组成：

(1)TRIZOL裂解液：购自Invitrogen公司，货号：15596-026；

(2)DEPC水：购自上海生工，货号：D1005；

(3)2×RT-LAMP反应液：其组分为：2×ThermoPol缓冲液、1.6M甜菜碱、3.6mMdNTPs、8mM MgSO₄、0.4μM外侧上游引物(F3)、0.4μM外侧下游引物(B3)、3.2μM内侧上游引物(FIP)、3.2μM内侧下游引物(BIP)、1.6μM环状上游引物(LF)、1.6μM环状下游引物(LB)；其中外侧上游引物(F3)是序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，外侧下游引物(B3)是序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，内侧上游引物(FIP)是序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，内侧下游引物(BIP)是序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，环状上游引物(LF)是序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，环状下游引物(LB)是序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；引物委托大连宝生物工程有限公司合成；

(4)Bst DNA聚合酶：8U/μL，购自NEB公司，货号M0275L；

(5)AMV反转录酶，10U/μL，购自Promega公司，货号M510A；

(6)阴性对照：生理盐水

(7)阳性对照：体外转录的星状病毒RNA片段或含星状病毒靶基因的质粒DNA；

(8)显色液：SYBR Green I染料，购自Invitrogen公司，货号S7563；

其中所述2×RT-LAMP反应液中：2×ThermoPol缓冲液是由10×ThermoPol缓冲液(购自NEB公司，货号M0275L)稀释而成。2×ThermoPol缓冲液含有0.2％Triton X-100、20mM(NH₄)₂SO₄、20mM KCl、4mM MgSO₄和pH 8.8的40mM Tris-HCl；

甜菜碱：购自Sigma公司，货号107-43-7；

10mM dNTPs：购自上海生工，货号D0056。

本发明还提供了一种检测星状病毒试剂盒的使用方法：

(1)提取样品的RNA，即模板RNA：按照实施例5所述的病毒RNA的提取方法提取模板RNA，也可以采用其他常规分子生物学方法制备样品的RNA或cDNA；

(2)RT-LAMP反应体系

表2RT-LAMP反应体系

(3)反应条件：65℃恒温反应90～120分钟，85℃2分钟使酶失活，反应即结束。

(4)结果判定：

浊度观察：反应结果可通过肉眼观测反应产物浊度来判断，白色混浊的为阳性，澄清透明的为阴性。也可将PCR管12,000rpm离心2分钟，反应阳性的可在管底见到白色沉淀。

颜色变化：向反应终体系加入2.5μl显色液即SYBR Green I荧光染料，阳性反应呈荧光绿色，而阴性反应则保持SYBR Green I染料的荧光橙色。

电泳检测：RT-LAMP法的扩增产物是各种不同长度的茎-环状结构DNA，因此阳性反应通过2％琼脂糖电泳检测呈梯形条带，而阴性反应则没有梯形扩增条带出现，可作为辅助检测方法。

本发明的优点是：(1)等温，合理避免了常规PCR对温度循环的特殊要求所带来的种种不便。(2)高效灵敏，设计出星状病毒特异的环状上游引物(LF)和环状下游引物(LB)，进一步提高检测灵敏度，在60min的时间内，扩增效率可达到10⁹～10¹⁰个数量级，扩增模板极限可达60拷贝星状病毒核酸。(3)特异性强，设计6条特异性引物，共识别星状病毒靶基因的8个不同位点，保证扩增的特异性。(4)费用低，不需要昂贵的精密仪器和特殊试剂，仅需一个恒温水浴即可。(5)操作简便，不需要进行双链核酸的预变性，在一管内即可以完成全部检测。(6)检测简单，在核酸大量合成时，产生副产物-焦磷酸镁沉淀，有极高的特异性。只要用肉眼观察沉淀浊度就能够判断扩增与否。(7)扩增RNA模板，反应体系中加入逆转录酶，即可一步实现对RNA的高效扩增。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1RT-LMAP试剂盒(A)、普通RT-PCR(B)和实时荧光RT-PCR(C)检测星状病毒的灵敏性分析结果，M：DL2000；1：6×10⁹拷贝；2：6×10⁸拷贝；3：6×10⁷拷贝；4：6×10⁶拷贝；5：6×10⁵拷贝；6：6×10⁴拷贝；7：6×10³拷贝；8：6×10²拷贝；9：60拷贝；10：6拷贝；11：阴性对照；

