CN104066851A - 肿瘤或肿瘤细胞中上皮或间充质表型的诊断性甲基化标志物和对egfr激酶抑制剂的响应 - Google Patents

Abstract

本发明提供用于测定肿瘤的上皮和间充质表型以及预测肿瘤生长对使用EGFR抑制剂治疗为敏感还是抗性的方法。具体地，提供在至少一种选自下组的基因中的CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失作为肿瘤细胞间充质表型的标志物，用于确定肿瘤生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感性，和/或鉴定很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗的癌症患者：CLDN7、HOXC4、CP2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、ERBB2和C20orf55。提供在至少一种选自下组的基因中的CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失作为肿瘤细胞上皮表型的标志物：PCDH8、PEX5L、GALR1和ZEB2。

Description

肿瘤或肿瘤细胞中上皮或间充质表型的诊断性甲基化标志物和对EGFR激酶抑制剂的响应

对相关申请的交叉引用

本申请要求2011年9月30日提交的美国临时申请No.61/542,141的权益，其公开内容通过提述完整并入本文。

发明领域

本发明提供基于基因甲基化状态来预测对癌症疗法的响应的方法。

发明背景

本发明针对用于诊断和治疗癌症患者的方法。具体地，本发明针对用于确定哪些患者将最受益于使用表皮生长因子受体(EGFR)激酶抑制剂治疗的方法。

癌症是大范围细胞恶性的通用名，其特征在于不受调控的生长、缺少分化、和侵入局部组织并转移的能力。这些赘生性恶性以各种患病程度影响体内的每个组织和器官。

在过去的数十年中已开发出多种治疗剂来治疗各种类型的癌症。最普遍使用的抗癌剂类型包括：DNA烷化剂(例如环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide))、抗代谢物(例如甲氨蝶呤、叶酸拮抗剂和5-氟尿嘧啶、嘧啶拮抗剂)、微管破坏物(例如长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、帕利他赛(paclitaxel))、DNA嵌入剂(例如多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunomycin)、顺铂)、和激素疗法(例如他莫昔芬(tamoxifen)、氟他胺(flutamide))。

表皮生长因子受体(EGFR)家族包含4种紧密相关的受体(HER1/EGFR、HER2、HER3和HER4)，其牵涉细胞应答如分化和增殖。EGFR激酶或其配体TGFα的过表达经常与许多癌症有关，包括乳腺癌、肺癌、结直肠癌、卵巢癌、肾细胞癌、膀胱癌、头和颈癌、成胶质细胞瘤和星形细胞瘤，且认为促进这些肿瘤的恶性生长。还发现EGFR基因(EGFRvIII)中的一种特定的缺失突变增加细胞致瘤性。EGFR刺激的信号传导途径的活化促进潜在促进癌症的多种过程，例如增殖、血管发生、细胞运动和侵入、降低的细胞凋亡和药物抗性诱导。增加的HER1/EGFR表达经常与晚期疾病、转移和不良预后关联。例如，在NSCLC和胃癌中，已显示增加的HER1/EGFR表达与高转移率、较差的肿瘤分化和增加的肿瘤增殖相关。

已在NSCLC和成胶质细胞瘤中观察到激活受体的内在蛋白酪氨酸激酶活性和/或增加下游信号传导的突变。然而，突变作用作为赋予对EGF受体抑制剂例如厄洛替尼(erlotinib)()或吉非替尼(gefitinib)(IRESSA^TM)的敏感性的原理机制一直是有争议的。最近，已报告全长EGF受体的突变体形式预测对EGF受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的响应性(Paez,J.G.等(2004)Science304:1497-1500；Lynch,T.J.等(2004)N.Engl.J.Med.350:2129-2139)。细胞培养研究显示表达EGF受体的突变体形式的细胞系(即H3255)对通过EGF受体酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼的生长抑制更敏感，且需要高得多浓度的吉非替尼来抑制表达野生型EGF受体的肿瘤细胞系。这些观察表明EGF受体的特定突变形式可能反映对EGF受体抑制剂的更大的敏感性但不鉴定完全不响应的表型。

开发用作抗肿瘤剂的直接抑制EGFR的激酶活性的化合物，以及通过阻断EGFR活化来降低EGFR激酶活性的抗体是大量研究努力的领域所在(deBono J.S.和Rowinsky,E.K.(2002)Trends in Mol.Medicine8:S19-S26；Dancey,J.和Sausville,E.A.(2003)Nature Rev.Drug Discovery2:92-313)。数项研究已显示、披露或表明一些EGFR激酶抑制剂在与某些其他抗癌剂或化疗剂或治疗组合使用时可能改进肿瘤细胞或赘生物杀伤(例如Herbst,R.S.等(2001)Expert Opin.Biol.Ther.1:719-732；Solomon,B.等(2003)Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.55:713-723；Krishnan,S.等(2003)Frontiers in Bioscience8,e1-13；Grunwald,V.和Hidalgo,M.(2003)J.Nat.Cancer Inst.95:851-867；Seymour L.(2003)Current Opin.Investig.Drugs4(6):658-666；Khalil,M.Y.等(2003)ExpertRev.Anticancer Ther.3:367-380；Bulgaru,A.M.等(2003)Expert Rev.AnticancerTher.3:269-279；Dancey,J.和Sausville,E.A.(2003)Nature Rev.Drug Discovery2:92-313；Ciardiello,F.等(2000)Clin.Cancer Res.6:2053-2063；和专利公开文本No:US2003/0157104)。

厄洛替尼(例如厄洛替尼HCl，亦称为或OSI-774)是口服可用的EGFR激酶的抑制剂。在体外，厄洛替尼已在许多人肿瘤细胞系(包括结直肠癌和乳腺癌中)显示出针对EGFR激酶的实质抑制性活性(Moyer J.D.等(1997)Cancer Res.57:4838)，而且临床前评估显示针对许多表达EGFR的人肿瘤异种移植物的活性(Pollack,V.A.等(1999)J.Pharmacol.Exp.Ther.291:739)。最近，厄洛替尼在许多适应证的I期和II期试验中显示有前景的活性，所述适应证包括头和颈癌(Soulieres,D.,等(2004)J.Clin.Oncol.22:77)、NSCLC(Perez-Soler R,等(2001)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.20:310a，摘要1235)、CRC(Oza,M.,等(2003)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22:196a，摘要785)和MBC(Winer,E.,等(2002)Breast Cancer Res.Treat.76:5115a，摘要445)。在III期试验中，厄洛替尼单一疗法在患有晚期治疗不应性NSCLC的患者中显著延长存活、延迟疾病进展和延迟肺癌有关症状的恶化(Shepherd,F.等(2004)J.Clin.Oncology,22:14S(July15Supplement)，摘要7022)。尽管许多关于厄洛替尼的临床试验数据涉及其在NSCLC中的使用，但来自I/II期研究的初步结果已显示厄洛替尼和卡培他滨(capecitabine)/厄洛替尼组合疗法在患有大范围的人实体肿瘤类型(包括CRC(Oza,M.,等(2003)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22:196a，摘要785)和MBC(Jones,R.J.,等(2003)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22:45a，摘要180))的患者中的有前景的活性。2004年11月美国食品和药物管理局(FDA)批准了在至少一种在前的化疗方案失败后，将厄洛替尼用于治疗患有局部晚期或转移性的非小细胞肺癌(NSCLC)的患者。厄洛替尼是表皮生长因子受体(EGFR)类中在III期临床试验中显示晚期NSCLC患者存活增加的唯一药物。

抗赘生性药物理想地将选择性杀伤癌细胞，关于其对非恶性细胞的毒性有较宽的治疗指标。它还会保留它对恶性细胞的功效，甚至在延长暴露于药物之后。不幸的是，没有一种目前的化疗具有这类理想概况。相反，大多数具有非常窄的治疗指标。此外，暴露于稍微亚致死浓度的化疗剂的癌细胞将非常经常地形成对这类药剂的抗性，而且还相当经常地形成对几种其他抗赘生性药剂的交叉抗性。另外，对于任何给定的癌症类型，甚至在使用较新的基因靶向疗法如EGFR激酶抑制剂时也经常不能预测哪个患者很可能应答特定治疗，如此需要大量试验和错误来发现最有效的疗法，这对患者经常带来相当大的风险和不适。

如此，需要更有效的用于赘生物形成和其他增殖性病症的治疗，和更有效的用于确定哪些肿瘤将响应哪种治疗的手段。用于增强现有药物的治疗功效的策略牵涉其施用时间安排中的变化，以及其与其他抗癌剂或生化调控剂的组合使用。组合疗法公知为是一种相对于使用治疗有关剂量的单独每种药剂，能产生更大功效和减少的副反应的方法。在一些情况中，药物组合的功效是加和性的(组合的功效约等于单独每种药物的效果之和)，但在其他情况中，该效果是协同性的(组合的功效大于单独给出的每种药物的效果之和)。

靶物特异性的治疗办法如厄洛替尼一般与相比于常规细胞毒性剂的降低的毒性有关，因此，有助于其在组合方案中使用。在厄洛替尼与贝伐单抗(Mininberg,E.D.,等(2003)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22:627a，摘要2521)和吉西他滨(gemcitabine)(Dragovich,T.,(2003)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.22:223a，摘要895)组合的I/II期研究中已观察到有前景的结果。在NSCLC III期试验中的最近数据显示与标准化疗组合的一线厄洛替尼或吉非替尼未改进存活(Gatzemeier,U.,(2004)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.23:617(摘要7010)；Herbst,R.S.,(2004)Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.23:617(摘要7011)；Giaccone,G.,等(2004)J.Clin.Oncol.22:777；Herbst,R.,等(2004)J.Clin.Oncol.22:785)。然而，胰腺癌III期试验显示一线厄洛替尼组合吉西他滨确实改进存活。

几个小组已研究了潜在的生物标志物来预测患者对EGFR抑制剂的响应(参见例如，WO 2004/063709、WO 2005/017493、WO 2004/111273、WO2004/071572；US 2005/0019785和US 2004/0132097)。一种这类生物标志物是上皮和间充质表型。在大多数癌症转移期间，在肿瘤细胞中发生一项重要的变化，称为上皮-到-间充质转变(EMT)(Thiery,J.P.(2002)Nat.Rev.Cancer2:442-454；Savagner,P.(2001)Bioessays 23:912-923；Kang Y.和Massague,J.(2004)Cell 118:277-279；Julien-Grille,S.,等Cancer Research63:2172-2178；Bates,R.C.等(2003)Current Biology13:1721-1727；Lu Z.,等(2003)Cancer Cell.4(6):499-515)。紧密结合在一起且展现极性的上皮细胞产生间充质细胞，其更宽松地保持在一起，展现出极性的降低且具有行进的能力。这些间充质细胞能传播到原始肿瘤周围的组织中，侵入血管和淋巴管，并行进至新位置，在该处分裂并形成另外的肿瘤。EMT不发生在健康细胞中，除了在胚胎发生期间以外。在正常情况下，TGF-β充当生长抑制剂，然而在癌症转移期间，TGF-β开始促进EMT。

上皮和间充质表型与特定的基因表达模式关联。例如，上皮表型在WO2006101925中显示为与E-钙粘蛋白、Brk、γ-连环蛋白(catenin)、α-连环蛋白、角蛋白8、角蛋白18、连接蛋白31、plakophilin3、stratafin1、核纤层蛋白α5和ST14的高表达水平有关，而间充质表型与波形蛋白、纤连蛋白、微纤维蛋白-1、微纤维蛋白-2、胶原α2(IV)、胶原α2(V)、LOXL1、巢蛋白(nidogen)、C11或f9、肌腱蛋白(tenascin)、N-钙粘蛋白、胚EDB+纤连蛋白、微管蛋白α3和上皮形成素(epimorphin)的高表达水平有关。

表观遗传学(epigenetics)是对由基础DNA序列中变化以外的机制导致的基因表达或细胞表型中的可遗传变化的研究，因此名称为epi-(希腊语：在上、之上、外部)-遗传学。这类变化的例子包括DNA甲基化和组蛋白修饰，两者均作用于调控基因表达而不改变相关基因的序列。这些变化可以是体细胞可遗传的，其经由生物体剩余生命中的细胞分裂，而且还可以传递到生物体的后续世代。然而，在生物体的基础DNA序列中没有变化；相反，是非遗传因素导致生物体的基因有不同的行为或表达。

DNA甲基化是高等生物中正常生物发育和细胞分化中至关重要的部分。DNA甲基化稳定地改变细胞中的基因表达模式，从而细胞能“记得其曾在何处”；例如，在胚胎发育期间程序化为胰岛的细胞在生物体的整个生命中在没有告诉它们必须保持岛的持续信号的情况下保持为胰岛。另外，DNA甲基化抑制病毒基因和其他已掺入宿主基因组的有害元件随时间的表达。DNA甲基化还形成染色质结构的基础，这使得细胞能从DNA的单个不可变序列形成多细胞生命所需要的无数特征。DNA甲基化还在几乎所有类型的癌症的形成中起着至关重要的作用。在胞嘧啶位置5的DNA甲基化具有降低基因表达的特定效果，且已在检查的每个脊椎动物中发现。在成人体细胞组织中，DNA甲基化通常发生在CpG二核苷酸背景中，而非CpG甲基化在胚胎干细胞中是普遍的。

“CpG”是“-C-磷酸-G-”的缩写，即胞嘧啶和鸟嘌呤由仅一个磷酸分开；磷酸将任意两个核苷在DNA中连接在一起。“CpG”记法用于将此线性序列与胞嘧啶和鸟嘌呤的CG碱基对区分开来。CpG二核苷酸中的胞嘧啶可经甲基化以形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。在哺乳动物中，将基因内的胞嘧啶甲基化能关闭该基因。将甲基基团添加到DNA的酶称为DNA甲基转移酶。在哺乳动物中，70％至80％的CpG胞嘧啶是甲基化的。存在具有更高的CpG位点浓度的基因组区域，称为CpG岛。这些“CpG岛”还具有高于预期的GC含量(即>50％)。哺乳动物基因组中的许多基因具有与基因起始关联的CpG岛。因此，CpG岛的存在被用来协助基因的预测和注释。CpG岛对于甲基化是顽固性的，这可能有助于维持开放的染色质构型。另外，这能产生对转变突变的降低的易受损性，因此导致续存更高平衡密度的CpG。基因启动子内CpG位点的甲基化能导致其沉默，这是在许多人癌症中发现的一种特征(例如肿瘤抑制基因的沉默)。相反，CpG位点的低甲基化与癌细胞内癌基因的过表达有关。

发明概述

本发明的一个方面提供一种确定肿瘤细胞是否具有上皮表型的方法，包括检测肿瘤细胞中表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任何CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤细胞具有上皮表型。在某些实施方案中，所述CpG位点在PCDH8、PEX5L、GALR1或ZEB2基因中。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是NSCLC细胞。

本发明的另一个方面提供一种确定肿瘤细胞是否具有上皮表型的方法，包括检测表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任何CpG位点处甲基化的缺失指示所述肿瘤细胞具有上皮表型。在某些实施方案中，所述CpG位点在CLDN7、HOXC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、或C20orf55基因中。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是NSCLC细胞。

本发明的另一个方面提供一种测定肿瘤生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感性的方法，包括检测样品肿瘤细胞中表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任一个CpG位点处DNA甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制敏感。在一个实施方案中，所述EGFR抑制剂是厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是NSCLC细胞。

本发明的另一个方面提供一种鉴定很可能受益于使用EFGR抑制剂治疗的癌症患者的方法，包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中如果任一个CpG位点处的DNA甲基化检测为缺失，那么将所述患者鉴定为很可能受益于使用所述EGFR抑制剂治疗。在某些实施方案中，所述CpG位点在CLDN7、HOXC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、或C20orf55基因中。在某些实施方案中，所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述癌症是NSCLC。

本发明的又一个方面提供一种鉴定很可能受益于使用EFGR抑制剂治疗的癌症患者的方法，包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中如果任一个CpG位点处的DNA甲基化检测为存在，那么将所述患者鉴定为很可能受益于使用所述EGFR抑制剂治疗。在某些实施方案中，如果所述患者被鉴定为很可能会受益于使用EGFR抑制剂治疗的患者，那么对所述患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂。在某些实施方案中，所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述癌症是NSCLC。

本发明的另一个方面提供一种确定肿瘤细胞是否具有间充质表型的方法，包括检测肿瘤细胞中表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任何CpG位点处甲基化的缺失指示所述肿瘤细胞具有间充质表型。在某些实施方案中，所述CpG位点在PCDH8、PEX5L、GALR1或ZEB2基因中。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是NSCLC细胞。

