CN103249844B - 目标核酸多标靶定量鉴定 - Google Patents
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Abstract
采用实时核酸扩增系统的定量能力和杂交系统的多标靶功能来检测目标核酸的方法和系统,包括如下:识别各个目标核酸序列中保守序列和独特序列;同时扩增保守区域和独特区域;实时监测保守区域的扩增情况;通过多标靶识别来识别独特区域;通过将实时监控信息与目标核酸多标靶识别相结合来进行多标靶定量分析。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求美国临时专利申请编号为61/393.253的优先权,题为“多标靶定量”,于2010年10月14日提交,所有内容纳入本参考中。
发明背景
1.发明适用领域
本发明涉及分子检测,更具体地来说,是关于一个或众多目标分子多标靶定量检测的方法和系统。
2.发明背景
生化分析一般用于研究、临床、环境和工业设置,以检测和量化某些基因序列、抗原、疾病或病原体。生化分析通常用来识别生物体,比如宿主生物体或样品中的寄生虫、真菌、细菌或病毒。在特定条件下,生化分析可以提供定量检测,其可以用来计算感染或疾病的程度,并且监测疾病随着时间的推移而产生的状态。一般情况下,生化分析通常检测从研究、临床、环境或工业来源样品中所提取的抗原(采用免疫测定法)或核酸(基于核酸或分子的生化分析)。
对生化分析而言,定量识别横跨国土安全、食品安全以及医疗诊断等众多学科的多种病原体需求是不断增长的。虽然现有技术可以进行多种定量分析,但是这些技术无法对多种病原体提供足够的定量识别。例如,微阵列提供满意的DNA多靶标鉴定,但是很少或根本没有提供量化信息。另一方面,实时PCR提供高品质的量化信息,但是多靶标鉴定则有限。
实时聚合酶链反应(PCR),在其它应用中也被称作定量实时聚合酶链反应(qrt-PCR),它是一个分子生物学工具,采用众所周知的PCR工艺来同时扩增目标DNA分子,同时量化目标DNA;与另一个输入相比,可以作为一个绝对量或者一个相对量。采用标准的PCR,可以在反应完成后对产品进行检测。与此相反,为进行定量实时聚合酶链反应,用户采用大致相同的方式来放大目标DNA分子,但是在聚合酶链反应进展的同时来检测目标DNA分子。用来实时检测qrt-PCR产品的一些最常用方法,就是利用结合到双链DNA产品中的非特异性荧光染料;或者使用标有荧光报告基团的特定序列探针,只有当探针与目标序列产生交叉时,荧光报告基团才会发出荧光。如果采用这些方法,则需要提供附加设备比如荧光检测器。
特定序列探针法要求使用的探针具有核苷酸碱基序列,它与目标序列基本上互补,或者与其扩增物交替互补。在选择性生化分析条件下,为了检测样品中目标序列是否存在,探针被用来杂交目标序列或其扩增物。有效的探针可以防止与任何核酸序列进行非特异性杂交,这些核酸序列会干扰检测是否存在目标序列。探针或扩增物可包括标记物,能够检测标记所在位置,比如放射性标记、荧光染料、生物素、酶、电化学或化学发光化合物等。
为量化qrt-PCR产品,将所检测到的荧光强度绘制在对应于PCR循环数的对数刻度图上。可以通过比较试验结果和采用已知量产品获得标准结果来决定待反应中的目标量。然而,这只是可以量化qrt-PCR产品的方式之一。
定量实时PCR应用很多,特别是在分子生物学方面更是如此。qrt-PCR的一个特别用处在于获取样品中有关病原体的定量信息。为了定量分析,实时测量荧光强度,或者实时测量扩增反应期间扩增物浓度增加的另外一个参数都是必要的。为区分众多靶标,必须为每个靶标设计带有特定探针的特殊引物。或者在一个要求不高的情况下,只需要设计引物以及将诸如SYBR绿色荧光报告物应用于该反应,以监测扩增物的浓度在增加。例如,如果有10个潜在靶标,那么通常情况下需要10个不同的探针。当前最先进的探测器/探针组合允许多靶标同时检测最多4或5个目标。但是,大多数实时PCR系统只配备两个探测器,用于多靶标检测。使用该系统,对于区分6个丙型肝炎C病毒(HCV)基因而言则需要进行6次单独的PCR反应。
DNA微阵列是一种工具,通过样品中目标核酸与微阵列上互补的DNA序列相杂交,以检测样品中是否存在目标核酸序列。微阵列本身含有多达数千个的DNA斑点–被称作探针(或报告物)-其连接到表面上(例如微阵列自身表面或者次表面,比如小珠)。通常在显微镜玻片或其他相对较小的表面上形成微阵列,可以通过微阵列读取器来轻松读取。DNA探针的读取范围可以从很短或很长的DNA片断,并且常常包括一个短的寡核苷酸、基因、基因段、或非编码DNA片段,其中包括许多其它类型的序列。
要使用微阵列,就需要获取、纯化、扩增、以及标记感兴趣的核酸,通常情况下要么采用荧光方式,要么采用放射性标记。而后在DNA斑点上洗涤标记过的核酸,并且如果感兴趣的核酸实际上存在,其会与微阵列上的互补探针相杂交。未绑定或非特异性绑定的核酸被冲走,只留下绑定目标。做过标记的绑定目标从而在各绑定的DNA斑点处产生了一个信号,微阵列读取器可以检测到荧光信号,同时根据微阵列上的已知位置来确定探针和目标的身份。
DNA微阵列技术的优点之一就是该阵列的多靶标能力。因为单一阵列最多可能包括数千个的不同探针,单一微阵列试验可以同时执行数以千计的基因检测。微阵列通常用于以下方面:(i)分析基因表达;(ii)识别生物体;(iii)检测单核苷酸多态性(简写为SNP);(iv)对密切相关的生物之间进行基因组比较,其中包括许多其它广为人知的用处。
因此,微阵列技术常用于DNA的多靶标识别。然而,微阵列提供与被识别DNA有关的非常少或者不准确的定量信息。因此,在该技术领域中需要继续改进方法和系统,以便定量与多靶标检测相结合。
本发明小结
因此,本发明的一个主要目的和优点就是向一个或众多目标定量检测提供一种方法。
本发明的另一个目的和优点就是将定量与一个或众多目标多标靶检测相结合。
本发明还有一个目的和优点就是将实时核酸扩增系统的定量能力与杂交系统的多标靶功能相结合。
本发明的其它目的和优点部分是显而易见的,部分将在下文介绍。
