MX2014003698A

MX2014003698A - Marcadores de diagnostico.

Info

Publication number: MX2014003698A
Application number: MX2014003698A
Authority: MX
Inventors: David Shames; Thomas M Holcomb; Kimberly Walter
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2011-09-30
Filing date: 2012-09-28
Publication date: 2014-07-28
Also published as: CA2849120A1; BR112014007569A2; RU2014110228A; AU2012321248A1; JP2014531213A; IL231590A0; WO2013055530A1; US20130084287A1; ZA201401968B; CN104066851A; EP2761025A1; KR20140066783A; SG11201400996SA

Abstract

La presente invención provee métodos para determinar el fenotipo epitelial y mesenquimal de tumores y predecir si el crecimiento del tumor será sensible o resistente al tratamiento con un inhibidor de EGFR.

Description

MARCADORES DE DIAGNÓSTICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención provee métodos para predecir la respuesta a una terapia de cáncer en base al estatus de metilación genética.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La presente invención es concerniente con métodos para diagnosticar y tratar pacientes con cáncer. En particular, la presente invención es concerniente con métodos para determinar cuáles pacientes se beneficiarán más del tratamiento con un inhibidor de cinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) .

El cáncer es un nombre genérico para un amplio intervalo de malignidades celulares caracterizadas por el crecimiento sin regular, carencia de diferenciación y la habilidad para invadir tejidos locales y metastasizarse . Estas malignidades neoplásicas afectan con varios grados de prevalencia, cada tejido y órgano en el cuerpo.

Una multitud de agentes terapéuticos han sido desarrollados en las pasadas pocas décadas para el tratamiento de varios tipos de cáncer. Los tipos más comúnmente usados de agentes anticáncer incluyen: agentes ADN-alquilante (por ejemplo, ciflosfamida, ifosfamida) , antimetabolitos (por ejemplo, metrotexato, un antagonista de foliato y 5-fluorouracilo, un antagonista de pirimidina) , disruptores de microtúbulo (por ejemplo, vincristina, vinblastina, paclitaxel) , intercaladores de ADN (por ejemplo, doxorrubicina, daunomicina, cisplatino) y terapia hormonal (por ejemplo, tamoxifeno, flutamida) .

La familia del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) comprende cuatro receptores estrechamente relacionados (HERl/EGFR, HER2, HER3 y HER4) involucrados en respuestas celulares, tales como diferenciación y proliferación. La sobreexpresión de la cinasa del EGFR o su ligando TGF-alfa, esta frecuentemente asociada con muchos cánceres, incluyendo cáncer de pecho, pulmón, colorrectal, ovario, de célula renal, de vejiga, cabeza y cuello, cánceres glioblastomas y astrocitomas y se cree que contribuye al crecimiento maligno de estos tumores. También se ha encontrado que una cancelación-mutación específica en el gen de EGFR (EGFRvIII) incrementa la tumorigenicidad celular. La activación de rutas de señalización estimuladas por EGFR promueven múltiples procesos que son potencialmente promotores de cáncer, por ejemplo, proliferación, angiogénesis , movilidad celular e invasión, apoptosis e inducción de resistencia a fármaco. La expresión de HERl/EGFR incrementada es frecuentemente enlazada con enfermedad avanzada, metástasis y escasa prognosis. Por ejemplo, en NSCLC y cáncer gástrico, se ha demostrado que la expresión incrementada de HER1/EGFR se correlaciona con una alta velocidad metastática, escasa diferenciación del tumor y proliferación del tumor incrementada.

Mutaciones que activan la actividad de cinasa de tirosina de proteína intrínseca del receptor y/o incrementan la señalización corriente abajo han sido observadas en NSCLC y glioblastoma. Sin embargo, el papel de mutaciones como mecanismo principal para conferir sensibilidad a inhibidores del receptor de EGF, por ejemplo erlotinib (TARCEVA*) o gefitinib (IRESSA™) , ha sido controversial . Recientemente, se ha reportado que una forma mutante del receptor de EGF de plena longitud predice la sensibilidad al inhibidor de cinasa de tirosina de receptor de EGF gefitinib (Paez, J. G. et al. (2004) Science 304:1497-1500; Lynch, T. J. et al. (2004) N. Engl. J. Med. 350:2129-2139). Estudios de cultivo celular han demostrado que las líneas celulares que expresan la forma mutante del receptor de EGFR (esto es H3255) fueron más sensibles a la inhibición del crecimiento por el inhibidor de cinasa de tirosina del receptor de EGF gefinitib y que concentraciones mucho más altas de gefitinib eran requeridas para inhibir las líneas de célula de tumor que expresan el receptor de EGFR tipo silvestre. Estas observaciones sugieren que las formas mutantes específicas del receptor de EGF pueden reflejar una mayor sensibilidad a los inhibidores del receptor de EGF pero no identifican un fenotipo no sensible completamente .

El desarrollo para uso como agentes anti-tumor de compuestos que inhiben directamente la actividad de cinasa del EGFR, también como anticuerpos que reducen la actividad de cinasa de EGFR al bloquear la activación de EGFR, son áreas de esfuerzo de investigación intenso (de Bono J.S. y Rowinsky, E.K. (2002) Trends in Mol. Medicine 8:S19-S26; Dancey, J. and Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313). Varios estudios han demostrado, revelado o sugerido que algunos inhibidores de cinasa de EGFR podrían mejorar el asesinato de células de tumor o neoplasia cuando son usados en combinación con ciertos otros agentes o tratamientos anti-cáncer o quimioterapéuticos (por ejemplo, Herbst, R.S. et al. (2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1:719-732; Solomon, B. et al (2003) Int. J. Radiat . Oncol . Biol. Phys. 55:713-723; Krishnan, S. et al. (2003) Frontiers in Bioscience 8, el-13; Grunwald, V. e Hidalgo, M. (2003) J. Nat. Cáncer Inst. 95:851-867; Seymour L. (2003) Current Opin. Investig. Drugs 4 (6) : 658-666 ; Khalil, M.Y. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther .3 : 367-380 ; Bulgaru, A.M. et al. (2003) Expert Rev. Anticancer Ther .3 : 269-279; Dancey, J. y Sausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313; Ciardiello, F. et al. (2000) Clin. Cáncer Res. 6:2053-2063 y publicación de patente estadounidense 2003/0157104) .

Erlotinib (por ejemplo, erlotinib HC1, también conocido como TARCEVA® o OSI-774) es un inhibidor disponible oralmente de cinasa de EGFR. In vitro, erlotinib ha demostrado actividad inhibidora sustancial contra la cinasa de EGFR en un número de líneas de célula de tumor humanas, incluyendo cáncer colorrectal y de pecho (Moyer J.D. et al. (1997) Cáncer Res. 57:4838) y la evaluación preclxnxca ha demostrado actividad contra un número de xenoinjertos de tumor humano que expresan EGFR (Pollack, V.A. et al (1999) J. Pharmacol . Exp. Ther. 291:739). Más recientemente, erlotinib ha demostrado actividad promisoria en pruebas de fase I y II en un número de indicaciones, incluyendo cáncer de cabeza y cuello (Soulieres, D., et al. (2004) J. Clin. Oncol . 22:77), NSCLC (Perez-Soler R, et al. (2001) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 20:310a, abstracto 1235), CRC (Oza, M. , et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:196a, abstracto 785) y MBC (Winer, E., et al. (2002) Breast Cáncer Res. Treat. 76:5115a, abstracto 445) . En pruebas de fase III, la monoterapia con erlotinib prolongó significativamente la supervivencia, retardo el avance de la enfermedad y retardó el empeoramiento de los síntomas relacionados con cáncer de pulmón en pacientes con NSCLC avanzado tratamiento-refractario (Shepherd, F. et al. (2004) J. Clin. Oncology, 22:14S (15 complemento del 15 de julio) , abstracto 7022) . En tanto que muchos de los datos de pruebas clínicas para erlotinib son concernientes con su uso en NSCLC, resultados preliminares de estudios de fase I/II han demostrado actividad promisoria para erlotinib y terapia de combinación de capecitabina/erlotinib en pacientes con un amplio intervalo de tipos de tumor sólido humano, incluyendo CRC (Oza, M. , et al. (2003) Proc. Am. Soc . Clin. Oncol . 22:196a, abstracto 785) y MBC (Jones, R.J., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:45a, abstracto 180). En noviembre de 2004, la administración de alimentos y medicinas de los Estados Unidos de América (FDA) aprobó erlotinib para el tratamiento de pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña avanzado localmente o metastático (NSCLC) después de la falla de por lo menos un régimen de quimioterapia previa. Erlotinib es el único fármaco en la clase del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) en un estudio clínico fase III e incrementan la supervivencia en pacientes con NSCLC avanzado.

Un fármaco anti-neoplásico idealmente asesinaría células de cáncer selectivamente, con un amplio índice terapéutico en relación con su toxicidad hacia células no malignas. También retendría su eficacia contra células malignas, aún después de exposición prolongada al fármaco. Desafortunadamente, ninguna de las quimioterapias actuales posee tal perfil ideal . En lugar de esto, la mayoría posee índices terapéuticos muy estrechos. Además, las células cancerosas expuestas a concentraciones ligeramente sub-mortales de un agente quimioterapéutico frecuentemente desarrollarán resistencia a tal agente y bastante frecuentemente una resistencia cruzada a varios otros agentes antineoplásicos también. Adicionalmente, para cualquier tipo de cáncer dado frecuentemente no se puede predecir cual pacientes es probable que responda a un tratamiento particular, aún con terapias gen-apuntadas más nuevas, tales como inhibidores de cinasa de EGFR, necesitando así considerable prueba y error, frecuentemente a riesgo considerable y molestias al paciente, con el fin de encontrar la terapia más efectiva.

Asi, hay necesidad por un tratamiento más eficaz para neoplasia y otras alteraciones proliferativas y por medios más efectivos para determinar cuáles tumores responderán a tal tratamiento. Estrategias para mejorar la eficacia terapéutica de los fármacos existentes han involucrado cambios en el horario para su administración y también su uso en combinación con otros agentes anti-cáncer o moduladores bioquímicos. La terapia de combinación es bien conocida como un método que puede dar como resultado una eficacia mayor y efectos secundarios disminuidos en relación con el uso de la dosis terapéuticamente relevante de cada agente solo. En algunos casos, la eficacia de la combinación de fármaco es aditiva (la eficacia de la combinación es aproximadamente igual a la suma de los efectos de cada fármaco solo) , pero en otros casos el efecto es sinergista. La eficacia de la combinación es mayor que la suma de los efectos de cada fármaco dado solo) .

Los procedimientos terapéuticos objetivo-específicos, tales como erlotinib, están en general asociados con toxicidad reducida en comparación con los agentes citotóxicos convencionales y por consiguiente se prestan por sí mismos a uso en regímenes de combinación. Resultados promisorios se han observado en estudios fase I/II de erlotinib en combinación con bevacizumab (Mininberg, E.D., et al. (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol . 22:627a, abstracto 2521) y gemcitabina (Dragovich, T. , (2003) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 22:223a, abstracto 895). Datos recientes en pruebas de fase III de NSCLC han demostrado que erlotinib o gefitinib de primera línea en combinación con quimioterapia estándar no mejoran la supervivencia (Gatzemeier, U. , (2004) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 23:617 (abstracto 7010); Herbst, R.S., (2004) Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 23:617 (abstracto 7011); Giaccone, G., et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:777; Herbst, R., et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22:785). Sin embargo, las pruebas fase II de cáncer pancreático han demostrado que erlotinib de primera línea en combinación con gemcitabina mejoraron la supervivencia.

Varios grupos han investigado biomarcadores potenciales para predecir la respuesta del paciente a inhibidores de EGFR (véase, por ejemplo WO 2004/063709, O 2005/017493, WO 2004/0132097) . Uno de tales biomarcadores es el fenotipo epitelial mesenquimal . Durante la mayoría de las metástasis de cáncer, ocurre un cambio importante en una célula de tumor conocido como la transición epitelial ha mesenquimal (EMT) (Thiery, J.P. (2002) Nat . Rev. Cáncer 2:442-454; Savagner, P. (2001) Bioessays 23:912-923; Kang Y. y Massague, J. (2004) Cell 118:277-279; Julien-Grille, S., et al . Cáncer Research 63:2172-2178; Bates, R.C. et al. (2003) Current Biology 13:1721-1727; Lu Z., et al. (2003) Cáncer Cell. 4(6):499-515)). Las células epiteliales, que están enlazadas de manera conjunta fuertemente y exhiben polaridad, dan surgimiento a células mesenquimales , que son mantenidas de manera conjunta más holgadamente, exhiben una pérdida de polaridad y tienen la habilidad de viajar. Estas células mesenquimales se pueden esparcir a tejidos que rodean el tumor original, invadir vasos sanguíneos y linfáticos y dejar al nuevo sitio en donde se dividen y forman tumores adicionales . EMT no se presenta en células saludables excepto durante la embriogénesis . Bajo circunstancias normales, TGF-ß actúa como inhibidor de crecimiento, sin embargo, durante metástasis de cáncer, TGF-ß comienza a promover la EMT.