本发明的另一个方面提供一种确定肿瘤细胞是否具有间充质表型的方法，包括检测表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任何CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤细胞具有间充质表型。在某些实施方案中，所述CpG位点在CLDN7、HOXC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、或C20orf55基因中。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是NSCLC细胞。

本发明的又一个方面提供一种测定肿瘤生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感性的方法，包括检测样品肿瘤细胞中表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任一个CpG位点处DNA甲基化的缺失指示所述肿瘤生长对使用所述EGFR抑制剂的抑制有抗性。在某些实施方案中，所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是NSCLC细胞。

本发明的另一个方面提供一种测定肿瘤生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感性的方法，包括检测样品肿瘤细胞中表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任一个CpG位点处DNA甲基化的存在指示所述肿瘤生长对使用所述EGFR抑制剂(如例如厄洛替尼、吉非替尼(gefitinib)、拉帕替尼(lapatinib)、西妥昔单抗或帕尼单抗)的抑制有抗性。在某些实施方案中，所述CpG位点在CLDN7、HOXC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、或C20orf55基因中。在某些实施方案中，所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述肿瘤细胞是NSCLC细胞。

本发明的另一个方面提供一种在患者中治疗癌症的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂，其中所述患者在施用所述EGFR抑制剂之前诊断为患有展现出在表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处存在DNA甲基化的癌症。在某些实施方案中，所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述癌症是NSCLC。

本发明的另一个方面提供一种在患者中治疗癌症的方法，包括对所述患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂，其中所述患者在施用所述EGFR抑制剂之前诊断为患有展现出在表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处缺失DNA甲基化的癌症。在某些实施方案中，所述EGFR抑制剂是厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述癌症是NSCLC。

本发明的另一个方面提供一种为癌症患者选择疗法的方法，其包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表2或表4中鉴定的一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，且当表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处检测为存在甲基化时，选出用于治疗的EGFR抑制剂的步骤。在一个实施方案中，如果选择EGFR疗法，那么对患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂，如厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述患者患有NSCLC。

本发明的另一个方面提供一种为癌症患者选择疗法的方法，其包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表1或表3中鉴定的一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，且当表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处检测为缺失甲基化时，选出用于治疗的EGFR抑制剂的步骤。在一个实施方案中，如果选择EGFR疗法，那么对患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂，如厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。在某些实施方案中，所述患者患有NSCLC。

在上文各方面的某些实施方案中，甲基化的存在或缺失通过焦磷酸测序检测。在上文各方面的某些实施方案中，DNA从福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)组织或新鲜冷冻的组织分离。在一个实施方案中，在焦磷酸测序前将从组织样品分离的DNA预扩增。

附图简述

本专利或申请文件含有至少一幅以彩色制成的图。具有彩图的本专利或专利申请公开文本的拷贝会在请求并支付必要费用后由专利局提供。

图1。依照Fluidigm EMT基因表达集分类为上皮和间充质表型的NSCLC细胞系。

图2。将细胞系表征为上皮样或间充质样的层次聚类。

图3。分类为对EGFR抑制剂厄洛替尼敏感性、居中和抗性的上皮和间充质NSCLC细胞系的DNA甲基化样式。

图4。选择用于亚硫酸氢钠测序或qMSP和焦磷酸测序阵列设计的DMR的注释。

图5A。对CLDN7启动子区的焦磷酸测序基于上皮样/间充质样表型区分42种NSCLC细胞系。

图5B。CLDN7mRNA的相对表达，其使用标准的ΔCt方法在42种(n＝20种上皮样，19种间充质样，3种居中)经DMSO处理和经5-氮杂-dC处理的NSCLC细胞系中测定。

图6A-H。基于TaqMan的甲基化检测测定法，其特异于与基因(A)MST1R/RON、(C)FAM110A、(E)CP2L3/GRHL2和(G)ESRP1有关的DMR，以及(B)RON、(D)FAM110A、(F)GRHL2和(H)ESRP1的接受者操作特征(Receiver operating characteristic)(ROC)图。

图7A-M。在厄洛替尼敏感性对厄洛替尼抗性NSCLC细胞系中的定量甲基化特异性PCR测定法的接受者操作特征(ROC)曲线-PEX5L(A)、PCDH8(B)、ZEB2(C)、ME3(D)、MSTR1(E)、STX2(F)、HOXC5(G)、C20orf55(H)、ESRP1(I)、BCAR3(J)、CLDN7(K)、NKX6.2(L)、CP2L3(M)。

图8A-B。显示82种NSCLC细胞系的上皮(E)或间充质(M)分类和厄洛替尼IC50值的表。

列表

表1。与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸(CpG)。

表2。与上皮表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸(CpG)。

表3。与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸(CpG)，通过基因的染色体编号、核苷酸位置和Entrez ID标识。

表4。与上皮表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸(CpG)，通过基因的染色体编号、核苷酸位置和Entrez ID标识。

发明详述

术语“癌症”在动物中指具有致癌细胞典型特征的细胞存在，所述特征如不受控的增殖、永生化、转移潜力、快速生长和增殖速率、和某些特征性形态学特征。癌症细胞经常将以肿瘤的形式，但这类细胞可在动物中单独存在，或可在血液流中作为独立细胞循环，如白血病细胞。

如本文中使用的，除非另外指示，“异常细胞生长”指独立于正常调控机制的细胞生长(例如失去接触抑制)。这包括以下异常生长：(1)通过表达突变的酪氨酸激酶或过表达受体酪氨酸激酶来增殖的肿瘤细胞(肿瘤)；(2)其他增殖性疾病的良性和恶性细胞，其中发生异常酪氨酸激酶活化；(4)通过受体酪氨酸激酶增殖的任何肿瘤；(5)通过异常丝氨酸/苏氨酸激酶活化增殖的任何肿瘤；和(6)其他增殖性疾病的良性和恶性细胞，其中发生异常丝氨酸/苏氨酸激酶活化。

如本文中使用的，除非另外指示，术语“治疗/处理”意指在患者中逆转、减轻、抑制进展、或预防(部分或完全地)肿瘤生长、肿瘤转移或其他致癌或赘生性细胞。如本文中使用的，除非另外指示，术语“治疗/处理”指治疗/处理的行为。

短语“一种治疗方法”或其等同体，在应用于例如癌症时指设计为减少或消除动物中的癌症细胞数，或减轻癌症症状的作用规程或过程。“一种治疗”癌症或另一种增殖性病症的“方法”不必然指事实上将消除癌细胞或其他病症，事实上将减少细胞数或病症，或事实上将减轻癌症或其他病症的症状。

术语“治疗有效的药剂”意指将引发研究者、兽医、医学医师或其他临床医师寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学应答的组合物。

术语“治疗有效量”或“有效量”意指将引发研究者、兽医、医学医师或其他临床医师寻求的组织、系统、动物或人的生物学或医学应答的受试化合物或组合的量。

术语“ErbB1”、“HER1”、“表皮生长因子受体”和“EGFR”和“EGFR激酶”在本文中可交换使用且指EGFR，如例如在Carpenter等Ann.Rev.Biochem.56:881-914(1987)中披露的，包括其天然存在的突变体形式(例如一种缺失突变体EGFR，如Humphrey等PNAS(USA)87:4207-4211(1990)中的)。erbB1指编码EGFR蛋白产物的基因。

如本文中使用的，术语“EGFR激酶抑制剂”和“EGFR抑制剂”指本领域中目前已知的或未来将鉴定的任何EGFR激酶抑制剂，其包括在对患者施用时导致与患者中EGF受体活化有关的生物学活性(包括另外从EGFR天然配体对EGFR的结合得到的任何下游生物学效应)受抑制的任何化学实体。这类EGFR激酶抑制剂包括能阻断EGFR活化或EGFR活化的任何下游生物学效应(与患者中的癌症治疗有关)的任何药剂。这类抑制剂能通过直接结合受体的胞内域并抑制其激酶活性起作用。或者，这类抑制剂能通过占据EGF受体的配体结合位点或其部分起作用，由此使得受体为其天然配体不可达的，从而阻止或降低其正常生物学活性。或者，这类抑制剂能通过调控EGFR多肽的二聚体化，或EGFR多肽与其他蛋白质的相互作用，或增强EGFR的遍在蛋白化和胞吞降解起作用。EGFR激酶抑制剂包括但不限于低分子量抑制剂、抗体或抗体片段、反义构建体、小抑制RNA(即通过dsRNA的RNA干扰；RNAi)和核酶。在一个优选的实施方案中，所述EGFR激酶抑制剂是特异性结合人EGFR的小有机分子或抗体。

EGF受体功能的抑制剂已显示临床效用，而且描述最可能受益于治疗的患者亚组的关键EGF受体信号传导途径的定义已成为一个重要的研究领域。已在NSCLC和成胶质细胞瘤中观察到活化受体的内在蛋白质酪氨酸激酶活性和/或增加下游信号传导的突变。体外和临床研究已显示wt EGF受体细胞系和肿瘤之间在其对EGF受体抑制的细胞应答中的相当大的变异性，这部分已显示为源自磷脂酰肌醇3-激酶途径的EGF受体独立性的活化，导致抗细胞凋亡丝氨酸-苏氨酸激酶Akt的持续的磷酸化。PI3激酶活化的备选路径和由此的EGF受体抑制剂不敏感性的分子决定物是一个积极的研究领域。例如强烈活化PI3激酶途径的胰岛素样生长因子1受体(IGF-1受体)牵连对EGF抑制剂的细胞抗性。在介导对选择性EGF受体抑制的不敏感性中经由PI3激酶途径也能施加存活信号的细胞-细胞和细胞-粘着网络的作用不那么清楚且将假定为影响对EGF受体阻断物的细胞敏感性。在缺少对胞外基质的粘附或细胞-细胞接触的情况下肿瘤细胞维持生长和存活信号的能力是重要的，不仅在细胞迁移和转移的背景中，而且还在维持伤口样肿瘤环境中的细胞增殖和存活中，其中胞外基质被重塑且细胞接触抑制减少。

先前已开发了与NSCLC细胞系对厄洛替尼的体外敏感性相关的EMT基因表达签名。(Yauch等,2005,Clin Cancer Res11,8686-8698)。基于该项工作开发了与上皮和间充质表型有关的基于fluidigm的EMT表达签名(图1)。

本发明部分基于使用整合的基因组办法，其将基因表达分析与全基因组甲基化概况分析组合以显示甲基化生物标志物能对癌症(如NSCLC)中的上皮和间充质表型分类，从而证明DNA甲基化模式中的基因组范围内的差异与癌症的独特的生物学和临床相关子集有关。使用本文中描述的方法将甲基化模式用于癌症的表型子集分类是有利的，因为它需要比更传统的基于DNA和RNA的分析方法更少量的测试组织。该特征在组织有限的情况下分析临床样品时特别有用。

在开发预测性生物标志物中的一项主要挑战是需要建立用于前景评估的有力的“截点(cut-point)”。这对于基于蛋白质的测定法如免疫组织化学尤其成问题。尽管受到广泛使用，但免疫组织化学受制于许多限制其在预测性生物标志物开发中使用的技术挑战。这些限制包括抗体特异性和灵敏性、表位可获性和稳定性、以及不同病理学家对数据解译的内在主观性(24、25)。能利用PCR的动态范围和特异性的分子测定法则是更期望的。然而，基于PCR的测定法也存在限制：RNA是高度不稳定的且需要预先设定的截留点。突变检测测定法，尽管是潜在二元性的，但受到高流行性突变热点和靶序列的可获性的限制。如实施例中显示的，基于PCR的甲基化测定法潜在地解决了这些问题中的许多个，因为它们具有突变测定法的许多特性，包括广泛的动态范围和基本二元性的读出(具有与突变测定法类似的灵敏性)，但由于CpG甲基化状态的局部相关行为，用于测定法设计的靶区域可以是相当大的。更重要的是，DNA甲基化可用于以差不多与过去使用基因表达相同的方式来推断肿瘤的生物学状态。

本文实施例中呈现的数据显示，在细胞培养中或在体内生长的含有野生型EGFR的肿瘤细胞如NSCLC或胰腺癌细胞，根据其是否经历上皮到间充质转变(EMT)，显示对EGFR激酶抑制剂的抑制的一定范围的敏感性。在EMT之前，肿瘤细胞对于EGFR激酶抑制剂如厄洛替尼HCl()的抑制非常敏感，而经历EMT的肿瘤细胞对于这类化合物的抑制要不敏感得多。数据指示EMT可能是决定肿瘤对EGFR激酶抑制剂的敏感性水平的一般性生物学转换。本文中显示，肿瘤对EGFR激酶抑制剂的敏感性水平可通过测定由肿瘤细胞表达的、EMT事件之前或之后的细胞特征性的生物标志物的水平来评估。例如，上皮生物标志物如E-钙粘蛋白的高肿瘤细胞表达水平(指示细胞尚未经历EMT)与对EGFR激酶抑制剂的高敏感性相关。相反，间充质生物标志物如波形蛋白或纤连蛋白的高肿瘤细胞表达水平(指示细胞已经历EMT)与对EGFR激酶抑制剂的低敏感性相关。如此，这些观察能形成用于预测EGFR激酶抑制剂对肿瘤生长的影响的诊断方法的基础，并给予肿瘤学家一项协助他们来选择针对其患者的最适宜治疗的工具。

如实施例中描述的，基于DNA甲基化模式，癌症可区分成为上皮样(EL)和间充质样(ML)肿瘤。间充质表型(或已经历EMT的肿瘤细胞)与表1和表3中显示的特定基因的甲基化有关。因此，本发明提供一种确定肿瘤细胞是否具有间充质表型的方法，包括检测肿瘤细胞中表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中任何CpG位点处的甲基化指示所述肿瘤细胞具有间充质表型。相反，表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的缺失指示所述肿瘤具有上皮表型。

在一个具体的实施方案中，确定肿瘤细胞是否具有间充质表型的方法包括检测以下一种或多种基因中CpG位点处甲基化的存在或缺失：CLDN7(密蛋白(claudin)-7)、HOXC4(同源框C4)、CP2L3(grainyhead样3)、STX2(突触融合蛋白2)、RON(巨噬细胞刺激性1受体)、TBCD(微管蛋白特异性分子伴侣D)、ESRP1(上皮剪接调控蛋白1)、GRHL2(grainyhead样2)、ERBB2和C20orf55(第20号染色体开读框55)基因，其中任一个CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。相反，任一个CpG位点处DNA甲基化的缺失指示所述肿瘤具有上皮表型。在一个具体的实施方案中，所述方法包括在以下一种或多种基因中检测CpG位点处的甲基化：CLDN7、HOXC4、CP2L3、STX2、RON、TBCD、ESRP1、GRHL2、ERBB2和C20orf55基因，其中任一个CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中的2种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中的3种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中的4种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中的5种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。在一个具体的实施方案中，检测出CLDN7、HOXC4、CP2L3、STX2、RON、TBCD、ESRP1、GRHL2和C20orf55基因中的2、3或4、5、6、7、8或所有9种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。在另一个实施方案中，检测出CLDN7、RON、ESRP1和GRHL2中的2、3或4种中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。在另一个实施方案中，检测出CLDN7、RON、ESRP1和GRHL2的所有4种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有间充质表型。

另外，本发明提供一种预测肿瘤生长对通过EGFR抑制剂的抑制的敏感性的方法，包括在取自肿瘤的样品细胞中检测表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中在任一个CpG位点处DNA甲基化的存在指示肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是抗性的。相反，在任一个CpG位点处DNA甲基化的缺失指示肿瘤生长对于通过EGFR抑制剂的抑制是敏感的(即响应的)。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中的2种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是抗性的。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中的3种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是抗性的。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中的4种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是抗性的。在一个具体的实施方案中，检测出表1或表3中的5种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是抗性的。在一个具体的实施方案中，检测出CLDN7、HOXC4、CP2L3、STX2、RON、TBCD、ESRP1、GRHL2、ERBB2和C20orf55基因中的2、3或4、5、6、7、8或所有9种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制为抗性的。在另一个实施方案中，检测出CLDN7、RON、ESRP1和GRHL2中的2、3或4种中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制为抗性的。在另一个实施方案中，检测出CLDN7、RON、ESRP1和GRHL2的所有4种基因中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制为抗性的。

