CN112458170B

CN112458170B - 用于检测circCSPP1靶标的检测试剂及应用

Info

Publication number: CN112458170B
Application number: CN202011351567.5A
Authority: CN
Inventors: 毛向明; 卢剑铭; 钟传帆
Original assignee: Southern Medical University Zhujiang Hospital
Current assignee: Southern Medical University Zhujiang Hospital
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2022-12-23
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN112458170A

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其是提供了一种用于检测circCSPP1靶标的检测试剂及应用，has_circ_0001806作为前列腺癌分子靶标，在制备筛选预防、缓解和/或治疗前列腺癌的药物中的用途。本发明首次阐述了circCSPP1的表达水平跟前列腺癌恶性程度的关系，还提供了一种用于检测circCSPP1分子靶标的试剂及诊断试剂盒，试剂盒检测效果明显，简单可用，特异性强。

Description

用于检测circCSPP1靶标的检测试剂及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于检测circCSPP1靶标的检测试剂及应用。

背景技术

前列腺癌(PCa)仍是北美地区男性中发病率最高的恶性肿瘤，其死亡率仅次于肺癌。近年来我国前列腺癌发病率也呈明显上升趋势，在男性泌尿生殖系统肿瘤中位居第二位，仅次于膀胱肿瘤。前列腺癌目前常见临床诊断指标包括患者Gleason评分、病理分期、血清PSA、手术切缘是否阳性等，但由于前列腺癌自然病程的个体差异大，常常会干扰到临床医生对肿瘤恶性程度的判断和治疗方案的选择，因此临床医生迫切需要寻找更加精准的临床诊断和预后标记物来筛出需要进一步干预治疗的患者，并依此制定出更合适的治疗方案。

环状RNA(circRNA)是一种内源性的非编码RNA(ncRNA)，其特征在于它们的5'帽或3'poly A尾巴不存在共价闭环结构，这使其对核酸外切酶的耐受性更高，circRNA能广泛并稳定存在于各种组织当中，可在表观遗传学水平上多途径调控细胞的生命活动。已有众多报道circRNA在子宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肺癌、乳腺癌等中起着均促进肿瘤恶性进展和不良预后的作用，因此具有在肿瘤诊断和治疗中用作分子标记的潜力。

据研究报道，来自中心体/纺锤体极相关蛋白1(CSPP1)的circRNA(hsa_circ_0001806)，circCSPP1(has_circ_0001806)是一种首尾相接成环的非编码RNA。CSPP1基因位于人类8号染色体(8q13.2)。一项研究最初将人B细胞淋巴瘤中的CSPP1鉴定为原癌基因。然后，另一项研究已经确定CSPP1是管腔型乳腺癌的候选致癌基因。然而，CSPP1(circ-CSPP1)的圆形结构及其在肿瘤发展中的功能仍不清楚。因此，circCSPP1有望成为预测前列腺肿瘤进展和判断预后的生物学标靶。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于检测circCSPP1分子靶标的试剂及诊断试剂盒，该试剂和试剂盒可以检测组织circCSPP1的表达水平进而衡量患者前列腺癌的恶性程度，从而区分临床前列腺癌患者的不同疾病进展，其中has_circ_0001806作为前列腺癌分子靶标，扩宽了检测前列腺癌进展和判断预后的分子靶标范围。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

has_circ_0001806作为前列腺癌分子靶标，在制备筛选预防、缓解和/或治疗前列腺癌的药物中的用途。

作为本发明所述用途的优选实施方式，所述has_circ_0001806的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明通过对前列腺癌患者临床样本进行circCSPP1实时定量PCR检测，并结合临床样本数据来进一步验证本发明对预测前列腺癌恶性进展的有利效果，证明生物学分子标记物circCSPP1的表达水平与前列腺癌恶性进展密切相关，因此，首次提出将has_circ_0001806作为前列腺癌相关的新的前列腺癌分子靶标在，本发明的has_circ_0001806分子靶标可用于筛选预防、缓解和/或治疗前列腺癌。