根据上述目的和优点,本发明为样品中至少一个目标核酸分子提供检测方法。该方法包括以下步骤:(i)识别每个众多目标核酸分子的第一区域,即在众多目标核酸分子中,该第一区域是保守的;(ii)在样品中生成各目标核酸分子第一区域的第一扩增物;(iii)在扩增期间实时检测第一扩增物的生成;(iv)识别每个众多目标核酸分子的第二区域,即在众多目标核酸分子中,第二区域并不是保守的;(v)在样品中生成各目标核酸分子第二区域的第二扩增物;(v)检测第二扩增物,以表示样品中是否存在各目标核酸分子。从另外一方面来说,第一扩增产物产生于存在能与第一区域杂交的第一核酸探针时,并且扩增产物的实时检测步骤包括检测第一核酸探针与第一区域的杂交情况。从另外一方面来说,检测第二扩增物的步骤包括将第二扩增产物与互补探针杂交,此处将探针固定在基片上,比如DNA微阵列。该方法还可以包括以下步骤:(i)识别第二众多目标核酸分子的第三区域,即在第二众多目标核酸分子中,第三区域是保守的。(ii)通过扩增样品中每个第二众多目标核酸分子的第三区域来生成第三扩增物。(iii)实时检测第三扩增物的生成。在同一反应中可以生成第一扩增物和上述第三扩增物。
第二方面就是上述方法,还包括通过分析样品中目标核酸分子的定量以及样品中是否检测各目标核酸分子来进行样品中各众多目标核酸分子的多标靶定量检测步骤。
第三方面,样品中存在一个或更多目标核酸分子表示该样品中存在病原体。该方法可以用来检测、定量或者识别至少两个目标,比如样品中的病原体、基因、单核苷酸多态性、特定核酸序列等。
第四方面,识别每个众多目标核酸分子的第一区域的步骤包括如下:(i)对每个众多目标核酸分子的至少一个核酸序列片段进行序列比对;(ii)在序列比对基础上识别第一区域;(iii)设计第一引物和第二引物,其将在PCR扩增期间扩增第一区域;(iv)设计一个探针,在第一区域PCR扩增期间用来与该区域杂交。该探针的熔解温度至少要比第一引物的熔解温度和第二引物的熔解温度高6℃。
第五方面,识别每个众多目标核酸分子的第二区域的步骤包括如下:(i)对每个众多目标核酸分子的核酸序列至少一个片段进行序列比对;(ii)基于序列比对来识别第二区域;(iii)设计第一引物和第二引物,在PCR扩增期间将扩增第二区域。该方法还包括设计互补探针的步骤,即与每个众多目标核酸分子的第二区域进行杂交。
第六方面,提供一个系统,用来检测众多目标核酸分子的至少一个分子。该系统包括如下:(i)包括众多靶核酸分子至少一个分子的样品;(ii)第一引物对:第一引物对可以扩增每个众多目标核酸分子的第一区域,以生成第一扩增物。其中,众多目标核酸分子中,第一区域是保守的。(iii)实时聚合酶链反应(PCR)仪器,其中,PCR仪器可以用第一引物对来生成第一扩增物,并且还可以实时检测第一扩增物。(iv)第二引物对:第二引物对可以扩增每个众多目标核酸分子的第二区域,以生成第二扩增物,其中在众多目标核酸分子中,第二区域并不是保守的。(v)检测装置用来检测第二扩增物。根据一个实施例子,该系统还包括以下一个或多个方面:与第一区域杂交的第一核酸探针;与第二区域杂交的第二核酸探针,其中可以将第二核酸探针固定在基板上,比如微阵列。
第七方面:该系统还包括以下一个或多个方面:(i)第三引物对:第三引物对可以扩增每个众多靶核酸分子的第三区域,以生成第三扩增物。其中在第二众多靶核酸分子中,第三区域是保守的。(ii)从样品中纯化核酸的方法。
第八方面,该系统是一试剂盒,用来检测样品中众多目标核酸分子的至少一个分子。
第九方面,提供一试剂盒,用来检测众多靶核酸分子的至少一个分子。该试剂盒包括如下:(i)第一引物对:第一引物对可以扩增每个众多靶核酸分子的第一区域,以生成第一扩增物。其中,在众多目标核酸分子中,第一区域是保守的。(ii)与第一区域杂交的第一核酸探针。(iii)第二引物对:第二引物对可以扩增每个众多靶核酸分子的第二区域,以生成第二扩增物。其中,在所述众多靶核酸分子中,第二区域是不保守的。(iv)与第二区域杂交的第二核酸探针。
第十方面:该试剂盒还包括以下一个或多个方面:(i)微阵列;(ii)从样品中纯化核酸的方法。
第十一方面,该试剂盒还包括第三引物对,其中第三引物对可以扩增每个第二众多靶核酸分子的第三区域,以生成第三扩增物。在第二众多靶核酸分子中,第三区域是保守的。
附图若干意见的简要说明
通过阅读以下详细说明连同附图,可以更好地理解本发明,其中:
图1为根据本发明的一方面对方法进行高级别的示意图示。
图2为对以下细菌进行23S核糖体RNA(rRNA)序列比对。肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌显示TQR引物序列,箭头位于对齐序列的左上侧和右下侧;并且显示TQR探针序列,箭头位于对齐序列的右上侧。
图3为相同五种细菌的16S rRNA序列比对,表示TDR引物序列,箭头位于对准序列的左上侧和右下侧;并且表示TDR探针,箭头通过对准序列而分布于对准序列之间变异所处的独特位置上。
图4为六变体丙型肝炎病毒(HCV)的基因序列比对,用箭头来识别上游引物和下游引物以及潜在的qrt-PCR探针区域框。
图5为六变体丙型肝炎病毒(HCV)的基因序列比对,用箭头来识别上游引物和下游引物以及潜在的微阵列探针位置框。
图6为本发明一个方面的qrt-PCR反应结果扩增曲线。
图7A是一张表,根据本发明的一个方面来代表微阵列的组织。
图7B表示微阵列分析的结果,采用图7A所组织的微阵列来进行分析,其中斑点表示杂交。
本发明的详细说明
本发明的一个方面是方法和系统,以便将实时核酸扩增系统的定量能力和杂交系统的多标靶功能相结合。例如,本文所述为方法和系统,对样品中的目标核酸序列、物种或者菌株进行定量分析,样品包括两个或两个以上的基因、物种或菌株。即使那些核酸序列、物种或者菌株存在或远或近的关系,都可以进行定量分析。
本文中所用到的术语“核酸”是指核苷酸链(即含有链接到可交换有机碱的糖的分子)。术语“核酸”还可以指寡核糖核苷酸和寡脱氧核苷酸、以及多核苷酸和其它含核酸的有机碱,包括但不限于腺嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘌呤、胞嘧啶和肌苷。核酸可以是单链或双链的、可以从天然来源获取或者通过合成方法获取。
请参阅附图,其中相同的标号表示相同的部件。在图1中,根据本发明的一个实施例,可以看到定量识别样品中核酸方法的高级别图示表示。作为本方法的初始步骤,获得样品来进行分析。样品可以是上述方法中所用的任何样品。例如:可以获得的样品包含一个或多个核酸序列、物种或菌株等等。作为具体实施例,样品可以是从食物获得,从动物或人类获得,或从环境获得的任何样品,以及获得的任何其他样品,比如用于识别致病性或非致病性微生物的微生物样品。
