CN108754032B

CN108754032B - 一种具有高特异性的等温核酸扩增体系及其应用

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Publication number: CN108754032B
Application number: CN201810798713.5A
Authority: CN
Inventors: 叶辛; 方雪恩; 孔继烈
Original assignee: Shanghai Igenetec Diagnostics Co ltd
Current assignee: Shanghai Igenetec Diagnostics Co ltd
Priority date: 2018-07-19
Filing date: 2018-07-19
Publication date: 2022-02-18
Anticipated expiration: 2038-07-19
Also published as: CN108754032A

Abstract

本发明涉及一种具有高特异性的等温核酸扩增体系，其包括全长Bst DNA聚合酶，并包括嵌入式荧光染料；本发明还涉及一种含有上述等温核酸扩增体系的试剂盒及其在在儿童腹泻病原体检测中的应用，该应用中扩增引物包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示、如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示、如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示的分别用于检测A群轮状病毒、星状病毒、腺病毒的引物组。全长Bst DNA聚合酶具有5'‑3'双链特异性外切酶活性及聚合活性，这一特点被应用于本发明所述的Exo‑NAT方法，并通过向反应体系中加入嵌入式荧光染料配合熔解曲线分析，可实现高特异性、高灵敏性的多重核酸检测，并成功应用于儿童腹泻病原体的精准检测，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。

Description

一种具有高特异性的等温核酸扩增体系及其应用

技术领域

本发明属于核酸扩增技术领域，具体涉及一种具有高特异性的等温核酸扩增体系，以及含有该等温核酸扩增体系的试剂盒及其应用。

背景技术

儿童感染性腹泻是一类临床多发病和常见病，严重威胁着儿童的生命健康，常年居于造成儿童病死率的前三位，且在发展中国家该疾病的情况更为严重。造成儿童感染性腹泻的病原体类型十分繁多，其中A群轮状病毒，星状病毒及腺病毒是造成感染的常见病原体，目前用于诊断这些病毒的方法主要包括免疫学方法及以PCR为基础的核酸检测方法，这些方法常常需要繁琐的操作程序、较为昂贵的仪器设备，专业的技术人员以及易出现假阳性或假阴性结果。

为了克服上述缺点，目前开发了适用于床旁快速检测的方法，一大类等温核酸扩增方法相继出现。如环介导的等温扩增(LAMP)，解旋酶依赖的等温扩增(HDA)，重组聚合酶扩增(RPA)等。这些等温扩增方法具有很多明显优势，如仪器设备及人员要求低，操作方便，设备易于简化，床旁使用等。但是这些等温核酸扩增的方法，由于其引物构成复杂，浓度较高且缺乏统一的退火温度，常常导致严重的假阳性现象，限制了其临床实际应用。因此，开发新的高特异性的等温核酸扩增方法具有重要的临床需求和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种具有高特异性的等温核酸扩增体系及其试剂盒和应用，本发明利用全长Bst DNA聚合酶开发出了一种具有高特异性的等温核酸扩增方法(Exo-NAT，Exo-Nuclecic Acid Testing)，并将其应用于常见儿童腹泻病原体的检测。本发明将全长Bst DNA聚合酶应用于Exo-NAT方法，通过向反应体系中加入嵌入式荧光染料配合熔解曲线分析，保证了该体系及方法的高度特异性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供一种具有高特异性的等温核酸扩增体系，其包括全长Bst DNA聚合酶，所述全长Bst DNA聚合酶具有5'-3'双链特异性外切酶活性及聚合活性。

为了进一步优化上述等温核酸扩增体系，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述等温核酸扩增体系还包括荧光染料，所述荧光染料选自SYBRGreen、Ever Green、Pico Green或SYTO系列。优选地，所述荧光染料为SYTO系列，更优选为SYTO-9。

进一步地，所述等温核酸扩增体系还包括Tris-HCl(pH 8.8@25℃)，KCl，(NH₄)₂SO₄，MgSO₄，Tween-20，dNTPs，扩增引物；其中，所述扩增引物包括前向外引物(FOP)，反向外引物(ROP)，前向内引物(FIP)及反向内引物(RIP)。