本发明还提供了一种用于检测has_circ_0001806的检测试剂，所述检测试剂包括以下引物序列：

正向引物：5’-TGAAGATTTGCGCAGTGGAC-3’；

反向引物：5’-GAGCATCCCTGCAAAAGGAC-3’。

本发明还提供了一种诊断前列腺癌的产品，所述产品包括检测has_circ_0001806的检测试剂。

本发明提供的检测试剂可以检测肿瘤组织circCSPP1的表达水平而衡量该患者前列腺癌的恶性程度，从而区分临床前列腺癌患者的不同疾病进展及预后诊断。

作为本发明所述诊断前列腺癌的产品的优选实施方式，所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。

本发明还提供了一种前列腺癌的诊断试剂盒，所述诊断试剂盒包含检测has_circ_0001806的检测试剂。

作为本发明所述诊断试剂盒的优选实施方式，诊断试剂盒包括组织RNA提取试剂、上述的检测试剂、去基因组DNA试剂和一步法逆转录PCR试剂。

作为本发明所述诊断试剂盒的优选实施方式，所述组织RNA提取试剂包括裂解液20～30ml、去蛋白液10～20ml、漂洗液4～10ml、70％乙醇2～5ml和RNase free H₂O 2～6ml。

作为本发明所述诊断试剂盒的优选实施方式，所述去基因组DNA试剂包括gDNAwiper 80～120μl、5×gDNA Wiper buffer 150～250μl和RNase free H₂O 1～3ml。

作为本发明所述诊断试剂盒的优选实施方式，所述一步法逆转录PCR试剂包括RTase(50×)80～120μl、One Step RT-qPCR Mix(5×)400～600μl和RNase free ddH₂O 2～6ml。

作为本发明所述诊断试剂盒的优选实施方式，所述诊断试剂盒检测肿瘤组织has_circ_0001806的表达水平。

本发明提供的试剂盒操作简单、快速，其检测灵敏度和特异性较高，可达到对选定临床样本进行定性及半定量检测，无需其他特殊仪器，临床样本保存时间长，一般医院实验室或者病理室都可以完成。

与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：

本发明首次阐述了circCSPP1的表达水平跟前列腺癌恶性程度的关系，提供了一种用于检测circCSPP1分子靶标的试剂及诊断试剂盒，试剂盒检测效果明显，简单可用，特异性强；并且采用circCSPP1作为检测前列腺癌恶性进展提供一种可行的新参考指标。

附图说明

图1为本发明正常组织Normal、高级别癌组织H-Pca和低级别癌组织L-Pca中CircCSPP1的表达示意图；

图2为本发明动物实验中过表达的CircCSPP1和常规载体Vector对肿瘤体积的影响示意图；

图3本发明动物实验中过表达的CircCSPP1和常规载体Vector对肿瘤体积的影响曲线图。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，前列腺癌及癌旁组织来自于广州医科大学附属肿瘤医院及广州市第一人民医院。

实施例1、检测环状RNA CircCSPP1引物设计和试剂盒设计

本发明采用的CircCSPP1(位置：67062417-67198003)的8-11号外显子反向剪切而成，其环化序列(如SEQ ID NO.1所示)为：

5’-GGTGTCTCCCAGTGCTCCAGACAATGAA-3’。

本实施例中使用的has_circ_0001806的检测试剂为以下引物序列(如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示)：

正向引物：5’-TGAAGATTTGCGCAGTGGAC-3’；

反向引物：5’-GAGCATCCCTGCAAAAGGAC-3’。

本发明还提供一种检测肿瘤组织has_circ_0001806的表达水平的诊断试剂盒。

试剂盒包括组织RNA提取试剂、上述的检测试剂、去基因组DNA试剂和一步法逆转录PCR试剂。

在本实施例中，试剂盒中的组织RNA提取试剂包括裂解液25ml、去蛋白液15ml、漂洗液6ml、70％乙醇5ml和RNase free H₂O 5ml。

在其他实施例中，试剂盒中的组织RNA提取试剂包括裂解液20ml或30ml；去蛋白液10ml或20ml；漂洗液4ml或10ml；70％乙醇2ml或5ml；RNase free H₂O2ml或6ml。

