CN117327840A - 检测不明肝炎相关病原体的组合物、试剂盒，及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及不明肝炎相关病原体的检测，更具体地，涉及细小病毒b19、人疱疹病毒6型和单纯疱疹病毒的检测。本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同病原体上的靶点，对不同病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实现细小病毒b19、人疱疹病毒6型、单纯疱疹病毒的检测和区分。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到400拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，涉及不同类型不明肝炎相关病原体的检测，更具体地，涉及细小病毒b19、人疱疹病毒6型和单纯疱疹病毒的检测。
背景技术
非嗜肝病毒性肝炎是指由非嗜肝性病毒感染引起的肝损伤，也被称为不明原因肝炎或不明肝炎，可能由一种病毒感染引起，也可能由多种病毒混合感染后发生。非嗜肝性病毒感染主要表现为肝炎，以人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，CMV)、EB病毒(Epstein-Barr virus，EBV)和柯萨奇病毒(coxsackievirus，CAV)感染多见；部分表现为引起其他器官系统病变的同时伴发肝损伤，以麻疹病毒、肾综合征出血热病毒和登革病毒感染多见。非嗜肝病毒性肝炎一般病情较轻，但是人疱疹病毒6型(human herpes virus 6，HHV-6)、柯萨奇病毒和腺病毒(adenovirus，ADV)混合感染后引起的肝炎易发展为急性肝衰竭，尤其多见于免疫功能缺陷和受损患者，值得引起重视。
而常见引起肝损害的非肝炎病毒包括疱疹病毒类、肠道病毒类和呼吸道病毒类。其中疱疹病毒类有EB病毒、人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)和人疱疹病毒6型等；肠道病毒类包括柯萨奇病毒A/B组和埃可病毒(Echovirus)等；呼吸道类病毒则主要有腺病毒及腺病毒41型。
因此，本领域需求一种产品能够简单、快速地检测上述不同的病原体，以便为临床医生提供较为充分的快速诊断以及排除不同病原体感染的依据，缩短临床医生对患者病情诊断的时间，加快对患者实施治疗措施，并且灵敏度高，特异性好。
发明内容
有鉴于此，第一方面，本发明提供一种不明肝炎相关病原体检测的组合物，包括：
第一核酸组合物：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测细小病毒b19的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:4～6所示的检测人疱疹病毒6型的上游引物、下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:7～9所示的检测单纯疱疹病毒的上游引物、下游引物及探针。
本发明提供的联检的组合物，主要利用多重荧光PCR分析方法，通过检测不同靶点，对不同类型的病原体进行检测，从而在单管反应体系中同时实细小病毒b19、人疱疹病毒6型、单纯疱疹病毒的检测和区分，以便为后续治疗提供针对性的策略。本发明的组合物，其检测的灵敏度更高，达到400拷贝/mL，特异性好，检测更为准确。
进一步地，所述组合物还包括第二核酸组合物：
如SEQ ID NO:10～12所示的检测腺病毒41型的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:13～15所示的检测人巨细胞病毒的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:16～18所示的检测腺病毒通用型的上游引物、下游引物及探针以及
如SEQ ID NO:19～21所示的检测EB病毒的上游引物、下游引物及探针。
进一步地，所述第一核酸组合物和/或第二核酸组合物包括检测内标的上游引物、下游引物及探针。
在一些具体的实施方案中，内标是人源内标基因。在一个具体的实施方案中，内标是Rnase P。
在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括如SEQ ID NO:22～24所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。
进一步地，本发明组合物探针的荧光基团彼此互不相同且互不干扰。
在本文中，“互不相同且互不干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用ATTO425、Quasar705、FAM、HEX、ROX和CY5，这些基团吸光值不接近，能选择不同的通道，因而不会互相干扰。
在一些具体的实施方案中，细小病毒b19和腺病毒41型探针的荧光报告基团为FAM；内标和人巨细胞病毒探针的荧光报告基团为HEX；单纯疱疹病毒和EB病毒探针的荧光报告基团为CY5；人疱疹病毒6型和腺病毒通用型探针的荧光报告基团为CY5。
进一步地，在一些实施方案中，本发明的组合物可以同时包括上述引物和探针对中的一对或多对。在本发明中，“对”是指检测一个靶点的互相匹配的上游、下游引物和探针。
本发明的组合物可以任意组合成检测对应8个靶点的任意组合形式。本领域技术人员可以根据需要进行组合，检测哪几个靶点，即把对应靶点的引物和探针对进行组合即可。这些组合形式均包括在本发明中。
举例来说，可以包括上述8对引物和探针中的任意7对，可以包括上述8对引物和探针中的任意6对，上述8对引物和探针中的任意5对，上述8对引物和探针中的任意4对，上述8对引物和探针中的任意3对，可以包括上述8对引物和探针中的任意2对，也可以包括上述8对引物和探针中的任意1对。