因此在本方法的许多用途中,本文所述的装置和系统用来识别致病性或非致病性微生物潜在复杂混合物中所发现的一种或多种微生物。例如,潜在性复杂混合物可能是人或动物的血液样本或血培养,可能包含众多类型以及来自不同领域、门、分类、目纲、科的致病性或非致病性微生物菌株,以及众多的属包括埃希氏杆菌细菌属、葡萄球菌属、假单胞菌属、肠球菌属、克雷博菌属、肠杆菌属、变形杆菌属、立克次体、李斯特菌、分支杆菌属、沙门菌属、芽孢杆菌属、梭状芽孢杆菌等等;还有病毒科比如腺病毒、小核糖核酸病毒、疱疹病毒、嗜肝DNA病毒、黄病毒科、逆转录病毒、正粘病毒科、副粘病毒、多瘤病毒、弹状病毒科、乳多空病毒、披膜病毒科等等。潜在的复杂混合物也可以是从任何其他微生物菌落获得的样品,包括土壤样品,空气样品,水样品和表面样品等。
一旦获得样品,就可以从样品中提取出核酸来。在一个实施例中,样品中诸如细胞或组织样品等生物材料在样品制备过程中发生裂解。在另一个实施例中,可以从生物材料中提取。可以采用本发明的方法来采用本领域中已知的任何生物提取准则,包括但不限于化学、机械、电、声、热等。可以采用本领域中已知的任何核酸提取和纯化介质,来分离感兴趣的核酸,包括公司、公司、公司等供应商制造或销售的核酸纯化商用试剂盒。
除了从样品中序列特异性或生物特异性提取核酸以外,还可以对该过程进行设计,以便从样品中获取所有或几乎全部的核酸。后者特别有用,例如在样品中潜在生物身份未知的情况则很适用。根据一个实施例,采用一种方法来获取核酸,从而在本文所述该过程的下一步操作中即时使用核酸。
目标定量区域
在本实施例中的第110步中,为各目标定位好一个第一独特区域。在目标中,这个第一区域为保守区域,并且可以被称作目标定量区域(TQR)。在一个实施例中,TQR被确定用于已知一组相关的微生物,比如各种细菌群体。在另外一个实例中,TQR被确定用于已知一组更密切相关的微生物,比如包括致病性和非致病性菌株的一组大肠杆菌菌株。
图2中显示的是五种不同细菌基因部分的序列比对,以便识别目标之间的TQR:肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌。图2所显示的比对将编码23S核糖体RNA(rRNA)各生物体的DNA序列进行对齐。在许多微生物包含一份以上23S rRNA基因序列的同时,这些有机体内部序列往往保守性非常高。例如,肺炎克雷伯菌有8份23S rRNA、大肠杆菌有7份、奇异变形杆菌有7份、金黄色葡萄球菌有5份、粪肠球菌有4份。23SrRNA是大原核50S亚基的组成部分,通常情况下执行这个特定rRNA的核糖体肽酰转移酶活性。由于23S rRNA基因序列结构方面的这种或许其它功能性限制,该序列包含生物体之间高度保守的特定区域。由于图2显示了序列比对,在五个细菌中间23S rRNA区域保持了高度保守。
在图1所示方法的第120步中,引物和荧光探针专用于TQR。由于图2所示的五种细菌具有高度保守的区域,该TQR在qrt-PCR步骤期间可以被扩增,对于所有五种细菌而言采用一组正向和反向引物(如图2所示,请参阅正向引物“UTI-23S-S For”和反向引物“UTI-23S-2rev”)。因此,相同的引物将扩增从所有五种描述细菌获取DNA的区域。在另一实施例中,可以用一组特殊的引物来扩增各目标的TQR,或者在一个或多个组内来扩增众多目标。还应当指出的是,除了PCR扩增以外,可以采用该领域内已知扩增的其它方法和技术,对按照此文所述方法扩增的这些核酸序列或任何其它核酸序列进行扩增和分析。可以包括但不限于其它方法中基于扩增的核酸序列(NASBA)。
Qrt-PCR的具体设计也是本发明的一方面。如图2所示,采用正向引物“UTI-23S-2for”(ATCGCTCAACGGATAAAAG)和反向引物“UTI-23S-2rev”(CCGAACTGTCTCACGAC)从五种细菌开始对TQR区域进行扩增。但是,qrt-PCR探针包含序列AGCCGACATCGAGTG,并且对图2所示“UTI-23S-2探针”所处位置进行退火处理。为方便TQR扩增和探针的结合,探针的融解温度或Tm最好要比正向和反向引物的Tm高6~8℃。因此,虽然其它配置文件是可能的,但是引物、探针和扩增子都具有表1所述的特征。
表1 引物、探针和扩增子的特征
例如,在图2所示的例子中,引物“UTI-23S-2for”和“UTI-23S-2rev”和探针“UTI-23S-S探针”具有表2所述的特征。
表2 引物和探针
引物 | 序列 | 经过计算的温度Tm |
正向引物 | ATCGCTCAACGGATAAAA | 55.1 |
探针 | AGCCGACATCGAGGTG | 62.25 |
反向引物 | CCGAACTGTCTCACGAC | 56.18 |
现在对确定TQR的方法实施例进行一下说明。在这个例子中,来确定人类乳头状瘤病毒(HPV)的TQR。在开始步骤中,为两个或更多种HPV生成比对树。该比对可以是目标基因组中的一个子集,或者可以是目标的整个基因组。一旦比对好,用户或计算机程序就会搜索最相似的序列。
而后,用户或计算机程序可以搜索一组或多组适当相似的序列,以识别qrt-PCR探针的区域。在一个实施例中,可以识别以下潜在的TQRs:(i)在比对序列中是相同的;(ii)15个核苷酸或长度更长。而后,由用户或通过计算机程序来分析一个或多个被识别潜在性探针区域的一个或多个特征。这可以包括Tm、GC得分、或者各潜在探针区域的二级结构得分。例如,表3表示选择比对中所识别的潜在探针区域,加上经过计算的Tm、GC含量以及各潜在区域的二级结构得分。在这个例子中,第1序列有最高的Tm(64.5℃),对于之前讨论的理由其为最适当的探针。
表3 潜在探针序列
序列 | Tm | GC含量 | 二级结构得分 | |
1 | TTTGTGTGTCCGTGGTGTGCA | 64.5 | 52.4 | 13 |
2 | CCACCAGGTGGTGCC | 59.0 | 73.3 | 17 |
3 | TGACTCTATGTGCAGTACCA | 57.1 | 45.0 | 21 |
4 | GTAATAAAACTGCTTTTAGGCA | 54.1 | 31.8 | 21 |