进一步地，引物FIP和引物RIP标记荧光基团和淬灭基团；更进一步地，引物FIP和引物RIP的5'端标记荧光基团；引物FIP第11位碱基T和引物RIP第12位碱基上标记淬灭基团；其中所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、CY5、Texas Red、JOE、TFAM；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、Dabcyl、Eclipse、MGB。更优选地，所述引物FIP和引物RIP的5'端标记的荧光基团不同，荧光基团选自TFAM和HEX，淬灭基团为TAMRA。

进一步地，所述等温扩增体系的反应条件为62～68℃，60～120mins，更优选为反应条件为65℃，90mins。

本发明的第二个目的是提供一种含有任一上述的等温扩增体系的试剂盒。优选地，该试剂盒还包括核酸提取试剂。

本发明的第三个目的是提供一种任一上述的等温扩增体系在儿童腹泻病原体检测中的应用，该应用基于非诊断和非治疗目的。

为了进一步优化上述应用，本发明采取的技术措施还包括：

进一步地，所述儿童腹泻病原体包括A群轮状病毒、星状病毒和/或腺病毒，所述扩增引物包括用于检测A群轮状病毒、星状病毒和/或腺病毒的引物；其中，所述用于检测A群轮状病毒的引物包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的FOP、ROP、FIP、RIP引物；所述用于检测星状病毒的引物包括如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示的FOP、ROP、FIP、RIP引物；所述用于检测腺病毒的引物包括如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示的FOP、ROP、FIP、RIP引物。

各引物的具体序列如下表所示：

进一步地，所述等温扩增体系中各组分的浓度如下：20mM Tris-HCl(pH 8.8@25℃)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，8mM MgSO₄，0.1％Tween-20，0.2μΜFOP/BOP，1.6μΜFIP/RIP，5U全长Bst DNA聚合酶，dNTPs(each 1.4mM)，1×SYTO-9。

进一步地，所述等温扩增体系的扩增条件为62～68℃，60～120mins；更优选为65℃，90mins。

进一步地，所述儿童腹泻病原体检测为单重检测或多重检测，所述单重检测或多重检测的最低检测限为100拷贝/反应(100copies/reaction)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明采用的等温核酸扩增体系及其检测方法能够实现高特异性、高灵敏性的多重核酸检测，并成功应用于儿童腹泻病原体的精准检测。本发明所述的检测方法具有重要的临床意义和广阔的应用前景，不仅可以应用于儿童腹泻病原体的精准检测，亦可以拓展应用于其它类型病原体感染的准确快速检测。

附图说明

图1为Exo-NAT方法的基本原理图。

图2为Exo-NAT方法基本原理的实验验证的结果示意图；其中A和B为荧光增长的结果示意图，C和D为采用琼脂糖凝胶电泳方法分析的扩增产物的分布图。

图3为将Exo-NAT方法应用于检测轮状病毒、星状病毒及腺病毒的熔解曲线示意图。

图4为将Exo-NAT方法应用于检测轮状病毒、星状病毒及腺病毒的最低检测限的结果示意图。

图5为将Exo-NAT方法应用于多重检测轮状病毒，星状病毒及腺病毒的熔解曲线示意图。

图6为将Exo-NAT方法应用于多重检测轮状病毒，星状病毒及腺病毒的最低检测限的结果示意图。

具体实施方式

本发明提供了一种具有高特异性的等温核酸扩增体系，其包括全长Bst DNA聚合酶，所述全长Bst DNA聚合酶具有5'-3'双链特异性外切酶活性及聚合活性；本发明还提供一种含有上述等温核酸扩增体系的试剂盒以及该等温核酸扩增体系在儿童腹泻病原体检测中的应用。

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

本发明所述的Exo-NAT方法的机理如图1所示。针对靶序列上的六个区域设计引物，引物包括前向外引物(FOP)，反向外引物(ROP)，前向内引物(FIP)及反向内引物(RIP)。在65℃左右的反应条件下，靶序列的双链呈松散的状态，内引物可以与靶序列配对，延伸后，在一侧可形成茎环结构，反向内引物继而配对延伸，当遇到之前形成茎环结构的双链部分时，外切酶活性可以起作用，将这一部分双链剪切掉，反向亦是相同机理，最终可形成产物1。同时两对外引物，也可同时与靶序上的互补区域结合延伸，最终形成产物2。

