KR102204898B1 - 차별적 메틸화 신호 연관성 분석에 의한 비소세포폐암 탐지방법 및 그 마커 - Google Patents

Abstract

폐암은 흔한 형태의 암이며 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인이다. 비침습적 바이오마커를 이용한 조기 진단은 폐암 환자의 생존율을 높이는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 혈액 시료에서 DNA 메틸화 바이오마커는 폐암의 조기 진단을 향상시킬 수 있다. 본 발명에서는 비소세포폐암 (NSCLC)으로 진단받은 150명의 환자와 150명의 건강한 대조군에서 얻은 말초 혈액 시료를 사용했다. 후자는 연령, 성별, 흡연 상태에 따라 비소세포폐암 환자 150명과 빈도 짝짓기를 통해 선택되었다. 전 유전체 메틸화 프로필은 850kbp의 CpG 부위를 커버하는 MethylationEPIC BeadChip Kit를 사용하여 얻었다. 이 분석은 현재의 흡연자에서 비소세포폐암과 관련된 두 가지 유의미한 차별적 메틸화 변화 (cg12169243 [DPH6] 및 cg25429010 [IMP3])를 보여주었고, 선암 환자에서 EGFR 돌연변이와 연관된 여섯 개의 차별적 메틸화 변화 (cg129245319, cg17183999 [USP7], cg06366994 [CPE], cg24992236 [MEG9], cg22144719 및 cg22448179)를 보여주었으며, 암 진행 병기와 관련된 네 가지 변화 (cg25021476 [RSL24D1], cg04989085 [FAM113B], cg20905681 [CKAP4] 및 cg26379694)를 보여주었다.

Description

차별적 메틸화 신호 연관성 분석에 의한 비소세포폐암 탐지방법 및 그 마커 {Non-small cell lung cancer detection method by differential methylation signal association analysis and its marker}

본 발명은 차별적 메틸화 신호 연관성 분석에 의한 비소세포폐암 탐지방법 및 그 마커에 관한 것으로서, 혈액 내의 전 유전체에 대한 후성 유전체 관련 연구를 통하여 비소세포폐암을 빠르고 손쉽게 진단할 수 있는 바이오마커와 방법을 제공한다.

2018년에 210만 명의 새로운 폐암환자와 180만 명의 폐암으로 인한 사망이 보고되었다. 폐암은 흔한 형태의 암이며 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인이다 [1]. 후기 단계에서의 암의 진단으로 인해 사망률은 여전히 높게 유지된다 [2]. 저선량 컴퓨터 단층 촬영 (CT)으로 조기 발견된 환자의 스크리닝은 약 90%의 높은 생존율을 보였다. 따라서 비침습성 바이오마커를 이용한 조기 진단은 폐암 환자의 생존율을 높이는 데 중요한 역할을 할 수 있다.

그러므로 효과적인 비침습성 스크리닝 방법이 임상 실무에서 긴급하게 요구된다. 수많은 최근의 연구에서 분자 바이오마커의 중요성이 보고되었다 [4]. 지금까지 p53과 커스틴 쥐 육종 바이러스성 종양 유전자 동족체가 가능성 있는 예후 바이오마커로 제안되었다. 또한, 초기 단계 비소세포폐암 (NSCLC)에서 예후 및 예측 바이오마커로서 표피 성장인자 수용체 (EGFR), 인간 EGFR-2, ERCC1 (excision repair cross-complementation group 1), 리보뉴클레오타이드 환원 효소 M1 및 BRCA가 제안되었다 [4]. 그러나, 이들 바이오마커 중 아주 소수만이 검증되었다.

한편, 여러 연구에서 DNA 메틸화를 기반으로 하는 후성 신호들이 초기 단계의 비소세포폐암과 관련이 있다고 기술하고 있다 [5]. 예를 들어, p16과 카데린 13은 더 짧은 재발 시간과 연관되고 [6], 5개의 유전자 (HIST1H4F, PCDHGB6, NPBWR1, ALX1, HOXA9) 메틸화 신호는 재발 위험이 높은 환자에서 확인되었다 [7]. 그러나 폐암의 조기 발견을 위한 바이오마커가 가까운 장래에 임상적으로 적용될 가능성은 낮다 [8]. 폐암 바이오마커와 관련된 대부분의 연구에서는 폐 조직에서 얻은 시료를 사용하였다. 따라서 임상에서 쉽게 이용할 수 있는 유용한 바이오마커의 경우 혈액 시료와 같이 쉽게 접근하고 쉽게 탐지할 수 있어야 한다.