图2RT-LAMP试剂盒检测星状病毒的特异性分析结果，1：DL2000；2：星状病毒；3：GI型诺如病毒；4：GII型诺如病毒；5：轮状病毒；6：甲肝病毒；7：阴性对照。

具体实施方式

实施例1：RT-LAMP引物的设计

参照1型星状病毒Oxford毒株的衣壳蛋白编码基因(ORF2)5’端核酸高度保守序列(GenBank accession No.L23513)，利用Primer Explorer V4.0在线软件(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)，设计星状病毒的特异性RT-LAMP引物，引物如表1所示。引物Tm值介于59℃和65℃之间；末端自由能(G)均小于-4cal/mol，可保证引物足够高的稳定性；GC含量均在50％左右；引物3’端不存在互补序列，可有效防止引物内部二级结构的形成。本发明所设计的星状病毒特异性环状上游引物(LF)和环状下游引物(LB)，有助于提高检测灵敏度，缩短反应时间。6条引物，共识别星状病毒靶基因的8个不同位点，充分保证扩增反应的特异性。引物委托大连宝生物工程有限公司合成，要求PAGE纯或HPLC纯。

实施例2：星状病毒RT-LAMP检测体系的建立与优化

1.方法：

1)Mg²⁺浓度：按照表2的反应体系配制反应混合液，分别调节Mg²⁺浓度至2mM、4mM、6mM、8mM、10mM、12mM，于65℃保温90min后，85℃反应2min终止反应。比较不同Mg²⁺浓度对扩增效率的影响。

2)dNTPs浓度：按照表2的反应体系配制反应混合液，分别调节dNTPs终浓度至0mM、0.2mM、0.6mM、1.0mM、1.4mM、1.8mM，于65℃保温90min后，85℃反应2min终止反应。比较不同浓度dNTPs对扩增效率的影响。

3)甜菜碱浓度：按照表2的反应体系配制反应混合液，并调节甜菜碱浓度至0M、0.4M、0.8M、1.2M，于65℃保温90min后，85℃反应2min终止反应。比较不同浓度甜菜碱对扩增效率的影响。

4)内外引物浓度比：按照表2的反应体系配制反应混合液，并调节内外引物浓度比分别为1∶1、1∶2、1∶4、1∶8，于65℃保温90min后，85℃反应2min终止反应。比较不同内外引物浓度比对扩增效率的影响。

5)反应时间：按照表2的反应体系配制反应混合液，分别于65℃保温15min、30min、45min、60min、90min、120min，85℃反应2min终止反应。比较反应时间长短对扩增效果的影响。

6)反应温度：按照表2的反应体系配制反应混合液，分别于55℃、58℃、60℃、63℃、65℃、68℃保温90min后，85℃反应2min终止反应。比较不同反应温度对扩增效果的影响。

2.结果：直接肉眼观察上述扩增产物的浊度变化，或在上述扩增产物中加入SYBR

Green I染料，观察颜色变化，或进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现Mg²⁺浓度选用4mM、dNTPs浓度选用1.8mM、甜菜碱浓度为0.8M、内外引物浓度比达1∶8时，于65℃反应90～120min时所得扩增效果最佳，故以此做为试剂盒组成的依据和推荐反应条件。

实施例3：检测星状病毒的试剂盒的组成

一、试剂盒的组成(保存于-20℃)