作为确定TQR方法的下一步,对潜在探针周围的区域进行分析。在该方法的一个实施例中,执行以下步骤:(i)找出具有最可取特征(比如:第1序列)的潜在探针序列;(ii)分析被取特征序列两侧各大约200对碱基以找出“标准PCR”区间(也即试图确定所有目标中被识别探针序列上游和下游均共同保守的区域以用它们作为上游和下游引物的结合位点);(iii)确定侧翼区域,其产生的引物与探针保持一致(即引物的Tm比探针Tm低大约6度)。
图4显示的是TQR设计引物方法的一个实施例。在这个例子中,对丙型肝炎病毒(HCV)TQR的引物进行了设计。图4中将HCV六个变体进行对齐并依碱基颜色编码。图中框图区域具有潜在qrt-PCR探针的特征。对区域侧翼潜在探针进行分析,以识别上游和下游引物的结合位点(用箭头来标识)。
目标分化区域
此外,在图1所示的方法实施例110步中,在各目标中都有第二独特区域。与上述TQR相反,第二区域是目标之间存在特色的一个区域,例如,可以被称作目标分化区域(TDR)。图3所示的序列比对显示来自相同细菌的部分基因组(肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、以及粪肠球菌),其用来识别TDR(该区域在目标之间为一个独特的区域)。比对将各生物体的DNA序列对齐,这些生物体编码为16SrRNA。16SrRNA是原核生物核糖体30S亚基的组成部分,并且在细胞中具有多种功能,包括作为支架并协助原核生物核糖体50S和30S亚基的绑定等等。
在图1所示的方法130步中,专用微阵列探针通过采用微阵列来检测TDR。正如图3序列比对所证实的那样,16S rRNA的该区域包含高度保守的子区域以及不保守的子区域。就像这种区域的比对好处之一就是可以采用相同的正向引物(UTI_For_010111-1)和反向引物(UTI_Rev_010111-1)来扩增整个TDR,其中包括重要的序列差异。换句话说,可以对微阵列上的探针进行设计,使其只和一个靶核酸互补来区分不同细菌(或者一个以上的靶核酸,这要取决于用户需要–例如:用户可以设计该系统,以便在子集内部个体之间没有区分的情况下借助于设计探针来识别相关目标的一个子集,这些探针与只有那个子集内所发现的区域互补,等等)。在图3所示的例子中,在微列阵上所发现和描述的探针,KP-1-2011-112和KP-2-2011-112用于肺炎克雷伯菌、EC-1-20110112用于大肠杆菌、PM-1-20110112用于奇异变形杆菌、SA-1-20110112和SA-2-20110112用于金黄色葡萄球菌、EF-1-20110112用于粪肠球菌,被设计用来只绑定目标菌,并且只在所示区域进行。
图5显示了为TDR设计引物的一个方法实施例。在这个例子中,对丙型肝炎病毒(HCV)TDR的引物和潜在性探针进行了检查。在图5中,将HCV六个变体进行对齐并对碱基对颜色编码。用箭头来表示上游和下游引物,并且将三个潜在性探针区域框起来。
qrt-PCR扩增
在图1所示的方法第140步中,TQR和TDR都被扩增。可以通过使用任一PCR扩增方法来进行Qrt-PCR反应,造成或者预计形成适当的扩增物。根据一个实施例,在进行qrt-PCR反应之前,用任何一种已知优化PCR反应的方法来优化PCR反应,包括但不限于改变一个或多个引物的浓度,改变退火或延伸温度,和/或改变延伸时间等。
在该方法的一个实施例中,采用单一的PCR反应器或反应来扩增众多目标的TQR和TDR(序列、基因、属、种、菌株等)。在该方法中,每个目标的TQR上游引物和下游引物是相同的(参见图2),需要使用单一一组引物来扩增所有目标的TQR。同样地,各目标TDR的上游引物和下游引物是相同的(参见图3),需要使用单一一组引物来扩增所有目标的TDR。根据本实施例,可以同时或者按照顺序来进行PCR反应。
根据另一实施例,采用单独的PCR反应来扩增TQR区域和TDR区域。TQR反应为定量步骤中所用的qrt-PCR反应,并且TDR反应用于下游应用比如许多其它方面的微阵列分析。根据本实施例,单独的PCR反应可能发生在同一热循环装置中,或者可能发生在完全不同的装置中。
在图1所示的方法第150步中,在qrt-PCR反应期间检测到TQR扩增子。有几种可能的方法可以用来量化qrt-PCR产物。例如:可以利用结合到双链DNA产物的非特定性荧光染料,或者可以利用荧光物标记的特定探针与目标序列杂交时发出的荧光。如果采用这些方法的话,可能要求采用荧光检测器。一旦收集荧光数据,就可以用标准方法来量化qrt-PCR产物。在该方法的第150步中,用本领域已知的方法来确定样品有关的定量信息。
例如,图6就是采用肺炎克雷伯菌、大肠埃希氏菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌的DNA以及图1所示的引物和探针来进行qrt-PCR反应结果扩增曲线的例子。该图给出deltaRn值随x轴热循环数的变化。DeltaRn值是试验反应Rn数值减去基线信号的Rn值后的归一化数值。
微阵列检测
在图1所示的方法第160步中,采用本领域已知的任意数量的技术或方法,将来自TDR的扩增物添加到DNA微阵列。例如,TDR反应的扩增子流过DNA斑点,这样TDR扩增子与绑定在微阵列上的互补探针杂交。最好将未绑定或非特异性绑定的核酸冲走,只留下绑定的目标。
第160步中所用的微阵列通常情况下包括固定基片,用来固定一个或多个TDR探针。将TDR探针固定在基板的未处理或已处理的表面上,对于TDR反应中与TDR序列扩增物互补相互作用的特异性检测而言,最好通过共价键结合。通过引入到基板表面上的目标液来添加TDR扩增子。探针区域可以是一个腔室,即在任何一侧都可密封或打开的。基板可以是热传导性的,并且耦合或暴露给温度控制或加热源,其为杂交和酶促反应提供可控温度或环境。
结合目标在结合的各个DNA斑点处产生一个信号,并且信号检测器可以检测信号,同时根据微阵列上已知位置来确定探针和目标的种类。扫描仪采用适用于被检测物的接收器来检测是否存在杂交的探针序列。例如,如果被检测物为荧光分子,扫描仪作为荧光扫描仪用来检测荧光杂交信号。将扫描仪的输出提供给处理器,以分析检测信号,并且处理器可以分析和评估被检测的目标核苷酸序列。评估是指探针和核苷酸序列之间形成的杂交定量或定性测定。这可以是杂交物或浓度的绝对值,或者为杂交级别指示值的指数或比值。