최근 연구는 말초혈액에서 흡연과도 연관된 메틸화 변화가 폐암 관련 사망률을 예측하고 폐암의 위험 예측을 개선할 수 있다는 증거를 제공했다 [9, 10]. 이러한 발견들은 임상에서 사용될 수 있는 바이오마커를 제안하는 데 중요한 의미가 있다. 그러나 현재 DNA 메틸화 마커의 임상적 적용을 위해서는 폐암과 혈액의 DNA 메틸화 변화의 상호 기작, 폐암에 걸린 비흡연자의 DNA 메틸화 변화의 효과 등 넘어야 할 수많은 과제가 있다.

Ferlay, J. et al., Int J Cancer 2019, 144(8), 1941-1953. Gettinger, S. et al., J Clin Oncol 2018, 36, 1675-1684. International Early Lung Cancer Action Program Investigators.; Henschke, C. I. et al., N Engl J Med 2006, 355, 1763-1771. Burotto, M. et al., J Thorac Oncol 2014, 9, 1609-1617. Balgkouranidou. I. et al., Biomarkers Med 2013, 7, 49-58. Brock, M. V. et al., N Engl J Med 2008, 358, 1118-1128. Sandoval, J. et al., J Clin Oncol 2013, 31, 4140-4147. Ansari, J. et al., Transl Lung Cancer Res 2016, 5, 155-171. Zhang, Y. et al., Int J Cancer 2015, 137, 1739-1748. Baglietto, L. et al., Int J Cancer 2017, 140, 50-61. Aryee, M. J. et al., Bioinformatics 2014, 30, 1363-1369. Johnson, W. E. et al., Biostatistics 2007, 8.; 118-127. Nordlund, J. et al., Genome Biol 2013, 14, r105. McCartney, D. L. et al., Genom Data 2016, 9, 22-24. Pidsley, R. et al., Genome Biol 2016, 17, 208. Houseman, E. A. et al., BMC Bioinform 2012, 13, 86. Kim, H. C. et al., Tuberc Respir Dis 2019, 82.; 118-125. Croswell, J. M. et al., Ann Intern Med 2010, 152, 505-512. Field, J. K. et al., J Thorac Oncol 2012, 7, 10-19. Hubers, A. J. et al., J Clin Pathol 2014, 67, 707-711. Kneip, C. et al., J Thorac Oncol 2011, 6, 1632-1638. Oxnard, G. R. et al., J Clin Oncol 2018, 36. Fasanelli, F. et al., Nat Commun 2015, 6, 10192. Davis, A. et al., Eur J Cancer Prev 2018, 1-5. Park, S. L. et al., Clin Epigenetics 2018, 10.; 110. Yan, J. et al., Lung 2016, 94, 137-146. Yanagita, K. et al., Am J Pathol 2018, 188, 1328-1333.

본 발명은 폐암 관련 바이오마커를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명자들은 본 발명에서 폐암에 걸린 국내 환자 150명과 건강한 대조군 150명의 혈액에서 추출한 DNA 시료를 이용한 메틸화 검출에 기초한 후성유전체 연관 메틸화 연구 결과를 제시한다.

본 발명에서는 혈액 DNA에서 NSCLC와 관련된 차별적으로 메틸화된 신호를 확인했다. 또한, 현재의 흡연자에서 비소세포폐암과 유의한 관련이 있는 DMPs (differentially methylated probes), 선암 환자의 EGFR 돌연변이 상태 및 진행성 비소세포폐암 환자의 생존율이 확인되었다. 이것은 NSCLC 환자에게서 얻은 혈액 DNA에서 Illumina 860k EPIC 어레이를 사용하는 첫 번째 연구이다. 본 발명의 결과는 비소세포폐암의 조기 진단이나 예후를 위해 쉽게 접근할 수 있는 바이오마커를 찾는 데 도움이 될 것이다.