Los fenotipos epiteliales y mesenquimales han sido asociados con patrones de expresión genética particulares . Por ejemplo, el fenotipo epitelial fue mostrado en WO2006101925 estar asociado con altos niveles de expresión de E-caderina, Brk, ?-catenina, -catenina, queratina 8, queratina 18, conexina 31, placofilina 3, estratafina 1, laminina alfa-5 y ST14 mientras que el fenotipo mesenquimal fue asociado con altos niveles de expresión de vimentina, fibronectina, fibrilina-1, fibrilina-2, colágeno alfa-2(IV), colágeno alfa-2(V), L0XL1, nidogen, Cllorf9, tenascina, N-caderina, embrional EDB+ fibronectina, tubulina alfa-3 y epimorfina.

La epigenética es el estudio de cambios hereditables en expresión genética o fenotipo celular provocados por mecanismos diferentes a cambios en la secuencia de ADN fundamental-de aquí el nombre epi (del griego: sobre, por encima, externo) -genética. Ejemplos de tales cambios incluyen metilación de ADN y modificaciones de histona, ambos de los cuales sirven para modular la expresión genética sin alterar la secuencia de los genes asociados. Estos cambios pueden ser heredables somáticamente por medio de división celular por el resto de la vida del organismo y se pueden también hacer pasar a generaciones subsecuentes del organismo. Sin embargo, no hay ningún cambio en la secuencia de ADN fundamental del organismo; en lugar de esto, factores no genéticos provocan que los genes del organismo se comporten o expresen diferentemente .

La metilación de ADN es una parte crucial del desarrollo normal del organismo y diferenciación celular en organismos superiores. La metilación de ADN altera establemente el patrón de expresión genética en células, de tal manera que las células "recuerdan en donde han estado"; por ejemplo, las células programadas para ser isletas pancreáticas durante el desarrollo embriónico siguen siendo isletas pancreáticas en toda la vida del organismo sin señales continuas que les digan que necesitan seguir siendo isletas. Además, la metilación de ADN suprime la expresión de genes virales y otros elementos perjudiciales que han sido incorporados al genoma del huésped con el paso del tiempo. La metilación de ADN también forma la base de la estructura de cromatina, que permite que las células forman miríadas de características necesarias para la vida multicelular a partir de una sola secuencia inmutable de ADN. La metilación de ADN también juega un papel crucial en el desarrollo de casi todos los tipos de cáncer. La metilación de ADN en posición 5 de citosina tiene el efecto específico de reducir la expresión genética y se ha encontrado en cada vertebrado examinado. En tejidos somáticos adultos, la metilación de ADN ocurre comúnmente en un contexto de dinucleótido de CpG en tanto que la metilación sin CpG es prevalente en células madre embroncas .

"CpG" es abreviatura para "-C-fosfato-G-" , esto es, citosina y guanina separados por solamente un fosfato; el fosfato enlaza cualesquier dos nucleótidos conjuntamente en ADN. La anotación "CpG" es usada para distinguir esta secuencia lineal del apareamiento de bases de CG de citosina y guanina. Las citosinas en dinucleótidos de CpG pueden ser metiladas para formar 5-metilcitosina (5-mC) . En mamíferos, la metilación de la citosina con un gen puede desactivar el gen. Enzimas que agregan un grupo metilo ADN son llamadas ADN metiltransferasas . En mamíferos, el 70% a 80% de citosinas de CpG son metiladas . Hay regiones del genoma que tienen una concentración más alta de sitios de CpG, conocidos como islas de CpG. Estas "islas de CpG" también tienen un contenido de CG más alto que el esperado (esto es >50%) . Muchos genes en los genomas mamíferos tienen islas de CpG asociadas con el inicio del gen. Debido a esto, la presencia de una isla de CpG es usada para ayudar en la predicción y anotación de genes. Las islas de CpG son refractarias a la metilación, lo que puede ayudar a mantener una configuración de cromatina abierta. Además, esto podría dar como resultado vulnerabilidad reducida a mutaciones de transición y como consecuencia, una densidad en equilibrio más alta de CpG que sobreviven. La metilación de sitios de CpG dentro de los promotores de genes puede conducir a su silenciamiento, un elemento encontrado en un número de canceres humanos (por ejemplo, el silenciamiento de genes supresores de tumor) . En contraste, la hipometilación de sitios de CpG ha sido asociada con la sobreexpresión de oncogenes dentro de las células de cáncer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un aspecto de la invención provee un método para determinar si una célula de tumor tiene un fenotipo epitelial que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de uno de los sitios de CpG identificados en la tabla 2 o tabla 4 en la célula de tumor, en donde la presencia de metilación en cualquiera de los sitios de CpG indica que la célula de tumor tiene un fenotipo epitelial. En ciertas modalidades, los sitios de CpG están en el gen de PCDH8, PEX5L, GALR1 o ZEB2. En ciertas modalidades, la célula de tumor es una célula de NSCLC.

Otro aspecto de la invención provee un método para determinar si una célula de tumor tiene un fenotipo epitelial, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de uno de los sitios de CpG identificados en la tabla 1 o tabla 3, en donde la ausencia de metilación en cualquiera de los sitios de CpG indica que la célula de tumor tiene un fenotipo epitelial. En ciertas modalidades, los sitios de CpG están en el gen de CLDN7, HOXC4, P2L3, TBCD, ESPR1, GRHL2 o C20orf55. En ciertas modalidades, la célula de tumor es una célula de NSCLC.

Otro aspecto de la invención provee un método para determinar la sensibilidad del crecimiento del tumor a la inhibición por un inhibidor de cinasa de EGFR, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 2 o tabla 4 en una célula de tumor de muestra, en donde la presencia de metilación de ADN en cualquiera de uno de los sitios de CpG indica que el crecimiento del tumor es sensible a inhibición con el inhibidor de EGFR. En una modalidad, el inhibidor de EGFR es erlotinib, cetuximab o panitumumab. En ciertas modalidades, la célula de tumor es una célula de NSCLC .

Otro aspecto de la invención provee un método para identificar un paciente con cáncer que es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 1 o tabla 3 en una muestra del cáncer del paciente, en donde el paciente es identificado por ser probable de beneficiarse del tratamiento con el inhibidor de EGFR si se detecta ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG. En ciertas modalidades, los sitios de CpG están en el gen de CLDN7, H0XC4 , P2L3, TBCD, ESPR1, GRHL2 o C20orf55. En ciertas modalidades, el inhibidor de EGFR es erlotinib, cetuximab o panitumumab. En ciertas modalidades, el cáncer es NSCLC.

En todavía otro aspecto de la invención provee un método para identificar un paciente con cáncer que es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 2 o tabla 4 en una muestra del cáncer del paciente, en donde el paciente es identificado por ser probable de beneficiarse del tratamiento con el inhibidor de EGFR si se detecta la presencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG. En ciertas modalidades, el paciente es administrado con una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de EGFR si el paciente es identificado como uno que probablemente se beneficiaría del tratamiento con el inhibidor de EGFR. En ciertas modalidades, el inhibidor de EGFR es erlotinib, cetuximab o panitumumab. En ciertas modalidades, el cáncer es NSCLC.

Otro aspecto de la invención provee un método para determinar si una célula de tumor tiene un fenotipo mesenquimal, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 2 o tabla 4 en la célula del tumor, en donde la ausencia de metilación en cualquiera de los sitios de CpG indica que la célula de tumor tiene un fenotipo mesenquimal. En ciertas modalidades, los sitios de CpG están en el gen de PCDH8, PEX5L, GALR1 o ZEB2. En ciertas modalidades, la célula de tumor es una célula de NSCLC.

Otro aspecto de la invención provee un método para determinar si una célula de tumor tiene un fenotipo mesenquimal, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 1 o tabla 3, en donde la presencia de metilación en cualquiera de los sitios de CpG indica que la célula de tumor tiene un fenotipo mesenquimal . En ciertas modalidades, los sitios de CpG están en el gen de CLDN7, HOXC4, P2L3, TBCD, ESPR1, GRHL2 o C20orf55. En ciertas modalidades, la célula de tumor es una célula de NSCLC.

En todavía otro aspecto de la invención provee un método para determinar la sensibilidad del crecimiento del tumor a inhibición por un inhibidor de cinasa de EGFR, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 2 o tabla 4 en una célula de tumor de muestra, en donde la ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG indica que el crecimiento del tumor es resistente a inhibición con el inhibidor de EGFR. En ciertas modalidades, el inhibidor de EGFR es erlotinib, cetuximab o panitumumab. En ciertas modalidades, la célula de tumor es una célula de NSCLC .

Otro aspecto de la invención provee un método para determinar la sensibilidad la sensibilidad del crecimiento del tumor a inhibición por un inhibidor de cinasa de EGFR, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 1 o tabla 3 en una célula de tumor de muestra, en donde la presencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG indica que el crecimiento del tumor es resistente a inhibición con el inhibidor de EGFR, tal como por ejemplo erlotinib, gefitinib, lapatinib, cetuximab o panitumumab. En ciertas modalidades, los sitios de CpG están en el gen de CLDN7, HOXC4, P2L3, TBCD, ESPR1, GRHL2 o C20orf55. En ciertas modalidades, el inhibidor de EGFR es erlotinib, cetuximab o panitumumab. En ciertas modalidades, la célula de tumor es una célula de NSCLC.

Otro aspecto de la invención provee un método para tratamiento de un cáncer en un paciente que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de EGFR al paciente, en donde el paciente, antes de la administración del inhibidor de EGFR, fue diagnosticado con un cáncer que exhibe presencia de metilación de ADN en uno de los sitios de CpG identificados en la tabla 2 o tabla 4. En ciertas modalidades, el inhibidor de EGFR es erlotinib, cetuximab o panitumumab. En ciertas modalidades, el cáncer es NSCLC .

Otro aspecto de la invención provee un método de tratamiento de un cáncer en un paciente que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de EGFR al paciente, en donde el paciente, antes de la administración del inhibidor de EGFR, fue diagnosticado con un cáncer que exhibe ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 1 o tabla 3. En ciertas modalidades, el inhibidor de EGFR es erlotinib, cetuximab o panitumumab. En ciertas modalidades, el cáncer es NSCLC.

Otro aspecto de la invención provee un método para seleccionar una terapia para un paciente con cáncer, que comprende las etapas de detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en uno de los sitios de CpG identificados en la tabla 2 o tabla 4 en una muestra del cáncer del paciente y seleccionar un inhibidor de EGFR para la terapia cuando la presencia de metilación en uno de los sitios de CpG identificados en la tabla 2 o tabla 4 es detectada. En una modalidad, el paciente es administrado con una cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor de EGFR, tal como erlotinib, cetuximab o panitumumab, si la terapia de EGFR es seleccionada. En ciertas modalidades, el paciente está sufriendo de NSCLC.

Otro aspecto de la invención provee un método para seleccionar una terapia para un paciente con cáncer, que comprende las etapas de detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en uno de los sitios de CpG identificados en la tabla 1 o tabla 3 en una muestra del cáncer del paciente y seleccionar un inhibidor de EGFR para la terapia cuando se detecta ausencia de metilación en uno de los sitios de CpG identificados en la tabla 1 o tabla 3 es detectada. En una modalidad, el paciente es administrado con una cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor de EGFR, tal como erlotinib, cetuximab o panitumumab, si la terapia de EGFR es seleccionada. En ciertas modalidades, el paciente está sufriendo de NSCLC.

En ciertas modalidades de los aspectos anteriores, la presencia o ausencia de metilación es detectada mediante pirosecuenciación. En ciertas modalidades de los aspectos anteriores, el ADN es aislado de un tejido embebido en parafina formalina-fijado (FFPE) o de tejido congelado nuevo. En una modalidad, el ADN aislado de la muestra del tejido es preamplificado antes de la pirosecuenciación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS El archivo de patente o solicitud contiene por lo menos un dibujo ejecutado a colores. Copias de esta publicación de patente o solicitud de patente con dibujo (s) a color (es) serán provistas por la oficina a petición y pago del derecho necesario.

Figura 1. Líneas celulares de NSCLC clasificadas como fenotipo epitelial y mesenquimal de acuerdo con el panel de expresión genética de EMT Fluidigm.

Figura 2A-B. Agrupamiento jerárquico que caracteriza líneas celulares como semejantes a epiteliales o semejantes a mesenquimales .

Figura 3. Metilación de ADN de patrones de líneas celulares de NSCLC epiteliales y mesenquimales clasificadas como sensibles, intermedias y resistentes a inhibidor de EGFR erlotinib .

Figura 4A-B. Anotación de DMR seleccionada para secuenciación con disulfito de sodio o qMSP y diseño de arreglo de pirosecuenciación.