本发明的另一个方面提供一种鉴定很可能受益于使用EFGR抑制剂治疗的癌症患者的方法，包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表1或表3中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中如果任一个CpG位点处的DNA甲基化检测为缺失，那么将所述患者鉴定为很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。相反，在任一个CpG位点处DNA甲基化的存在指示患者不太可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测表1或表3中的2种基因中CpG位点处的甲基化为缺失指示患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测表1或表3中的3种基因中CpG位点处的甲基化为缺失指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测表1或表3中的4种基因中CpG位点处的甲基化为缺失指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测表1或表3中的5种基因中CpG位点处的甲基化为缺失指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测CLDN7、HOXC4、CP2L3、STX2、RON、TBCD、ESRP1、GRHL2、ERBB2和C20orf55基因中的2、3或4、5、6、7、8或所有9种基因中CpG位点处甲基化为缺失指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在另一个实施方案中，检测CLDN7、RON、ESRP1和GRHL2中的2、3或4种中CpG位点处甲基化为缺失指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在另一个实施方案中，检测CLDN7、RON、ESRP1和GRHL2的所有4种中CpG位点处甲基化为缺失指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在某些实施方案中，对视为很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗的患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂。

如实施例中描述的，肿瘤细胞中的上皮表型与表2和表4中显示的特定基因的甲基化有关。因此，本发明提供一种确定肿瘤细胞是否具有上皮表型的方法，包括在肿瘤细胞中检测表2或表4中鉴定的任一个胞嘧啶核苷酸(CpG位点)处DNA甲基化的存在或缺失，其中任一个胞嘧啶核苷酸(CpG位点)处甲基化的存在指示所述肿瘤细胞具有上皮表型。相反，本发明还提供一种确定肿瘤细胞是否具有上皮表型的方法，包括在肿瘤细胞中检测表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中CpG位点处甲基化的缺失指示所述肿瘤具有间充质表型。

在一个具体的实施方案中，所述方法包括在以下一种或多种基因中的CpG位点处检测甲基化的存在或缺失：PCDH8(原钙粘蛋白(protocadherin)8)、PEX5L(过氧化物酶体生源因子5样)、GALR1(神经节肽(galanin)受体1)、ZEB2(锌指E盒结合同源框2)和ME3(苹果酸酶3)基因，其中CpG位点处甲基化的存在指示肿瘤具有上皮表型。在一个具体的实施方案中，所述方法包括检测ZEB2基因中的CpG位点处甲基化的存在或缺失，其中CpG位点处甲基化的存在指示所述肿瘤具有上皮表型。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的2种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤具有上皮表型。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的3种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤具有上皮表型。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的4种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤具有上皮表型。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的5种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤具有上皮表型。在一个具体的实施方案中，检测PCDH8、PEX5L、GALR1或ZEB2基因的每一种中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤具有上皮表型。

另外，本发明提供一种预测肿瘤生长对通过EGFR抑制剂的抑制的敏感性的方法，包括在取自肿瘤的样品细胞中检测表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中在任一个CpG位点处DNA甲基化的存在指示肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。相反，在任一个CpG位点处DNA甲基化的缺失指示肿瘤生长对于通过EGFR抑制剂的抑制是抗性的。在一个具体的实施方案中，所述方法包括检测PCDH8、PEX5L、GALR1或ZEB2基因的一种或多种中CpG位点的甲基化，其中在任一个CpG位点处甲基化的存在指示肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。在一个具体的实施方案中，所述方法包括检测ZEB2基因中CpG位点处的甲基化，其中ZEB2基因中CpG位点处甲基化的存在指示肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的2种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的3种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的4种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的5种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。在一个具体的实施方案中，检测PCDH8、PEX5L、GALR1或ZEB2基因的每一种中CpG位点处的甲基化为存在指示所述肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制是敏感的。

本发明的另一个方面提供一种鉴定很可能受益于使用EFGR抑制剂治疗的癌症患者的方法，包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表2或表4中鉴定的任一个CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失，其中如果任一个CpG位点处的DNA甲基化检测为存在，那么将所述患者鉴定为很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。相反，任一个CpG位点处的DNA甲基化的缺失指示患者不太可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的2种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的3种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的4种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测表2或表4中的5种基因中CpG位点处的甲基化为存在指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在一个具体的实施方案中，检测PCDH8、PEX5L、GALR1或ZEB2中的2、3或4种中CpG位点处的甲基化为存在指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在另一个实施方案中，检测ZEB2中CpG位点处的甲基化为存在指示所述患者很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。在某些实施方案中，对视为很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗的患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂。

本发明的另一个方面提供一种治疗癌症患者的方法，使用本文中描述的DNA甲基化概况分析先前已鉴定所述癌症患者是很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗的患者，所述方法包括对该患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂。

本发明的另一个方面提供一种基于本文中描述的DNA甲基化概况分析方法为癌症患者选择疗法的方法。在一个实施方案中，所述方法包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表2或表4中鉴定的CpG位点之一处甲基化的存在或缺失，并且当表2或表4中鉴定的CpG位点之一处检测为存在甲基化时，选出EGFR抑制剂用于疗法。在另一个实施方案中，所述方法包括在来自所述患者的癌症的样品中检测表1或表3中鉴定的CpG位点之一处DNA甲基化的存在或缺失，并且当表1或表3中鉴定的CpG位点之一处检测为缺失甲基化时，选出EGFR抑制剂用于疗法。在某些实施方案中，如果选择EGFR抑制剂疗法，那么对患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂，如厄洛替尼、西妥昔单抗或帕尼单抗。

医学领域，特别是关于诊断性测试的应用和治疗学治疗的医学领域中的技术人员将认可生物学系统可展现出变异性且并非总是完全可预测的，如此许多较好的诊断性测试或治疗学有时是无效的。如此，最终由主治医师基于测试结果、患者状况和病史、及其自身经验的判断来确定个体患者的最适宜的治疗过程。甚至有以下情况，例如，当基于来自诊断测试或来自其他标准的数据肿瘤未预测为对EGFR激酶抑制剂特别敏感时，医师会选择用EGFR抑制剂来治疗患者，尤其是在如果所有或大多数其他明显的治疗选项已经失败，或者预期在与另一种治疗一起施用时有一些协同性的情况下。与癌症治疗中使用的许多其他抗癌药物如更传统的化疗剂或细胞毒性剂相比，EGFR抑制剂作为一类相对耐受较好的药物的事实使其成为更可行的选择。

因此，本发明提供一种预测肿瘤细胞生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感性的方法，包括：评估肿瘤细胞中一种或多种(或一组)上皮生物标志物的DNA甲基化水平；和预测肿瘤细胞生长对EGFR抑制剂所致抑制的敏感性，其中所有肿瘤细胞上皮生物标志物的同时较高的DNA甲基化水平与对通过EGFR抑制剂的抑制的高度敏感性相关。在该方法的一个具体的实施方案中，所述上皮生物标志物包括基因PCDH8、PEX5L、GALR1、ZEB2和ME3，其中两种肿瘤细胞上皮生物标志物的同时的高表达水平与对EGFR激酶抑制剂所致抑制的高度敏感性相关。

本发明还提供一种预测肿瘤细胞生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感性的方法，包括：评估肿瘤细胞中一种或多种(或一组)间充质生物标志物的水平；和预测肿瘤细胞生长对EGFR抑制剂所致抑制的敏感性，其中所有肿瘤细胞间充质生物标志物的同时的高水平与对通过EGFR抑制剂的抑制的抗性相关。在该方法的一个具体的实施方案中，所述间充质生物标志物包括基因CLDN7、HOXC4、CP2L3、TBCD、ESRP1、GRHL2和C20orf55，其中至少两种肿瘤细胞间充质生物标志物的同时的高DNA甲基化水平与对通过EGFR抑制剂的抑制的抗性相关。

本发明还提供一种预测癌症患者是否患有会对使用EGFR激酶抑制剂的治疗有效响应的肿瘤的方法，包括：评估肿瘤细胞中一种或多种(或一组)上皮生物标志物PCDH8、PEX5L、GALR1、ZEB2和ME3的DNA甲基化水平；和预测肿瘤是否会有效响应使用EGFR抑制剂的治疗，其中所有肿瘤细胞上皮生物标志物的同时的高表达水平与会有效响应使用EGFR抑制剂的治疗的肿瘤相关。

本发明还提供一种预测癌症患者是否患有会对使用EGFR激酶抑制剂的治疗有效响应的肿瘤的方法，包括：评估肿瘤细胞中一种或多种(或一组)间充质生物标志物CLDN7、HOXC4、CP2L3、TBCD、ESRP1、GRHL2和C20orf55的水平；和预测肿瘤是否会有效响应使用EGFR抑制剂的治疗，其中所有这类肿瘤细胞间充质生物标志物的高DNA甲基化水平与对使用EGFR抑制剂的治疗有抗性的肿瘤相关。

在本文所述方法中，肿瘤细胞通常将来自诊断为患有癌症、癌症前期疾患、或异常细胞生长的另一种形式，并且需要治疗的患者。所述癌症可以是肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、胰腺癌、头和颈癌、胃癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌或下文中描述的多种其他癌症中的任一种。所述癌症是已知潜在可用EGFR抑制剂治疗的癌症。肿瘤细胞可获自患者痰、唾液、血液、尿、粪、脑脊髓液，或直接获自肿瘤，例如通过细针穿刺(fine needle aspirate)。

可通过许多方法学来分析样品中各种生物标志物的存在和/或水平/量，其中许多是本领域中已知且熟练技术人员理解的，包括但不限于免疫组织化学(“IHC”)、Western印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定法、ELISA、ELIFA、荧光激活细胞分选(“FACS”)、MassARRAY、蛋白组学、基于血液的定量测定法(如例如血清ELISA)、生化酶活性测定法、原位杂交、Southern分析、Northern分析、全基因组测序、聚合酶链式反应(“PCR”)(包括定量实时PCR(“qRT-PCR”)和其他扩增类型检测方法，如例如分支的DNA、SISBA、TMA等)、RNA-Seq、FISH、微阵列分析、基因表达概况分析、和/或基因表达系列分析(“SAGE”)，以及可通过蛋白质、基因和/或组织阵列分析实施的许多种测定法中的任一种。用于评估基因和基因产物状态的典型方案见于例如Ausubel等编,1995,Current Protocols In Molecular Biology,Units2(NorthernBlotting),4(Southern Blotting),15(Immunoblotting)和18(PCR Analysis)。还可使用多重免疫测定法如那些可从Rules Based Medicine or Meso ScaleDiscovery(“MSD”)获得的。

用于评估DNA甲基化的方法是公知的。例如，Laird(2010)NatureReviews Genetics11:191-203提供关于DNA甲基化分析的综述。在一些实施方案中，评估甲基化的方法包括将基因组DNA随机剪切或随机片段化，用甲基化依赖性或甲基化敏感性限制酶切割DNA，随后选择性鉴定和/或分析切割或未切割的DNA。选择性鉴定可包括例如，分离切割和未切割的DNA(例如通过大小)并量化感兴趣的切割或未切割的序列。参见例如，美国专利No.7,186,512。在一些实施方案中，所述方法可涵盖在限制酶消化后扩增完整的DNA，由此仅扩增在扩增区域中未被限制酶切割的DNA。参见例如，美国专利申请No.10/971,986；11/071,013；和10/971,339。在一些实施方案中，扩增可使用基因特异性的引物进行。或者，可将接头添加到随机片段化的DNA的端，所述DNA可用甲基化依赖性或甲基化敏感性限制酶消化，完整DNA可使用与接头序列杂交的引物扩增。在一些实施方案中，可实施第二步骤来测定DNA的扩增池中特定基因的存在、缺失或量。在一些实施方案中，使用实时定量PCR来扩增DNA。

在一些实施方案中，所述方法包括量化基因组DNA群体内的靶序列中的平均甲基化密度。在一些实施方案中，所述方法包括使基因组DNA与甲基化依赖性限制酶或甲基化敏感性限制酶在允许基因座中至少一些潜在的限制酶切割位点的拷贝保持未切割的条件下接触；量化基因座的完整拷贝；并将扩增产物的量与代表对照DNA甲基化的量的对照值比较，由此相比于对照DNA的甲基化密度量化基因座中的平均甲基化密度。

DNA基因座的甲基化的量可通过以下来测定：提供包含该基因座的基因组DNA样品，将DNA用甲基化敏感或甲基化依赖性的限制酶切割，然后在感兴趣的DNA基因座处量化完整DNA的量或量化切割DNA的量。完整或切割DNA的量将依赖于含有该基因座的基因组DNA的起始量，基因座中甲基化的量，和在基因组DNA中甲基化的基因座中核苷酸的数目(即部分)。DNA基因座中的甲基化量可通过将完整DNA或切割DNA的量与在类似处理的DNA样品中代表完整DNA或切割DNA的量的对照值比较来测定。对照值能代表已知或预测数目的甲基化核苷酸。或者，对照值能代表来自另一种细胞(例如正常、未患病的)中的同一基因座或第二基因座的完整或切割DNA的量。

通过在允许基因座中至少一些潜在的限制酶切割位点的拷贝保持未切割的条件下使用甲基化敏感性或甲基化依赖性限制酶，随后量化剩余的完整拷贝，并将该量与对照比较，能测定基因座的平均甲基化密度。如果使甲基化敏感性限制酶与DNA基因座的拷贝在允许基因座中至少一些潜在的限制酶切割位点的拷贝保持未切割的条件下接触，那么剩余的完整DNA将与甲基化密度直接成比例，如此可与对照比较来测定样品中基因座的相对甲基化密度。类似地，如果使甲基化依赖性限制酶与DNA基因座的拷贝在允许基因座中至少一些潜在的限制酶切割位点的拷贝保持未切割的条件下接触，那么剩余的完整DNA将与甲基化密度成反比，如此可与对照比较来测定样品中基因座的相对甲基化密度。这类测定法披露在例如美国专利申请Ser.No.10/971,986中。

在一些实施方案中，可使用定量扩增方法(例如定量PCR或定量线性扩增)来量化限制性消化后由扩增引物侧接的基因座中完整DNA的量。定量扩增的方法披露于例如美国专利No.6,180,349；6,033,854；和5,972,602，以及例如Gibson等,Genome Research6:995-1001(1996)；DeGraves等,Biotechniques34(1):106-10,112-5(2003)；Deiman B等,Mol Biotechnol.20(2):163-79(2002)。

用于检测DNA甲基化的其他方法可牵涉在用亚硫酸氢盐处理DNA之前和之后的基因组测序。参见例如，Frommer等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:1827-1831(1992)。当将亚硫酸氢钠与DNA接触时，未甲基化的胞嘧啶被转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不被修饰。

在一些实施方案中，将从亚硫酸氢盐转化后的DNA扩增的PCR产物的限制酶消化用于检测DNA甲基化。参见例如，Sadri&Hornsby,Nucl.Acids Res.24:5058-5059(1996)；Xiong&Laird,Nucleic Acids Res.25:2532-2534(1997)。

在一些实施方案中，单独或与其他方法组合地使用MethyLight测定法来检测DNA甲基化(参见Eads等,Cancer Res.59:2302-2306(1999))。简言之，在MethyLight方法中，基因组DNA在亚硫酸氢钠反应中转化(亚硫酸氢盐方法将未甲基化的胞嘧啶残基转化成尿嘧啶)。然后，实施感兴趣DNA序列的扩增，其使用与CpG二核苷酸杂交的PCR引物。通过使用仅与得自未甲基化DNA的亚硫酸氢盐转化的序列(或者与未转化的甲基化序列)杂交的引物，扩增可指示引物杂交之处序列的甲基化状态。类似地，扩增产物可使用一种探针检测，该探针特异性结合得自未甲基化(或甲基化)DNA的亚硫酸氢盐处理的序列。如果期望的话，可将两种引物和探针均用于检测甲基化状态。如此，用于与MethyLight使用的试剂盒可包括亚硫酸氢钠以及在经亚硫酸氢盐处理的甲基化和未甲基化DNA之间区分的引物或可检测标记的探针(包括但不限于Taqman或分子信标探针)。其他试剂盒组分可包括，例如DNA扩增所需的试剂，包括但不限于PCR缓冲液、脱氧核苷酸；和热稳定的聚合酶。