在本实施例中，试剂盒中的去基因组DNA试剂包括gDNA wiper 100μl、5×gDNAWiper buffer 200μl和RNase free H₂O 2ml。

在其他实施例中，试剂盒中的去基因组DNA试剂包括gDNA wiper 80μl或120μl；5×gDNA Wiper buffer 150μl或250μl；RNase free H₂O 1ml或3ml。

在本实施例中，试剂盒中的一步法逆转录PCR试剂包括RTase(50×)100μl、OneStep RT-qPCR Mix(5×)500μl和RNase free ddH₂O 5ml。

在其他实施例中，试剂盒中的一步法逆转录PCR试剂包括RTase(50×)80μl或120μl；One Step RT-qPCR Mix(5×)400μl或600μl；RNase free ddH₂O 2ml或6ml。

实施例2、提取待检组织样本RNA

1.获取待检测组织样本：取5例低级别前列腺癌(Gleason Score，GS＜8)组织样本及匹配的癌旁正常组织、5例高级别前列腺癌(GS≥8)组织样本及匹配的癌旁正常组织。

2.提取待检组织样本RNA(Trizol法)：

1)分别上述获得的新鲜组织，切成小块(50-100mg)，将组织块放入盛有液氮的研钵中，用研棒磨碎组织，使其成粉末状。

2)研磨过程中液氮挥发完后需及时补充，使样品一直处于冷冻状态，防止RNA降解。

3)将研磨完毕的组织粉末转移至RNase free离心管中，每50-100mg组织加入1ml裂解液后匀浆，控制组织体积不超过Trizol体积的10％。

4)匀浆剧烈震荡后室温放置5min以充分裂解(或转入-80℃长期保存，一般为3个月)。

5)按200μl/ml Trizol加入氯仿，剧烈震荡15s，室温孵育3min。

6)4℃12000rpm离心10min；吸取上层水相于另一新的RNase free离心管中(此步骤严禁吸取中间层成分)。

7)4℃12000rpm离心10min，弃上清，RNA沉于管底；加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀后转入吸附柱中；10000rpm离心45s，弃掉废液并将吸附柱套回收集管。

8)加500μl去蛋白液，12000rpm离心45s，弃掉废液。

9)加入600μl漂洗液，12000rpm离心60s，弃掉废液，重复一次。

10)将吸附柱放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。

11)取出吸附柱，套入一新RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加50-80μlRNase free H₂O，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA。

12)Nanodrop测量RNA质量及浓度(OD＝1.8-2.0)，RNA样品可随即进行下一步操作或放于-80℃长期保存。

实施例3、去基因组DNA处理

将实施例2制备的RNA样品进行去基因组DNA处理，其中去基因组DNA反应体系及反应程序设置：

试剂名称	使用量
		5×gDNA Wiper buffer	2μl
gDNA Wiper	1μl
		Total RNA(100ng-2μg)	1μl
RNase free ddH<sub>2</sub>O	To 10μl

在反应温度为42℃条件下反应2min。

实施例4、一步法检测circCSPP1表达水平

将经过实施例3处理得到的样品经过RT-qPCR检测每个样本的circCSPP1的表达水平。其中配制反应体系及反应程序设置：

试剂名称	使用量
		RTase(50×)	0.4μl
One Step RT-qPCR Mix(5×)	4μl
		Forward Primer(10μM)	0.4μl
Reverse Primer(10μM)	0.4μl
		Total RNA(10ng-1μg)	5μl
RNase free ddH<sub>2</sub>O	To 20

反应程序如下：(以Bio-rad PCR CFX96为例)