实施例1—Exo-NAT方法的基本原理的验证

本实施例为了验证Exo-NAT方法机理的可靠性，采取如下实验：首先将内引物(FIP/RIP)的5'端标记荧光基团FAM和HEX，并分别在FIP第11位碱基T和RIP第12位碱基T上标记猝灭基团TAMRA，形成FAM-FIP和HEX-RIP，当反应中外切酶活性起作用时，这两个荧光基团会被剪切下来与猝灭基团分离，从而荧光增长，如图2中A和B部分的结果验证了上述假设，证明了反应机理的可靠性；另外进一步应用琼脂糖凝胶电泳的方法分析了扩增产物的分布，其结果如图2的C和D部分所示，三种病毒阳性的标本均出现了明显的两条带，而阴性标本没有条带出现，这也验证了该Exo-NAT方法会产生一长一短两种产物的特点，进一步证实了本方法的可靠性。

实施例2—将Exo-NAT方法应用于儿童腹泻病原体的检测

本实施例将Exo-NAT方法用于检测轮状病毒，星状病毒及腺病毒，其应用嵌入式荧光染料(SYTO-9)配合熔解曲线分析，成功实现了上述三种病毒的特异性检测。

在实施例中，反应扩增体系为25μL，其中各成分浓度为：20mM Tris-HCl(pH8.8@25℃)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，8mM MgSO₄，0.1％Tween-20，0.2μΜ FOP/BOP，1.6μΜFIP/RIP，5U全长Bst DNA聚合酶，dNTPs(each 1.4mM),1×SYTO-9，反应条件为：65℃，90mins；其中，用于检测A群轮状病毒的引物为如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4所示的FOP、ROP、FIP、RIP引物；用于检测星状病毒的引物为如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8所示的FOP、ROP、FIP、RIP引物；用于检测腺病毒的引物为如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.12所示的FOP、ROP、FIP、RIP引物。

如图3所示，三种病毒的阳性样本和阴性样本T_m值有显著差异，且阴性样本T_m值较低，提示并不是目标产物的片段；进一步应用梯度稀释(10¹cp、10²cp、10³cp、10⁴cp、10⁵cp、10⁶cp、10⁷cp)的质粒标本验证了Exo-NAT方法检测上述三种病原体的最低检测限为100copies/reaction(如图4所示)。

实施例3—将Exo-NAT方法应用于儿童腹泻病原体的多重检测

本实施例将实施例2中所述的三种病毒的引物组混合在一个体系中，能够实现对每种病毒高特异性的多重检测，其结果如图5所示，可以通过T_m值的不同准确判断感染的病原体种类，另外有两例临床标本是轮状病毒与腺病毒双重感染，则可以出现两个特征性的T_m值峰，表明了本申请所述的Exo-NAT方法具有多重检测的能力。进一步评估了该方法用于多重检测时的最低检测限，结果表明其最低检测限依然为100copies/reaction(如图6所示)，证明了该方法具有较好的多重检测能力。

本发明所述的扩增体系及Exo-NAT方法，结合嵌入式荧光染料法及内引物5'标记荧光基团方法，其可利用不同靶序列间T_m的不同值进行多重Exo-NAT，本发明所述的等温核酸扩增体系及其检测方法可实现高特异性、高灵敏性的多重核酸检测，并成功应用于儿童腹泻病原体的精准检测，也可以拓展应用于其它类型病原体感染的准确快速检测，具有重要的临床意义和广阔的应用前景。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 上海速创诊断产品有限有限公司

<120> 一种具有高特异性的等温核酸扩增体系及其应用

<130> IPI182102

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> A群轮状病毒 FOP引物(Artificial Sequence)

<400> 1

ctacaacgtc aactctttct g 21

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> A群轮状病毒 ROP引物(Artificial Sequence)

<400> 2

aatccataga cacgccag 18

<210> 3

<211> 49

<212> DNA

<213> A群轮状病毒 FIP引物(Artificial Sequence)