在一些实施方案中，单独或与其他方法组合地使用Ms-SNuPE(甲基化敏感性单核苷酸引物延伸，Methylation-sensitive Single Nucleotide PrimerExtension)来检测DNA甲基化(参见Gonzalgo&Jones Nucleic Acids Res.25:2529-2531(1997))。Ms-SNuPE技术是用于基于DNA的亚硫酸氢盐处理来评估特定CpG位点处的甲基化差异，接着是单核苷酸引物延伸的定量方法。简言之，使基因组DNA与亚硫酸氢钠反应来将未甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，而留下5-甲基胞嘧啶不变。然后使用特异于经亚硫酸氢盐转化的DNA的PCR引物来实施对期望靶序列的扩增，将所得产物分离并用作在感兴趣的CpG位点处甲基化分析的模板。

在一些实施方案中，单独或与其他方法组合地使用甲基化特异性PCR(“MSP”)反应来检测DNA甲基化。MSP测定法必须首先通过亚硫酸氢钠来修饰DNA，将所有未甲基化的而非甲基化的胞嘧啶转化成尿嘧啶，随后使用特异于甲基化相对于未甲基化DNA的引物进行扩增。参见，Herman等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:9821-9826,(1996)；美国专利No.5,786,146。在一些实施方案中，DNA甲基化通过QIAGEN PyroMark CpG Assay预设计的焦磷酸测序DNA甲基化测定法检测。

在一些实施方案中，使用高通量DNA甲基化分析来测定细胞甲基化状态以确定对EGFR抑制剂的敏感性。简言之，从细胞或组织样品(例如肿瘤样品或血液样品)分离基因组DNA并在亚硫酸氢钠反应中转化(亚硫酸氢盐方法将未甲基化的胞嘧啶残基转化成尿嘧啶)，其使用本领域中的标准测定法。将经亚硫酸氢盐转化的DNA产物扩增、片段化并与含有来自整个基因组的CpG位点的阵列杂交，其使用本领域中的标准测定法。杂交后，将阵列成像，并使用本领域中的标准测定法处理用于分析DNA甲基化状态。在一些实施方案中，所述组织样品是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。在一些实施方案中，所述组织样品是新鲜冷冻的组织。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前将从组织样品分离的DNA预扩增。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前将从组织样品分离的DNA预扩增，其通过使用InvitrogenSuperscript III One-Step RT-PCR系统和Platinum Taq。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前使用基于Taqman的测定法将从组织样品分离的DNA预扩增。在一些实施方案中，所述亚硫酸氢钠反应使用Zymo EZ DNA甲基化试剂盒进行。在一些实施方案中，扩增经亚硫酸氢盐转化的DNA并与阵列杂交，其使用Illumina Infinium HumanMethylation450Beadchip试剂盒。在一些实施方案中，将阵列在Illumina iScan Reader上成像。在一些实施方案中，将图像用GenomeStudio软件甲基化模块处理。在一些实施方案中，使用Bioconductorlumi软件程序包来分析甲基化数据。参见Du等,Bioinformatics,24(13):1547-1548(2008)。

在一些实施方案中，使用亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)鉴定DNA甲基化位点以确定对EGFR抑制剂的敏感性。简言之，从细胞或组织样品(例如肿瘤样品或血液样品)分离基因组DNA并在亚硫酸氢钠反应中转化(该亚硫酸氢盐方法将未甲基化的胞嘧啶残基转化成尿嘧啶)，其使用本领域中的标准测定法。将经亚硫酸氢盐转化的DNA产物用设计为特异于经亚硫酸氢盐转化的DNA的引物(例如亚硫酸氢盐特异性引物)扩增并连接到载体中用于转化到宿主细胞中，其使用本领域中的标准测定法。在选出含有PCR扩增的、经亚硫酸氢盐转化的、感兴趣的DNA产物的宿主细胞之后，分离DNA产物并测序以确定甲基化的位点，其使用本领域中的标准测定法。在一些实施方案中，所述组织样品是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。在一些实施方案中，所述组织样品是FFPE组织，其已经过处理用于IHC分析；例如针对基因表达。在一些实施方案中，所述组织样品是通过IHC显示极少或无基因表达的FFPE组织。在一些实施方案中，所述组织样品是新鲜冷冻的组织。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前将从组织样品分离的DNA预扩增。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前将从组织样品分离的DNA预扩增，其使用Invitrogen Superscript III One-Step RT-PCR系统和Platinum Taq。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前使用基于Taqman的测定法将从组织样品分离的DNA预扩增。在一些实施方案中，所述亚硫酸氢钠反应使用Zymo EZ DNA甲基化金试剂盒进行。在一些实施方案中，设计为特异于经亚硫酸氢盐转化的DNA的引物是使用Applied Biosystems Methyl Primer Express软件设计的。在一些实施方案中，所述亚硫酸氢盐转化的DNA产物是使用InvitrogenSuperscript III One-Step RT-PCR System和Platinum Taq PCR扩增的。在进一步的实施方案中，PCR扩增的、经亚硫酸氢盐转化的DNA产物使用InvitrogenTOPO TA克隆试剂盒连接到载体中。在一些实施方案中，宿主细胞是细菌。在一些实施方案中，分离的PCR扩增的、经亚硫酸氢盐转化的、感兴趣的DNA产物使用Applied Biosystems3730x1DNA Analyzer测序。在一些实施方案中，设计为特异于经亚硫酸氢盐转化的DNA的引物是使用Qiagen PyroMarkAssay Design软件设计的。在一些实施方案中，经亚硫酸氢盐转化的DNA产物是使用Invitrogen Superscript III One-Step RT-PCR System和Platinum TaqPCR扩增的。在进一步的实施方案中，PCR扩增的、经亚硫酸氢盐转化的DNA产物使用Qiagen Pyromark Q24测序并用Qiagen PyroMark软件分析。

在一些实施方案中，使用定量甲基化特异性PCR(QMSP)来鉴定DNA甲基化位点以确定对EGFR抑制剂的敏感性。简言之，从细胞或组织样品分离基因组DNA并在亚硫酸氢钠反应中转化(该亚硫酸氢盐方法将未甲基化的胞嘧啶残基转化成尿嘧啶)，其使用本领域中的标准测定法。在一些实施方案中，所述组织样品是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。在一些实施方案中，所述组织样品是FFPE组织，其已经过处理用于IHC分析。在一些实施方案中，所述组织样品是通过IHC显示极少或无基因表达的FFPE组织。在一些实施方案中，所述组织样品是新鲜冷冻的组织。经亚硫酸氢盐转化的DNA产物是使用设计为特异于经亚硫酸氢盐转化的DNA的引物(例如定量甲基化特异性PCR引物)扩增的。将经亚硫酸氢盐转化的DNA产物使用定量甲基化特异性PCR引物扩增并分析甲基化，其使用本领域中的标准测定法。在一些实施方案中，所述组织样品是福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织。在一些实施方案中，所述组织样品是新鲜冷冻的组织。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前将从组织样品分离的DNA预扩增，其使用InvitrogenSuperscript III One-Step RT-PCR系统和Platinum Taq。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前将从组织样品分离的DNA预扩增。在一些实施方案中，在亚硫酸氢盐转化前使用基于Taqman的测定法将从组织样品分离的DNA预扩增。在一些实施方案中，所述亚硫酸氢钠反应使用商品化的试剂盒进行。在一些实施方案中，所述亚硫酸氢钠反应使用Zymo EZ DNA甲基化金试剂盒进行。在一些实施方案中，设计为特异于经亚硫酸氢盐转化的DNA的引物是使用Applied Biosystems Methyl Primer Express软件设计的。在一些实施方案中，经亚硫酸氢盐转化的DNA是使用基于Taqman的测定法扩增的。在一些实施方案中，在Applied Biosystems7900HT上扩增经亚硫酸氢盐转化的DNA并使用Applied Biosystems SDS软件分析。

在一些实施方案中，本发明提供测定甲基化的方法，其通过1)对肿瘤样品的IHC分析，接着是2)对从步骤1的IHC分析中使用的肿瘤组织提取的DNA的定量甲基化特异性PCR。简言之，通过以下两种方法之一从IHC载玻片移去盖玻片：将载玻片置于冷冻器中达至少15分钟，然后使用剃刀片从显微镜载玻片撬开盖玻片。然后，将载玻片在二甲苯中室温温育以溶解封固剂。或者，将载玻片浸泡在二甲苯中直至盖玻片脱落。这可能占用数天。所有载玻片都通过5分钟二甲苯(x3)和5分钟100％乙醇(x2)的脱石蜡化规程。将组织用剃刀片从载玻片刮下，置于含有蛋白酶K的组织裂解缓冲液中，并在56℃过夜温育。在其中组织在温育后仍然存在的情况中，可再添加10μl蛋白酶K，并将组织再温育30分钟。继续DNA提取；例如通过使用QIAampDNA FFPE组织试剂盒。对从IHC载玻片直接提取的DNA进行QMSP分析，其使用如上文描述的QMSP3引物和探针。

在一些实施方案中，通过深度测序来对经亚硫酸氢盐转化的DNA测序。深度测序是其中多次读序列的方法，如直接焦磷酸测序。深度测序可用于检测稀有事件如稀有突变。对有限数目基因座的超深度测序可通过对PCR产物的直接焦磷酸测序和通过在单次运行中对超过100种PCR产物测序来实现。在对经亚硫酸氢盐转化的DNA测序中的挑战源于其在胞嘧啶残基到胸腺嘧啶(尿嘧啶)残基的亚硫酸氢盐转化后的低序列复杂性。可引入降低代表性亚硫酸氢盐测序(Reduced representation bisulphite sequencing，RRBS)来减少序列冗余，其通过仅选择基因组的一些区域来通过DNA片段的大小-分断分离(size-fractionation)测序(Laird,PW Nature Reviews11:195-203(2010))。靶向可通过在测序前阵列捕捉或挂锁捕捉(padlock capture)来完成。例如，在固定阵列上或通过溶液杂交选择的靶向性捕捉能富集DNA或RNA寡核苷酸库靶向的序列并且可在亚硫酸氢盐转化之前或之后实施。或者，挂锁捕捉提供改进的富集效率，其通过组合两种系留探针的增加的退火特异性，随后使用通用引物来进行扩增，其允许比使用基因座特异性引物扩增更均一的代表性。

其他甲基化检测方法包括但不限于，甲基化的CpG岛扩增(参见Toyota等,Cancer Res.59:2307-12(1999))和记载于例如美国专利公开文本2005/0069879；Rein等,Nucleic Acids Res.26(10):2255-64(1998)；Olek等,NatGenet.17(3):275-6(1997)；Laird,PW Nature Reviews11:195-203(2010)；和PCT公开文本No.WO00/70090)的那些。

DNA甲基化水平可由甲基化指标表示为甲基化的DNA拷贝数(循环次数)对参照基因的循环次数(其等同扩增甲基化和非甲基化靶物)的比率。高水平的DNA甲基化可通过比较非赘生性细胞的样品(特别是相同组织类型的或来自外周血单个核细胞的)中的DNA甲基化水平来测定。在一个具体的实施方案中，特定基因中的高水平DNA甲基化可在相比于正常细胞中更高的水平检测到。在另一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约2倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约3倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约4倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约5倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约6倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约7倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约8倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约9倍或更高。在一个具体的实施方案中，高水平的DNA甲基化相比于正常细胞中为约10倍或更高。

“低甲基化”意指可能甲基化的CpG位点中多数是未甲基化的。在某些实施方案中，低甲基化意指基因的一部分中低于50％、低于45％、低于40％、低于35％、低于30％、低于25％、低于20％、低于15％、低于10％、低于5％、或低于1％的可能的甲基化位点是甲基化的。在再一个实施方案中，低甲基化意指相比于在正常水平例如在非肿瘤细胞中表达的基因，更少的可能甲基化的位点是甲基化的。在另一个实施方案中，低甲基化意指没有一个CpG位点是甲基化的。

“高甲基化”意指可能甲基化的CpG位点中多数是甲基化的。在某些实施方案中，高甲基化意指基因的一部分中高于50％、高于55％、高于60％、高于65％、高于70％、高于75％、高于80％、高于85％、高于90％、高于95％、或高于99％的可能的甲基化位点是甲基化的。在再一个实施方案中，高甲基化意指相比于在正常水平例如在非肿瘤细胞中表达的基因，更多的可能甲基化的位点是甲基化的。在另一个实施方案中，高甲基化意指所有的CpG位点是甲基化的。

在一些实施方案中，通过评估细胞中的mRNA来测定细胞中的生物标志物表达。用于评估细胞中mRNA的方法是公知的，且包括例如使用互补DNA探针的杂交测定法(如使用特异于一种或多种基因的经标记riboprobe的原位杂交、Northern印迹和相关技术)和各种核酸扩增测定法(如RT-PCR，其使用特异于一种或多种基因的互补引物，和其他扩增类型检测方法如例如分支的DNA、SISBA、TMA等)。在一些实施方案中，比较生物标志物在测试样品与参照样品中的表达。例如，测试样品可以是肿瘤组织样品，参照样品可以是来自正常组织或细胞如PBMC。

来自哺乳动物的样品可使用Northern、点印记或PCR分析方便地测定。另外，这类方法可包括允许测定生物学样品中靶mRNA的水平的一个或多个步骤(例如通过同时检查“看家”基因如肌动蛋白家族成员的比较性对照mRNA序列的水平)。任选地，可测定扩增的靶cDNA的序列。

本发明的任选方法包括在组织或细胞样品中通过微阵列技术来检查或检测mRNA如靶mRNA的方案。使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品逆转录并标记以生成cDNA探针。然后，将探针与固定化在固体支持物上的核酸阵列杂交。阵列配置为使得阵列的每个成员的序列和位置都是已知的。例如，可将其表达与抗血管生成疗法的增加或降低的临床益处相关的基因选择排列在固体支持物上。经标记探针与特定阵列成员的杂交指示该探针来源的样品表达该基因。

依照一些实施方案，通过观察前述基因的蛋白质表达水平来测量存在和/或水平/量。在某些实施方案中，所述方法包括使生物学样品与针对本文中描述的生物标志物的抗体在允许生物标志物结合的条件下接触，并检测抗体与生物标志物之间是否形成复合物。这类方法可以是体外或体内方法。

在某些实施方案中，使用IHC和染色方案来检查样品中生物标志蛋白的存在和/或水平/量。已显示组织切片的IHC染色是测定或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。在一个方面，使用包括以下的方法测定生物标志物的水平，包括：(a)使用抗体实施对样品(如受试者癌症样品)的IHC分析；并b)测定样品中生物标志物的水平。在一些实施方案中，相对于参照值测定IHC染色强度。

IHC可与另外的技术如形态学染色和/或荧光原位杂交组合实施。IHC有两种一般性方法；直接和间接测定法。依照第一种测定法，直接测定抗体对靶抗原的结合。该直接测定法使用经标记的试剂，如荧光标签或酶标记的一抗，其可以在没有别的抗体相互作用的情况下可视化。在典型的间接测定法中，未缀合的一抗结合抗原，然后经标记的二抗结合该一抗。在二抗缀合于酶标记物的情况下，添加生色或产荧光底物以提供抗原的可视化。发生信号扩增，因为几个二抗可以与一抗上的不同表位反应。

用于IHC的一抗和/或二抗通常用可检测模块标记。存在大量标记，其一般可分组成以下类别：(a)放射性同位素，如³⁵S、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I；(b)胶体金颗粒；(c)荧光标记物，包括但不限于稀土螯合物(铕螯合物)、TexasRed、罗丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺(Lissamine)、伞形酮(umbelliferone)、藻红蛋白(phycocrytherin)、藻蓝蛋白、或商品化的荧光团如SPECTRUMORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述任意一种或多种的衍生物；(d)存在各种酶-底物标记物，且美国专利No.4,275,149提供了对其中一些的综述。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利No.4,737,456)、萤光素、2,3-二氢酞嗪二酮(dihydrophthalazinedione)、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶(lactoperoxidase)、微过氧化物酶(microperoxidase)等。

酶-底物组合的例子包括，例如辣根过氧化物酶(HRPO)和作为底物的过氧化氢酶；碱性磷酸酶(AP)和作为生色底物的对硝基苯基磷酸；和β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如对硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或产荧光底物(例如4-甲基伞形基(methylumbelliferyl)-β-D-半乳糖苷酶)。对于这些的一般性综述，参见美国专利No.4,275,149和4,318,980。