분자 표적 약제 또는 면역 요법과 같은 새로운 요법의 도입으로 비소세포폐암 환자의 생존율은 다소 증가했다. 그러나 폐암 환자 중 비소세포폐암 환자의 사망률은 여전히 높은 편이다 (약 20%) [2, 17]. 저선량 CT 스크리닝으로 폐암 관련 사망률을 줄이려는 최근의 시도는 거짓 양성 반응, 불확실한 결절의 추가 평가 및 CT 방사선과 관련된 잠재적인 위험에 대한 주요 관심사를 계속 보고했다 [18, 19]. 따라서 NSCLC의 조기 진단이나 예후 예측을 위한 효과적인 비침습성 스크리닝 방법의 개발은 중요한 과제로 남아있다. 말초 혈액의 DNA 메틸화 변화와 같은 후성 바이오마커 (epigenetic biomarker)는 초기 단계의 비소세포폐암 발견을 위한 유망한 도구가 될 수 있다. 비소세포폐암의 잘못된 메틸화 변화는 객담, 기관지 흡인물 및 종양 조직과 같은 다양한 시료에서 얻은 여러 게놈 영역에서 보고되었다 [6, 20, 21]. 그러나 현재까지 임상적으로 유용한 DNA 메틸화 마커는 없다. 최근의 대규모 연구에서 혈장 세포 유리 DNA를 사용하여 폐암이 단계별로 (1기에서도) 검출될 수 있다고 보고되었다 [22]. 본 발명은 쉽게 얻을 수 있는 말초 혈액 시료에서 조기 단계 폐암의 진단 방법을 제공한다. 그러나, 전체 게놈 중아황산염 (bisulfite) 시퀀싱의 임상적 사용은 비용이 많이 소요되고 기술 전문가를 필요로 하기 때문에 최근에 들어서는 한정적으로 이용된다. 따라서 말초 혈액의 DNA 메틸화 변화에 대한 이해 증진은 조기 단계 폐암의 발견을 위한 비용 효과적이고 쉬운 방법의 개발에 중요하다.

최근 전향적 코호트 (NOWAC, MCCS, NSHDS, EPIC-하이델베르크 및 EPIC-이탈리아 코호트) 내에 중첩된 여러 환자-대조군 연구 [9, 10, 23]에서 말초 혈액 시료에서 측정한 DNA 메틸화 변화가 폐암의 위험과 사망률과 관련이 있다고 반복적으로 보고된 바 있다. 이 보고서는 말초 혈액에서 측정 가능한 DNA 메틸화 변화가 폐암의 위험을 측정하는 바이오마커로 유용할 수 있다는 증가하는 증거를 뒷받침했다. 발견된 유전자 위치 중 F2RL3과 AHRR의 CpG는 반복적으로 흡연 및 폐암 발병 위험과 관련이 있었다 [9]. 이러한 CpG 부위의 저메틸화가 폐암의 위험에 대한 담배의 영향을 매개할 수 있다는 가설을 세울 수 있다 [23]. 또한, 이 연구는 cg03636183 (F2RL3)과 cg05934812 (AHRR)가 NSCLC 환자군에서 흡연과 유의하게 연관되어 있지만 대조군에서는 그렇지 않다는 것을 보여주었다. 이 발견은 폐암의 위험에 대한 담배의 매개 효과를 뒷받침한다. 그러나 모순된 결과를 보고하는 연구도 있다. 동유럽과 중부유럽에서 수행된 다원적 연구에서 말초 혈액에서 전체적인 DNA 메틸화와 금연 여성의 폐암 위험 사이의 연관성은 보고되지 않았다 [24]. 또 다른 연구에서 흡연 빈도와 순환 백혈구 내 DNA 메틸화 증가 사이의 연관성은 인종적 차이를 나타낸다고 보고되었다 [25].

본 발명에서는 현재 흡연자의 NSCLC와 관련된 두 가지 중요한 DMP, 즉 cg12169243(DPH6)와 cg25429010(IMP3)을 확인했다. DPH6는 이전에 폐암과 관련이 없었으며, 현재의 발견을 확인하기 위한 추가 연구가 필요하다. IMP3는 선암 환자의 진전 단계와 연관되어 종양 침입에 중요한 역할을 했다 [26]. 폐암의 위험과 예후에 대한 바이오마커를 개발하기 위해서는 이 유전자에 대한 추가 연구가 필요하다. 또한, 선암 환자의 EGFR 돌연변이와 상당히 관련이 있는 6개의 DMP도 확인했다. 비록 다섯 개의 관련 부위가 EGFR 돌연변이와 연관되지 않았지만, cg22448179는 EGFR 유전자에 있는 것으로 식별되었다. 이 결과는 NSCLC의 EGFR 돌연변이에 따라 백혈구의 EGFR에 변화가 있음을 시사한다. 구체적인 기작을 설명하기 위한 추가 연구가 필요하다. 또한, 병기가 진행된 NSCLC 환자에서 생존율과 크게 연관된 4개의 DMP를 관찰했다. 이 중 CKAP4는 NSCLC의 진단 마커로 제안되었다 [27]. 본 발명에서 혈청 내 CKAP4 수준은 대조군에서 관찰된 수준과 비교하여 I기 NSCLC 환자에서 더 높았다. 본 발명자들의 연구 결과를 고려할 때, CKAP4는 NSCLC의 조기 진단 및 예측을 위한 바이오마커 개발에 중요한 표적이 될 것으로 예상된다. 잘 연구된 유전자 부위는 아니지만, cg04989085(FAM113B)는 I기 NSCLC에 비해 진행된 병기의 NSCLC와 관련이 있었으며, 진행된 병기의 NSCLC 환자의 연장된 생존 기간과 관련이 있었다. 이 부위는 비소세포폐암의 나쁜 예후를 예측할 수 있는 바이오마커를 발견하는 데 중요한 표적이 될 것으로 기대된다.