(1)TRIZOL裂解液：购自Invitrogen公司，货号：15596-026；

(2)DEPC水：购自上海生工，货号：D1005；

(3)2×RT-LAMP反应液：其组分为：2×ThermoPol缓冲液、1.6M甜菜碱、3.6mM dNTPs、8mM MgSO₄、0.4μM外侧上游引物(F3)、0.4μM外侧下游引物(B3)、3.2μM内侧上游引物(FIP)、3.2μM内侧下游引物(BIP)、1.6μM环状上游引物(LF)和1.6μM环状下游引物(LB)；其中外侧上游引物(F3)是序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，外侧下游引物(B3)是序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，内侧上游引物(FIP)是序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，内侧下游引物(BIP)是序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，环状上游引物(LF)是序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，环状下游引物(LB)是序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；引物委托大连宝生物工程有限公司合成，要求PAGE纯或HPLC纯；

(4)Bst DNA聚合酶：8U/μL，购自NEB公司，货号M0275L；

(5)AMV反转录酶，10U/μL，购自Promega公司，货号M510A；

(6)阴性对照：生理盐水

(7)阳性对照：体外转录的星状病毒RNA片段或含星状病毒靶基因的质粒DNA；

(8)显色液：SYBR Green I染料，购自Invitrogen公司，货号S7563。

其中所述2×RT-LAMP反应液中：2×ThermoPol缓冲液是由10×ThermoPol缓冲液(购自NEB公司，货号M0275L)稀释而成。2×ThermoPol缓冲液含有0.2％Triton X-100、20mM(NH₄)₂SO₄、20mM KCl、4mM MgSO₄和pH 8.8的40mM Tris-HCl；

甜菜碱：购自Sigma公司，货号107-43-7；

10mM dNTPs：购自上海生工，货号D0056。

二、阳性对照品的制备

以星状病毒RNA(由中国疾病预防控制中心病毒病所提供)为模板，利用引物F3和B3，扩增出约215bp的特异性片断，称之为Ast(Ast包含RT-LAMP的扩增靶基因)；T-A克隆构建重组质粒pCR2.1-Ast(pCR2.1-T载体购自Invitrogen公司)，于上海生工公司进行序列测定，并将测序结果与GenBank中星状病毒的基因序列(accession No.L23513)进行同源性分析，保证其同源性达95％以上。提取并纯化质粒DNA，以其为模板，用Promega公司的Ribo MAX^TM Large Scale RNA Production system-T7试剂盒(货号：P1300)进行体外转录(按试剂盒操作说明书进行)，体外转录产物用DNase消化，去除其中的DNA。利用RNeasy MiniElute Cleanup kit(购自QIAGEN公司，货号74204)进一步纯化RNA。紫外分光光度计测定质粒DNA或体外转录RNA的浓度，并分别通过以下公式计算模板分子的拷贝数。将质粒DNA或体外转录RNA稀释至1000拷贝/μL，分装后于-80℃保存，作为试剂盒的阳性对照。

质粒DNA拷贝数/μL＝{6.022×10²³×[5×10^-8g/μL]×OD₂₆₀}/[质粒分子碱基数×6.58×10²]体外转录RNA拷贝数/μL＝[总含量(g/μL)/(转录分子碱基数×340)]×6.023×10²³

实施例4：检测星状病毒的试剂盒的特异性和灵敏性试验

1.检测灵敏度分析

(1)方法：将阳性对照质粒进行10倍梯度稀释至单拷贝/μL，各取1μL，分别进行LAMP、PCR和荧光PCR检测。

LAMP检测：利用实施例3所述的试剂盒进行LAMP检测，反应体系见表2，于65℃温育90min后，85℃2min终止反应。观察各扩增产物的浊度变化；或者在各扩增产物中加入SYBR Green I染料2.5μL，观察颜色变化；也可进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，分析本发明所述试剂盒所能检测到的最低限。