然后分别统计各组样品circCSPP1的CT值，以GAPDH或β-actin为内参基因，计算各组样品circCSPP1的ΔCT值(ΔCT＝CT_circCSPP1-CT_{GAPDH/β-actin})；以正常组织为对照，计算癌组织circCSPP1的ΔΔCT及2^-ΔΔCT值(ΔΔCT＝ΔCT_癌-ΔCT_正常)。

注：当12<ΔCT<15时，判定为恶性程度较低的前列腺癌；当ΔCT<12时，判定为恶性程度较高的前列腺癌。

结果显示：由图1所示，在10例前列腺癌(PCa)组织中circCSPP1比匹配的癌旁正常组织(Normal)显著高表达，且5例高级别癌组织(H-PCa)中circCSPP1的表达水平较5例低级别癌组织(L-PCa)更高。Normal、L-PCa、H-PCa组织circCSPP1表达水平分别为：1.281±0.2242；3.786±0.3179；7.616±0.773(所有P值均<0.001)，说明生物学分子标记物circCSPP1的表达水平与前列腺癌恶性进展密切相关，本发明提供的试剂及试剂盒，可有效检测人体前列腺组织circCSPP1的表达水平，根据其表达水平可以方便快捷地为临床前列腺癌患者的肿瘤恶性进展程度判断提供一个新指标，并对疾病治疗选择提供帮助。

实施例5、动物实验

实验步骤：

1.实验动物准备：SPF级雄性裸鼠6只。

2.待移植肿瘤细胞准备

1)分组：DU145-vector；DU145-circCSPP1

2)注射细胞量：3×10⁶个/注射位点。

3)待移植细胞准备：细胞长至汇合度达80％左右时，往每个细胞培养皿(10cm)加入1ml胰酶，消化1min；弃掉胰酶，加入1ml含10％FBS的培养基终止消化，获得细胞悬液；将1ml细胞悬液转移至1.5ml EP管(每个分组各6管)，常温下1000rpm离心5min，弃上清；加入1ml PBS重悬，弃上清，重复2次；加入100μl PBS重悬细胞，放至冰上待用。

3.小鼠皮下肿瘤细胞种植

1)注射部位选择：小鼠两侧腋部；同只小鼠两侧腋部分别注射DU145-vector；DU145-circCSPP1细胞。

2)注射前准备：双手佩戴无菌手套，左手大拇指和食指捏住小鼠颈部皮肤，左手无名指和小指将小鼠尾部固定于左手大鱼际；使用75％酒精将小鼠腋窝消毒3次。

3)肿瘤细胞皮下注射：右手持吸有PBS充分重悬的肿瘤细胞液的注射器，在小鼠腋窝的位置，45度斜角进针，并将针头保持于皮下位；随后近水平位置将针头几乎完全插入皮下，将PBS充分重悬的肿瘤细胞注射入小鼠皮下；快速退针，左手食指轻压针孔约1min后将小鼠放回饲养笼中。

4.种植后观察

1)观察时间：连续观察4周。

2)观察指标：小鼠生长状态；皮下移植瘤大小(包括长轴和短轴)，绘制瘤体生长曲线；4周后对小鼠实施安乐死，并取下瘤体，称重及记录。

结论：过表达circCSPP1可促显著促进小鼠皮下移植瘤的增长，见图2和图3。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学珠江医院

<120> 用于检测circCSPP1靶标的检测试剂及应用

<130> 2020.09.29

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> has_circ_0001806的核苷酸序列

<400> 1

ggtgtctccc agtgctccag acaatgaa 28

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 正向引物

<400> 2

tgaagatttg cgcagtggac 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 反向引物

<400> 3

gagcatccct gcaaaaggac 20

Claims

1.检测前列腺癌分子靶标has_circ_0001806表达水平的试剂在制备辅助诊断前列腺癌的药物中的用途，其特征在于，前列腺癌分子靶标has_circ_0001806在前列腺癌中过表达。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂包括以下引物序列：

正向引物：5’-TGAAGATTTGCGCAGTGGAC-3’；

反向引物：5’-GAGCATCCCTGCAAAAGGAC-3’。