결론적으로, 본 발명은 게놈 전반의 DNA 메틸화 분석을 통해 NSCLC와 관련된 두 가지 유의한 메틸화 변화, EGFR 돌연변이와 관련된 여섯 가지 변화, NSCLC 환자로부터 얻은 말초 혈액 시료의 진행된 병기의 NSCLC와 관련된 네 가지 변화를 확인했다.

본 발명은 현재 흡연자의 혈액 시료 중 차별적 메틸화 마커로서 cg12169243 및 cg25429010 중 선택되는 1종 이상의 메틸화를 현재 흡연자 정상인과 비교하여 비소세포폐암을 탐지하는 방법에 관한 것이다. 즉 현재 흡연자의 경우, 정상인에 비해서 비소세포폐암 환자의 혈액에서 cg12169243의 메틸화가 더 높고, cg25429010의 메틸화는 더 낮다.

또한, 본 발명은 상기 cg12169243이 DPH6 유전자, 상기 cg25429010이 IMP3 유전자에 위치하는 것을 특징으로 하는, 비소세포폐암을 탐지하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은

1) 차별적 메틸화 마커 cg12169243의 메틸화가 현재 흡연자 정상인보다 더 높은 경우; 및

2) 차별적 메틸화 마커 cg25429010의 메틸화가 현재 흡연자 정상인보다 낮은 경우; 중 하나 이상에 해당하면 비소세포폐암 위험이 높은 것으로 예측하는, 비소세포폐암을 탐지하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 비소세포폐암 환자의 혈액 시료 중 차별적 메틸화 마커로서 cg25021476, cg04989085, cg20905681 및 cg26379694 중 선택되는 1종 이상의 메틸화를 비교하여 비소세포폐암 환자의 진행 병기를 탐지하는 방법에 관한 것이다. 비소세포폐암 1기에 비해서 진행 병기 (3b 또는 4) 환자의 혈액에서 cg25021476의 메틸화는 더 낮고, cg04989085, cg20905681, cg26379694의 메틸화는 더 높다.

또한, 본 발병은 cg04989085(FAM113B)의 진행된 병기의 NSCLC 환자에서 예후에 관한 것이다. 진행 병기 (3b 또는 4) 비소세포폐암 환자의 혈액에서 cg04989085의 메틸화가 높을수록 생존률이 더 높다.

또한, 본 발명은

1) 차별적 메틸화 마커 cg25021476의 메틸화가 비소세포폐암 병기 1 환자보다 낮은 경우;

2) 차별적 메틸화 마커 cg04989085의 메틸화가 비소세포폐암 병기 1 환자보다 높은 경우;

3) 차별적 메틸화 마커 cg20905681의 메틸화가 비소세포폐암 병기 1 환자보다 높은 경우; 및

4) 차별적 메틸화 마커 cg26379694의 메틸화가 비소세포폐암 병기 1 환자보다 높은 경우; 중 하나 이상에 해당하면 병기 3b 또는 병기 4일 가능성이 높은 것으로 예측하는, 비소세포폐암 환자의 진행 병기를 탐지하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 cg25021476이 유전자 RSL24D1에, 상기 cg04989085는 유전자 FAM113B에, 상기 cg20905681은 유전자 CKAP4에 위치하는, 비소세포폐암 환자의 진행 병기를 탐지하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 비소세포폐암 선암 환자의 혈액 시료 중 차별적 메틸화 마커로서 cg09245319, cg17183999, cg06366994, cg24992236, cg22144719 및 cg22448179 중 선택되는 1종 이상의 메틸화를 비교하여 표피 성장인자 수용체 돌연변이를 탐지하는 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 비소세포폐암 선암 환자 중에서 종양에 표피 성장인자 수용체 돌연변이 유무와 관련 있는 혈액 메틸화 마커에 관한 것이다. 비소세포폐암 선암 환자일 경우 종양에 표피 성장인자 수용체 돌연변이 양성 환자의 혈액에서 cg24992236의 메틸화가 더 높고, g09245319, cg17183999, cg06366994, cg22144719, cg22448179의 메틸화가 더 낮다.