<400> 3

cgacaacatg tacttattga atgccaaaat ctattggtag gagtgaaca 49

<210> 4

<211> 45

<212> DNA

<213> A群轮状病毒 RIP引物(Artificial Sequence)

<400> 4

tctccagagg atattggacc atcttgtctt aactgcattc gatct 45

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 星状病毒 FOP引物(Artificial Sequence)

<400> 5

aataacaatg gcaatttagc ac 22

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 星状病毒 ROP引物(Artificial Sequence)

<400> 6

tggtgccaat aaaaactgtt 20

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 星状病毒 FIP引物(Artificial Sequence)

<400> 7

agaccacgta tctggctcac ttggcatatc ttcttgtgct 40

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 星状病毒 RIP引物(Artificial Sequence)

<400> 8

gcacgcctgt ttgacactca cctacaagtt agtatgacaa caa 43

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 腺病毒 FOP引物(Artificial Sequence)

<400> 9

aagacaaaac ggcgtgct 18

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 腺病毒 ROP引物(Artificial Sequence)

<400> 10

gcttacggat tcccaacaga 20

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 腺病毒 FIP引物(Artificial Sequence)

<400> 11

ttggttaccg ggtcccaacc agaaagcgac ataggggtga 40

<210> 12

<211> 41

<212> DNA

<213> 腺病毒 RIP引物(Artificial Sequence)

<400> 12

cttgtcatgc caggcgtgta cagcgtaaaa tccactccgc a 41

Claims

1.一种等温核酸扩增体系在儿童腹泻病原体检测中的应用，其特征在于，所述应用为非疾病诊断的应用；所述等温核酸扩增体系包括全长Bst DNA聚合酶，所述全长Bst DNA聚合酶具有5'- 3'双链特异性外切酶活性及聚合活性；

所述等温核酸扩增体系还包括荧光染料，所述荧光染料选自SYBR Green、Ever Green、Pico Green或SYTO系列；

所述等温核酸扩增体系还包括Tris-HCl，KCl，(NH₄)₂SO₄，MgSO₄，Tween-20，dNTPs，扩增引物；其中，所述扩增引物包括FOP、ROP、FIP、RIP；

引物FIP和引物RIP标记荧光基团和淬灭基团；其中所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、CY5、Texas Red、JOE、TFAM；所述淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA、Dabcyl、Eclipse、MGB；

所述等温核酸扩增体系在使用时采用的方法为Exo-NAT，所述Exo-NAT方法的原理为：在65℃的反应条件下，靶序列的双链呈松散的状态，内引物可以与靶序列配对，延伸后，在一侧可形成茎环结构，反向内引物继而配对延伸，当遇到之前形成茎环结构的双链部分时，外切酶活性可以起作用，将这一部分双链剪切掉，反向亦是相同机理，最终可形成产物1；同时两对外引物，也可同时与靶序上的互补区域结合延伸，最终形成产物2。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述儿童腹泻病原体包括A群轮状病毒、星状病毒和/或腺病毒，所述扩增引物包括用于检测A群轮状病毒、星状病毒和/或腺病毒的引物；其中，所述用于检测A群轮状病毒的引物包括如SEQ ID NO.1~ SEQ ID NO.4所示的FOP、ROP、FIP、RIP引物；所述用于检测星状病毒的引物包括如SEQ ID NO.5~ SEQ ID NO.8所示的FOP、ROP、FIP、RIP引物；所述用于检测腺病毒的引物包括如SEQ ID NO.9~ SEQ ID NO.12所示的FOP、ROP、FIP、RIP引物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述等温扩增体系中各组分的浓度如下：20 mM Tris-HCl，10 mM KCl，10 mM (NH₄)₂SO₄，8mM MgSO₄，0.1% Tween-20，0.2μΜ FOP/BOP，1.6μΜ FIP/RIP，5U 全长Bst DNA聚合酶，dNTPs，1× SYTO-9。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述等温扩增体系的扩增条件为62~68℃，60~120mins。

5.根据权利要求1~4中任一项所述的应用，其特征在于，所述儿童腹泻病原体检测为单重检测或多重检测，其最低检测限为100拷贝/反应。