PCR检测：PCR反应体系(25μL)中含有10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP(2.5mmol/L)2μL、10μmol/L上游引物F3(5’-GCAGGTAACTGTTGAGGTCA-3’，序列表中的编号为SEQ ID No.1)和下游引物B3(5’-GGTTTTGGTCCTGTGACACC-3’，序列表中的编号为SEQ ID No.2)各0.5μL、Taq酶(5U/μL)0.2μL以及阳性对照质粒模板1μL。于ABI 9700 PCR仪中按以下条件进行反应：94℃预变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸45s，35个循环，72℃，8min，4℃保存。PCR反应结束后，取10μL产物在1.5％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统观察结果并拍照。

荧光PCR检测：25μL的实时荧光RT-PCR反应体系包括：2×Master mix(ABI公司，货号4304437)12.5μL、10μmol/L上游引物(5’-AAGCAGGTAACTGTTGAGGTC-3’，序列表中的编号为SEQ ID No.7)和下游引物(5’-GGTTTTGGTCCTGTGACAC-3’，序列表中的编号为SEQ ID No.8)各1μL、10μmol/L探针(5’-FAM-TCAACGTGTCCGTAACATTGTCAATAA-TAMRA-3’，序列表中的编号为SEQ IDNo.9，所述探针序列的5’端标记荧光报告基团FAM，3’端标记淬灭荧光基团TAMRA)0.1μL以及阳性对照质粒模板1μL。于ABI 7000PCR仪中按以下条件进行反应：50℃2min，95℃10min；95℃15s，60℃1min，40个循环。

(2)结果：发现利用本发明所述试剂盒，在90min内，可检测到60拷贝的阳性对照DNA；而普通PCR和实时荧光PCR的检测低限可分别达6×10³和60拷贝/反应。结果见图1。可见本试剂盒的检测灵敏度同荧光PCR相当，两者均明显高于普通PCR。而LAMP方法相比较于PCR和实时荧光PCR，操作更加简单，不需要进行模板的热变性、长时间温度循环，亦不需要荧光PCR仪等精密的仪器以及探针等昂贵的检测试剂，结果直观可靠，因而更便于现场快速检测工作的开展。

2.检测特异性分析

(1)材料：轮状病毒、星状病毒、甲肝病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒RNA均由中国疾病预防控制中心病毒病所提供。

(2)方法：使用本发明所述试剂盒，对常见的腹泻病毒包括轮状病毒、星状病毒、甲肝病毒、GI型诺如病毒和GII型诺如病毒RNA进行RT-LAMP扩增检测，观察该试剂盒有无非特异性反应的发生。

(3)结果：对扩增产物经浊度观察、SYBR Green I染色、2％琼脂糖凝胶电泳检测，只有星状病毒出现特异性扩增，其余病毒经RT-LAMP检测均呈阴性，证明该方法具有良好的特异性。结果见图2。

实施例5：检测星状病毒的试剂盒对临床样品的检测

1.材料：于首都儿童医院检验科收集婴幼儿的腹泻粪便标本，共16份。用PBS将粪便样品制成10％(wt/v)的悬液，5000g，离心5min，取上清保存于-80℃冻存，备用。

2.方法：

(1)病毒RNA的提取：利用传统Trizol法提取粪便RNA，具体操作如下：①在100μL粪便样品中加入1mL Trizol，震荡30s后，室温放置5min；②加入250μL氯仿-异戊醇，剧烈震荡30s，室温放置5min；4℃，12000g，离心5min；③将上清液转入新离心管中，加入500μL的异丙醇剧烈震荡混匀30s，室温放置5min；④4℃，5000g，离心5min；⑤小心移去上清，沉淀用1mL 70％乙醇清洗后12000g，4℃，离心5min(尽可能吸走上清，离心管置于超净台上将沉淀吹干)；⑥加入50μL无RNase水溶解RNA(为了使病毒RNA更好的溶解，置60℃加热10min)；⑦提取的RNA于-80℃保存备用。