在一些具体的实施方案中，本发明组合物用于荧光PCR。
进一步地，探针的3’末端还具有非荧光淬灭剂。
进一步地，探针的3’末端还具有淬灭基团，例如BHQ1或BHQ2。
在一个具体的实施方案中，探针的3’末端为BHQ1。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分分别存在于单独包装中。
在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。
进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。
第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备不明肝炎相关病原体检测的试剂盒中的用途。
第三方面，本发明提供了一种检测不明肝炎相关病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述本发明的组合物。
进一步地，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
在一个具体的实施方案中，阴性质控品是DEPC H2O、生理盐水、内标基因中的至少一种。阳性质控品是细小病毒b19、人疱疹病毒6型、单纯疱疹病毒、腺病毒41型、人巨细胞病毒、腺病毒通用型的片段DNA、假病毒等中的至少一种。
进一步地，所述试剂盒还包括dNTP、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂，以及DNA聚合酶中的至少一种。
更进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放试剂、核酸提取试剂、dNTP、dUTP、UNG酶、DNA聚合酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
进一步地，所述DNA聚合酶的浓度为3U/反应～15U/反应，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒包括Taq酶、Mg2+、dNTP(U)s、引物、探针和PCR缓冲液。
常见的PCR缓冲液由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20μl～200μl。
在一个具体的实施方案中，本发明试剂盒可以兼容数字PCR扩增体系，即可以直接用于数字PCR仪上进行扩增。
第四方面，提供了一种非诊断目的的检测不明肝炎相关病原体的方法，所述方法包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上所述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
在本发明中，用于检测的样本可以是粪便、不明肝炎分泌物等，但不限于此。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
预变性和酶激活，温度为95℃，时间为1～5min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
在一个具体的实施方案中，提供了一种组合物用于制备不明肝炎相关病原体检测的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：
预变性和酶激活，温度为95℃，时间为1～5min，1次循环；变性，温度为95℃，时间为5～20秒，退火，温度为55℃～60℃，时间为10～60秒，30～50次循环，采集荧光。
附图说明
图1为本发明第一核酸组合物检测结果图(分别为细小病毒b19、人疱疹病毒6型、单纯疱疹病毒、内标)；
图2为本发明第二核酸组合物检测结果图(分别为腺病毒41型、人巨细胞病毒、腺病毒通用型、EB病毒)
图3本发明组合物特异性结果图；
图4为本发明对比例组合物的细小病毒b19单靶点检测结果图；
图5为本发明对比例组合物的细小病毒b19四联检检测结果图；
图6为本发明对比例组合物的EB细胞病毒单靶点检测结果图；
图7为本发明对比例组合物的EB细胞病毒四联检检测结果图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方案和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方案和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
实施例1、本发明所使用的引物及探针
本发明所使用的引物及探针如下表1所示。
表1
其中，细小病毒b19和腺病毒41型探针的荧光报告基团为FAM；内标和人巨细胞病毒探针的荧光报告基团为HEX；单纯疱疹病毒和EB病毒探针的荧光报告基团为CY5；人疱疹病毒6型和腺病毒通用型探针的荧光报告基团为CY5。
实施例2、检测病原体的方法
荧光PCR扩增反应液：含有PCR缓冲液、Taq酶、Mg2+、dNTP、引物、探针等。具体的反应体系如表2所示。酶混合液由1μL H-Taq酶(15U/μL)(每人份为2.5μL)。
表2
| 组份 | 每一个反应中的体积/浓度 |
| PCR buffer* | 24.5μL |
| dNTPs(T)(100mM) | 1.00μL |
| 1mol/L MgCl2 | 0.30μL |
| 引物(40pmol/μL) | 0.50μL |
| 探针(40pmol/μL) | 0.20μL |
| 0.1％DEPC水 | 补至37.5μL |
试剂准备：
根据待测样本、阳性对照、阴性对照的数量，按比例(PCR反应液38μL/人份+酶混合液2μL/人份)取相应量的PCR反应液和酶混合液，充分混匀成PCR混合液，2000rpm离心10s后备用。