可以将存储装置或设备连在TDR微阵列系统上,并且在多种不同类型存储设备中体现出来,适于存储数字信息,比如静态随机存取存储器、动态随机存取存储器、同步动态随机存取存储器、或者双数据速率SDRAM或DRAM以及标准非易失性存储器,比如只读存储器。存储装置可以通过存储器接口体现在外设存储器系统变化中,允许将数据传输到其它存储设备上,比如硬盘驱动器、软盘驱动器、闪存驱动器、光盘驱动器等;还可以传输到适当的接口上。
可以用TDR微阵列检测系统来同时测定大量的核酸。可以采用该系统来结合微阵列或生物芯片系统,包括固定在基板表面上的寡核苷酸或核酸阵列。可以将这种微阵列用于任何适当的目的,比如筛选RNA样品、单核苷酸多态性、检测、基因突变分析、疾病或感染预后、基因组比较、以及其它类似的应用。
例如,图7A是表示微阵列组织的一个表,其中SA是金黄色葡萄球菌,EC是粪肠球菌,EF是大肠杆菌,PM是变形杆菌,KP是肺炎克雷伯氏菌。每个名称代表一个TDR探针,比如图3中所确定的TDR。图7B是微阵列分析的一个例子,采用图7A中所示的微阵列,其中斑点表示之前步骤中扩增子和图7A中所列探针之间的杂交。例如,第一列(Neg)为对照列,没有细菌探针显示杂交。相反,第三列(KP)有几个附加斑点,表示肺炎克雷伯菌(KP)TDR产物和含有肺炎克雷伯菌(KP-2)探针的两个DNA斑点之间出现杂交。同样,第五列(SA)显示几个斑点,表示金黄色葡萄球菌(SA)TDR产物和含有金黄色葡萄球菌(SA)探针的四个DNA半点之间出现杂交(比如SA-1和SA-2)。由肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌TDR产物组成的第七列(SA/KP)显示SA和KP探针的杂交。正如第七列所示的那样,按照本文所述的方法,微阵列系统提出了一种多标靶检测系统,能够区分两个或更多不同的细菌菌株。同时按照qrt-PCR步骤,该系统还提出了高度定量多标靶检测系统。
应当指出的是,按照上述DNA微阵列描述定量扩增子多标靶检测的同时,本领域内的技术人员会认识到可以采用多标靶检测的其它方法,包括但不限于质谱分析、基因表达序列分析(SAGE)、高通量测序,以及其它技术中许多其它杂交方法。为检测qrt-PCR扩增子,可以采用能够多标靶区分两个或更多DNA序列、基因、生物、病原体、菌株、或物种的任何方法、技术、系统或手段。
材料和方法
例1–实时PCR
在Rheonix公司制备大肠杆菌(E.coli)和粪肠杆菌(E.faecalis)的DNA。其它的DNA比如肺炎克雷伯氏菌(ATCC BAA-1706D-5)、金黄色葡萄球菌(ATCC BAA-1718D-5)和奇异变形杆菌(ATCC12453D)从非营利性生物资源中心ATCC获取。
通过分光光度计(2000)来估计各DNA的浓度。所有DNA样品都稀释至每微升10K份。该溶液可作为备料,将DNA进一步稀释到工作浓度。将所有核酸从人体细胞系(C33A)分离出来,在Rheonix公司实验室进行培养,并进行估计。将纯化的三十二纳克(32ng)核酸用作PCR反应混合物的背景,来模仿人体样本10000基因组的核酸当量。
从集成DNA技术有限公司(IDT)获取23S核糖体基因的定制设计探针和引物组合(黄金时间测定(PrimeTime Assay))(参见图2)。按照IDT的建议,在IDTE缓冲液(10mMTris,0.1mMEDTA pH8.0)中,将黄金时间测定混合物进行重新悬浮处理。简单地说,将IDT黄金时间冻干测定重新悬浮于200ul的IDTE(含有1×参考染色物),以便获取10×(5μM引物和2.5μM探针)浓度的探针和引物混合物。将该溶液存放在-20℃的琥珀色小瓶内。
TaqMan-Universal PCR预混液(PN#4304437)购自于采用Applied Biosystems的实时PCR系统来进行所有定量PCR测试。在PCR反应中使用快速光学96-孔反应板(PN#4346906)。在运行系统之前,采用Applied Biosystems的光学胶膜(PN#4360954)将PCR反应板密封。
在无菌条件下,进行实时PCR反应,以避免任何环境的潜在污染。在层流罩中打开试剂,在放进微生物DNA之前,设置PCR反应。
PCR反应设置如下:对样品的数目进行计数。每份样品一式三份,包括阴性对照(无DNA)。每份样品的体积取20μl。通过向微量离心管添加无核酸酶水来开始设置,之后加入2×通用PCR预混液,使最终浓度为1×。添加含有探针和引物混和液的10×黄金时间测定,以实现1×浓度(500nM引物和250nM探针)。添加和涡旋背景DNA(C33A),以混和反应混和物。对各反应物离心处理。而后将PCR反应混和物分发到标有特定微生物的各个管内。各实时PCR样品为20μl,这样三份反应混合物共有60μL。将57μl的主反应混和物添加到各标记管中,然后将3μl已知份数的目标DNA添加到各管中。由于在IDTE中稀释DNA,将3μl的IDTE添加到阴性对照中,以弥补总体积。
表4500μl反应混和物
将样品一式三份小心地分布在快速光学96-孔反应板上,以避免出现任何气泡。然后用薄膜将该板密封起来,并且放在StepOnePlus实时PCR机上,该机已经进行了运行编程。
打开StepOnePlus仪器和计算机,登录StepOnePlus软件,选择“高级设置”。这样打开一个窗口,选择试验属性。对于实时PCR而言,为2小时标准PCR扩增而选择TaqMan试剂。下一步是“定义目标和样品”。每份样品分别命名。在“板布局”设置中,将检测物分配给含有样品的各孔,并且样品单独分配到各孔并进行标记。在“查看孔表”窗口中进一步检查各个样品及其位置。而后,返回到设置窗口中,选择该框内ROX的参比荧光。下一步是选择“运行方法”窗口。在选择反应体积之后,添加热循环条件,每孔的反应物体积为20μl。
以下为实时PCR反应中所用到的热循环条件:(i)AmpErase激活37℃10分钟(2×通用PCR预混液包含AmpErase,该酶可以分解反应混合物中可能存在的污染扩增物);(ii)在95℃时预变性2分钟,(iii)以下操作40个循环:(a)在95℃时变性30秒;(b)在60℃时退火30秒;(c)在72℃时延伸30秒。
保存好实验,并点击“运行”按钮。就会高光显示“板布局”中的样品,以监测热循环。然后选择“分析”窗口,以选择参数,比如运行与周期、dRun与周期或者CT值,在对数或者线性范围内。通过选择样本或目标来选择划分颜色。在运行结束时,导出数据进行分析。