또한, 본 발명은

1) 차별적 메틸화 마커 cg24992236의 메틸화가 표피 성장인자 수용체 돌연변이 음성 환자보다 더 높은 경우;

2) 차별적 메틸화 마커 cg09245319의 메틸화가 표피 성장인자 수용체 돌연변이 음성 환자보다 더 낮은 경우;

3) 차별적 메틸화 마커 cg17183999의 메틸화가 표피 성장인자 수용체 돌연변이 음성 환자보다 더 낮은 경우;

4) 차별적 메틸화 마커 cg06366994의 메틸화가 표피 성장인자 수용체 돌연변이 음성 환자보다 더 낮은 경우;

5) 차별적 메틸화 마커 cg22144719의 메틸화가 표피 성장인자 수용체 돌연변이 음성 환자보다 더 낮은 경우; 및

6) 차별적 메틸화 마커 cg22448179의 메틸화가 표피 성장인자 수용체 돌연변이 음성 환자보다 더 낮은 경우; 중 하나 이상에 해당하면 표피 성장인자 수용체 돌연변이 양성인 것으로 판단하는, 표피 성장인자 수용체 돌연변이를 탐지하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명에서 상기 cg17183999는 유전자 USP7에, 상기 cg06366994는 유전자 CPE에, 상기 cg24992236은 유전자 MEG9에, 상기 cg22448179는 유전자 EGFR에 위치하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 cg12169243 및 cg25429010 중 선택되는, 현재 흡연자에서 비소세포폐암을 탐지할 수 있는 차별적 메틸화 마커에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 cg25021476, cg04989085, cg20905681 및 cg26379694 중 선택되는 비소세포폐암 환자의 진행 병기 탐지용 차별적 메틸화 마커에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 cg09245319, cg17183999, cg06366994, cg24992236, cg22144719 및 cg22448179 중 선택되는 선암 비소세포폐암 환자 중 표피 성장인자 수용체 돌연변이 탐지용 차별적 메틸화 마커에 관한 것이다.

상기 CG 유전자좌 기호로 표시되는 차별적 메틸화 마커는 파이로시퀀싱 등의 방법으로 탐지할 수 있다.

또한, 상기 CG 유전자좌 기호로 표시되는 차별적 메틸화 마커는 이를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 이 조성물을 포함하는 킷트로 제조되어 탐지에 이용할 수 있다.

폐암은 흔한 형태의 암이며 전 세계적으로 암 관련 사망의 주요 원인이다. 비침습적 바이오마커를 이용한 조기 진단은 폐암 환자의 생존율을 높이는 데 중요한 역할을 할 수 있다. 혈액 시료에서 DNA 차별적 메틸화 바이오마커는 폐암의 조기 진단을 향상시킬 수 있다.

도 1은 현재 흡연자 집단의 비소세포폐암과 연관된 EWAS (Epigenome-wide association study) 플롯이다. 연령, 성별, 흡연 (1년 동안 피운 담뱃갑 수), 혈액 세포 유형 및 PCA (Principal component analysis)에 맞게 조정되었다.
도 2는 비소세포폐암 환자와 대조군 간의 EWAS 플롯이다. 연령, 성별, 흡연 (1년 동안 피운 담뱃갑 수), 혈액 세포 유형 및 PCA (Principal component analysis)에 맞게 조정되었다.
도 3은 비흡연자군에서 비소세포폐암 환자와 대조군 간의 EWAS 플롯이다. 연령, 성별, 흡연 (1년 동안 피운 담뱃갑 수), 혈액 세포 유형 및 PCA (Principal component analysis)에 맞게 조정되었다.
도 4는 비소세포폐암 환자 중 현재 흡연자군과 비흡연자군 간의 EWAS 플롯이다. 연령, 성별, 흡연 (1년 동안 피운 담뱃갑 수), 혈액 세포 유형 및 PCA (Principal component analysis)에 맞게 조정되었다.
도 5는 대조군에서 현재 흡연자군과 비흡연자군 간의 EWAS 플롯이다. 연령, 성별, 흡연 (1년 동안 피운 담뱃갑 수), 혈액 세포 유형 및 PCA (Principal component analysis)에 맞게 조정되었다.
도 6은 cg04989085 (FAM113B)가 비소세포폐암 3기b 및 4기 환자에서 저메틸화 군보다 고메틸화 군에서 더 긴 무진행 생존율과 관련이 있음을 보여준다.

아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.