Figura 5A. La pirosecuenciación de la región de promotor de CLDN7 diferencia las 42 líneas celulares de NSCLC en base al fenotipo semejante a epitelial/semejante a mesenquimal.

Figura 5B. La expresión relativa del mARN de CLDN7 determinada utilizando un método de ACt estándar en 42 líneas celulares de NSCLC tratadas con DMSO y 5-aza-dC (n = 20 semejantes a epiteliales, 19 semejantes a epiteliales, 3 intermedias) .

Figura 6A-H. Ensayos de detección a base de Taqman específieos para DMR asociados con los genes (A) MST1R/RON, (C) FAM110A, (E) CP2L3/GRHL2 y (G) ESRP1 y gráficas de características de operación del receptor (ROC) para (B) RON, (D) FAM110A, (F) GRHL2 y (H) ESRP1.

Figura 7A-M. Curvas características de operación de receptor (ROC) de ensayos de PCR específicos de metilación cuantitativa en líneas celulares de NSCLC sensibles a erlotinib versus resistentes a erlotinib-PEX5L (A) , PCDH8 (B) , ZEB2 (C) , ME3 (D) , MSTR1 (E) , STX2 (F) , H0XC5 (G) , C20orf55 (H) , ESRP1 (I), BCAR3 (J) , CLDN7 (K) , NKX6.2 (L) , CP2L3 (M) .

Figura 8A1-B2. Tabla que muestra la clasificación epitelial (E) o mesenquimal (M) de 82 líneas celulares de NSCLC y valores de IC50 de erlotinib.

Lista de tablas Tabla 1. Nucleótidos de citosina metilados (CpG) asociados con fenotipo mesenquimal Tabla 2. Nucleótidos de citosina metilados (CpG) asociados . con fenotipo epitelial Tabla 3. Nucleótidos de citosina metilados (CpG) asociados con fenotipo mesenquimal identificados por el número de cromosoma, posición de nucleótido y Entrez ID el gen.

Tabla 4. Nucleótidos de citosina metilados (CpG) asociados con fenotipo epitelial identificados por el número de cromosoma, posición de nucleótido y Entrez ID el gen.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "cáncer" en un animal se refiere a la presencia de células que poseen características de células típicas que provocan cáncer, tal como proliferación incontrolada, inmortalidad, potencial metastático, crecimiento y velocidad de proliferación rápida y ciertos elementos morfológicos característicos. Frecuentemente, las células de cáncer estará en forma de un tumor, pero tales células pueden existir solas en un animal o pueden circular en la corriente sanguínea como células independientes tales como célula leucémica.

"Crecimiento celular anormal" , como se usa en la presente, a no ser que sea indicado de otra manera, se refiere al crecimiento celular que es independiente de mecanismos regulatorios normales (por ejemplo, pérdida de inhibición de contacto) . Esto incluye el crecimiento anormal de: (1) células de tumor (tumores) que proliferan al expresar una cinasa de tirosina mutada o sobreexpresión de cinasa de tirosina de receptor; (2) células benignas y malignas de otras enfermedades proliterativas en las cuales se presenta la activación de cinasa de tirosina aberrante; (4) cualesquier tumores que proliferan por cinasas de tirosina de receptor; (5) cualesquier tumores que proliferan mediante activación de cinasa de serina/treonina aberrante y (6) células benignas y malignas de otras enfermedades proliferativas en las cuales se presenta la activación de cinasa de serina/treonina aberrante.

El término "que trata" como se usa en la presente, a no ser que indique de otra manera, significa revertir, aliviar, inhibir el avance de o impedir, ya sea parcial o completamente, el crecimiento de tumores, metástasis de tumor y otras células que provocan cáncer post-neoplásicas en un paciente. El término "tratamiento" como se usa en la presente, a no ser que se indique de otra manera, se refiere al acto de tratar.

La frase "un método de tratamiento" o su equivalente, cuando es aplicado por ejemplo a cáncer se refieren a un procedimiento o curso de acción que está diseñado para reducir o eliminar el número de células de cáncer en un animal o aliviar los síntomas de un cáncer. "Un método de tratamiento" de cáncer u otra alteración proliferativa no significa necesariamente que las células de cáncer u otra alteración en efecto serán eliminados, que el número de células o alteración en efecto serán reducidas o que los síntomas de un cáncer u otra alteración serán en efecto aliviados .

El término "agente terapéuticamente efectivo" significa una composición que producirá la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o humano que es buscado por el investigador, veterinario, médico u otro clínico.

El término "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad efectiva" significa la cantidad del compuesto sujeto o combinación que producirá la respuesta biológica o médica de un tejido, sistema, animal o humano que es buscada por el investigador, veterinario, médico u otro clínico.

Los términos "ErbBl" , "HERI" , "receptor del factor de crecimiento epidérmico" y "EGFR" y "cinasa de EGFR" son usados intercambiablemente en la presente y se refieren a EGFR como se revela, por ejemplo en Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881-914 (1987), incluyendo formas mutantes que se presentan en la naturaleza del mismo (por ejemplo, un EGFR mutante de cancelación como en Humphrey et al . PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). erbBl se refiere al gen que codifica el producto de proteína de EGFR.

Como se usa en la presente, el término "inhibidor de cinasa de EGFR" e "inhibidor de EGFR" se refiere a cualquier inhibidor de cinasa de EGFR que es actualmente conocido en el arte o que será identificado en el futuro e incluye cualquier entidad química que, después de administración a un paciente, da como resultado inhibición de una actividad biológica asociada con la activación del receptor de EGF en el paciente, incluyendo cualquiera de los efectos biológicos corriente abajo de otra manera resultantes del enlace de EGFR de su ligando natural. Tales inhibidores de cinasa de EGFR incluyen cualquier agente que puede bloquear la activación de EGFR o cualquiera de los efectos biológicos corriente abajo de la región de EGFR que son relevante para tratar el cáncer en un paciente. Tal inhibidor puede actuar al enlazarse directamente al dominio intracelular de receptor e inhibir su actividad de cinasa. Alternativamente, tal inhibidor puede actuar al ocupar el sitio de enlace de ligando o una porción del mismo del receptor de EGF, haciendo mediante esto el receptor inaccesible a su ligando natural de tal manera que su actividad biológica normal es impedida o reducida. Alternativamente, tal inhibidor puede actuar al modular la dimerización de polipéptidos de EGFR o interacción del polipéptido de EGFR con otras proteínas o mejorar la ubiquitinación y degradación endocitica de EGFR. Los inhibidores de cinasa de EGFR incluyen pero no están limitados a inhibidores de bajo peso molecular, anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, construcciones o construc os antisentido, ARN inhibidores pequeños (esto es, interferencia de ARN mediante dsARN; ARNi) y ribozimas. En una modalidad preferida, el inhibidor de cinasa de EGFR es una molécula orgánica pequeña o un anticuerpo que se enlaza específicamente al EGFR humano.

Inhibidores de función de receptor de EGF han mostrado utilidad clínica y la definición de rutas de señalización del receptor de EGF clave que describen subconjuntos de pacientes más probables de beneficiarse de la terapia se ha puesto un área de investigación importante. Las mutaciones que activan la actividad de cinasa de tirosina de proteína intrínseca del receptor y/o incrementan la señalización corriente abajo han sido observadas en NSCLC y glioblastoma . Estudios in vitro y clínicos han mostrado variabilidad considerable entre líneas de célula de receptor de EGF tipo silvestre y tumores en su respuesta celulares a la inhibición de receptor de EGF, que en parte ha mostrado derivarse de la activación independiente del receptor de EGF de la ruta de fosfatidil inositol 3-cinasa, conduciendo a la fosforilación continua de la cinasa de serina/treonina anti-apoptótica Akt. Los determinantes moleculares a rutas alternativas de la activación de PI3-cinasa e insensibilidad del inhibidor del receptor de EGF consecuente son un área de investigación activa. Por ejemplo, el receptor del factor-1 de crecimiento semejante a insulina (receptor de IgF-1) , que activa fuertemente la ruta de PI3-cinasa, ha sido implicado en resistencia celular a inhibidores de EGFR. Los papeles de las redes de célula-célula y redes de célula-adhesión, que pueden también ejercer señales de supervivencia por medio de la ruta de PI3-cinasa en moderar la insensibilidad a la inhibición de receptor de EGF selectiva son menos claros y serían postulados para impactar la sensibilidad celular al bloqueo del receptor de EGF. La habilidad de las células de tumor para mantener el crecimiento y señales de supervivencia en ausencia de adhesión a matriz extracelular o contacto célula-célula es importante no solamente en el contexto de migración celular y metástasis sino también en mantener la proliferación celular y supervivencia en medios ambientes de tumor semejantes a herida en donde la matriz extracelular es remodelada y la inhibición de contacto celular es disminuida.

Una firma de expresión genética de EMT que se correlaciona con la sensibilidad in vitro de líneas de células NSCLC a erlotinib fue previamente desarrollada. (Yauch et al., 2005, Clin Cáncer Res 11, 8686-8698). Una firma de expresión de EMT a base de fluidigm asociada con fenotipos epiteliales y mesenquimales fue desarrollada en base a este trabajo (figura 1) .

La presente invención está basada en parte en el uso de un procedimiento genómico integrado que combina el análisis de expresión genética con el perfilado de metilación de genoma entero que muestra que los biomarcadores de metilación son aptos de clasificar fenotipos epiteliales y mesenquimales en cáncer (tal como NSCLC) , demostrando que diferencias genoma-amplios en patrones de metilación de ADN están asociadas con subconjuntos biológicamente distintos y clínicamente relevantes de aquel cáncer. El uso de patrones de metilación para clasificar subconjuntos fenotípicos de cánceres utilizando los métodos descritos en la presente es ventajoso ya que requiere menos cantidad de tejido de prueba en comparación con los métodos más tradicionales de análisis a base de ADN y ARN. Este elemento es particularmente útil cuando se analizan muestras clínicas en donde el tejido es limitado.

Un desafio principal en el desarrollo de biomarcadores predictivos es la necesidad de establecer un "punto de corte" robusto para la evaluación prospectiva. Esto es particularmente problemático para ensayos a base de proteínas, tales como inmunohistoquímica. En tanto que es usada ampliamente, la inmunohistoquímica es sometida a un número de desafíos técnicos que limitan su uso en el contexto de desarrollo de biomarcador predictivo. Estás limitaciones incluyen especificidad y sensibilidad de anticuerpo, disponibilidad y estabilidad de epítope y la subjetividad inherente de interpretación de datos por diferentes patólogos (24, 25) . Ensayos moleculares que puedan apalancar el intervalo dinámico y especificidad de PCR son mucho más deseables. Sin embargo, hay también limitaciones con los ensayos a base de PCR: el AR es altamente inestable y requiere que un punto de corte sea definido prospectivamente . Los ensayos de detección de mutación, en tanto que son potencialmente binarios, están limitados por la disponibilidad de puntos calientes de mutación de alta prevalescencia y secuencias objetivo. Como se muestra en los ejemplos, los ensayos de metilación a base de PCR tratan potencialmente muchas de estas cuestiones debido a que tienen muchas de las propiedades de los ensayos de mutación, incluyendo un amplio intervalo dinámico y una lectura esencialmente binaria con sensibilidad similar a los ensayos de mutación, todavía debido al comportamiento correlacionado localmente de los estados de metilación de CpG, las regiones objetivo para el diseño de ensayo pueden ser bastante grandes. Más importantemente, la metilación de ADN puede ser usada para inferir el estado biológico de tumores en mucho de la misma manera como la expresión genética sea usado en el pasado .

Los datos presentados en los ejemplos en la presente demuestran que las células de tumor tales como NSCLC o células de cáncer pancreático, que contienen EGFR tipo silvestre, crecen ya sea en cultivo celular o in vivo, muestran un intervalo de sensibilidades a inhibición por los inhibidores de cinasa de EGFR, dependiendo de si han sufrido una transición epitelial ha mesenquimal (EMT) antes de la EMT, las células de tumor son muy sensibles a inhibición por inhibidores de cinasa de EGFR tales como erlotinib HC1 (Tarceva®) , mientras que las células de tumor que han sufrido una EMT son sustancialmente menos sensibles a inhibición por tales compuestos . Los datos indican que el EMT puede ser un cambio biológico general que determina el nivel de sensibilidad de tumores a inhibidores de cinasa de EGFR. Se demuestra en la presente que el nivel de sensibilidad de tumores a los inhibidores de cinasa de EGFR puede ser determinado al determinar el nivel de biomarcadores expresados por una célula de tumor que son característicos para células ya sea antes o subsecuente a un evento de EMT. Por ejemplo, altos niveles de expresión de célula de tumor de biomarcadores epiteliales tales como e-caderina, indicadores de una célula que todavía no ha sufrido una EMT, se correlacionan con alta sensibilidad a los inhibidores de cinasa de EGFR. Inversamente, los altos niveles de expresión de célula de tumor de biomarcadores mesenquimales tales como vimentina o fibronectina, indicadores de una célula que ha sufrido una EMT, se correlacionan con baja sensibilidad a inhibidores de cinasa de EGFR. Así, estas observaciones pueden formar la base de métodos de diagnóstico para predecir los efectos de inhibidores de cinasa de EGFR sobre el crecimiento de tumor y dar a los oncólogos una herramienta para ayudarlos a escoger el tratamiento más apropiado para sus pacientes.