例2–微阵列分析
在微阵列实验中使用了以下材料:具有特定捕获探针的反向斑点杂交(RDB)出现在阵列、扩增子(PCR扩增产物16S,从具有生物素化引物的特定目标进行扩增)、0.1N NaOH、预杂交和杂交缓冲液(3×SSPE(氯化钠、磷酸钠、和EDTA缓冲液,pH为7.5)和0.1%SDS);RDB洗涤缓冲液(1×SSPE和0.1%SDS);辣根过氧化物酶(HRP)、以及3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。
将水浴和搅拌装置预热到52℃;并且将预杂交/杂交缓冲液置于水浴中,使其达到所需温度。为制备分析膜的微阵列,以便与前面热循环中产生的扩增物杂交,将250μl的预杂交混和液置于贮液器中,并且将RDB放入贮液器进行预杂交15分钟。在95℃时,添加50μl的预杂交缓冲液,5分钟后,5μl的扩增物发生变性。在RDB处于预杂交阶段的同时,将变性的扩增物置于冰上。将变性的扩增物(55μl)添加到含有RDB的贮液器中,并且在52℃时反应15分钟。同时,将等份的洗涤缓冲液置入水浴中,使其温度达到52℃。在杂交之后,将RDB膜置于52℃含有洗涤缓冲液的新贮液器中。杂交后,在52℃进行第一次洗涤,时间为10分钟。在预杂交、杂交以及第一次洗涤期间,将搅拌装置的温度保持在52℃。在添加HRP溶液之前(在洗涤缓冲液中稀释至1:500),在室温条件下进行第二次洗涤,时间为10分钟。在室温条件下,让RDB膜在HRP缓冲液中反应15分钟。而后在室温条件下,用洗涤缓冲液洗涤RDB膜10分钟,重复三次进行搅拌。通过添加TMB来进行显色反应。在室温条件下,通过轻轻搅拌,让RDB膜在TMB中反应10分钟。用水终止反应。最后,采集和分析图像。
多标靶定量检测和识别系统
如上所述,可以将该方法用于一系列物理上分离或不同分析或实验装置,包括如下:用来制备核酸样品或纯化的第一装置或区域;用于qrt-PCR反应的第二装置;用于qrt-PCR信号检测的第三装置;用于微阵列分析TDR扩增子制备的第四装置或区域;组成微阵列的第五装置;检测微阵列信号的第六装置;用于捕获、处理、分析、可视化的一个或多个运算装置,或者以其它方式采用一个或多个分析或实验装置获得的数据。在用多靶分析另一方法来代替微阵列分析的另一实施例中,这些实验和检测装置将替代上述列出的微阵列装置。
根据发明的一个方面,在可以进行样品制备、PCR、以及电子杂交检测的单一装置上采用该方法。在各种实施例中,该装置包括如下:样品制备组件能够接受生物样品,并且为qrt-PCR和TDR制备样品;qrt-PCR组件可以从样品制备组件那里接收样品,并且在样品核酸目标上执行qrt-PCR,以便生成qrt-PCR结果;TDR扩增组件可以从样品制备组件那里接收样品,并且在样品核酸目标上执行PCR,以便生成目标扩增物;微阵列组件可以接收TDR目标扩增物,并且检测TDR目标扩增物的杂交事件,探针则绑定在微阵列表面上,支架则是由样品制备组件、qrt-PCR组件、TDR扩增组件、以及微阵列组件组成。
根据本发明的一方面,在本领域已知的集成微流体装置上采用该方法,比如由周朋等人在PCT公开刊物上发表编号为WO2009/049268A1标题为《集成微流体装置和方法》,在此引入本文作为参考。在本文公开的样品中,用于检测感兴趣核酸目标的方法可以很容易地适用于集成微流体装置,简称为测定单元,或者从商业角度上称作化学试剂装置(),在该领域内采用已知的方法,比如在WO2009/049268A1中公开的方法。
微流体通常情况下是指用来处理小体积流体的系统、装置和方法。微流控系统可以集成多种操作用来操纵流体。这些流体可包括化学或生物样品。这些系统也有许多应用领域,比如生物测定(如医疗诊断、药物发现和药物传输),生化传感器或者一般情况下的生命科学研究以及环境分析、工业过程监测和食品安全检测。一种类型的微流体装置是一个微流体芯片。微流体芯片可包括微观尺度的特征(或者微特征),比如通道、阀门、泵、反应器或者贮液器,用来存储流体,使流体来回流向芯片上的不同位置或者用来反应试剂。
根据本发明的一方面,可以在美国专利申请号13/033,165标题为《自包含生物测定装置、方法和应用》中披露的那样,在自包含、完全自动化的微流体装置中采用该方法,在此的全部内容通过引用并入本文。该装置包括一个自包含、完全自动化、生物测定执行装置,其含有外壳、包括可控移动试剂分注系统并设置在外壳中的分配平台、设置在外壳中试剂供给组件,设置在外壳内与分配平台共享空间的可移动气动岐管、可拆卸连接到流体输送层及多个贮存器、其中流体输送层和贮存器,试验样品被引入其内并置于该空间的外壳中,与分配平台分开、气动供给系统可拆卸连接到外壳中的气动岐管,空间与分配平台隔开,并且控制系统耦合到至少一个分配平台和设置在外壳中的气动供给系统。
CARD分配平台还可以包括可操作耦合到试剂分注系统的运动控制系统,其中,试剂分注系统包括具有远侧分配端的试剂分配器组件、连接到试剂分注系统上的摄像机,其视场包括至少一个感兴趣贮液器的选择区域。该摄像机还包括从qrt-PCR反应获取数据的光学系统,虽然其它剂型也可以,但是优先从平坦的反应器设置中获取数据;包括锥形反应器系统。该光学系统用来从qrt-PCR反应获取数据,在本技术领域中被技术人员们所熟知。
另外一个非限制性方面就是用CARD系统来分离、扩增、和分析目标核酸序列,是一个自动过程。该过程包括提供气动岐管,其操纵具有流体输送层和设置有流体通道的微流体系、连接其上的贮液器,将流体试样引入流体通道;向至少一个相应贮液器的通道内提供至少一种试剂,该贮液器流体与流体输送层相连;在流体输送层、贮液器或扩增反应器的区域中将流体试样与至少一种试剂相结合;将流体试样输送到温控扩增/反应的反应器,其与流体输送层保持通信;在足以允许扩增靶核酸序列的条件下,在扩增/反应反应器中温育流体试样;将流体试样输送到分析贮液器中;分析试样的扩增靶核酸序列,其中将试样从流体输送层中的起始位置输送到分析贮液器中,与任何其它样品隔开,并且与气动岐管和分配系统隔开。
所有参考文献包括出版物、专利申请和专利,如果各参考文献个别或特定与参考文献相结合引用,并且在本文有所陈述,则对在此引入的内容一视同仁。