样本处理与加样
取300μL待测样本、阴性对照、阳性对照到1.5mL离心管中，使用圣湘生物科技股份有限公司的核酸提取或纯化试剂按其说明书操作进行核酸提取。
吸取上述处理好的样本、阴性对照及阳性对照各10μL分别加入反应管A-B中，在各反应管中分别加入40μL PCR混合液A-B，盖上管盖。
在SLAN-96P全自动医用PCR分析系统上，按照一定的温度、时间设置程序进行PCR扩增其扩增反应程序如表3所示。
表3
结果分析与判断：
如果A管、B管的FAM、HEX、CY5及ROX通道有明显S型扩增曲线，且Ct值≤40，则判为阳性；如果FAM、HEX、CY5及ROX通道无扩增曲线(NoCt)或Ct值＞40，则判为阴性，具体如表4所示：
表4
实施例3、本发明组合物测试样本的检测结果
将实施例1所示的引物和探针，按照实施例2的方法对细小病毒b19、人疱疹病毒6型、单纯疱疹病毒，以及腺病毒41型、人巨细胞病毒、腺病毒通用型、EB病毒混合样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行PCR检测，检测结果如图1～2所示，从图中可以看出，本发明组合物均能对各种病原体进行良好的检测。
实施例4、本发明组合物的灵敏度
使用本发明实施例1中的组合物，对各个靶标进行LOD(灵敏度)检测，以模拟临床样本，在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测。结果如表5所示，表明对低至400拷贝/mL的样本各通道仍然能够准确检测出，表明本发明组合物的灵敏度为400拷贝/mL。
表5
实施例5、本发明组合物的特异性
为了测试本发明实施例1中的组合物的特异性，特异性实验表明，采用本发明中的方法对其他非嗜肝性病原体(肠道病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、轮状病毒、腮腺炎病毒、流感病毒、副流感病毒、水痘-带状疱疹病毒和呼吸道合胞病毒)等无交叉反应，特异性实验结果如图3所示。结果表明，本发明方法对上述不明肝炎病原体无交叉反应。
对比例1、本发明设计的其余的效果不好的引物和探针
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，但这种概率很少，在设计之初就可以排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计。
因此，发明人还设计了其余一些引物和探针组成了不同的检测体系1～3(序列未示出)，同样用于检测上述病原体。具体检测结果如图4～7所示，从图4和5图中可以看出A管病原体中细小病毒b19单独检测时效果较好，但联合检测则存在荧光信号低和Ct值拖后，同理B管病原体中EB病毒单检时效果较好，但联检后出现检测信号极低等现象。
Claims (10)
1.一种不明肝炎相关病原体检测的组合物，包括：
第一核酸组合物：
如SEQ ID NO:1～3所示的检测细小病毒b19的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:4～6所示的检测人疱疹病毒6型的上游引物、下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:7～9所示的检测单纯疱疹病毒的上游引物、下游引物及探针。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括第二核酸组合物：
如SEQ ID NO:10～12所示的检测腺病毒41型的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:13～15所示的检测人巨细胞病毒的上游引物、下游引物及探针；
如SEQ ID NO:16～18所示的检测腺病毒通用型的上游引物、下游引物及探针；以及
如SEQ ID NO:19～21所示的检测EB病毒的上游引物、下游引物及探针。
3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述第一和/或第二核酸组合物还包括如SEQ ID NO:22～24所示的检测内标的上游引物、下游引物及探针。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，细小病毒b19和腺病毒41型探针的荧光报告基团为FAM；内标和人巨细胞病毒探针的荧光报告基团为HEX；单纯疱疹病毒和EB病毒探针的荧光报告基团为CY5；人疱疹病毒6型和腺病毒通用型探针的荧光报告基团为CY5。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物的各成分以混合的形式存在。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的组合物在制备检测不明肝炎相关病原体的试剂盒中的用途。
7.一种检测不明肝炎相关病原体的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1～5中任一项所述的组合物。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：核酸释放试剂、核酸提取试剂、DNA聚合酶、dNTP、dUTP、UNG酶、PCR缓冲液以及Mg2+中的至少一种。
10.一种组合物用于制备不明肝炎相关病原体检测的试剂的用途，所述检测包括以下步骤：
1)提取或释放待测样本的核酸；
2)使用如权利要求1～5中任一项所述的组合物或权利要求7～9中任一项所述的试剂盒对步骤1)获得的核酸进行荧光定量PCR；
3)获得并分析结果。
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