Como se describe en los ejemplos, el cáncer puede ser diferenciado en tumores semejantes a epiteliales (EL) y tumores semejantes a mesenquimales (ML) en base a los patrones de metilación de ADN. El fenotipo mesenquimal (o una célula de tumor que ha sufrido EMT) está asociado con metilación de genes particulares mostrados en la tabla 1 y tabla 3. Así, la presente invención provee un método para determinar si una célula de tumor tiene un fenotipo mesenquimal, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 1 o tabla 3 en la célula de tumor, en donde la metilación en cualquiera de los sitios de CpG indican que la célula de tumor tiene un fenotipo mesenquimal . Inversamente, la ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 1 o tabla 3 indica que el tumor tiene un fenotipo epitelial.

En una modalidad particular, el método para determinar si una célula de tumor tiene un fenotipo mesenquimal comprende detectar la presencia o ausencia de metilación en sitios de CpG en uno o más de CLDN7 (claudin-7) , HOXC4 (homeobox C4) , CP2L3 (semejante a graynhead-3) , STX2 (sintaxin 2) , RON (receptor estimulantes de macrófago 1) , TBCD (caperona D tubulina-específica) , ESRP1 (proteína 1 reguladora de empalme epitelial) , GRHL2 (semejante agrainyhead 2) , ERBB2 y genes de C20orf55 (cuadro de lectura abierto 55 de cromosoma 20) en donde la presencia de metilación en cualquiera de los sitios de CpG indica que el tumor tiene un fenotipo mesenquimal. Inversamente, la ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG indica que el tumor tiene un fenotipo epitelial. En una modalidad particular, el método comprende detectar la metilación en los sitios de CpG en uno o más de los genes de CLDN7, HOXC4, CP2L3 , STX2 , RON, TBCD, ESRP1, GRHL2. ERBB2 , y C20orf55, en donde la presencia de metilación en cualquiera de los sitios de CpG indica que el tumor tiene un fenotipo mesenquimal . En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en dos de los genes de la tabla 1 o tabla 3 indica que el tumor tiene un fenotipo mesenquimal. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en sitios de CpG en tres de los genes de la tabla 1 o tabla 3 indica que el tumor tiene un fenotipo mesenquimal. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en cuatro de los genes de la tabla 1 o tabla 3 indica que el tumor tiene un fenotipo mesenquimal. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en cinco de los genes de la tabla 1 o tabla 3 indica que el tumor tiene un fenotipo mesenquimal. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en sitios de CpG en dos, tres o cuatro o cinco, seis, siete, ocho o todos los nueves de los genes de CLDN7, H0XC4, CP2L3, STX2, RON, TBCD, ESRP1, GRHL2 y C20orf55 indica que el tumor tiene un fenotipo mesenquimal . En otra modalidad, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en dos, tres o cuatro de CLDN7, RON, ESRP1 y GRHL2 indican que el tumor tiene un fenotipo mesenquimal . En otra modalidad, la detección de la presencia de metilación de los sitios de CpG en todos los cuatros de CLDN7, RON, ESRP1 y GRHL2 indica que el tumor tiene un fenotipo mesenquimal.

Además, la invención provee un método para predecir la sensibilidad del crecimiento de tumor a la inhibición de un inhibidor por EGFR, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilacion de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 1 o tabla 3 en una célula de muestra tomada del tumor, en donde la presencia de metilacion de ADN en cualquiera de los sitios de CpG indica que el crecimiento del tumor es resistente a inhibición con un inhibidor de EGFR. Inversamente, la ausencia de metilacion de ADN en cualquiera de los sitios de CpG indica que el crecimiento del tumor es sensible (esto es, responsivo) a inhibición por un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de presencia de metilacion en sitios de CpG en dos de los genes de la tabla 1 o la tabla 3 indica el crecimiento del tumor es resistente a inhibición con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilacion en los sitios de CpG en tres de los genes de la tabla 1 o tabla 3 indica el crecimiento del tumor es resistente a la inhibición con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de presencia de metilacion en los sitios de CpG en cuatro de los genes de la tabla 1 o tabla 3 indica el crecimiento del tumor es resistente a la inhibición con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en cinco de los genes de la tabla 1 o la tabla 3 indica el crecimiento del tumor es resistente a la inhibición con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de presencia de metilación en los sitios de CpG en dos, tres, o cuatro, cinco, seis, siete, ocho o todo los nueve genes de CLDN7, HOXC4 , CP2L3 , STX2, RON, TBCD, ESRP1, GRHL2 , ErbB2 y C20orf55 indica que el crecimiento del tumor es resistente a inhibición con un inhibidor de EGFR. En otra modalidad, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en dos, tres o cuatro de CLDN7, RON, ESRP1 y GRHL2 indican que el crecimiento del tumor es resistente a inhibición con un inhibidor de EGFR. En otra modalidad, la detección de presencia de metilación en los sitios de CpG en todos los cuatro CLDN7, RON, ESRP, y GRHL2 indica que el crecimiento del tumor es resistente a inhibición con un inhibidor de EGFR.

Otro aspecto de la invención provee un método para identificar un paciente con cáncer que es probable de beneficiarse del tratamiento con el inhibidor de EGFR, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 1 o tabla 3 en una muestra de cáncer del paciente, en donde el paciente es identificado ser probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR en ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG es detectado. Inversamente, la presencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG indica que el paciente es menos probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la ausencia de metilación en los sitios de CpG en dos de los genes de la tabla 1 o tabla 3 indica que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la ausencia de metilación en los sitios de CpG en tres de los genes de la tabla 1 o tabla 3 indica que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la ausencia de metilación en los sitios de CpG en cuatro de los genes de la tabla 1 o tabla 3 indica que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la ausencia de metilación en los sitios de CpG en cinco de los genes de la tabla 1 o tabla 3 indica que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la ausencia de metilación en los sitios de CpG en dos, tres, o cuatro, cinco, seis, siete, ocho o todos los nueve CLDN7, HOXC4, CP2L3, STX2 , RON, TBCD, ESRP1, GRHL2 , ErbB2 genes y C20orf55 indica que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En otra modalidad, la detección de la ausencia de metilación en los sitios de CpG en dos, tres, o cuatro de CLDN7, RON, ESRP1, y GRHL2 indica que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En otra modalidad, la detección de la ausencia de metilación en los sitios de CpG en todos los cuatro de CLDN7, RON, ESRP1, y GRHL2 indica que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En ciertas modalidades, el paciente que se ha sido considerado probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR es administrado con una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de EGFR.

Como se describe en los ejemplos, el fenotipo epitelial en una célula de tumor está asociada con metilación de genes particulares mostrados en la tabla 2 y en tabla 4. Así, la presente invención provee un método para determinar si una célula de tumor tiene un fenotipo epitelial, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los nucleótidos de citosina (sitios de CpG) identificados en la tabla 2 o en la tabla 4 en la célula de tumor, en donde la presencia de metilación en cualquiera de los nucleótidos de citosina (sitios de CpG) indica que la célula de tumor tiene un fenotipo epitelial. Inversamente, la presente invención provee además un método para determinar si una célula de tumor tiene un fenotipo epitelial que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 2 o la tabla 4 en la célula de tumor, en donde la ausencia de metilación en sitios de CpG indica que el tumor tiene un fenotipo mesenquimal .

En una modalidad particular, el método comprende detectar la presencia o ausencia de metilación en los sitios de CpG en uno o más de PCDH8 (protocaderina 8), PEX5L (semejante a factor 5 de biogénesis peroxisomal) , GALR1 (receptor 1 de galanina) , ZEB2 (homeobox 2 de enlace de E-box de manecilla de zinc) y genes de E3 (enzima málica 3) , en donde la presencia de metilación en los sitios de CpG indica que el tumor tiene un fenotipo epitelial. En una modalidad particular, el método comprende detectar la presencia o ausencia de metilación en los sitios de CpG en el gen ZEB2, en donde la presencia de metilación en los sitios de CpG indica que el tumor tiene un fenotipo epitelial. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en dos de los genes de la tabla 2 o tabla 4 indica que el tumor tiene un fenotipo epitelial. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en tres de los genes de la tabla 2 o tabla 4 indica que el tumor tiene un fenotipo epitelial. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en cuatro de los genes de la tabla 2 o tabla 4 indica que el tumor tiene un fenotipo epitelial. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en cinco de los genes de la tabla 2 o tabla 4 indica que el tumor tiene un fenotipo epitelial . En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en cada uno de los genes de PCDH8, PEX5L, GALR1 o ZEB2 indica que el tumor tiene un fenotipo epitelial .

Además, la invención provee un método para predecir la sensibilidad del crecimiento de tumor a inhibición por un inhibidor de EGFR, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados en la tabla 2 o tabla 4 en un célula de muestra tomada de la del tumor, en el que la presencia de la metilación del ADN en cualquiera de los sitios de CpG indica el crecimiento del tumor es sensible a la inhibición con un inhibidor de EGFR. Inversamente, la ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG indica el crecimiento del tumor es resistente a inhibición por un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, el método comprende la detección de metilación de los sitios de CpG de una o más de los genes de PCDH8, PEX5L, GALR1 o ZEB2, en donde la presencia de metilación en cualquiera de los sitios de CpG indica que el crecimiento del tumor es sensible a inhibición con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, el método comprende detectar la metilacion de los sitios de CpG en el gen ZEB2, en donde la presencia de metilacion de los sitios de CpG en el gen de ZEB2 indica el crecimiento del tumor es sensible a inhibición con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilacion en los sitios de CpG en dos de los genes de la tabla 2 o tabla 4 indica el crecimiento del tumor es sensible a inhibición con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilacion en los sitios de CpG en tres de los genes de la tabla 4 indica que el crecimiento del tumor es sensible a inhibición con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilacion en los sitios de CpG en cuatro de los genes de la tabla 4 indica el crecimiento del tumor es sensible a inhibición con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilacion en los sitios de CpG en cinco de los genes de la tabla 4 indica que el crecimiento del tumor es sensible a inhibición con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilacion en los sitios de CpG en cada uno de los genes de PCDH8 , PEX5L, GALR1 o ZEB2 indica que el crecimiento del tumor es sensible a inhibición con un inhibidor de EGFR.

Otro aspecto de la invención provee un método para identificar un paciente con cáncer que es probable de beneficiarse del tratamiento con el inhibidor de EGFR, que comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG identificados de la tabla 2 o tabla 4 en una muestra de cáncer del paciente, en donde el paciente es identificado por ser probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR si se detecta la presencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG. Inversamente, la ausencia de metilación de ADN en cualquiera de los sitios de CpG indica que el paciente es menos probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en dos de los genes de la tabla 2 o tabla 4 indica que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en tres de los genes de la tabla 2 o tabla 4 indica que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en cuatro de los genes de la tabla 2 o tabla 4 indica que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en cinco de los genes de la tabla 2 o tabla 4 indica que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En una modalidad particular, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en dos, tres, o cuatro de PCDH8 , PEX5L, GALR1 o ZEB2 indican que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En otra modalidad, la detección de la presencia de metilación en los sitios de CpG en ZEB2 indica que el paciente es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR. En ciertas modalidades, el paciente que se ha considerado probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR es administrado con una cantidad terapéuticamente efectiva con un inhibidor de EGFR.

Otro aspecto de la invención provee un método de tratamiento de un paciente de cáncer que ha sido previamente identificado como uno probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR utilizando el perfilado de metilación de ADN descrito en la presente, que comprende administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de EGFR.

Otro aspecto de la invención provee un método para seleccionar una terapia para un paciente con cáncer en base a los métodos de perfilado de metilación del ADN descritos en la presente. En una modalidad, el método comprende detectar la presencia o ausencia de ADN en uno de los sitios de CpG identificados de la tabla 2 o tabla 4 en una muestra de cáncer del paciente y seleccionar de un inhibidor de EGFR para la terapia cuando se detecta la presencia de metilación en uno de los sitios de CpG identificados en la tabla 2 o tabla 4. En otra modalidad, el método comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en uno de los sitios de CpG identificados en la tabla 1 o tabla 3 en una muestra de cáncer del paciente y seleccionar un inhibidor de EGFR para la terapia cuando se detecta la ausencia de metilación en uno del uno de los sitios de CpG identificados de la tabla 1 o tabla 3. En ciertas modalidades, el paciente es administrado la cantidad terapéuticamente efectiva del inhibidor de EGFR, tal como erlotinib, cetuximab, o panitumumab, si se selecciona la terapia de inhibidor de EGFR.