可将如此制备的标本封固并盖上盖玻片。然后确定载玻片评估，例如使用显微镜，并可采用本领域中常规使用的染色强度标准。在一些实施方案中，约1+或更高的染色模式得分是诊断性和/或预后性的。在某些实施方案中，IHC测定法中约2+或更高的染色模式得分是诊断性和/或预后性的。在其他实施方案中，约3或更高的染色模式得分是诊断性和/或预后性的。在一个实施方案中，理解当使用IHC检查来自肿瘤或结肠腺瘤的细胞和/或组织时，通常在肿瘤细胞和/或组织中测定或评估染色(相对于可能存在于样品中的基质或周围组织)。

在备选的方法中，可使样品与特异于生物标志物的抗体在足以形成抗体-生物标志物复合物的条件下接触，然后检测该复合物。可以许多途径来检测生物标志物的存在，如通过Western印迹和ELISA规程，其用于测定很多种组织和样品，包括血浆或血清。有大量使用这类测定形式的免疫测定技术，参见例如美国专利No.4,016,043、4,424,279和4,018,653。这些包括非竞争型的单位点和双位点二者或“三明治式”测定法，以及传统的竞争性结合测定法。这些测定法还包括经标记抗体对靶生物标志物的直接结合。

选定的生物标志物在组织或细胞样品中的存在和/或水平/量还可经由功能性或基于活性的测定法来检查。例如，如果生物标志物是酶，可以进行本领域中已知的测定法来测定或检测给定的酶活性在组织或细胞样品中的存在。

在某些实施方案中，针对测定的生物标志物的量中的差异和使用的样品质量中的可变性，以及测定轮数之间的变异性两者将样品标准化。这类标准化可通过检测并纳入特定标准化生物标志物(包括公知的看家基因如ACTB)水平来实现。或者，标准化可基于所有测定基因或其较大子集的均值或中值信号(全局标准化办法)。在一个基因接一个基因的基础上，将受试者肿瘤mRNA或蛋白质的测量的经标准化的量与在参照集中发现的量比较。每种mRNA或蛋白质每份测试肿瘤每位受试者的经标准化表达水平可表示为在参照集中测量的表达水平的百分数。在要分析的特定受试者样品中测量的存在和/或表达水平/量将落在该范围内的某个百分数处，这可通过本领域中公知的方法来测定。

在某些实施方案中，如下测定基因的相对表达水平：

相对表达基因1样品1＝2exp(Ct看家基因–Ct基因1)，Ct在样品中测定。

相对表达基因1参照RNA＝2exp(Ct看家基因–Ct基因1)，Ct在参照样品中测定。

标准化的相对表达基因1样品1＝(相对表达基因1样品1/相对表达基因1参照RNA)x100

Ct是阈值循环。Ct是反应中生成的荧光与阈值线相交的循环数。

将所有实验均对参照RNA标准化，参照RNA是来自各种组织来源的RNA的广泛混合物(例如参照RNA#636538，来自Clontech,Mountain View,CA)。将等同的参照RNA包含在每次qRT-PCR运行中，从而允许在不同的实验轮之间比较结果。

在一个实施方案中，所述样品是临床样品。在另一个实施方案中，所述样品用在诊断性测定法中。在一些实施方案中，所述样品从原发性或转移性肿瘤获得。经常使用组织活组织检查(biopsy)来获得肿瘤组织的代表性的片/块。或者，可以以已知或认为含有感兴趣肿瘤细胞的组织或流体的形式间接获得肿瘤细胞。例如，可通过切除、支气管镜检、细针抽吸、支气管刷检、或从痰、胸膜液或血液获得肺癌损伤的样品。在一些实施方案中，所述样品包括循环的肿瘤细胞；例如血液、尿液或痰中的循环癌细胞。可从癌症或肿瘤组织或从其他身体样品如尿液、痰、血清或血浆检测基因或基因产物。上文论述的用于检测癌性样品中靶基因或基因产物的相同技术可应用于其他身体样品。癌细胞可能从癌损伤脱落并出现在这类身体样品中。通过筛选这类身体样品，可实现对这些癌症的简单的早期诊断。另外，通过测试这类身体样品中的靶基因或基因产物能更容易地监测治疗的进展。

在某些实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自同一受试者或个体的单一样品或组合的多重样品，其在不同于获得测试样品时的一个或多个时间点获得。例如，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织在早于获得测试样品时的时间点从同一受试者或个体获得。如果参照样品在癌症的初始诊断期间获得而测试样品在癌症变成转移性时的更晚时候获得，那么这类参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织可以是有用的。

在某些实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自一个或多个并非该受试者或个体的健康个体的组合的多重样品。在某些实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自患有疾病或病症(例如癌症)的、并非该受试者或个体的一个或多个个体的组合的多重样品。在某些实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自并非该受试者或个体的一个或多个个体的正常组织的合并RNA样品或合并的血浆或血清样品。在某些实施方案中，参照样品、参照细胞、参照组织、对照样品、对照细胞或对照组织是来自患有疾病或病症(例如癌症)的、并非该受试者或个体的一个或多个个体的肿瘤组织的合并RNA样品或合并的血浆或血清样品。

在本发明的方法中，组织样品可以是体液或排泄物如血液、尿液、唾液、粪、胸膜液、淋巴液、痰、腹水、前列腺液、脑脊髓液(CSF)、或任何其他的身体分泌物或其衍生物。血液意为包括全血液、血浆、血清或血液的任何衍生物。在其中侵入性取样方法不适宜或不方便的情况下，有时可优选在这类体液或排泄物中评估肿瘤上皮或间充质生物标志物。

在本发明的方法中，肿瘤细胞可以是肺癌肿瘤细胞(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、胰腺癌肿瘤细胞、乳腺癌肿瘤细胞、头和颈癌肿瘤细胞、胃癌肿瘤细胞、结肠癌肿瘤细胞、卵巢癌肿瘤细胞、或来自如下文中描述的多种其他癌症中任一种的肿瘤细胞。所述肿瘤细胞优选为已知或预期表达EGFR的类型，来自实体肿瘤的所有肿瘤细胞均如此。EGFR激酶可以是野生型或突变体形式。

在本发明的方法中，肿瘤可以是肺癌肿瘤(例如非小细胞肺癌(NSCLC))、胰腺癌肿瘤、乳腺癌肿瘤、头和颈癌肿瘤、胃癌肿瘤、结肠癌肿瘤、卵巢癌肿瘤、或来自如下文中描述的多种其他癌症中任一种的肿瘤。所述肿瘤优选为其细胞已知或预期表达EGFR的类型，如所有实体肿瘤均如此。EGFR可以是野生型或突变体形式。

抑制剂和药物组合物

适用于本发明的例示性EGFR激酶抑制剂包括，例如喹唑啉EGFR激酶抑制剂、吡啶并嘧啶EGFR激酶抑制剂、嘧啶并嘧啶EGFR激酶抑制剂、吡咯并嘧啶EGFR激酶抑制剂、吡唑并嘧啶EGFR激酶抑制剂、苯基氨基-嘧啶EGFR激酶抑制剂、羟吲哚EGFR激酶抑制剂、indolocarbazole EGFR激酶抑制剂、酞嗪EGFR激酶抑制剂、异黄酮EGFR激酶抑制剂、quinalone EGFR激酶抑制剂、和tyrphostin EGFR激酶抑制剂，如记载于以下专利公开文本的那些，和EGFR激酶抑制剂的所有药学可接受的盐和溶剂合物：国际专利公开文本No.WO 96/33980、WO 96/30347、WO 97/30034、WO 97/30044、WO 97/38994、WO 97/49688、WO 98/02434、WO 97/38983、WO 95/19774、WO 95/19970、WO 97/13771、WO 98/02437、WO 98/02438、WO 97/32881、WO 98/33798、WO 97/32880、WO 97/3288、WO 97/02266、WO 97/27199、WO 98/07726、WO 97/34895、WO 96/31510、WO 98/14449、WO 98/14450、WO 98/14451、WO 95/09847、WO 97/19065、WO 98/17662、WO 99/35146、WO 99/35132、WO 99/07701和WO 92/20642；欧洲专利申请No.EP 520722、EP 566226、EP787772、EP 837063和EP 682027；美国专利No.5,747,498、5,789,427、5,650,415和5,656,643；和德国专利申请No.DE 19629652。低分子量EGFR激酶抑制剂的其他非限制性例子包括Traxler,P.,1998,Exp.Opin.Ther.Patents8(12):1599-1625中描述的任何EGFR激酶抑制剂。

可依照本发明使用的低分子量EGFR激酶抑制剂的特定优选的例子包括[6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(亦称为OSI-774、厄洛替尼或TARCEVA^TM(厄洛替尼HCl)；OSIPharmaceuticals/Genentech/Roche)(美国专利No.5,747,498；国际专利公开文本No.WO 01/34574和Moyer,J.D.等(1997)Cancer Res.57:4838-4848)；CI-1033(之前已知为PD183805；Pfizer)(Sherwood等,1999,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.40:723)；PD-158780(Pfizer)；AG-1478(University of California)；CGP-59326(Novartis)；PKI-166(Novartis)；EKB-569(Wyeth)；GW-2016(亦称为GW-572016或二甲苯磺酸拉帕替尼(lapatinib ditosylate)；GSK)；和吉非替尼(亦称为ZD1839或IRESSA^TM；Astrazeneca)(Woodburn等,1997,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.38:633)。可依照本发明使用的一种特别优选的低分子量EGFR激酶抑制剂是[6,7-二(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基苯基)胺(即厄洛替尼)、其盐酸盐(即厄洛替尼HCl，TARCEVA^TM)、或其他盐形式(例如甲磺酸(mesylate)厄洛替尼)。

基于抗体的EGFR激酶抑制剂包括任何抗EGFR抗体或抗体片段，其能部分或完全地阻断EGFR通过其天然配体的活化。基于抗体的EGFR激酶抑制剂的非限制性例子包括记载于Modjtahedi,H.,等,1993,Br.J.Cancer67:247-253；Teramoto,T.,等,1996,Cancer77:639-645；Goldstein等,1995,Clin.Cancer Res.1:1311-1318；Huang,S.M.,等,1999,Cancer Res.15:59(8):1935-40；和Yang,X.,等,1999,Cancer Res.59:1236-1243的那些。如此，EGFR激酶抑制剂可以是单克隆抗体Mab E7.6.3(Yang,X.D.等(1999)Cancer Res.59:1236-43)、或MabC225(ATCC登录号HB-8508)，或具有其结合特异性的抗体或抗体片段。适宜的单克隆抗体EGFR激酶抑制剂包括但不限于IMC-C225(亦称为西妥昔单抗或ERBITUX^TM；Imclone Systems)、ABX-EGF(Abgenix)、EMD 72000(Merck KgaA,Darmstadt)、RH3(York Medical Bioscience Inc.)和MDX-447(Medarex/Merck KgaA)。

本发明的方法可扩展至抑制EGFR和其他靶物的那些化合物。这些化合物在本文中称为“双特异性抑制剂”。在一个实施方案中，所述双特异性抑制剂是双特异性HER3/EGFR、EGFR/HER2、EGFR/HER4或EGFR c-Met抑制剂。在一个实施方案中，所述双特异性抑制剂是双特异性抗体。在一个实施方案中，所述双特异性抑制剂是包含特异性结合EGFR和第二靶物的抗原结合域的双特异性抗体。在一个实施方案中，所述双特异性抑制剂是包含特异性结合HER3和EGFR的抗原结合域的双特异性抗体。在一个实施方案中，所述双特异性HER3/EGFR抑制剂是包含两个等同抗原结合域的双特异性抗体。这类抗体记载于US 8,193,321、20080069820、WO2010108127、US20100255010和Schaefer等,Cancer Cell,20:472-486(2011)。在一个实施方案中，所述双特异性HER2/EGFR是拉帕替尼/GW572016。

可依照已知方法产生另外的基于抗体的抑制剂，其通过将适宜的抗原或表位施用给选定的宿主动物，例如猪、牛、马、家兔、山羊、绵羊和小鼠等。可将本领域中已知的各种佐剂用于增强抗体生成。

尽管可用于实践本发明的抗体可以是多克隆的，但优选单克隆抗体。可使用通过培养连续细胞系提供抗体分子生成的任何技术来制备并分离单克隆抗体。用于生成和分离的技术包括但不限于，最初由Kohler和Milstein描述的杂交瘤技术(Nature,1975,256:495-497)；人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等,1983,Immunology Today4:72；Cote等,1983,Proc.Nati.Acad.Sci.USA80:2026-2030)；和EBV-杂交瘤技术(Cole等,1985,Monoclonal Antibodies andCancer Therapy,Alan R.Liss,Inc.,pp.77-96)。

或者，可将针对单链抗体生产所描述的技术(参见例如美国专利No.4,946,778)改为适应于产生具有期望特异性的单链抗体。可用于实践本发明的基于抗体的抑制剂还包括抗体片段，包括但不限于F(ab’).sub.2片段，其可通过对完整抗体分子的胃蛋白酶消化生成，和Fab片段，其可通过还原F(ab’).sub.2片段的二硫桥生成。或者，可构建Fab和/或scFv表达库(参见例如Huse等,1989,Science246:1275-1281)以允许快速鉴定出具有期望特异性的片段。

用于生产和分离单克隆抗体和抗体片段的技术是本领域中公知的，且记载于Harlow和Lane,1988,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory和J.W.Goding,1986,Monoclonal Antibodies:Principles andPractice,Academic Press,London。人源化的抗EGFR抗体和抗体片段还可依照已知的技术来制备，如记载于Vaughn,T.J.等,1998,Nature Biotech.16:535-539的那些和其中引用的参考文献，而且这类抗体或其片段也可用于实践本发明。

或者，用于本发明的抑制剂可基于反义寡核苷酸构建体。反义寡核苷酸，包括反义RNA分子和反义DNA分子，将作用于通过对其结合来直接阻断靶mRNA的翻译，并如此预防蛋白质翻译或提高mRNA降解，如此降低细胞中靶蛋白的水平，如此降低活性。例如，可合成至少约15个碱基且与编码EGFR或HER2的mRNA转录本序列的独特区域互补的反义寡核苷酸，例如通过常规的磷酸二酯技术，并通过例如静脉内注射或输注施用。用于使用反义技术来特异性抑制其序列已知的基因的基因表达的方法是本领域中公知的(例如参见美国专利No.6,566,135；6,566,131；6,365,354；6,410,323；6,107,091；6,046,321；和5,981,732)。

小抑制性RNA(siRNA)还可充当用于本发明的抑制剂。可通过以下来降低靶基因表达：使肿瘤、受试者或细胞与小双链RNA(dsRNA)或导致小双链RNA产生的载体或构建体接触，从而使靶基因的表达受到特异性抑制(即RNA干扰或RNAi)。针对其序列已知的基因，用于选择适宜dsRNA或dsRNA编码载体的方法是本领域中公知的(例如参见Tuschi,T.,等(1999)Genes Dev.13(24):3191-3197；Elbashir,S.M.等(2001)Nature411:494-498；Hannon,G.J.(2002)Nature418:244-251；McManus,M.T.和Sharp,P.A.(2002)Nature Reviews Genetics3:737-747；Bremmelkamp,T.R.等(2002)Science296:550-553；美国专利No.6,573,099和6,506,559；和国际专利公开文本No.WO01/36646,WO99/32619和WO01/68836)。

核酶也可充当用于本发明的抑制剂。核酶是能够催化RNA的特异性切割的酶性RNA分子。核酶作用机制牵涉核酶分子对互补性靶RNA的序列特异性杂交，继之以内切核苷酸切割。由此，特异且有效地催化mRNA序列的内切核苷酸切割的工程化的发夹或锤头状基序核酶分子在本发明的范围内可用。初始通过扫描靶分子中的核酶切割位点来鉴定任何潜在RNA靶物内的特异性核酶切割位点，所述位点通常包括以下序列：GUA、GUU和GUC。一旦鉴定出来，即可评估对应于含切割位点的靶基因区域的约15至20个核糖核苷酸的短RNA序列中的使得该寡核苷酸序列不适宜的预测性结构特征，如二级结构。还可通过测试候选靶物对与互补性寡核苷酸杂交的可达性来评估其适宜性，使用例如核糖核酸酶保护测定法。

可通过已知方法来制备可用作抑制剂的反义寡核苷酸和核酶两者。这些包括用于化学合成的技术，如例如通过固相亚磷酰胺化学合成。或者，反义RNA分子可通过编码该RNA分子的DNA序列的体外或体内转录生成。这类DNA序列可掺入很多种载体中，所述载体掺有适宜的RNA聚合酶启动子如T7或SP6聚合酶启动子。可引入对本发明寡核苷酸的各种修饰作为增加胞内稳定性和半衰期的手段。可能的修饰包括但不限于向分子的5'和/或3'端添加核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸的侧翼序列，或在寡核苷酸主链内使用硫代磷酸酯或2’-O-甲基而非磷酸二酯连接。