2.1. 연구대상자 및 조직시료 제작

본 연구에서는 아산 병원 생물자원센터 (서울, 한국)에서 채취한 혈액 시료를 사용하였다. 시료는 비소세포폐암으로 진단받은 150명의 환자와 2012년과 2014년 사이에 건강 검진을 받은 150명의 건강한 대조군에 의해 기증되었다. 150명의 건강한 대조군은 연령, 성별 및 흡연 상태에 따라 150명의 비소세포폐암 환자와 빈도 일치(frequency matching)하여 선택되었다. 흡연 상태 (현재, 과거 및 비흡연자)는 설문지로 조사했다. 과거의 흡연자는 1년 이상 흡연을 중단 한 사람으로 정의되었지만 비 흡연자는 평생 동안 1갑 미만의 흡연력이 있는 사람으로 정의되었습니다. 실험대상자들로부터 충분한 정보에 입각한 동의를 얻었고, 서울 아산 병원의 기관 검토위원회 (Seoul, Korea)가 연구를 승인했다 (IRB no. AMC IRB 2011-0883).

2.2. 유전체 DNA 제작과 DNA 메틸화 프로파일링

제조 회사가 제공한 프로토콜에 따라 EZ DNA 메틸화 키트 (Zymo Research, Irvine, CA, USA)를 사용하여 바이설파이트 전환을 수행하였다. 전 유전체 메틸화 프로파일은 850kbp의 CpG 부위를 커버하는 Methylation EPIC BeadChip Kit를 사용하여 얻었다. 메틸화 데이터의 전처리는 백그라운드 보정, 프로브 유형 차이의 조정, 배치 효과 제거 및 프로브 제외를 통해 수행되었다. 주성분 분석 (PCA)을 사용하여 메틸화 데이터에서 이상치 시료를 확인했다. 메틸화 전처리 단계는 R 소프트웨어 (버전 3.3.0)에서 작동 가능한 Bioconductor 프로젝트의 minfi [11] 및 ComBat [12] 패키지를 사용하여 수행되었다.

850k 어레이는 염색체 전역에서 866,277개의 프로브를 사용하여 메틸화 상태의 단일 뉴클레오티드 해상도를 제공한다. 이 중 품질 관리 절차로서 품질이 낮은 프로브 (즉, 시료의 p <0.01 탐지 또는 시료의 1 % 이상에서 비드 개수 ＜3), X 또는 Y 염색체, 또는 예컨대 단일 뉴클레오타이드 다형성과 같은 근처의 유전적 다양성 (예컨대, SNP)에 의해 영향을 받을 가능성이 있는 프로브를 제외하였다 [13]. 또한, 여러 위치에 정렬된 40,832개의 프로브와 몸체와 겹치는 유전 변이가 있는 프로브를 제거했다 [14, 15]. 나머지 695,162개의 CpG가 연관 분석에 포함되었다.

메틸화 값 (β) (즉, 주어진 CpG 부위에서의 메틸화 비율)을 통계 분석에 사용하였다. 값의 범위는 0 (비메틸화)에서 1 (메틸화)까지이다. 우리는 백혈구 유형 이질성에 대한 전체 DNA 메틸화 데이터를 조정하기 위해 Houseman 알고리즘 [16]의 minfi 기반 통계적 절차를 실시했다. 이 접근법은 미가공 강도 파일을 사용하여 CD4 + 및 CD8 + T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포 및 자연 살해 세포의 상대적 비율을 계산한다.통계학적 유의성에 대하여 우리는 유의하게 다른 메틸화 프로브 (DMPs)에 대해서는 본페로니의 보정 (0.05/695,162 = 7.2E-08) 후

< 7.2E-08의 기준점을, 암시적인 DMPs에 대해서는 임의의 기준점

< 1.0E-5를 설정했다.

2.3. EWAS (Epigenome -wide association study)

비소세포폐렴과 관련된 DMP를 확인하기 위해 비소세포폐렴 상태의 반응 변수와 메틸화 값의 예측 변수와 함께 로지스틱 회귀 모델을 사용했다. 통계 모델의 공변수는 연령, 성별, PCA, 흡연 (1년 동안 피우는 담뱃갑 수), 추정 혈액 세포 유형 비율이었다.

흡연의 효과를 독립적으로 측정하기 위해 비소세포폐암과 관련된 DMP에 대하여 추가 분석을 수행했다. 현재 흡연자와 비흡연자의 각 군에서 비소세포폐암과 관련된 DMP를 분석하였다. 또한, 비소세포폐암 환자 및 대조군의 각 그룹에서 흡연과 관련된 DMP를 조사하였다.