El experimentado en las artes médicas, particularmente perteneciente a la aplicación de pruebas de diagnóstico y tratamiento con terapéuticos, reconocerán que los sistemas biológicos pueden exhibir variabilidad y puede no siempre ser completamente predecible y así muchas pruebas de diagnóstico buenas o terapéuticos son ocasionalmente no efectivos. Así, esta finalmente a juicio del médico que atiende determinar el curso de tratamiento más apropiado para un paciente individual, en base a resultados de pruebas, condiciones o historia del paciente y su propia experiencia. Pueden aun haber ocasiones, por ejemplo, cuando el médico escogerá tratar un paciente con un inhibidor de EGFR, aun cuando un tumor no es predicho ser particularmente sensible a inhibidores de cinasa de EGFR, con base en datos de pruebas de diagnóstico o de otros criterios, particularmente si todos o la mayoría de las otras opciones de tratamiento obvias han fallado, o si se anticipa algo de sinergia cuando es dado con otro tratamiento. El hecho de que los inhibidores de EGFR como una clase de fármacos son relativamente bien tolerados en comparación con muchos otros fármacos anti-cáncer, tales como agentes de quimioterapia o citotóxicos más tradicionales usados en el tratamiento del cáncer, hace esto una opción más viable .

Así, la presente invención provee un método para predecir la sensibilidad del crecimiento de célula de tumor a inhibición por un inhibidor de cinasa del EGFR, que comprende: detectar el nivel de metilación del ADN de uno o más (o un panel de) biomarcadores epiteliales en una célula de tumor y predecir la sensibilidad del crecimiento de células de tumor a la inhibición por un inhibidor de EGFR, en donde los niveles de metilación de ADN altos simultáneas de todos los biomarcadores epiteliales de célula de tumor se correlaciona con alta sensibilidad a inhibición por inhibidores de EGFR. En una modalidad particular de este método. Los biomarcadores epiteliales comprenden los genes PCDH8 , PEX5L, GALR1, ZEB2 y ME3 , en donde el alto nivel de expresión simultáneo de los dos biomarcadores epiteliales de célula de tumor se correlaciona con la alta sensibilidad a inhibición por el inhibidor de cinasa de EGFR.

La presente invención también provee un método para predecir la sensibilidad del crecimiento de célula de tumor a inhibición por un inhibidor de cinasa de EGFR, que comprende: determinar el nivel de uno o más (o un panel de) biomarcadores mesenquimales en una célula de tumor y predecir la sensibilidad del crecimiento de célula de tumor a inhibición por un inhibidor de EGFR, en donde altos niveles simultáneos de todos los biomarcadores mesenquimales de la célula de tumor se correlaciona con la resistencia a inhibición por inhibidores de EGFR. En una modalidad particular de este método, los biomarcadores mesenquimales comprenden los genes CLDN7, HOXC4, CP2L3 , TBCD, ESRP1, GRHL2 , y C20orf55, en donde los altos niveles de metilación de ADN simultáneos de por lo menos dos biomarcadores mesenquimales de la célula de tumor se correlaciona con la resistencia a inhibición por el inhibidor de EGFR.

La presente invención también provee un método para predecir si un paciente con cáncer que es afligido con tumor que responderá efectivamente al tratamiento con un inhibidor de cinasa de EGFR, que comprende: determinar el nivel de metilación de ADN de uno o más (o un panel de) biomarcadores epiteliales PCDH8 , PEX5L, GALR1, ZEB2 y ME3 en células del tumor y predecir si el tumor responderá efectivamente al tratamiento con un inhibidor de EGFR, en donde los altos niveles de expresión simultáneo de todos los biomarcadores epiteliales de célula de tumor se correlacionan con un tumor que responderá efectivamente al tratamiento con un inhibidor de EGFR.

La presente invención también provee un método para predecir si un paciente de cáncer que es afligido con un tumor que responderá efectivamente al tratamiento con un inhibidor de cinasa di EGFR, que comprende: determinar el nivel de uno o más (o un panel de biomarcadores mesenquimales) CLDN7 , HOXC4 , CP2L3 , TBCD, ESRP1, GRHL2 y C20orf55 en las células del tumor y predecir si el tumor responderá efectivamente al tratamiento con un inhibidor de EGFR, en donde los altos niveles de metilación de ADN de todos de tales biomarcadores mesenquimales de celular de tumor se correlaciona con un tumor que es resistente al tratamiento con un inhibidor de EGFR.

En los métodos descritos en la presente, la célula de tumor comúnmente será de un paciente diagnosticado con cáncer, una condición precancerosa u otra forma de crecimiento celular anormal y en necesidad de tratamiento. El cáncer puede ser cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) ) , cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, cáncer gástrico, cáncer de pecho, cáncer de colon, cáncer de ovario o cualquiera de una variedad de otros cánceres descritos posteriormente en la presente. El cáncer es uno que se sabe que es potencialmente tratable con un inhibidor de EGFR. La célula de tumor puede ser obtenida del esputo del paciente, saliva, sangre, orina, heces, fluido cerebroespinal o directamente del tumor, por ejemplo, mediante aspirado de aguja fina.

La presencia y/o nivel/cantidad de varios biomarcadores en una muestra puede ser analizada mediante un número de metodologías, muchas de las cuales son conocidas en el arte y entendidas por el experimentado en el arte, incluyendo pero no limitado a inmunohistoquímica ("IHC"), análisis de Western blot, inmunoprecipitación y ensayos de enlace molecular, ELISA, ELIFA, clasificación celular activada por fluorescencia ("FACS"), MassARRAY, proteómicos, ensayos a base de sangre cuantitativos (como por ejemplo ELISA de suero) , ensayos de actividad enzimática bioquímica, en hibridación in situ, análisis de Southern, análisis de Northern, secuenciación de genoma entero, reacción en cadena de polimerasa ("PCR"), incluyendo PCR en tiempo real cuantitativa ("QRT-PCR") y otros métodos de detección tipo amplificación, tales como por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y los semejantes) , ARN-Seq, FISH, análisis de microarreglo, perfilado de expresión génica, y/o análisis serial de expresión genética ("SAGE"), también como cualquiera de la amplia variedad de ensayos que pueden ser efectuados mediante análisis de proteína, genética y/o arreglo de tejido. Protocolos típicos para evaluar el estatus de genes y productos genéticos se encuentran, por ejemplo en Ausubel et al., eds . , 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting) , 4 (Southern Blotting) , 15 (Immunoblotting) y 18 (PCR Analysis) . Inmunoensayos multiplexados tales como aquellos disponibles de Rules Based Medicine o Meso Scale Discovery ( "MSD" ) pueden también ser usados .

Métodos para la evaluación de metilación del ADN son bien conocidos. Por ejemplo, Laird (2010) Nature Reviews Genetics 11:191-203 provee una revisión de análisis de metilación del ADN. En algunas modalidades, métodos para evaluar la metilación incluyen corte aleatoriamente o fragmentación aleatoriamente de ADN genómico, corte del ADN con una enzima de restricción de metilación-dependiente o metilación-sensible y subsecuentemente identificar y/o analizar el ADN selectivamente cortado o sin cortar. La identificación selectiva puede incluir, por ejemplo separar el ADN cortado y sin cortar (por ejemplo, por tamaño) e identificar una secuencia de interés que fue cortada o alternativamente, que no fue cortada. Véase, por ejemplo, patente estadounidense 7, 186,512. En algunas modalidades, el método puede abarcar amplificar el ADN intacto después de digestión con enzimas de restricción, amplificando mediante esto solamente el ADN que no fue escindido por la enzima de restricción en el área amplificada. Véase, por ejemplo, solicitud de patente estadounidense 10/971,986; 11/071,013 y 10/971,339. En algunas modalidades, la amplificación puede ser efectuada utilizando cebadores que son específicos del gen. Alternativamente, se pueden agregar adaptadores a los extremos del ADN fragmentado aleatoriamente, el ADN puede ser digerido con una enzima de restricción de metilación-dependiente o metilación-sensible, el ADN intacto puede ser amplificado utilizando cebadores que se hibridizan a las secuencias de adaptador. En algunas modalidades, una segunda etapa puede ser efectuada para determinar la presencia, ausencia o cantidad de un gen particular en un fondo amplificado de ADN. En algunas modalidades, el ADN es amplificado utilizando PCR cuantitativa en tiempo real.

En algunas modalidades, los métodos comprenden cuantificar la densidad de metilación promedio en una secuencia objetivo dentro de una población de ADN genómico. En algunas modalidades, el método comprende poner en contacto el ADN genómico con una enzima de restricción metilación-dependiente o una enzima de restricción metilación-sensible bajo condiciones que permiten que por lo menos algunas copias de los sitios de escisión de enzima de restricción potencial en el sitio permanezcan sin escindir; cuantificar las copias intactas del sitio y comparar la cantidad del producto amplificado con un valor testigo que representa la cantidad de metilacion del ADN testigo, cuantificando mediante esto la cantidad de metilacion promedio en el sitio en comparación con la densidad de metilacion del ADN testigo.

La cantidad de metilacion de un sitio de ADN puede ser determinada al proveer una muestra de ADN que comprende al sitio, escindir una enzima de AND con restricción que es ya sea metilación-sensible o metilación-dependiente y luego cuantificar la calidad de ADN intacto o cuantificar la cantidad de ADN cortado en el sitio de ADN de interés . La cantidad de ADN intacto o cortado dependerá de la cantidad inicial del ADN genómico que contiene el sitio, la cantidad de metilacion en el sitio y el número (esto es, la fracción) de nucleótidos que están metilados en el ADN genómico. La cantidad de metilacion en un sitio de ADN puede ser determinada al comparar la cantidad de ADN intacto o ADN cortado con un valor testigo que representa la cantidad de ADN intacto o ADN cortado en una muestra de ADN tratada similarmente . El valor testigo puede representar un número conocido o predicho de nucleótidos metilados. El valor testigo puede representar un número conocido o predicho de nucleótidos metilados. Alternativamente, el valor testigo puede representar la cantidad de ADN intacto o ADN cortado del mismo sitio en otra célula (por ejemplo, normal, no enferma) o un segundo sitio.

Al usar la enzima de restricción metilación-sensible o metilación-dependiente bajo condiciones que permiten que por lo menos algunas copias de los sitios de enzima de restricción potenciales en el sitio permanezcan sin escindir y subsecuentemente cuantificar copias intactas restantes y comparar la cantidad con un testigo, la densidad promedio de un sitio puede ser determinada. Si la enzima de restricción metilación-sensible es puesta en contacto con copias de un sitio de ADN bajo condiciones que permiten que por lo menos algunas copias de los sitios de escisión de enzima de restricción potenciales en el sitio permanezcan sin escindir, entonces el ADN intacto restantes será directamente proporcional a la densidad de metilación y así puede ser comparada con un testigo para determinar la densidad de metilación relativa del sito en la muestra. Similarmente, si una enzima de restricción-dependiente es puesta con copias de un sitio de ADN bajo condiciones que permiten que por lo menos una copia del sitio de escisión de enzima de restricción potencial en el sitio permanezcan sin escindir, entonces el ADN intacto restante será inversamente proporcional a la densidad de metilación y así puede ser comparado con un testigo para determinar la densidad de metilación relativa del sitio en la muestra. Tales ensayos son revelados en, por ejemplo solicitud de patente estadounidense no. de serie 10/971,986.

En algunas modalidades, se pueden usar métodos de amplificación cuantitativa (PCR cuantitativa o amplificación lineal cuantitativa) para cuantificar la cantidad de ADN intacto dentro de un sitio flanqueado por cebadores de amplificación enseguida de la digestión de restricción. Métodos de amplificación cuantitativa son revelados en, por ejemplo patentes estadounidenses 6,180,349; 6,033,854 y 5,972,602, como también en, por ejemplo Gibson et al., Genome Research 6:995-1001 (1996); DeGraves et al., Biotechniques 34 (1) : 106-10, 112-5 (2003); Deiman B et al., Mol Biotechnol . 20 (2) : 163-79 (2002) .

Métodos adicionales para detectar metilación de ADN pueden involucrar secuenciación genómica antes y después del tratamiento de ADN con bisulfito. Véase, por ejemplo .g., Frommer et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 89:1827-1831 (1992) . Cuando el bisulfito de sodio es puesto en contacto con ADN, la citosina sin metilar es convertida a uracilo, en donde la citosina metilada no es modificada.

En algunas modalidades, la digestión de enzima de restricción del producto de PCR amplificados de ADN bisulfitos-convertidos es usada para detectar la metilación de ADN. Véase, por ejemplo, Sadri & Hornsby, Nucí. Acids Res. 24:5058-5059 (1996); Xiong y Laird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534 (1997) .