在本发明治疗方法的背景中，将抑制剂(如EGFR抑制剂)作为包含药学可接受载体和非毒性治疗有效量的EGFR激酶抑制剂化合物(包括其药学可接受的盐)的组合物使用。

术语“药学可接受的盐”指从药学可接受的非毒性碱或酸制备的盐。当本发明的化合物是酸性时，其相应的盐可从药学可接受的非毒性碱方便地制备，包括无机碱或有机碱。从这类无机碱衍生的盐包括铝盐、铵盐、钙盐、铜盐(二价铜和一价铜)、铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、锰盐(三价锰和二价锰)、钾盐、钠盐、锌盐等盐。特别优选的是铵盐、钙盐、镁盐、钾盐和钠盐。源自药学可接受的有机非毒性碱的盐包括伯胺、仲胺或叔胺，以及环胺和经取代胺如天然存在的和合成的经取代胺的盐。其他可从其形成盐的药学可接受的有机非毒性碱包括离子交换树脂如例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N’,N’-联苄基乙撑二胺、二乙胺、2-二乙基氨基乙醇、2-二甲基氨基乙醇、乙醇胺、乙撑二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺(glucamine)、葡糖胺(glucosamine)、组氨酸、hydrabamine、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱(theobromine)、三乙胺(triethylameine)、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇(tromethamine)等。

当用于本发明的化合物是碱性时，其相应的盐可从药学可接受的非毒性酸方便地制备，包括无机或有机酸。这类酸包括例如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸(camphorsulfonic)、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟基乙磺酸(isethionic)、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸(pamoic)、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。特别优选的是柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。

包含作为活性成分的抑制剂化合物(包括其药学可接受的盐)的用于本发明的药物组合物可包含药学可接受的载体和任选地其他治疗成分或佐剂。其他治疗剂可包括那些细胞毒性剂、化疗剂或抗癌剂，或增强这类药剂的效果的药剂，如上文所列的。所述组合物包括适用于口服、直肠、局部和胃肠外(包括皮下、肌内和静脉内)施用的组合物，尽管在任意给定情况中的最适宜的路径将依赖于具体的宿主、和施用活性成分所针对的状况的性质和严重性。药物组合物可以单位剂量形式方便地呈现并通过药学领域中公知的任何方法来制备。

在实践中，本发明的抑制剂化合物(包括其药学可接受的盐)可作为活性成分与药学载体依照常规的药物复合技术组合到密切的混合物中。根据期望用于施用(例如口服或胃肠外(包括静脉内))的制备物的形式，载体可采用很多种形式。如此，本发明的药物组合物可呈现为适用于口服施用的离散单位，如胶囊、扁囊剂(cachet)或片剂，其各自含有预确定量的活性成分。另外，所述组合物可呈现为粉剂、颗粒剂、溶液、水性液体中的混悬剂、非水性液体、水包油乳剂、或油包水液体乳剂。除了上文列出的常见剂量形式以外，抑制剂化合物(包括其每种组分的药学可接受的盐)还可通过受控释放手段和/或投递装置施用。所述组合组合物可通过任何药学方法来制备。一般地，这类方法包括使活性成分与构成一种或多种必要成分的载体产生联合的步骤。一般地，所述组合物通过将活性成分与液体载体或精细分开的固体载体或两者均一且密切混合来制备。然后，产物可方便地成形为期望的呈现物。

本发明中使用的抑制剂化合物(包括其药学可接受的盐)还可以与一种或多种其他治疗活性化合物组合纳入药学组合物中。其他治疗活性化合物可包括那些细胞毒性剂、化疗剂或抗癌剂，或增强这类药剂效果的药剂，如上文列出的。

如此，在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物可包含与抗癌剂组合的抑制剂化合物，其中所述抗癌剂是选自下组的成员：烷化药物、抗代谢物、微管抑制剂、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、抗生素、亚硝基脲、激素疗法、激酶抑制剂、肿瘤细胞凋亡的激活剂、和抗血管生成剂。

采用的药学载体可以是例如固体、液体或气体。固体载体的例子包括乳糖、石膏粉(terra alba)、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯树胶(acacia)、硬脂酸镁和硬脂酸。液体载体的例子是糖浆剂、花生油、橄榄油和水。气态载体的例子包括二氧化碳和氮气。

在针对口服剂量形式的组合物的制备中，可采用任何方便的药学介质。例如，水、二醇、油、醇、增味剂、防腐剂、着色剂等可用于形成口服液体制备物如混悬剂、酏剂和溶液；而载体如淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、颗粒化剂、滑润剂、结合剂、分解剂等可用于形成口服固体制备物如粉剂、胶囊和片剂。由于其易于施用，片剂和胶囊是优选的口服剂量单位，由此采用固体药学载体。任选地，片剂可通过标准的水性或非水性技术包被。

含有用于本发明的组合物的片剂可通过压缩或模塑制备，任选地连同一种或多种附属成分或佐剂。压缩的片剂可通过在合适的机器中压缩来制备，活性成分处于自由流动形式如粉剂或颗粒剂，任选地与结合剂、滑润剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合。模塑的片剂可通过在合适的机器中模塑来制备，将成粉状的化合物的混合物用惰性液体稀释剂加湿。每种片剂优选含有约0.05mg至约5g的活性成分，每种扁囊剂或胶囊优选含有约0.05mg至约5g的活性成分。

例如，意图口服施用给人的配制剂可含有约0.5mg至约5g的活性剂，其与适宜且方便量的载体材料复合，所述载体材料的量可在总组合物的约5至约95个百分数变化。单位剂量形式一般将含有约1mg至约2g活性成分，通常为25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg、或1000mg。

用在本发明中的适用于胃肠外施用的药物组合物可制备为活性化合物在水中的溶液或混悬剂。可纳入合适的表面活性剂，如例如羟丙基纤维素。分散体还可在甘油、液体聚乙二醇及其混合物中，在油中制备。另外，可纳入防腐剂以阻止微生物的有害生长。

在本发明中使用的适合注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液或分散体。此外，组合物可以以供临场制备这类无菌可注射溶液或分散体用的无菌粉剂的形式。在所有情况下，最终可注射形式必须是无菌的，且必须为有效流动的从而得到容易的可注射性。所述药物组合物在制造和存储条件下必须是稳定的；如此，优选应保存为免于微生物如细菌和真菌的污染作用。载体可为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇)、植物油、及其适当混合物的溶剂或分散介质。

本发明的药物组合物可以以适于局部使用的形式，如例如气雾剂、乳膏、软膏剂、洗剂、粉化散剂(dusting powder)等。另外，所述组合物可以以适用于经皮装置中的形式。这些制剂可利用抑制剂化合物(包括其药学可接受的盐)经由常规处理方法制备。例如，乳膏或软膏剂通过将亲水性材料和水与约5wt％至约10wt％的化合物混合在一起以产生具有期望稠度的乳膏或软膏剂来制备。

本发明的药物组合物可以以适用于直肠施用的形式，其中载体是固体。优选混合物形成单位剂量栓剂。合适的载体包括可可脂和本领域中普遍使用的其他材料。可通过以下便利地形成栓剂，首先将组合物与软化或熔解的载体混合，接着在模具中冷却并成形。

除了前述载体成分外，上文描述的药物制剂在适宜时还可包含一种或多种其他载体成分如稀释剂、缓冲剂、增味剂、结合剂、表面活性剂、增稠剂、滑润剂、防腐剂(包括抗氧化物)等。此外，可纳入其他佐剂以使得所述制剂与意图受体的血液等渗。还可以粉剂或液体浓缩物形式制备含有抑制剂化合物(包括其药学可接受的盐)的组合物。

用于实践本发明的化合物的剂量水平将大概如本文中描述的，或如本领域中对这些化合物描述的。然而，理解对任何具体患者的特定剂量水平将依赖于多种因素，包括年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、施用路径、排泄速率、药物组合和进行治疗的具体疾病的严重性。

本领域中已知的许多备选的实验方法可成功地取代在实践本发明时本文中具体描述的那些，如例如记载于本发明相关技术领域中可获的许多优秀的手册和教科书中的(例如Using Antibodies,A Laboratory Manual,Harlow,E.和Lane,D.编,1999,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(例如ISBN0-87969-544-7)；Roe B.A.等1996,DNA Isolation and Sequencing(EssentialTechniques Series),John Wiley&Sons.(例如ISBN0-471-97324-0)；Methods inEnzymology:Chimeric Genes and Proteins",2000,ed.J.Abelson,M.Simon,S.Emr,J.Thorner.Academic Press；Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001,3rd Edition,由Joseph Sambrook和Peter MacCallum,(以前的ManiatisCloning manual)(例如ISBN0-87969-577-3)；Current Protocols in MolecularBiology,Ed.Fred M.Ausubel,等John Wiley&Sons(例如ISBN0-471-50338-X)；Current Protocols in Protein Science,Ed.John E.Coligan,JohnWiley&Sons(例如ISBN0-471-11184-8)；和Methods in Enzymology:Guide toprotein Purification,1990,Vol.182,Ed.Deutscher,M.P.,Acedemic Press,Inc.(例如ISBN0-12-213585-7))，或如致力于描述分子生物学中的实验方法的许多大学和商业性网站上描述的。

医学领域中的普通技术人员将领会，在诊断患者对抑制剂的可能的响应性之后，对患者施用治疗有效量的如本文中描述的抑制剂(例如EGFR激酶抑制剂、双特异性EGFR激酶抑制剂或HER2抑制剂)的确切方式将由主治医师的判断而定。施用的模式，包括剂量、与其他抗癌剂的组合、施用时机和频率等可能受到患者对抑制剂的可能响应性的诊断，以及患者的状况和病史的影响。如此，甚至诊断为患有预测对抑制剂类型相对不敏感的肿瘤的患者仍可能受益于使用这类抑制剂治疗，特别是在与其他抗癌剂或可能改变对抑制剂的肿瘤敏感性的药剂组合时。

就本发明而言，抑制剂与其他抗癌剂“的共施用”和将抑制剂与其他抗癌剂“共施用”(两种组分在后文中均称为“两种活性药剂”)指两种活性药剂的分开或一起的任何施用，其中两种活性药剂作为设计为获得组合疗法益处的适宜剂量方案的部分施用。如此，两种活性成分可作为同一药物组合物的部分施用，或在分别的药物组合物中施用。所述其他药剂可在抑制剂施用之前、同时或之后施用，或以其一些组合施用。当以重复间期对患者施用抑制剂时，例如在标准的治疗过程期间，所述其他药剂可在每次抑制剂施用之前、同时或之后，或以其一些组合，或相对于抑制剂治疗以不同的间期，或以单一剂量在使用抑制剂的治疗过程之前、期间任何时间、或之后施用。

所述抑制剂通常将以对所治疗患者提供最有效癌症治疗(从功效和安全性角度两者)的剂量方案施用给患者，如本领域中已知的，和如披露在例如国际专利公开文本No.WO 01/34574中的。在进行本发明的治疗方法中，所述抑制剂可以本领域中已知的任何有效方式施用，如通过口服、局部、静脉内、腹膜内、肌内、关节内、皮下、鼻内、眼内、阴道、直肠或皮内路径，根据所治疗的癌症类型、所使用的抑制剂类型(例如，小分子、抗体、RNAi、核酶或反义构建体)、和处方医师的医学判断，如例如基于公开的临床研究结果。

施用的抑制剂的量和抑制剂施用的时机将取决于所治疗患者的类型(种、性别、年龄、重量等)和状况、所治疗疾病或状况的严重性、和施用路径。例如，小分子抑制剂可以范围从0.001至100mg/kg体重每天或每周的剂量以单一或分开的剂量或通过连续输注施用给患者(参见例如，国际专利公开文本No.WO 01/34574)。具体地，厄洛替尼HCl可以范围从5-200mg每天或100-1600mg每周的剂量以单一或分开的剂量或通过连续输注施用给患者。优选的剂量是150mg/天。基于抗体的抑制剂或反义、RNAi或核酶构建体可以范围从0.1至100mg/kg体重每天或每周的剂量以单一或分开的剂量或通过连续输注施用给患者。在一些情况中，在前述范围下限之下的剂量水平可以是更适宜的，而在其他情况中，可采用仍更大的剂量而不导致任何有害的副作用，只要这类更大的剂量首先分成几个小剂量以供在整天施用。

所述抑制剂和其他另外的药剂可通过相同或不同路径分开或一起施用，且以很多种不同的剂量形式施用。例如，所述抑制剂优选口服或胃肠外施用。当抑制剂是厄洛替尼HCl(TARCEVA^TM)时，优选口服施用。抑制剂和其他另外的药剂均可以单一或多剂量施用。

所述抑制剂可与各种药学可接受的惰性载体以片剂、胶囊、锭剂(lozenge)、圆形锭剂(troche)、硬糖(hard candies)、粉剂、喷雾剂、乳膏、软膏(salve)、栓剂、凝胶剂(jellies)、凝胶(gel)、糊剂、洗剂、软膏剂、酏剂、糖浆剂等的形式施用。这类剂量形式的施用可以单剂量或多剂量进行。载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂等。口服药物组合物可适宜地加甜和/或增味。

所述抑制剂可以与各种药学可接受的惰性载体组合在一起以喷雾剂、乳膏、软膏(salve)、栓剂、凝胶剂(jellies)、凝胶(gel)、糊剂、洗剂、软膏剂等的形式。这类剂量形式的施用可以单剂量或多剂量实施。载体包括固体稀释剂或填充剂、无菌水性介质和各种无毒有机溶剂等。

应选择所有包含蛋白质性抑制剂的制剂以避免抑制剂生物学活性的变性和/或降解和损失。

制备包含抑制剂的药学组合物的方法是本领域中已知的，且记载于例如国际专利公开文本No.WO01/34574。就本发明的教导而言，制备包含抑制剂的药学组合物的方法从上文引用的公开出版物和其他已知的参考文献，如Remington's Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,18^th edition(1990)，将是显而易见的。

对于抑制剂的口服施用，将含有一种或两种活性药剂的片剂与多种赋形剂中的任一种例如，微晶纤维素、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸二钙和甘氨酸，连同各种分解剂如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、海藻酸和某些复合硅酸盐，与颗粒化结合剂如聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、明胶和阿拉伯树胶一起组合。另外，滑润剂如硬脂酸镁、月桂醇硫酸钠和滑石对于形成片剂的目的经常极为有用。还可以采用类似类型的固体组合物作为凝胶胶囊中的填充剂；在这一点上，优选的材料还包括乳糖(lactose)或乳糖(milk sugar)以及高分子量聚乙二醇。当期望将水性混悬剂和/或酏剂用于口服施用时，抑制剂可与各种增甜剂或增味剂、着色物质或染料和(若期望的)乳化剂和/或助悬剂，以及这类稀释剂如水、乙醇、聚乙二醇、甘油和其各种类似组合一起组合。

对于一种或两种活性剂的胃肠外施用，可采用在芝麻油或花生油或水性丙二醇中的溶液，以及无菌水性溶液，其包含活性剂或其相应的水溶性盐。这类无菌水性溶液优选是经过适宜缓冲的，且还优选例如用充足的盐水或葡萄糖使之为等渗的。这些具体的水性溶液尤其适用于静脉内、肌内、皮下和腹膜内注射目的。油性溶液适用于关节内、肌内和皮下注射目的。所有这些溶液在无菌条件下的制备是通过本领域技术人员公知的标准药学技术容易实现的。任何选定用于施用蛋白质性抑制剂的胃肠外制剂应选择为避免所述抑制剂生物学活性的变性和损失。

另外，依照标准的药学实践，可能局部施用一种或两种所述活性成分，通过例如乳膏、洗剂、凝胶剂(jellies)、凝胶(gel)、糊剂、软膏剂、软膏(salve)等。例如，可以制备包含约0.1％(w/v)至约5％(w/v)浓度的抑制剂的局部制剂。

对于兽医用目的，可使用上文所述任何形式并通过任何路径将所述活性成分分开或一起地施用给动物。在一个优选的实施方案中，所述抑制剂以胶囊、推注、片剂、大剂量药液(liquid drench)的形式通过注射或作为植入物施用。一个备选方案是，所述抑制剂可与动物饲料一起施用，而出于此目的可制备浓缩的饲料添加剂或预混合物用于正常的动物给料。这类制剂以常规方式依照标准的兽医实践制备。