除非本文另有说明或出现明显矛盾的情况下,本发明上下文中所使用的术语中(尤其是在以下权利要求的上下文中),a和an以及the等类似参考内容均被解释为单数或复数。术语“包含”、“具有”、“包括”以及“含有”均被解释为开放式术语(也就是包括但不限于),另有说明的除外。术语“连接”被理解为部分或全部包括、附着或结合在一起,即使有些干预也是如此。
本文中数值范围都仅指该范围内各单独数值,另有说明的除外;并且如果在本文中单独陈述,则单独数值被纳入本说明中。
除非本文另有说明、或者以其他方式表明与上下文有明显矛盾,本文所述的所有方法都可以按照任意适当的顺序来执行。本文所提供的任何和所有例子或者示例性语言(比如“例如”),都只能为更好地阐述本发明的实施例,除非另有说明,对本发明的范围无限制要求。
本说明中没有语言,则应理解为表示对本发明实践具有必要性的任何非要求元素。
显而易见,对于本领域的技术人员而言,在不脱离本发明主旨和范围的情况下,可以对本发明进行各种修改和变动。也没有意图将本发明限于具体形式或所披露的形式,但是相反,其意图是涵盖所有修改、替换构造以及本发明主旨和范围的等同内容,正如所附权利要求定义的那样。因此,其目的就是:本发明涵盖发明内容的修改和变动,只要它们落在所附权利要求及其等同内容的范围之内即可。
Claims (9)
1.用来检测至少一个众多目标核酸分子的系统,系统包括如下:
包括至少一个所述众多目标核酸分子的一个样品;
第一引物对,所述第一引物对可以扩增每个所述众多目标核酸分子的第一区域,以生成第一扩增产物,其中在所述众多目标核酸分子中,第一区域是保守的;
实时核酸扩增仪器,其中所述仪器可用所述第一引物对来生成所述第一扩增产物,并且还可以实时检测所述第一扩增产物;
第二引物对,所述第二引物对可以扩增每个所述众多目标核酸分子的第二区域,以生成第二扩增产物,其中在所述众多目标核酸分子中,第二区域不是保守的;
第三引物对,所述第三引物对可以扩增每个所述众多目标核酸分子的第三区域,以生成第三扩增产物,其中在第二众多目标核酸分子中,第三区域是保守的;
用来检测所述第二扩增产物的装置;
与所述第一区域杂交的第一核酸探针;
与所述第二区域杂交的第二核酸探针;
其中,所述第二核酸探针固定在基板上,所述基板为微阵列;
所述第一核酸探针的熔解温度至少要比所述第一引物对各引物的熔解温度高6℃。
2.权利要求1的系统,其中检测到所述第二扩增产物则表示在所述样品中存在病原体。
3.权利要求1的系统,其中该系统可以检测所述样品中至少两种病原体。
4.权利要求1的系统,其中检测到所述第二扩增产物则表示在所述样品中存在特定核酸序列。
5.权利要求1的系统,其中所述系统是一个试剂盒,用来检测样品中至少一个众多目标核酸分子。
6.权利要求1的系统,其中所述实时核酸扩增仪器为聚合酶链反应(PCR)仪。
7.用来检测至少一个众多目标核酸分子的试剂盒,该试剂盒包括如下:第一引物对,所述第一引物对可以扩增每个所述众多目标核酸分子的第一区域,以生成第一扩增产物,其中在所述众多目标核酸分子中,第一区域是保守的;与所述第一区域杂交的第一核酸探针;第二引物对,所述第二引物对可以扩增每个所述众多目标核酸分子的第二区域,以生成第二扩增产物,其中在所述众多目标核酸分子中,第二区域不是保守的;与所述第二区域杂交的第二核酸探针;微阵列基板;
所述第二核酸探针固定在基板上,所述基板为微阵列。
8.权利要求7的试剂盒,还包括第三引物对,所述第三引物对可以扩增每个所述众多目标核酸分子的第三区域,以生成第三扩增产物,其中在所述第二众多目标核酸分子中,第三区域是保守的。
9.权利要求7的试剂盒,其中所述第一核酸探针的熔解温度至少要比所述第一引物对各引物的熔解温度高6℃。
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Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9994897B2 (en) * | 2013-03-08 | 2018-06-12 | Ariosa Diagnostics, Inc. | Non-invasive fetal sex determination |
US8852919B2 (en) | 2011-11-17 | 2014-10-07 | Rheonix, Inc. | Microfluidic apparatus, method, and applications |
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AU2021279039A1 (en) * | 2020-05-29 | 2023-01-19 | Mammoth Biosciences, Inc. | Programmable nuclease diagnostic device |
Family Cites Families (20)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2159044A1 (en) | 1994-09-26 | 1996-03-27 | Falko-Guenter Falkner | Method of quantitating nucleic acids |
US6280946B2 (en) | 1998-08-07 | 2001-08-28 | Boston Probes, Inc. | PNA probes, probe sets, methods and kits pertaining to the universal detection of bacteria and eucarya |
WO2000037480A1 (en) | 1998-10-26 | 2000-06-29 | University Of Iowa Research Foundation | Novel naphthalene dioxygenase and methods for their use |
WO2000044935A2 (en) | 1999-01-29 | 2000-08-03 | Bavarian Nordic Research Institute A/S | Multiplex real-time pcr |
US6235479B1 (en) * | 1999-04-13 | 2001-05-22 | Bio Merieux, Inc. | Methods and devices for performing analysis of a nucleic acid sample |