En algunas modalidades, se usa un ensayo de MethyLight solo o en combinación con otros métodos para detectar la metilación de ADN (véase Eads et al., C ncer Res. 59:2302-2306 (1999) ) . Brevemente, en el proceso MethyLight el ADN genómico es convertido en una reacción con bisulfito de sodio (el proceso de bisulfito convierte los residuos de citosina sin metilar a uracilo) . La amplificación de una secuencia de ADN de interés es luego efectuada utilizando cebadores de PCR que se hibridizan a binucleótidos de CpG. Al usar cebadores que se hibridizan solamente a secuencias resultantes de la conversión de bisulfito del ADN sin metilar (o alternativamente a secuencias metiladas que no son convertidas) la amplificación puede indicar el estatus de metilación de secuencias en donde los cebadores se hibridizan. Similarmente, el producto de amplificación puede ser detectado con una sonda que se enlaza específicamente a una secuencia resultante del tratamiento con bisulfito de un ADN sin metilar (o metilado) . Si se desea, ambos cebadores y sondas pueden ser usados para detectar el estatus de metilación. Esto es, kits para uso con MethyLight puede incluir bisulfito de sodio, también como cebadores o sondas marcadas detectablemente (incluyendo pero no limitado a Taqman o sondas de faro molecular) que distinguen entre ADN metilado y sin metilar que han sido tratados con bisulfito. Otros componentes de kit pueden incluir, por ejemplo reactivos necesarios para amplificación de ADN incluyendo pero no limitado a soluciones reguladoras de pH de PCR, desoxinucléotidos y una polimerasa termoestable .

En algunas modalidades, se usa una reacción de Ms-SNuPE (extensión de cebador de un solo nucleótido metilación-sensible) sola o en combinación con otros métodos para detectar la metilación de ADN (véase, Gonzalgo y Jones Nucleic Acids Res. 25:2529-2531 (1997)). La técnica de Ms-SNuPE es un método cuantitativo para determinar la diferencia de metilación en sitios de CpG específicos en base al tratamiento con bisulfito del ADN, seguido por extensión de cebador de un solo nucleótido. Brevemente, el ADN genómico se hace reaccionar con bisulfito de sodio para convertir la citosina sin metilar a uracilo en tanto que deja la 5-metilcitosina sin cambios. La amplificación de la secuencia objetivo deseada es luego efectuada utilizando cebadores de PCR específicos bisulfito-convertido y el producto resultante es aislado y usado como plantilla para el análisis de metilación en el (los) sitio (s) de CpG de interés.

En algunas modalidades, una reacción de PCR metilación-específica ( "MSP" ) es usada sola o en combinación con otros métodos para detectar la metilación de ADN. Un ensayo de MSP abarca la modificación inicial de ADN por bisulfito de sodio, convirtiendo todas las citosinas sin metilar, pero no metiladas a uracilo y subsecuente amplificación con cebadores específicos para el ADN metilado versus sin metilar. Véase Hermán et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, (1996); patente estadounidense 5,786,146. En algunas modalidades, la metilación de ADN es detectada mediante un ensayo de CpG PyroMark de QIAGEN prediseñado por ensayos de metilación de ADN de pirosecuenciación.

En algunas modalidades, el estatus de metilación celular es determinado utilizando análisis de metilación de ADN de alto rendimiento para determinar la sensibilidad a inhibidores de EGFR. Brevemente, el ADN genómico es aislado en una muestra celular o muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de tumor o una muestra de sangre) y es convertido en una reacción con bisulfito de sodio (el proceso de bisulfito convierte los residuos de citosina sin metilar a uracilo) utilizando ensayos estándar en el arte. El producto de ADN convertido por bisulfito es amplificado, fragmento e hibridizado a un arreglo que contiene sitios de CpG a través de un genoma utilizando ensayos estándar en el arte. Enseguida de la hibridización, el arreglo es representado en imagen y procesado para análisis del estatus de metilación utilizando ensayos estándar en el arte. En algunas modalidades, la muestra de tejido es tejido embebido con parafina formalina-fijada (FFPE) . En algunas modalidades, la muestra de tejido es tejido nuevo congelado. En algunas modalidades, el ADN aislado de la muestra de tejido es preamplificado antes de la conversión con bisulfito. En algunas modalidades, el ADN aislado de la muestra de tejido es preamplificado antes de la conversión con bisulfito al utilizar el sistema de RT-PCR de una etapa superscript III de Invitrogen con Platinum Taq. En algunas modalidades, el ADN aislado de la muestra de tejido es preamplificado antes de la conversión con bisulfito utilizando un ensayo a base de Taqman. En algunas modalidades, la reacción con bisulfito de sodio es conducida utilizando el kit de metilación de ADN Zymo EZ. En algunas modalidades, el ADN convertido por bisulfito es amplificado e hibridizado a un arreglo utilizando el kit Infinium HumanMethylation450 Beadchip. En algunas modalidades, el arreglo es representado en imagen en un lector Illumina iScan Reader. En algunas modalidades, los datos de metilación son analizados utilizando el paquete de elementos de programación de Bioconductor lumi. Véase, Du et al., Bioinformatics, 24 (13) : 1547-1548 (2008).

En algunas modalidades, los sitios de metilación de ADN son identificados utilizando PCR de secuenciación de bisulfito (BSP) para determinar la sensibilidad a inhibidores de EGFR. Brevemente, el ADN genómico es aislado de una muestra celular o muestra de tejido (por ejemplo, una muestra de tumor o una muestra de sangre) y es convertido en una reacción con bisulfito de sodio (el proceso de bisulfito convierte los residuos de citosina sin metilar a uracilo) utilizando ensayos estándar en el arte. El producto de ADN convertido por bisulfito es amplificado utilizando cebadores diseñados para ser específicos al ADN convertido por bisulfito (por ejemplo, cebadores bisulfito-específicos) y ligados a vectores para transformación a una célula huésped utilizando ensayos estándar en el arte. Después de la selección de las células huésped que contienen el producto de ADN convertido por bisulfito amplificado por PCR de interés, el producto de ADN es aislado y secuenciado para determinar los sitios de metilación utilizando ensayos estándar en el arte. En algunas modalidades, la muestra de tejido es tejido embebido en parafina formalina-fijado (FFPE) . En algunas modalidades, la muestra de tejido es un tejido de FFPE que ha sido procesado para análisis de IHC; por ejemplo, para expresión genética. En algunas modalidades, la muestra de tejido es un tejido de FFPE que demostró poca o ninguna expresión genética mediante IHC. En algunas modalidades, la muestra de tejido es tejido congelado nuevo. En algunas modalidades, el ADN aislado de la muestra e tejido es preamplificado antes de la conversión con bisulfito. En algunas modalidades, el ADN aislado de la muestra de tejido es preamplificado antes de la conversión con bisulfito al utilizar el sistema de RT-PCR de una etapa superscript III de Invitrogen con Platinum Taq. En algunas modalidades, el ADN aislado de la muestra de tejido es preamplificado antes de la conversión con bisulfito utilizando un ensayo a base de Taqman. En algunas modalidades, la reacción con bisulfito de sodio es conducida utilizando el kit de Methylation-Gold de ADN de Zymo EZ . En algunas modalidades, los cebadores diseñados para ser específicos al ADN convertido con bisulfito son diseñados utilizando los elementos de programación Methyl Primer Express de Applied Biosystems. En algunas modalidades, el producto de ADN convertido por bisulfito es amplificado por PCR utilizando el sistema de RT-PCR de una etapa superscript III de Invitrogen con Platinum Taq. En modalidades adicionales, el producto de ADN convertido por bisulfito amplificado por PCR es ligado a un vector utilizando el kit de clonación de TA TOPO de Invitrogen. En algunas modalidades, la célula huésped es bacteria. En algunas modalidades, el producto de ADN convertido por bisulfito amplificado por PCR aislado de interés es secuenciado utilizando el analizador de ADN 3730x 1 de Applied Biosystems. En algunas modalidades, los cebadores diseñados para ser específicos al ADN convertido por bisulfito son diseñados utilizando los elementos de programación de diseño de ensayo Pyromark de Qiagen. En algunas modalidades, el producto de ADN convertido por bisulfito es amplificado por PCR utilizando el sistema de RT-PCR e una etapa superscript III de Invitrogen con Platinum Taq. En modalidades adicionales, el producto de ADN convertido por bisulfito amplificado por PCR es secuenciado utilizando Pyromark Q24 de Qiagen y analizado con Qiagen con elementos de programación de Pyromark de Qiagen.

En algunas modalidades, los sitios los sitios de metilación de ADN son identificados utilizando PCR específica de metilación cuantitativa (QMSP) para determinar la sensibilidad a inhibidores de EGFR. Brevemente, el ADN genómico es aislado de una muestra celular o muestra de tejido y es convertido en una reacción con bisulfito de sodio (el proceso de bisulfito convierte los residuos de citosina sin metilar a uracilo) utilizando ensayos estándar en el arte. En algunas modalidades, la muestra de tejido es tejido embebido en parafina formalina-fijo (FFPE) . En algunas modalidades, la muestra de tejido es un tejido de FFPE que ha sido procesado para análisis de IHC. En algunas modalidades, la muestra de tejido es un tejido de FFPE que demostró poca o ninguna expresión genética mediante IHC. En algunas modalidades, la muestra de tejido es tejido congelado nuevo. El producto de ADN convertido por bisulfito es amplificado utilizando cebadores diseñados para ser específicos al ADN convertido por bisulfito (por ejemplo, cebadores de PCR específicos de metilación cuantitativos) . El producto de ADN convertido por bisulfito es amplificado con cebadores de PCR específicos de metilación cuantitativos y analizados en cuanto a metilación utilizando ensayos estándar en el arte.

En algunas modalidades, la muestra de tejido es tejido embebido en parafina formalina-fij ado (FFPE) . En algunas modalidades, la muestra de tejido es tejido congelado nuevo. En algunas modalidades, el ADN aislado de la muestra de tejido es preamplificado antes de la conversión con bisulfito utilizando el sistema de RT-PCR de una etapa superscript III de Invitrogen con Platinum Taq. En algunas modalidades, el ADN aislado de la muestra de tejido es clasificado antes de la conversión con bisulfito. En algunas modalidades, el ADN aislado de la muestra de tejido es clasificado antes de la conversión con bisulfito utilizando ensayo a base de Taqman. En algunas modalidades, la reacción con bisulfito de sodio es conocida utilizando un kit disponible comercialmente . En algunas modalidades, la reacción con bisulfito de sodio es conducida utilizando el kit de Methylation-Gold de ADN de Zymo EZ. En algunas modalidades, los cebadores diseñados para ser específicos al ADN convertido con bisulfito son diseñados utilizando los elementos de programación Methyl Primer Express de Applied Biosystems. En algunas modalidades, el ADN convertido por bisulfito es amplificado utilizando un ensayo a base de Taqman. En algunas modalidades, el ADN convertido por bisulfito es amplificado en un dispositivo 7900HT de Applied Biosystems y analizado utilizando elementos de programación de SDS de Applied Biosystems.

En algunas modalidades, la invención provee métodos para determinar la metilación mediante 1) análisis de metilación de muestras de tumor seguido por 2) PCR específica de metilación cuantitativa de ADN extraído del tejido de tumor utilizado en el análisis de IHC de la etapa 1. Brevemente, los cubreobjetos de los portaobjetos de IHC son retirados mediante uno de dos métodos: los portaobjetos con colocados en un congelador por al menos 15 minutos, luego el cubreobjetos es apalancado del portaobjetos en el microscopio utilizando una navaja de afeitar. Los portaobjetos son luego incubados en xileno a temperatura ambiente para disolver los medios de montaje. Alternativamente, los portaobjetos son enjuagados en xileno hasta que el cubreobjetos cae. Esto puede tomar hasta varios días. Todos los portaobjetos son llevados a través de un procedimiento de desparafinización de 5 minutos de xileno (x3) y 5 minutos de etanol al 100% (x2) . Los tejidos son raspados de los portaobjetos con navajas de afeitar y colocados en una solución reguladora del pH de lisis de tejido que contiene proteinasa K e incubados de la noche a la mañana a 56 °C. En casos en donde el tejido está todavía presente después de la incubación, se pueden agregar 10 µ? extra de proteinasa K y el tejido es incubado por otros 30 minutos. La extracción de ADN fue proseguida; por ejemplo, al utilizar un kit de tejido de FFPE de ADN QIAamp. El ADN extraído directamente de los portaobjetos de IHC fue sometido a análisis de QMSP utilizando los cebadores y sondas de QMSP3 como se describe anteriormente.