医学领域，特别是关于诊断性测试的应用和治疗学治疗的医学领域中的技术人员将认可生物学系统可展现出变异性且并非总是完全可预测的，如此许多较好的诊断性测试或治疗学有时是无效的。如此，最终由主治医师基于测试结果、患者状况和病史、及其自身经验的判断来确定个体患者的最适宜的治疗过程。甚至有以下情况，例如，当基于来自诊断测试或来自其他标准的数据肿瘤未预测为对EGFR激酶抑制剂特别敏感时，医师会选择用EGFR抑制剂来治疗患者，尤其是在如果所有或大多数其他明显的治疗选项已经失败，或者预期在与另一种治疗一起施用时有一些协同性的情况下。与癌症治疗中使用的许多其他抗癌药物如更传统的化疗剂或细胞毒性剂相比，EGFR抑制剂作为一类相对耐受较好的药物的事实使其成为更可行的选择。

做广告的方法

本文中的发明还涵盖一种用于为EGFR抑制剂或其药学可接受的组合物做广告的方法，其包括给目标受众宣传抑制剂或其药物组合物治疗患有特征为指示上皮样肿瘤的甲基化模式的癌症类型的患者群体的用途，或给目标受众宣传抑制剂或其药物组合物不用来治疗患有特征为指示间充质样肿瘤的甲基化模式的癌症类型的患者群体的用途。

做广告为经由非个人媒体进行的、通常付费的通讯，其中发起人受到鉴别且信息受到控制。为本文目的的做广告包括宣传、公共关系、产品布置、赞助、保险(underwriting)、和促销。该术语还包括出现在任何印刷传播媒体中的赞助的信息公告，其设计用于引起大众的兴趣以劝说、通知、宣传、激发、或以其它方式改变行为，向购买、支持、或认可本文中发明的有利方式发展。

本文中诊断方法的广告和宣传可通过任何手段实现。用于传递这些信息的广告媒体的例子包括电视、电台、电影、杂志、报纸、因特网、和告示板，包括商业性的，即出现在广播媒体中的信息。广告还包括那些在食品货车座位上、机场通道墙壁上、和公共汽车侧面上的广告、或电话等候信息或店内布告(PA)系统中听到的广告、或可放置视觉或听觉通讯的任何地方的广告。

宣传或做广告手段的更特定的例子包括电视、电台、电影、因特网(诸如网络传播和网络研讨会(webinar))、意图到达同步用户的交互式计算机网络、固定的或电子的告示板和其它公共标牌、海报、传统的或电子的文献(诸如杂志和报纸)、其它媒体渠道、讲座或个体接触，例如通过电子邮件、电话、即时信息、邮寄、快递、大众(mass)、或承运人邮件(carrier mail)、亲自访问等进行。

所使用的做广告的类型会取决于许多因素，例如待传达的目标受众的性质，例如医院、保险公司、诊所、医生、护士、和患者，以及成本考虑和管理药物和诊断剂做广告的相关管辖权法律和条例。可根据由服务相互作用和/或其它数据(诸如用户人口统计状况和地理学定位)限定的用户表征使做广告个性化或用户化。

表

表1 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表1 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表1 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表1 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表1 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表1 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表1 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表1 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表1 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表1 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表1 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表2 与上皮表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表2 (续上) 与上皮表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表2 (续上) 与上皮表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表3 (续上) 与间充质表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表4 与上皮表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

表4 (续上) 与上皮表型有关的甲基化胞嘧啶核苷酸

本发明将从以下实施例得到更好的理解。然而，本领域技术人员将容易地领会，论述的特定方法和结果仅为本发明例示性的，如在随后权利要求中更完全描述的，且不视为以任何方式对其限定的。

实施例

实施例1-材料和方法

Fluidigm表达分析：使用BioMark96×96基因表达平台(Fluidigm)和20基因EMT表达集(补充表S1和方法)，在82种NSCLC细胞系上进行EMT基因表达分析。将ΔCt值用于使用Cluster v.3.0和Treeview v.1.60软件依照EMT基因表达水平将细胞系聚类。

Illumina Infinium分析：如下文描述使用Illumina Human Methylation450BeadChip(Illumina,San Diego,CA)，在Expression Analysis,Inc.(Durham,N.C.)收集微阵列数据。分析阵列数据，并使用“留一(leave-one-out)”交叉验证策略建立甲基化分类器(classifier)(在下文和参考文献25、26中描述)。阵列数据已提交到Gene Expression Omnibus数据库(登录号GSE36216)。

细胞系：所有NSCLC细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)或由UT Southwestern的Adi Gazdar和John Minna提供。永生化的支气管上皮(gBEC)和小气道(gSAC)细胞系在Genentech使用含有cdk4、hTERT和G418作为选择标志物的三顺反子载体创建。该三顺反子载体从含有hTERT的pQCXIN主链工程化而来。永生化过程基于先前公开的方案，有一些修改(Ramirez,Sheridan等2004；Sato,Vaughan等2006)。gBEC和gSAC具有二倍体核型而且是非致瘤性的。如描述的实施用5-氮杂dC、厄洛替尼或TGFβ1对细胞系的处理。

NSCLC正常肺组织，原发性肿瘤和活组织检查组织：代表早期、手术可切除肿瘤的31份NSCLC新鲜冷冻的原发性肿瘤组织(N＝28份腺癌，3份鳞状细胞癌)和来自继续在前线化疗失败的患者的60份福尔马林固定的、石蜡包埋(FFPE)NSCLC活组织检查。35份新鲜冷冻的正常肺组织(匹配原发性肿瘤组织的31份也是此收集的一部分)。所有样品均在有知情同意书的情况下以IRB批准的方案获得。所有样品均由病理学家评估组织质量和肿瘤阶段、级别和肿瘤内容物。在Genentech临床处从健康志愿者获得外周血单核细胞(N＝20)。

5-氮杂dC治疗和TGFβ1治疗：细胞在补充有10％胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的RPMI1640中生长。在第0天，将细胞以4000-9000个细胞/cm2接种，并在第1、3和5天用1μM5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-氮杂-dC)(SIGMA-ALDRICH货号A3656)或DMSO对照(货号D2650)给药。在第6天，将细胞在冷的PBS中清洗1次，通过刮擦到Trizol(Invitrogen，货号15596018)中收获，并提取RNA或速冻用于其后的RNA提取。对于EMT的诱导，将细胞以20000-50000个细胞/10cm2铺板于完全培养基并补充有2ng/mL的人转化生长因子beta1(TGFβ1)(R&D Systems,货号100-B/CF)或PBS对照。每3天替换培养基和TGFβ1，并在EMT的TGFβ1诱导后4-5周提取RNA。使用Taqman测定法对20基因EMT集评估基因表达变化(图1)。

厄洛替尼处理：对于厄洛替尼IC50测定，将细胞一式四份地以3x102个细胞每孔铺板于384孔板中的含0.5％FBS的RPMI中(测定培养基)，并过夜温育。24小时后，将细胞用含3nM TGFα和剂量范围为10μM-1pM终浓度的厄洛替尼的测定培养基处理。72小时后，使用Celltiter-Glo Luminescent CellViability Assay(Promega)测量细胞存活力。从4参数曲线分析计算导致细胞存活力50％抑制的厄洛替尼浓度并从最少2个实验测定。展现出厄洛替尼IC50≤2.0μM的细胞系定义为敏感性的，2.0-8.0μM的为居中的，而≥8.0μM为抗性的。

Fluidigm基因表达分析：使用Superscript III/Platinum Taq(Invitrogen)和预扩增反应混合物(Invitrogen)，在单次反应中将2μl的总RNA逆转录成cDNA并预扩增。将选择用于EMT表达集(图1)的20种Taqman引物/探针集纳入以0.05x初始Taqman测定浓度(Applied Biosystems)最终稀释的预扩增反应中。热循环条件如下：50℃15分钟1个循环，70℃2分钟1个循环，然后95℃15秒和60℃4分钟的14个循环。

将预扩增的cDNA稀释1.94倍，然后使用Taqman Universal PCRMasterMix(Applied Biosystems)在BioMark BMK-M-96.96平台(Fluidigm)上依照制造商用法说明书扩增。所有样品均一式三份地测定。将先前评估其在多种细胞系(新鲜冷冻的组织样品和FFPE组织样品，AL-1377271和VPS-33B)中的表达稳定性的2种定制设计的参照基因纳入该表达集。对于每种样品计算两种参照基因的Ct值的均值，并使用delta Ct(dCt)方法如下测定EMT靶基因的表达水平：均值Ct(靶基因)-均值Ct(参照基因)。

Illumina Infinium分析：使用Illumina HumanMethylation450BeadChip(Illumina)，在Expression Analysis,Inc.(Durham,NC；www.expressionanalysis.com)收集微阵列数据。这些阵列含有用于约450,000个CpG基因座位点的探针。靶物依照“Illumina Infinium HD Methylation Assay,Manual Protocol"(Illumina Part#15019522Rev.A)制备并杂交。

亚硫酸氢盐转化：使用500ng的基因组DNA依照针对Zymo EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research)的制造商方案采用亚硫酸盐转化反应。将DNA添加到Zymo M稀释缓冲液并在37℃温育15分钟。然后添加CT转化试剂，并通过加热至95℃达30秒，接着在50℃温育1小时将混合物变性。将此变性/温育循环重复总共16小时。在亚硫酸氢盐转化后，DNA结合Zymo旋转柱并使用脱磺酸基试剂按照制造商方案在柱上脱磺酸基。将经亚硫酸氢盐转化的DNA在10μl洗脱缓冲液中从柱洗脱。

Infinium甲基化测定法：将4μl经亚硫酸氢盐转化的产物转移至具有等量0.1N NaOH和20ul MA1试剂(Illumina)的新板，然后允许在RT温育10分钟。紧接温育后，添加68ul的MA2试剂和75ul的MSM试剂(均来自Illumina)，并将板在37℃过夜温育以扩增。在扩增后，将DNA酶法片段化，沉淀并重悬于RA1杂交缓冲液。杂交和扫描：将片段化的DNA分配到多通道HumanMethylation BeadChip，并在Illumina杂交炉中实施杂交达20小时。依照制造商方案清洗BeadChip，延伸引物，并染色。将BeadChip包被，然后在Illumina iScan Reader上成像，将图像用GenomeStudio软件甲基化模块处理(版本1.8或以上)。

Infinium分析：甲基化数据使用Bioconductor lumi软件程序包处理(Du,Kibbe等2008)。Infinium450K平台包括在同一张阵列上的Infinium I和II测定。Infinium I测定采用两种珠类型每CpG基因座，在一些情况中甲基化状态由红色染料报告，在其他情况中由绿色染料(与先前的Infinium27K平台相同)。Infinium II测定使用一种珠类型且总是用同一种染料报告甲基化状态，从而涉及到染料偏差。将两阶段标准化规程应用于阵列：首先，对于每张阵列，从Infinium I数据使用平滑的分位数标准化方法估测颜色-偏差校正曲线；然后，将该校正曲线应用于来自该阵列的所有数据。其次，通过对所有颜色校正过的信号应用标准的分位数标准化来将阵列彼此标准化。在预处理后，对于每份样品计算甲基化M值(甲基化对未甲基化探针的log₂比)和值(M值经由对数转化尺度改变为0至1范围)(Du,Zhang等2010)。对于可视化，使用完全连接和欧几里得距离(complete linkage and Euclidean distance)来进行值的聚集性层次聚类(agglomerative hierarchical clustering)。

甲基化分类器：将10x10倍交叉验证策略用于选择一组差异甲基化的CpG位点(DMR)并同时评估基于甲基化的EL对ML分类器的准确性。将细胞系分成10个均衡大小的组。使用9/10的系(训练集)，通过以下来鉴定候选的DMR：首先计算每种细胞系M值的移动平均(以查询的CpG位点为中心的500bp窗口)；然后，利用t检验来对比上皮样对间充质样训练系相关的窗口得分。调整DMR p值来控制错误发现率(Benjamini和Hochberg,1995)并与0.01的截留比较。为了富集更生物学相关的现象，需要候选物具有以下平均窗口得分(i)在上皮和间充质系之间至少相差1个单位，且(ii)在两种细胞系的集中具有相反的标志(sign)。该过程得到间充质有关(阳性信号)和上皮有关(阴性信号)的候选DMR。为了评估性能，将扣留用于测试的1/10的系通过汇总其对阳性DMR的信号并减去对阴性DMR的信号，然后除以DMR总数来打分。将测试系的已知的上皮对间充质标记物与结果的标志比较。最后，将每1/10作为测试集，重复交叉验证过程。最终，交叉验证过程本身再重复9次，且总体准确性评估是100种不同测试集准确率的平均。为了构建最终的DMR集，我们仅保留了在100％的交叉验证分组中鉴定为相关的候选物。将符合此标准的连续DMR合并成单一DMR，如果它们相隔少于2kb的话。

基于表达的EMT得分：观察到我们的20基因Fluidigm表达集中一些基因的行为在细胞系和肿瘤样品之间不同。为了鉴定该集的更有力的子集用于EL对ML分类目的，我们采用CDH1表达作为EMT锚定物，然后选出其与CDH1的相关性在细胞系和肿瘤样品二者中显示相同标志的基因(总共13种)。为了向肿瘤样品分配EMT表达得分，首先中心化13种基因中每一种的-dCT值以具有均值0，并调整比例以具有标准偏差1。接着翻转那些显示与CDH1负相关的基因的标志。最后，通过平均经标准化和标志调整的结果来计算各肿瘤样品得分。

亚硫酸氢盐测序和分析：将基因组DNA使用EZ DNA甲基化金试剂盒(Zymo Research)亚硫酸氢盐转化。特异于经转化DNA的引物使用MethylPrimer Express软件v1.0(Applied Biosystems)设计(序列在需要时可获得)。PCR扩增使用1μl经亚硫酸氢盐转化的DNA在25-μl反应中使用Platinum PCRsupermix(Invitrogen)实施。PCR热循环条件如下：95℃10分钟的1个初始变性循环，接着是94℃30秒、65℃1分钟并每个循环降低1℃和72℃1分钟的10个循环，然后是94℃30秒、55℃1.5分钟和72℃1分钟的30个循环，接着是72℃15分钟的最终延伸。PCR产物通过使用含溴化乙锭(Invitrogen)的2％琼脂糖E-凝胶的电泳来解析并使用FluorChem8900照相机(AlphaInnotech)可见。

将PCR产物使用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen)依照制造商用法说明书连接到pCR4-TOPO载体中。将2μl连接的质粒DNA转化到TOP10感受态细菌(Invitrogen)中，并将100μl经转化的细菌铺板于含50μg/ml羧苄西林(carbenicillin)(Teknova)的LB-琼脂板上，在37℃过夜温育。将针对每个候选基因座的12个菌落每细胞系接种到1ml含50μg/ml羧苄西林的LB中，并在摇动培养箱中于37℃过夜生长。质粒DNA使用Qiaprep miniprep试剂盒以96孔形式(Qiagen)分离并在3730x1DNA Analyzer(Applied Biosystems)上测序。

亚硫酸氢盐测序分析：测序数据使用Sequencher v4.5软件和BiQ Analyzer软件分析(Bock,Reither等2005)。

焦磷酸测序：亚硫酸氢盐特异性PCR(BSP)引物使用Methyl PrimerExpress软件v1.0(Applied Biosystems)或PyroMark Assay Design软件v2.0(Qiagen)设计。PCR引物合成为在前向或反向引物上具有5’生物素标记物以促进PCR产物对链霉亲合素琼脂糖珠的结合。测序引物使用PyroMarkAssay Design软件v2.0(Qiagen)在5’-生物素标记的PCR引物的相反方向设计。引物序列在需要时可获得。将1μl亚硫酸氢盐修饰的DNA在25μl反应中使用Platinum PCR Supermix(Invitrogen)扩增并将20μl PCR产物用于在PyromarkQ24(Qiagen)上测序。将PCR产物与链霉亲合素琼脂糖珠温育10分钟，之后用70％乙醇、Pyromark变性溶液和Pyromark清洗缓冲液清洗。然后，将变性的PCR产物使用0.3μM测序引物来测序。使pyrogram可见并评估序列质量，使用PyroMark软件版本2.0.4(Qiagen)测定在各个CpG位点处的百分比甲基化。