또한, 우리는 메틸화 값과 병리학적/분자적 서브타입 (즉, 선암 또는 편평 세포암, EGFR 돌연변이 또는 EGFR 야생형) 사이의 연관성을 평가하기 위해 각 서브타입을 응답 변수로, 메틸화 값을 예측 변수로 강력한 선형 회귀 모델을 사용하였다.

또한, 상기 분석에서 확인된 중요한 DMP에 대해 생존 분석을 수행했다. 메틸화 수치는 각각 하위 50%와 상위 50%를 포함하는 하위군과 상위군으로 나뉘었다. 카플란-마이어 곡선은 저메틸화군 대 고메틸화군에서 생성되었다.

결과

비소세포폐암 환자와 대조군의 기본 특성은 표 1에 요약되어 있다. 평균 연령은 56세였다. 총 72명의 비흡연자와 30명의 전흡연자, 48명의 현재 흡연자가 두 군에 포함되었다. 비소세포폐암 환자 중 선암 및 편평세포암으로 진단받은 환자는 각각 108명, 42명이었다. 108명의 선암 환자 중 70명은 EGFR 돌연변이를 보였다.

비소세포폐암에 대한 연관성 분석을 바탕으로 나이, 성별, PCA, 흡연 및 추정된 세포형 비율을 조정한 후 비소세포폐암과의 연관성을 암시하는 11개의 DMP를 발견했다 (표 6). 그러나 우리는 본페로니 교정 후 비소세포폐암과 관련이 있는 DMPs를 확인할 수 없었다. 비소세포폐암과 관련된 EWAS 플롯은 도 2에 제시되어 있다.

흡연 상태에 따른 DMP 분석 결과, 현재 흡연자군에서 비소세포폐암과 관련이 있는 58개의 암시적 DMPs (

< 1.0E-5)와 두 개의 중요한 DMPs (cg12169243 [DPH6],

= 4.3E-08, cg25429010 [IMP3],

= 5.2E- 08)를 발견하였다 (표 2, 표 7, 표 8, (주) 표 7과 표 8은 하나의 표이나 편의상 두 개로 나타냄). 현재 흡연자군에서 비소세포폐암과 연관된 EWAS 플롯이 도 1에 제시되어 있다. 반면, 비흡연자군에서 비소세포폐암과의 연관성을 암시하는 19개의 DMP가 발견되었다 (표 9). 비흡연자군에서 비소세포폐암과 연관된 EWAS 플롯이 도 3에 제시되어 있다.

또한, 본 연구에서 흡연과 관련된 DNA 메틸화 변화를 확인하기 위하여 NSCLC 환자와 대조군 각 군에서 현재 흡연자 (각각 48명, 48명)와 관련된 유의한 CpG를 평가했다. 상위 30개의 CpG 부위는 표 10 및 표 11에 나와 있다. 흡연과 비소세포폐암에 대한 두 개의 확립된 유전자 부위인 Cg03636183 (F2RL3)과 cg05934812 (AHRR)는 비소세포폐암 환자군에서 흡연과 유의한 관련이 있는 것으로 나타났다. NSCLC 환자 또는 대조군의 각 군에서 흡연과 관련된 EWAS 도표는 도 4와 도 5에 제시되어 있다.

또한, 질병 단계 및 돌연변이 EGFR 상태와 유의한 관련이 있는 DMP를 평가했다. 우리는 건강한 대조군과 비교하여 1기 비소세포폐암과의 연관성을 암시하는 15개의 DMP를 확인했다 (표 12). 선암 환자 (N = 108, EGFR 돌연변이 = 64)에서 EGFR 돌연변이에 대한 연관성 분석에 따르면, 우리는 159개의 암시적 DMPs와 6개의 중요한 DMPs (cg09245319, cg17183999 [USP7], cg06366994 [CPE], cg24992236 [MEG9] cg22144719 및 cg22448179 [EGFR])를 발견하였다 (표 3). 진행성 비소세포폐암 (3b기 및 4기,

= 67)과 1기 (

= 46)의 연관성 분석에서 58개의 암시적인 DMPs와 4개의 중요한 DMPs (cg25021476 [RSL24D1], cg04989085 [ FAM113B], cg20905681 [CKAP4] 및 cg26379694)를 발견하였다 (표 4).

생존 분석에서, cg25429010은 1기 및 2기 비소세포폐암 환자에서 고메틸화군에 비해 저메틸화군에서 더 긴 무진행 생존율과 관련성이 있었다 (위험비: 1.836;

= 0.163). cg04989085 (FAM113B)는 3b기 및 4기 비소세포폐암 환자에서 저메틸화군보다 고메틸화 군에서 더 긴 무진행 생존율과 유의한 관련이 있었다 (위험비: 0.559,

= 0.024) (도 6).