US6613520B2 (en) | 2000-04-10 | 2003-09-02 | Matthew Ashby | Methods for the survey and genetic analysis of populations |
US20040005555A1 (en) * | 2000-08-31 | 2004-01-08 | Rothman Richard E. | Molecular diagnosis of bactermia |
US20020150887A1 (en) | 2000-11-09 | 2002-10-17 | National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology | Methods and nucleic acid probes for molecular genetic analysis of polluted environments and environmental samples |
AU2002257205B2 (en) | 2001-04-23 | 2006-09-21 | Monsanto Technology Llc | PCR-based monitoring in wastewater biotreatment systems |
CA2407744C (en) | 2001-11-20 | 2012-01-03 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Quantitative multiplex pcr with high dynamic range |
US20040161767A1 (en) | 2002-06-28 | 2004-08-19 | Baldwin Brett R. | Detection and quantification of aromatic oxygenase genes by real-time PCR |
US7759057B2 (en) | 2004-02-04 | 2010-07-20 | Ut-Battelle, Llc | Method for analyzing microbial communities |
KR100850193B1 (ko) | 2004-08-28 | 2008-08-04 | 주식회사 진인 | 모든 세균의 감별을 위한 세균 특이적, 속 특이적 및 종특이적 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 진단 키트, 및이를 이용한 검출 방법 |
US7405044B2 (en) | 2004-10-08 | 2008-07-29 | Reliagene Technologies Inc. | Multiplex PCR for simultaneous quantitation of human nuclear, mitochondrial, and male Y-chromosome DNA |
EP1866445B1 (en) | 2005-03-30 | 2013-10-16 | Labo Bio-Medical Investments B.V. | Identification of beta-papillomavirus dna by type-specific reverse hybridization |
WO2007115582A1 (en) | 2006-04-11 | 2007-10-18 | Bio-Rad Pasteur | Hpv detection and quantification by real-time multiplex amplification |
WO2008103770A2 (en) | 2007-02-20 | 2008-08-28 | Applera Corporation | Multiplex compositions and methods for quantification of human nuclear dna and human male dna and detection of pcr inhibitors |
US20090227476A1 (en) | 2008-03-07 | 2009-09-10 | Applied Microarrays, Inc. | Amplification and microarray detection apparatus and methods of making |
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"Detection of Four Plasmodium Species in Blood from Humans by 18S rRNA Gene Subunit-Based and Species-Specific Real-Time PCR Assays";Mathieu Rougemont et al;《Journal of Clinical Microbiology》;20041231;第42卷(第12期);第4044页摘要和Clinical specimens,第4045页Fig 1和Primers and hydrolysis probe和Real-Time PCR * |
"Real-Time Quantitative PCR Detection of Four Human Bocaviruses";Kalle Kantola et al;《Journal of Clinical Microbiology》;20100915;第48卷(第11期);第5636页摘要,第5637页Fig 1和Real-Time PCR和18S screening real-time PCR,第5638页Plasmodium species real-time PCR * |
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