定量甲基化特异性PCR：设计靶向通过Infinium概况分析鉴定的DMR的定量甲基化特异性PCR(qMSP)测定法。将经亚硫酸氢钠转化的DNA用各种20X Custom Taqman Assay扩增，其使用Universal PCR MasterMix、NoUNG(Applied Biosystems)，循环条件为95℃10分钟，然后50个循环的95℃15秒和60℃1分钟。扩增在7900HT上进行并使用SDS软件(Applied Biosystems)分析。DNA含量使用meRNaseP Taqman测定法标准化。使用预扩增规程实施FFPE材料的qMSP。

FFPE肿瘤材料的预扩增：如下开发出一种用于对从福尔马林固定石蜡包埋的(FFPE)组织提取的pg量DNA的甲基化分析的预扩增方法。将2μl(等同于100pg-1ng)经亚硫酸氢盐转化的DNA首先在20μl反应中以0.1X qMSP引物-探针浓度扩增，其使用Universal PCR Master Mix、NoUNG(Applied Biosystems，货号4324018)，循环条件为95℃10分钟，然后14个循环的95℃15秒和60℃1分钟。然后，将1μl预扩增的材料在第二PCR反应中扩增，循环条件为95℃10分钟，然后50个循环的95℃15秒和60℃1分钟。DNA含量使用参照meRNaseP Taqman测定法的预扩增来确认，且在qMSP反应的进一步分析中仅纳入对于meRNaseP阳性的样品。所有反应均一式两份地进行。

实施例2-上皮样和间充质样表达签名与体外厄洛替尼敏感性相关

先前定义了与NSCLC细胞系对厄洛替尼的体外敏感性相关的基因表达签名(11)。该基因集对于涉及EMT的基因是高度富集的。开发了在Fluidigm纳米流控平台上的基于定量逆转录酶PCR的EMT表达集(图1)。来自Yauch等的研究(11)的100探针集与Yauch等的研究中概况分析的42种系的20基因EMT Fluidigm集的比较显示该20基因表达集是EMT的代表性分类器(参考文献11)。

为了进一步评估20基因集是否是与EMT有关的表型变化代表性的，将2种细胞系用TGFβ1处理。该研究的结果显示，TGFβ1诱导与EMT有关的形态学变化。在这些细胞系中，与上皮表型有关的基因下调，而与间充质表型有关的基因上调。

为了确定DNA甲基化概况分析是否可用于将NSCLC细胞系分类到上皮样和间充质样组中，20基因表达集被用于将上皮样对间充质样状态分配给82种细胞系。在此研究中使用的NSCLC细胞系包括在Yauch等的研究(11)中概况分析的大多数系和另外的52种系，其包括具有EGFR突变的6种系。在82种细胞系中，基于其中这些标志物的表达，36种被分类为上皮样，而34种被分类为间充质样(图2)。将表达数据标准化并中值中心化(样品和基因)。绿色指示指定基因的低水平或无mRNA表达；红色指示高表达。12种系(指示在图2的底部类中)被分类为上皮样，但表达上皮和间充质标志物的组合，指示这些系代表称为中间体的独特的生物学。如此，在82种NSCLC系中，89％可清楚地分类为上皮或间充质。对于大部分而言，该上皮样对间充质样表达表型是互相排斥的，可能反映了独特的根本性的生物学，这可能与独特的DNA甲基化概况有关联。包括组织学在内的细胞系描述的汇总显示于图8A-B。

实施例3-NSCLC细胞系中基因组范围内的甲基化概况与基于Fluidigm的EMT签名相关

将Illumina Infinium450K阵列作为平台分析高通量甲基化概况分析，其通过比较52个探针的β值和细胞系子集(N＝12)上的亚硫酸氢钠测序数据。观察到Infinium阵列的甲基化访问(call)与直接亚硫酸氢盐测序之间的高显著性的、强烈正相关性(r＝0.926)。

为了鉴定在上皮样和间充质样细胞系之间区分的DMR，使用同时构建基于甲基化的分类器的交叉验证策略，并评估其预测准确性，如实施例1中描述的。当应用于69细胞系训练集时，该分析得到549种DMR，其代表选择为限定上皮样对间充质样NSCLC细胞系的915个分别的CpG位点，在100％的交叉验证迭代中经错误发现率调整的P值低于0.01。基于甲基化的分类器的交叉验证估测的准确性为88.0％(±2.4％，95％置信区间)。

接着，将包括在我们的基于甲基化的EMT分类器中的CpG位点用于对69种NSCLC细胞系(包括6个EGFR突变的厄洛替尼敏感系)和2种主要正常肺细胞菌株及其永生化对应体聚类。该分析揭示，上皮样、间充质样和正常系的惊人的分离(图3)。在该测定法中，使用Illumina Infinium450K甲基化阵列平台将72种NSCLC细胞系和正常肺上皮细胞概况分析。使用915种探针进行监督层次聚类，所述探针在上皮样和间充质样细胞系之间显著差异甲基化(错误发现率＝0.01；实施例1)。列出了用于该聚类分析的注释过的探针集。每行代表在Infinium450K阵列上的单个探针，每列代表细胞系。在热图中呈蓝色的区域代表未甲基化区域，呈红色的区域代表甲基化区域。顶部色条显示代表每种细胞系的上皮样或间充质样状态(如通过Fluidigm EMT基因表达分析测定的)的柱。绿色指示上皮样，黑色指示间充质样细胞系。底部色条指示每种细胞系的厄洛替尼响应表型。红色指示厄洛替尼敏感性系；黑色指示厄洛替尼抗性系；灰色指示具有对厄洛替尼的居中敏感性的系。将欧几里得距离计量用于无中心化的聚类；配色方案代表绝对甲基化差异。

特别地，来自这些CpG位点的甲基化信号将上皮样和间充质样细胞系聚类成其相应的上皮样和间充质样组，仅有6个例外：间充质样系H1435、HCC4017、H647、H2228、H1755和HCC15聚类为上皮样组。有意思的是，这6种系中有5种通过EMT基因表达分析一起紧密聚类到间充质样系的一个独特子集中，表明该基因表达表型与有些独特的根本性甲基化签名相关。重要的是，间充质样表型携带比上皮表型更大比例的高甲基化位点。这表明可能需要甲基化中的变化来稳定化NSCLC中EMT期间所获得的表型改变。

EGFR突变体NSCLC通常在周围肺中呈现为分化较高的腺癌。基于其上皮样表达表型及其特征性组织学，EGFR突变体细胞系的行为相比于间充质样系更多地类似于上皮样系。注意到基于对厄洛替尼的体外敏感性的细胞系分离模式(图3，由中间的敏感性指示)。几乎所有的厄洛替尼敏感性系都与上皮样表型相关，而几乎所有的间充质样系都对厄洛替尼抗性。然而，并非所有的上皮样系对于厄洛替尼都是敏感的。10种厄洛替尼抗性系聚类为上皮样系，而4种厄洛替尼敏感性系H838、H2030、RERF-LC-MS和SK-MES-1聚类为间充质样系。特别地，在使用我们先前定义的EMT表达签名通过基因表达聚类时(11)，H838和SK-MES-1就厄洛替尼敏感性而言行为表现为外部者(outlier)。一些其他外部者就厄洛替尼敏感性而言具有解释其明显抗性的突变。例如，上皮样系H1975携带EGFR中的T790M突变，H1993携带MET扩增。这些遗传变化特异性赋予对厄洛替尼的抗性，表明观察到的表观遗传签名本身是细胞系生物学状态而非对厄洛替尼敏感性的代替品。

实施例4-选定的DMR的亚硫酸氢钠测序验证Infinium甲基化概况分析

检查由Infinium鉴定的与基因空间有关(在5′CpG岛中或基因内)的17种DMR(图4)的甲基化状态，其通过对经亚硫酸氢钠转化的DNA的克隆片段的直接测序。选择5种上皮样系，4种间充质样系，和1种中间系来测序验证。对于10个基因座的约10个克隆每细胞系的亚硫酸氢盐测序揭示，近乎所有这些标志物在至少4种间充质样细胞系和中间系H522中几乎完全甲基化。相比之下，这些基因座在所有5种上皮样系中完全未甲基化。在间充质样系中甲基化的10种标志物中的4种，ESRP1和CP2L3/GRHL2、miR200C和MST1R/RON，牵涉上皮分化(2、27、28)。ESRP1是可变剪接的上皮特异性调控物，其在间充质细胞中下调，而CP2L3/GRHL2是顶端连接复合物的转录调控物(27、28)；miR200C是EMT诱导物ZEB1的已知负向调控物(29)。ESRP1和GRHL2表达在相对于所有上皮样系的更大的间充质样系的集中下调，与间充质细胞中已知的ESRP蛋白缺少和这些蛋白调控上皮转录本(转换EMT期间的剪接)的能力一致。焦磷酸测序分析指示GRHL2还在相对于上皮样系更广的间充质样系的集中高甲基化。

实施例5-DMR的生物学相关性

为了评估甲基化在调控与选定DMR有关的基因表达中的作用，在一组34种经5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-氮杂-dC)和二甲亚砜处理的NSCLC细胞系中实施定量PCR。并非所有的DMR在5-氮杂-dC处理后与明显的基因表达变化有关，但注意到间充质样对上皮样系中显著的GRHL2、ESRP1和CLDN7转录本的诱导。从该组基因中选择CLDN7为EMT的代表性标志物且其甲基化状态在扩展的42种细胞系的集中通过焦磷酸测序定量。近乎所有的间充质样系在CLDN7启动子区处甲基化且展现出响应5-氮杂-dC处理的急剧的CLDN7表达诱导(>10倍)(图5A和B)。相比之下，CLDN7在多数的上皮样细胞系中表达，且并未受到5-氮杂-dC处理的进一步诱导。这些数据显示，NSCLC细胞系中上皮样和间充质样状态有关的基因子集中基因座特异性的DNA高甲基化与转录沉默的直接联系。

在图5A中，在7个CpG位点处通过Pyromark分析软件测定定量甲基化，其使用等式：％甲基化＝(C峰高度x100/C峰高度+T峰高度)。数据呈现为7个CpG位点处甲基化百分比的均值±SD。在图5B中，使用标准的ΔCt方法在42种(n＝20上皮样，19间充质样，3中间体)经DMSO处理和经5-氮杂-dC处理的NSCLC细胞系中测定CLDN7mRNA的相对表达。表达值计算为经5-氮杂-dC处理的相对于经DMSO处理的对照细胞的倍数变化。将数据标准化至看家基因GAPDH并表示为2个重复的均值。DMSO，二甲亚砜；GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

实施例6-定量MSP将NSCLC细胞系分类成上皮和间充质亚型并预测厄洛替尼敏感性

在通过直接测序分析独立验证17种标志物的甲基化状态后，分析70个NSCLC细胞系来确定这些标志物是否能正确分类上皮样和间充质样表型。基于亚硫酸氢钠测序分析，选择最好地将上皮样系与间充质样系区分的甲基化区域，并基于TaqMan技术设计定量甲基化特异性PCR(qMSP)测定法。使用qMSP作为测定平台，因为其已显示具有在从患有癌症的患者获得的标本中检测肿瘤特异性启动子高甲基化的用途。该方法对于量化甲基化等位基因是高度灵敏度和特异性的，且易于适应于高通量形式，从而使其适于临床应用(30–33)。对于MSP，TaqMan技术优于基于SYBR的设计，原因是不充当引物的荧光探针赋予增加的测定法特异性。为了标准化样品用于DNA输入，设计经亚硫酸氢盐修饰的RNase P参照测定法来独立于其甲基化状态扩增输入DNA。使用对照甲基化DNA，源自外周血单核细胞的DNA(N＝20)，和来自已知每个DMR甲基化状态的细胞系的DNA建立滴度曲线。值得注意的是，近乎所有开发的测定法对于甲基化的存在或缺失均产生基本二元性输出，这避免了定义截留点的需要。

测试上皮(E)或间充质(M)状态的13种候选标志物以确定其是否基于EMT基因表达分类区分上皮样和间充质样细胞系，所述分类包括RON/MST1R(M)、STX2(M)、HOXC5(M)、PEX5L(E)、FAM110A(M)、ZEB2(E)、ESRP1(M)、BCAR3(E)、CLDN7(M)、PCDH8(E)、NKX6.2(M)、ME3(E)和GRHL2(M)。使用P<0.05的截留值，13种标志物中有10种与上皮样或间充质样状态显著相关(图6)。在此测定法中，利用qMSP测定来确定上皮样(n＝36)和间充质样(n＝34)NSCLC细胞系中的甲基化。总输入DNA使用亚硫酸氢盐特异性RNase P TaqMan探针标准化。在图6中，对于y轴上的每份样品，甲基化水平绘制为-ΔC_t(指示靶基因-RNase P)。增加的-ΔC_t值指示增加的甲基化。细胞系通过x轴上的上皮样/间充质样状态分组。P值使用双侧不配对Student t检验测定。呈现(B)RON、(D)FAM110A、(F)GRHL2和(H)ESRP1的接受者操作特征(ROC)图。P值使用Wilcoxon秩和检验测定。

检查这些相同的标志物以确定其是否预测体外厄洛替尼敏感性。13个DMR中有7个强烈预测厄洛替尼抗性(分别的P<0.005；图7)，而13个DMR中有3个，PEX5L、ME3和ZEB2，与上皮表型显著相关，但不统计学预测厄洛替尼敏感性。在该测定中，使用指示的qMSP测定法实施58种NSCLC细胞系DNA样品的qMSP扩增。使用R统计学软件生成厄洛替尼敏感性对厄洛替尼抗性细胞系的ROC曲线。P值使用Student t检验测定。图7A-M和图8A-B。

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提述并入

本文中公开的所有专利、公开的专利申请和其他参考文献通过提述完整明确地并入本文。

等同

本领域技术人员将认可或能够确定，仅使用常规实验的本文中特定描述的本发明特定实施方案的许多等同体。这类等同体意图涵盖在所附权利要求的范围内。术语“包含/包括”用于本文是非限制性的，且包括指定的要素而不限制其他要素的纳入。

Claims (12)

1.一种测定肿瘤细胞是否具有间充质表型的方法，其包括检测至少一种选自下组的基因中CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失：CLDN7、HOXC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、ERBB2和C20orf55，其中所述CpG位点处甲基化的存在指示肿瘤细胞具有间充质表型。

2.一种测定肿瘤生长对EGFR激酶抑制剂所致抑制的敏感性的方法，其包括在样品肿瘤细胞中检测至少一种选自下组的基因中CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失：CLDN7、HOXC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2、ERBB2和C20orf55，其中所述CpG位点处甲基化的存在指示肿瘤生长对于使用EGFR抑制剂的抑制为抗性。

3.一种鉴定很可能受益于使用EFGR抑制剂治疗的癌症患者的方法，其包括在来自患者的癌症的样品中检测至少一种选自下组的基因中CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失：CLDN7、HOXC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2和C20orf55，其中如果所述CpG位点处的DNA甲基化检测为缺失，那么将患者鉴定为很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗。

4.权利要求3的方法，其进一步包括如果患者鉴定为很可能受益于使用EGFR抑制剂治疗的患者，那么对所述患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂。

5.一种在患者中治疗癌症的方法，其包括对所述患者施用治疗有效量的EGFR抑制剂，其中所述患者在施用所述EGFR抑制剂之前诊断为患有展现出至少一种选自下组的基因中CpG位点处缺失DNA甲基化的癌症：CLDN7、HOXC4、P2L3、TBCD、ESPR1、GRHL2和C20orf55。

6.权利要求2-5中任一项的方法，其中所述EGFR抑制剂是厄洛替尼(erlotinib)、西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)。

7.一种测定肿瘤细胞是否具有上皮表型的方法，其包括检测至少一种选自下组的基因中CpG位点处DNA甲基化的存在或缺失：PCDH8、PEX5L、GALR1和ZEB2，其中所述CpG位点处甲基化的存在指示肿瘤细胞具有上皮表型。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中通过焦磷酸测序检测甲基化的存在或缺失。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中从福尔马林固定、石蜡包埋的(FFPE)组织或新鲜冷冻的组织分离DNA。

10.权利要求9的方法，其中在焦磷酸测序前预扩增从组织样品分离的DNA。

11.权利要求1或2的方法，其中所述肿瘤细胞是NSCLC细胞。

12.权利要求3-5中任一项的方法，其中所述癌症是NSCLC。