값은 숫자 (범위 또는 %) 또는 중간값과 범위로 표시된다.

EGFR: 표피 성장 인자 수용체.

a: 염색체

b: 통계 모델의 회귀 계수. 공변량 연령, 성별, PCA, 흡연 (1년 동안 피우는 담뱃갑 수) 및 예상 셀 유형 비율이 모델에 포함되었다. 메틸화 (베타)는 분석에서 0과 1 사이의 범위였다.

c: 통계 모델의 통계적 유의성.

a: 염색체

b: 통계 모델의 회귀 계수. 공변량 연령, 성별, PCA, 흡연 (1년 동안 피우는 담뱃갑 수) 및 예상 셀 유형 비율이 모델에 포함되었다. 메틸화 (베타)는 분석에서 0과 1 사이의 범위였다.

c: 통계 모델의 통계적 유의성.

a: 염색체

b: 통계 모델의 회귀 계수. 공변량 연령, 성별, PCA, 흡연 (1년 동안 피우는 담뱃갑 수) 및 예상 셀 유형 비율이 모델에 포함되었다. 메틸화 (베타)는 분석에서 0과 1 사이의 범위였다.

c: 통계 모델의 통계적 유의성.

a: 염색체

b: 통계 모델의 회귀 계수. 공변량 연령, 성별, PCA, 흡연 (1년 동안 피우는 담뱃갑 수) 및 예상 셀 유형 비율이 모델에 포함되었다. 메틸화 (베타)는 분석에서 0과 1 사이의 범위였다.

c: 통계 모델의 통계적 유의성.

a: 염색체

b: 통계 모델의 회귀 계수. 공변량 연령, 성별, PCA, 흡연 (1년 동안 피우는 담뱃갑 수) 및 예상 셀 유형 비율이 모델에 포함되었다. 메틸화 (베타)는 분석에서 0과 1 사이의 범위였다.

c: 통계 모델의 통계적 유의성.

a: 염색체

b: 통계 모델의 회귀 계수. 공변량 연령, 성별, PCA, 흡연 (1년 동안 피우는 담뱃갑 수) 및 예상 셀 유형 비율이 모델에 포함되었다. 메틸화 (베타)는 분석에서 0과 1 사이의 범위였다.

c: 통계 모델의 통계적 유의성.

a: 염색체

b: 통계 모델의 회귀 계수. 공변량 연령, 성별, PCA, 흡연 (1년 동안 피우는 담뱃갑 수) 및 예상 셀 유형 비율이 모델에 포함되었다. 메틸화 (베타)는 분석에서 0과 1 사이의 범위였다.

c: 통계 모델의 통계적 유의성.

a: 염색체

b: 통계 모델의 회귀 계수. 공변량 연령, 성별, PCA, 흡연 (1년 동안 피우는 담뱃갑 수) 및 예상 셀 유형 비율이 모델에 포함되었다. 메틸화 (베타)는 분석에서 0과 1 사이의 범위였다.

c: 통계 모델의 통계적 유의성.

a: 염색체

b: 통계 모델의 회귀 계수. 공변량 연령, 성별, PCA, 흡연 (1년 동안 피우는 담뱃갑 수) 및 예상 셀 유형 비율이 모델에 포함되었다. 메틸화 (베타)는 분석에서 0과 1 사이의 범위였다.

c: 통계 모델의 통계적 유의성.

Claims (13)

1. 현재 흡연자의 혈액 시료 중 차별적 메틸화 마커로서 cg12169243 및 cg25429010 중 선택되는 1종 이상의 메틸화를 현재 흡연자 정상인과 비교하여 비소세포폐암을 탐지하는 방법.
   
2. 청구항 1에 있어서,
   상기 cg12169243은 DPH6 유전자, 상기 cg25429010은 IMP3 유전자에 위치하는, 비소세포폐암을 탐지하는 방법.
   
3. 청구항 1에 있어서,
   1) 차별적 메틸화 마커 cg12169243의 메틸화가 현재 흡연자 정상인보다 더 높은 경우; 및
   2) 차별적 메틸화 마커 cg25429010의 메틸화가 현재 흡연자 정상인보다 낮은 경우; 중 하나 이상에 해당하면 비소세포폐암 위험이 높은 것으로 예측하는, 비소세포폐암을 탐지하는 방법.
   
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 삭제
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제

Images