(2)逆转录：用SuperscriptTM first-strand synthesis system for RT-PCR试剂盒(购自Invitrogen公司，货号18080-051)进行逆转录反应，按该试剂盒操作说明进行。获得cDNA用于下面试验。

(3)荧光RT-PCR：取16份粪便样本的cDNA各5μL，参照实施例4中荧光PCR的反应体系和反应条件进行扩增检测。

(4)RT-LAMP检测：利用本发明所述的试剂盒、反应体系(如表2)和条件(如发明内容中试剂盒使用时所提供的反应条件)对16份粪便样本cDNA进行RT-LAMP扩增检测。

3.结果：利用RT-LAMP共检出3份星状病毒阳性粪便样本，检出率约18.75％，与实时荧光RT-PCR的检测结果一致，检测结果见表3。而LAMP方法较荧光RT-PCR，操作更加简单，不需要进行模板的热变性、长时间温度循环，亦不需要荧光PCR仪等精密的仪器以及探针等昂贵的检测试剂，更有利于现场快速检测工作的广泛开展。

表3儿童粪便样品筛选结果

序列表

<110>中华人民共和国北京出入境检验检疫局

<120>一种检测星状病毒的试剂盒和寡核苷酸序列

<130>

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成引物F3

<400>1

gcaggtaact gttgaggtca    20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工合成引物B3

<400>2

ggttttggtc ctgtgacacc    20

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工合成引物FIP

<400>3

ctgctctgtc ccgccctcta atggccgcaa caggagta         38

<210>4

<211>41

<212>DNA

<213>人工合成引物BIP

<400>4

aggactagaa gacagcccgg atgacaatgt tacggacacg t    41

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成引物LF

<400>5

ttgtgagcgg gcccttg                               17

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成引物LB

<400>6

cgcggcaaac atcaatcttc tca                        23

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成引物

<400>7

aagcaggtaa ctgttgaggt c          21

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工合成引物

<400>8

ggttttggtc ctgtgacac             19

<210>9

<211>27

<212>DNA

<213>人工合成探针

<400>9

tcaacgtgtc cgtaacattg tcaataa    27

Claims (2)

1.一组检测星状病毒的寡核苷酸，其特征在于：由序列表SEQ ID No.1至序列表SEQ ID No.6所示碱基序列的寡核苷酸组成；其中SEQ ID No.1为外侧上游引物，SEQ ID No.2为外侧下游引物，SEQ ID No.3为内侧上游引物，SEQ ID No.4为内侧下游引物，SEQ ID No.5为环状上游引物，SEQ ID No.6为环状下游引物。

2.一种检测星状病毒的试剂盒，其特征在于，由以下试剂组成：

(1)TRIZOL裂解液；

(2)DEPC水；

(3)2×RT-LAMP反应液：其组分为：2×ThermoPol缓冲液、1.6M甜菜碱、3.6mMdNTPs、8mM MgSO₄、0.4μM外侧上游引物、0.4μM外侧下游引物、3.2μM内侧上游引物、3.2μM内侧下游引物、1.6μM环状上游引物、1.6μM环状下游引物；外侧上游引物是序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，外侧下游引物是序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列，内侧上游引物是序列表SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，内侧下游引物是序列表SEQ ID No.4所示的核苷酸序列，环状上游引物是序列表SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，环状下游引物是序列表SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；

(4)Bst DNA聚合酶；

(5)AMV反转录酶；

(6)阴性对照：生理盐水；

(7)阳性对照：体外转录的星状病毒RNA片段或含星状病毒靶基因的质粒DNA；

(8)显色液：SYBR Green I染料；

其中，所述2×RT-LAMP反应液中，2×ThermoPol缓冲液含有0.2％Triton X-100、20mM(NH₄)₂SO₄、20mM KCl、4mM MgSO₄和pH 8.8的40mM Tris-HCl。

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