En algunas modalidades, el ADN convertido por bisulfito es secuenciado mediante una secuenciación intensa. La secuenciación intensa es un proceso, tal como pirosecuenciación directa, en donde una secuencia es leída múltiples veces. La secuenciación intensa puede ser usada para detectar eventos raros tales como mutaciones raras . La secuenciación ultra-intensa de un número limitado de sitios puede ser obtenida mediante pirosecuenciación directa de productos de PCR y mediante secuenciación de más de 100 productos de PCR en una sola corrida. Surge un desafío en la secuenciación de ADN convertido por bisulfito de su complejidad de baja secuencia enseguida de la conversión por bisulfito de residuos de citosina residuos de timina (uracilo) . La secuenciación de bisulfito de representación reducida (RRBS) puede ser introducida para reducir la redundancia de secuencia al seleccionar solamente algunas regiones de genoma para secuenciación mediante fraccionamiento de tamaño de fragmentos de ADN (Laird, PW Nature Reviews 11:195-203 (2010)). El apuntamiento puede ser efectuado mediante captura de arreglo o captura de candado antes de la secuenciación. Por ejemplo, la captura apuntada sobre arreglos fijos o mediante selección híbrida en solución puede enriquecer secuencias apuntadas por una biblioteca de oligonucleótidos de ADN o ARN y puede ser efectuada antes o después de la conversión con bisulfito. Alternativamente, la captura de candado provee eficiencia de enriquecimiento mejorada al combinar la especificidad de recocido incrementada de dos sondas sujetadas y amplificación subsecuente con cebadores universales permite una representación más uniforme que la amplificación con cebadores sitio-específicos.

Métodos de detección de metilación adicionales incluyen pero no están limitados a amplificación de isla de CpG metilada (véase, Toyota et al., Cáncer Res. 59:2307-12 (1999) ) y aquellos descritos en por ejemplo publicación de patente estadounidense 2005/0069879; Rein et al., Nucleic Acids Res. 26 (10): 2255-64 (1998); Olek et al., Nat Genet . 17(3): 275-6 (1997); Laird, P Nature Reviews 11:195-203 (2010) y publicación de PCT WO 00/70090) .

El nivel de metilación de ADN puede ser representado por un Indice de metilación como una proporción del número de copia de ADN metilado (tiempo de ciclo) al tiempo de ciclo de un gen de referencia, que amplifica igualmente tanto los objetivos metilados como los objetivos sin metilar. Un alto nivel de metilación de ADN puede ser determinado por comparación del nivel de metilación de ADN en una muestra de células no neoplásicas, particularmente del mismo tipo de tejido o de células mononucleares de sangre periférica. En una modalidad particular, un alto nivel de metilación de ADN del gen particular es detectable a un nivel más alto en comparación con aquel en una célula normal. En otra modalidad particular, un alto nivel de metilación de ADN es de alrededor de 2X o mayor en comparación con aquel en una célula normal. En una modalidad particular, un alto nivel de metilación de ADN es de alrededor de 3X o mayor en comparación con aquel en una célula normal . En una modalidad particular, un alto nivel de metilación de ADN es de alrededor de 4X o mayor en comparación con aquel en una célula normal. En una modalidad particular, un alto nivel de metilación de ADN es de alrededor de 5X o mayor en comparación con aquel en una célula normal . En una modalidad particular, un alto nivel de metilación de ADN es de alrededor de 6X o mayor en comparación con aquel en una célula normal. En una modalidad particular, un alto nivel de metilación de ADN es alrededor de 7X o mayor en comparación con aquel en una célula normal. En una modalidad particular, un alto nivel de metilación de ADN es alrededor de 8X o mayor en comparación con aquel en una célula normal. En una modalidad particular, un alto nivel de metilación de ADN es alrededor de 9X o mayor en comparación con aquel en una célula normal. En una modalidad particular, un alto nivel de metilación de ADN es alrededor de 10X o mayor en comparación con aquel en una célula normal "Hipometilación" significa que una mayoría de los sitios de CpG posiblemente metilados están sin metilar. En ciertas modalidades, hipometilación significa menos del 50, menos de 45%, menos de 40%, menos de 35%, menos de 30%, menos de 25%, menos de 20%, menos de 15%, menos de 10%, menos de 5% o menos de 1% de los sitios de metilación posibles en una parte del gen están metilados. En todavía otra modalidad, hipometilación significa que menos sitios de metilación posibles están metilados en comparación con un gen que es expresado a un nivel normal, por ejemplo en una célula sin tumor. En otra modalidad, hipometilación significa que ninguno de los sitios de CpG está metilados.

"Hipermetilación" significa que una mayoría de los sitios de CpG posiblemente metilados están metilados. En ciertas modalidades, hipermetilación significa más del 50, más de 45%, más de 40%, más de 35%, más de 30%, más de 25%, más de 20%, más de 15%, más de 10%, menos de 5% o menos de 1% de los sitios de metilación posibles en una parte del gen están metilados. En todavía otra modalidad, hipermetilación significa que más de los sitios de metilación posibles están metilados en comparación con un gen que es expresado a un nivel normal, por ejemplo en una célula sin tumor. En otra modalidad, hipermetilación significa que todos de los sitios de CpG están metilados.

En algunas modalidades, la expresión de un biomarcador en una célula es determinada al evaluar el mARN en una célula. Métodos para la evaluación de mAR en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo ensayos de hibridización utilizando sondas de ADN complementarias (tal como hibridización in situ utilizando ribosondas marcadas específicas para el uno o más genes, técnicas de Northern blot y técnicas relacionadas) y varios ensayos de amplificación de ácido nucleico (tal como RT-PCR utilizando cebadores complementarios específicos para uno o más de los genes y otros métodos de detección tipo amplificación, tales como por ejemplo ADN ramificado, SISBA, TMA y los semejantes) . En algunas modalidades, la expresión de un biomarcador en una muestra de prueba es comparada con una muestra de referencia. Por ejemplo, la muestra de prueba puede ser una muestra de tejido de tumor y la muestra de referencia puede ser de tej ido o células normales tales como PBMC.

Las muestras de mamíferos pueden ser analizadas convenientemente en cuanto a mARN utilizando análisis de Northern, inmnoabsorción o PCR. Además, tales métodos pueden incluir una o más etapas que permiten determinar los niveles de mARN objetivo en una muestra biológica (por ejemplo, al examinar simultáneamente los niveles de una secuencia de ARN testigo comparativa de un gen de "mantenimiento" tal como un miembro de la familia de actina) . Opcionalmente, se puede determinar la secuencia del cADN objetivo amplificado.

Métodos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o detectan mARN, tales como mARN objetivo, en una muestra de tej ido o muestra celular mediante tecnología de microarreglo. Utilizando micro arreglos de ácido nucleico, muestras de mARN de prueba y testigo de muestras de tejidos de prueba y testigo son transcritas inversamente y marcadas para generar sondas de cADN. Las sondas son luego hibridizadas a un arreglo de ácidos nucleicos inmovilizados sobre un soporte sólido. El arreglo está configurado de tal manera que la secuencia y posición de cada miembro del arreglo es conocido. Por ejemplo, una selección de genes cuya expresión se correlaciona con beneficio clínico incrementado o reducido de terapia anti-angiogénica puede ser dispuesto sobre un soporte sólido. La hibridización de una zona marcada con una miembro de arreglo particular indica que la muestra de la cual la sonda fue derivada expresa aquel gen.

De acuerdo con algunas modalidades, la presencia y/o nivel/cantidad es medida al observar los niveles de expresión de proteína de un gen mencionado anteriormente. En ciertas modalidades, el método poner en contacto la muestra biológica con anticuerpos a un biomarcador descrito en la presenta bajo condiciones permisivas para el enlace del biomarcador y detectar si se formó un complejo entre los anticuerpos y el biomarcador. Tal método puede ser un método in vitro o in vivo .

En ciertas modalidades, la presencia y/o nivel/cantidad de proteínas de biomarcador en una muestra son examinadas utilizando IHC y protocolos de teñido. Se ha demostrado que el teñido de IHC de secciones de tejido es un método confiable para determinar o detectar la presencia de proteínas en una muestra. En un aspecto, el nivel de biomarcador es determinado utilizando un método que comprende: (a) efectuar el análisis de IHC de una muestra (tal como una muestra de cáncer del sujeto) con un anticuerpo y (b) determinar el nivel de un biomarcador en la muestra. En algunas modalidades, la intensidad de teñido de IHC es determinada en relación con un valor de referencia.

IHC puede ser efectuado en combinación con técnicas adicionales tales como teñido morfológico y/o hibridización in situ de fluorescencia. Dos métodos generales de IHC están disponibles : ensayos directos y ensayos indirectos . De acuerdo con el primer ensayo, el enlace de un anticuerpo al antígeno objetivo es determinado directamente. Este ensayo directo utiliza un reactivo marcado, tal como una etiqueta fluorescente o un anticuerpo primario enzima-marcado que puede ser visualizado sin interacción de anticuerpo adicional. En un ensayo indirecto típico, el anticuerpo primario sin conjugar se enlaza al antígeno y luego un anticuerpo secundario marcado se enlaza al anticuerpo primario. En donde el anticuerpo secundario es conjugado a un marcador enzimático, un sustrato cromogénico o fluorogénico para proveer visualización del antígeno. La amplificación de señal ocurre debido a que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopes sobre el anticuerpo primario.

El anticuerpo primario y/o secundario usado para ICH comúnmente será marcado con una porción detectable . Numerosos marcadores están disponibles que pueden en general ser agrupados en las siguientes categorías: (a) radioisótopos, tales como as 35S, 1C, 125I, 3H y 131I; (b) partículas de oro coloidales; (c) marcadores fluorescentes incluyendo pero no limitados a quelatos de tierras raras (quelatos de europio) , rojo de Texas, rodamina, fluoresceína, dansilo, lisamina, umbeliferona, ficocriterina, ficocianina o fluoróforos disponibles comercialmente tales como SPECTRUM ORANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de cualquiera de uno o más de los anteriores; (d) varios marcadores de enzima-sustrato están disponibles y la patente estadounidense 4,275,149 provee una revisión de algunos de estos. Ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasa (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; patente estadounidense 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano (HRPO) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacáridos oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa) , oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa y los semejantes.

Ejemplos de combinación de enzima-sustrato incluyen por ejemplo peroxidasa de rábano (HRPO) con hidrógeno peroxidasa como sustrato; fosfatasa alcalina (AP) con para-nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico y ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-ß-D-galactosidasa) o sustrato fluorogénico (por ejemplo, 4-metilumbeliferil^-D-galactosidasa) . Para una revisión general de esto, véase patente estadounidense 4,275,149 y 4,318, 980.

Los especímenes así preparados pueden ser montados y cubiertos con cubreobjetos. Luego, la evaluación del portaobjetos es determinada, por ejemplo utilizando un microscopio y criterios de intensidad de teñido, usados sistemáticamente en el arte pueden ser empleados . En algunas modalidades, una puntuación de patrón de teñido de alrededor de 1+ o superiores diagnóstico y/o prognóstico. En ciertas modalidades, una puntuación de patrón de teñido de alrededor de 2+ o más alto en un ensayo de IHC en el diagnóstico y/o prognóstico. En ciertas modalidades, una puntuación de patrón de teñido de alrededor de 2+ o superior en un ensayo de IHC de diagnóstico y/o prognóstico. En otras modalidades, una puntuación de patrón de teñido de alrededor de 3 o superior es de diagnóstico y/o prognóstico. En una modalidad, se comprenderá que cuando las células y/o tejido de un adenoma de colon son examinados utilizando IHC, el teñido es en general determinado o indagado en la célula y/o tejido de tumor (en contraposición al tejido estromal o de los alrededores que puede estar presente en la muestra) .

En métodos alternativos, la muestra se puede poner en contacto con un anticuerpo específico para el biomarcador bajo condiciones suficientes para que se forma un complejo de anticuerpo-biomarcador y luego detectar el complejo. La presencia del biomarcador puede ser detecta de una diversidad de maneras, tales como mediante Western blot y procedimientos de ELISA para ensayar una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Un amplio intervalo de técnicas de inmunoensayo que utilizan tal formato de ensayo está disponibles, véanse, por ejemplo patentes estadounidenses 4,016,043, 4,424,279 y 4,018,653. Estas incluyen tanto un solo sitio y dos sitios o ensayos de "emparedado" de los tipos no competitivos, también como en los ensayos de enlace competitivos tradicionales . Estos ensayos también incluyen enlace directo del anticuerpo marcado a un biomarcador objetivo.

La presencia y/o nivel/cantidad de un biomarcador seleccionado en una muestra de tejido o célula puede también ser examinada por medio de ensayos funcionales o ensayos a base de actividad. Por ejemplo, si el biomarcador es una enzima, se pueden llevar a cabo ensayos conocidos en el arte para determinar o detectar la presencia de la actividad enzimática dada en la muestra de tejido o célula.

En ciertas modalidades, las muestras son normalizadas tanto por diferencias en la cantidad del biomarcador ensayado y la variabilidad en la calidad de las muestras usadas y variabilidad entre corrida de ensayo. Tal normalización se puede llevar a cabo al detectar e incorporar el nivel de ciertos biomarcadores normalizantes, incluyendo genes de mantenimiento bien conocidos, tales como ACTB. Alternativamente, la normalización puede estar basada en la señal media o mediana de todos los genes ensayados o un subconjunto grande de los mismos (procedimiento de normalización global) . En una base de gen en gen, la cantidad normalizada dividida de un mARN de tumor en sujeto o proteína es comparada con la cantidad encontrada en un subconjunto de referencia. Los niveles de expresión normalizados para mARN o proteína por tumor probado por el sujeto pueden ser expresados como porcentaje de nivel de expresión medido en el conjunto de referencia. La presencia y/o nivel de expresión/cantidad medida en una muestra del sujeto particular a ser analizada caerá a algún percentil dentro de este intervalo, lo que puede ser determinado mediante métodos bien conocidos en el arte.

En ciertas modalidades, el nivel de expresión relativa de un gen es determinado como sigue: Expresión relativa gen 1 muestra 1 = 2 exponencial (Ct gen de mantenimiento - Ct de gen 1) con Ct determinada en una muestra .

Expresión relativa ARN de referencia gen 1 = 2 exponencial (Ct de gen de mantenimiento - Ct de gen 1) con Ct determinada en la muestra de referencia.

Expresión relativa normalizada muestra 1 gen 1 = (expresión relativa gen 1 muestra 1/expresión relativa ARN de referencia a gen 1) x 100 Ct es el ciclo de umbral. El Ct es el número de ciclo al cual la fluorescencia generada dentro de una reacción cruza la línea de umbral.

Todos los experimentos son normalizados a un ARN de referencia, que es una mezcla extensa de ARN de varias fuentes de tejido (por ejemplo, ARN de referencia #636538 de Clontech, Mountain View, CA) . ARN de referencia idéntico es incluido en cada corrida de qRT-PCR, permitiendo la comparación de resultados entre diferentes corridas experimentales. En una modalidad, la muestra es una muestra clínica. En otra modalidad, la muestra es usada en el ensayo de diagnóstico. En algunas modalidades, la muestra es obtenida de un tumor primario o metastático. La biopsia de tejido es frecuentemente usada para obtener una pieza representativa de tejido de tumor. Alternativamente, células de tumor pueden ser obtenidas indirectamente en forma de tejidos o fluidos que son tomados o que se piensa que contienen las células de tumor de interés. Por ejemplo, muestras de lesiones de cáncer de pulmón pueden ser obtenidas mediante resección, broncoscopía, aspiración de aguja fina, cepillados bronquiales o de esputo, fluido pleural o sangre. En algunas modalidades, la muestra incluye células de tumor circulantes; por ejemplo, células de cáncer circulantes en la sangre, orina o esputo. Los genes o productos genéticos pueden ser detectados de tejido de cáncer o tumor o de otras muestras corporales tales como orina, esputo, suero o plasma. Las mismas técnicas discutidas anteriormente para detección de genes objetivo o productos genéticos objetivo en muestras cancerosas pueden ser aplicadas a otras muestras corporales . Las células de cáncer pueden ser desprendidas de lesiones de cáncer y aparecer en tales muestras corporales . Al seleccionar tales muestras corporales, una simple diagnosis prematura puede ser obtenida para estos cánceres. Además, el avance de terapia puede ser monitoreado más fácilmente al probar tales muestras corporales en cuanto a genes o productos genéticos objetivo.

En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejidos de referencia, muestras testigo, células testigo o tejido testigo es una sola muestra o múltiples muestras combinadas del mismo sujeto o individuo que son obtenidas a uno o más puntos en el tiempo diferentes que cuando la muestra de prueba es obtenida. Por ejemplo, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo es obtenido en un punto en el tiempo anterior del mismo sujeto o individuo que cuando la muestra de prueba es obtenida. Tal muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo puede ser útil si la muestra de referencia es obtenida durante la diagnosis inicial de cáncer y la muestra de la prueba es más tarde obtenida cuando el cáncer se vuelve metastático.

En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejidos de referencia, muestras testigo, célula testigo o tejido testigo es múltiples muestras combinadas de uno o más individuos saludables que no son el sujeto o individuo. En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo consiste de múltiples muestras combinadas de uno o más individuos con una enfermedad o alteración (por ejemplo, cáncer) que son el sujeto o individuo. En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestra testigo, célula testigo o tejido testigo consiste de muestras de AR acumuladas de tejidos normales o plasma acumulado o muestras de suero de uno o más individuos que no son el sujeto o individuo. En ciertas modalidades, una muestra de referencia, célula de referencia, tejido de referencia, muestras testigo, células testigo o tejido testigo consiste de muestras de ARN acumuladas de tej idos de tumor o plasma acumulado o muestras de suero de uno o más individuos con una enfermedad o alteración (por ejemplo, cáncer) que no son el sujeto o individuo .

En los métodos de está invención, las muestras de tejido pueden ser fluidos corporales o excreciones tales como sangre, orina, saliva, deposiciones, fluido pleural, fluido linfático, esputo, aceites, fluido prostático, fluido cerebroespinal (CSF) o cualquier otra secreción corporal o derivado de la misma. Sangre pretende incluir sangre entera, plasma, suero o cualquiera derivado de sangre. La determinación de biomarcadores epiteliales o mesenquimales de tumor en tales fluidos corporales o excreciones puede ser algunas veces preferida en circunstancias cuando un método de toma de muestra es invasivo es inapropiado e inconveniente.

En los métodos de está invención, las células de tumor pueden ser una célula de tumor de cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) ) , una célula de tumor de cáncer pancreático, una célula de tumor de cáncer de pecho, una célula de tumor de cáncer de cabeza y cuello, una célula de tumor de cáncer gástrico, una célula de tumor de cáncer de colon, una célula de tumor de cáncer de ovario o una célula de tumor de cáncer de cualquiera de una variedad de otros cánceres como se describe posteriormente en la presente . La célula de tumor es preferiblemente de un tipo conocido o que se espere que exprese EGFR, como lo hacen todas las células de tumor de tumores sólidos. La cinasa de EGFR puede ser tipo silvestre o una forma mutante.

En los métodos de está invención, el tumor puede ser un tumor de cáncer de pulmón (por ejemplo, cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) ) , un tumor de cáncer pancreático, un tumor de cáncer de pecho, un tumor de cáncer de cabeza y cuello, un tumor de cáncer gástrico, un tumor de cáncer de colon, un tumor de cáncer de ovario o un tumor de cáncer de cualquiera de una variedad de otros cánceres como se describe posteriormente en la presente . El tumor es preferiblemente de un tipo cuya célula se sabe o se esperen que expresen EGFR, como lo hacen todos los tumores sólidos. El EGFR puede ser tipo silvestre o de una forma mutante.

Inhibidores y composiciones farmacéuticas Inhibidores de cinasa de EGFR ejemplares apropiados para uso en la invención incluyen, por ejemplo inhibidores de cinasa de EGFR de quinazolino, inhibidores de cinasa de EGFR de pirido pirimidina de EGFR, inhibidores de cinasa de EGFR de pirimido pirimidina, inhibidores de cinasa de EGFR pirrolo-pirimidina, inhibidores de cinasa de EGFR pirazolo-pirimidina, inhibidores de cinasa de EGFR de fenilamino-pirimidina, inhibidores de cinasa de EGFR de oxindol, inhibidores de cinasa de EGFR de indolocarbazol, inhibidores de cinasa de EGFR de ftalazina, inhibidores de cinasa de EGFR de isoflavonas, inhibidores de cinasa de EGFR de quinalona e inhibidores de cinasa del EGFR de tirfostina, tales como aquellos descritos en las siguientes publicaciones de patentes y todas las sales y solvatos aceptables farmacéuticamente de los inhibidores de cinasa de EGFR: publicación de patente internacional WO 96/33980, WO 96/30347, WO 97/30034, WO 97/30044, WO 97/38994, WO 97/49688, WO 98/02434, WO 97/38983, WO 95/19774, WO 95/19970, WO 97/13771, WO 98/02437, WO 98/02438, WO 97/32881, WO 98/33798, WO 97/32880, WO 97/3288, WO 97/02266, WO 97/27199, WO 98/07726, WO 97/34895, WO 96/31510, WO 98/14449, WO 98/14450, WO 98/14451, WO 95/09847, WO 97/19065, WO 98/17662, WO 99/35146, WO 99/35132, WO 99/07701 y WO 92/20642; solicitud de patente europea EP 520722, EP 566226, EP 787772, EP 837063 y EP 682027; patentes estadounidenses 5,747,498, 5,789,427, 5,650,415 y 5,656,643 y solicitud de patente alemana DE 19629652. Ejemplos no limitantes adicionales de inhibidores de cinasa de EGFR de bajo peso molecular incluyen cualquiera de los inhibidores de cinasa de EGFR descritos en Traxler, P., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents 8 (12) :1599-1625.

Ejemplos preferidos específicos de inhibidores de cinasa de EGFR de bajo peso molecular que pueden ser usados de acuerdo con la presente invención incluyen [6,7-bis(2-metoxietoxi) -4-quinazolin-4-il] - (3-etinilfenil) amina (también conocido como OSI-774, erlotinib o TARCEVA™ (erlotinib HC1) ; OSI Pharmaceuticals/Genentech/Roche) (patente estadounidense 5,747,498; publicación de patente internacional WO 01/34574 y Moyer, J.D. et al. (1997) Cáncer Res. 57:4838-4848); CI-1033 (conocido anteriormente como PD183805; Pfizer) (Sherwood et al., 1999, Proc . Am. Assoc. Cáncer Res. 40:723); PD-158780 (Pfizer); AG-1478 (Universidad de California) ; CGP-59326 (Novartis) ; PKI-166 (Novartis) ; EKB-569 (Wyeth) ; GW-2016 (también conocido como G -572016 o ditosilato de lapatinib; GSK) y gefitinib (también conocido como ZD1839 o IRESSA™; Astrazeneca) (Woodburn et al., 1997, Proc. Am. Assoc. Cáncer Res. 38:633). Un inhibidor de cinasa de EGFR de bajo peso molecular particularmente preferido que puede ser usado de acuerdo con la presente invención es [6,7-bis (2-metoxietoxi) -4 -quinazolin-4 -il] - (3-etinilfenil) amina (esto es, erlotinib) , su sal de clorhidrato (esto es, erlotinib HC1, TARCEVA™) u otras formas de sal (por ejemplo, mesilato de erlotinib) .

Los inhibidores de cinasa de EGFR a base de anticuerpo incluyen cualquier anticuerpo anti-EGFR o fragmento de anticuerpo que pueda bloquear parcial o completamente la activación de EGFR por su ligando natural. Ejemplos no limitantes de inhibidores de cinasa de EGFR a base de anticuerpo incluyen aquellos descritos en Modjtahedi, H., et al., 1993, Br. J. Cáncer 67:247-253; Teramoto, T. , et al . , 1996, Cáncer 77:639-645; Goldstein et al., 1995, Clin. Cáncer Res. 1:1311-1318; Huang, S. M. , et al., 1999, Cáncer Res. 15:59(8) : 1935-40; and Yang, X., et al., 1999, Cáncer Res. 59:1236-1243. Así, el inhibidor de cinasa de EGFR puede ser el anticuerpo monoclonal Mab E7.6.3 (Yang, X.D. et al. (1999) Cáncer Res. 59:1236-43) o Mab C225 (número de acceso ATCC HB-8508) o un anticuerpo of fragmento de anticuerpo que tiene la especificidad de enlace del mismo. Inhibidores de cinasa de EGFR de anticuerpo monoclonal apropiados incluyen pero no están limitado a IMC-C225 (también conocido como cetuximab o ERBITUX™ ; Imclone Systems) , ABX-EGF (Abgenix) , EMD 72000 (Merck KgaA, Darmstadt) , RH3 (York Medical Bioscience Inc.), y MDX-447 (Medarex/ Merck KgaA) .

Los métodos de esta invención pueden extenderse a aquellos compuestos que inhiben EGFR y un objetivo adicional. Estos compuestos son referidos en la presente como "inhibidores biespecífieos" . En una modalidad, el inhibidor biespecífico es un inhibidor HER3/EGFR, EGFR/HER2 , EGFR/ HER4 o c-Met de EGFR, biespecífico . En una modalidad, el inhibidor biespecífico es un anticuerpo biespecífico . En una modalidad, el inhibidor biespecífico es un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio de enlace de antígeno que se enlaza específicamente a EGFR y un segundo objetivo. En una modalidad, el inhibidor biespecífico es un anticuerpo biespecífico que comprende un dominio de enlace de antígeno que se enlaza biespecíficamente a HER3 y EGFR. En una modalidad, el inhibidor de HER3/EGFR biespecífico es un anticuerpo biespecífico que comprende dos dominios de enlace de antígeno idénticos. Tales anticuerpos son descritos en US 8,193,321, 20080069820, WO2010108127 , US20100255010 y Schaefer et al, Cáncer Cell, 20: 472-486 (2011). En una modalidad, el HER2/EGFR específico es lapatinib/GW572016.

Inhibidores a base de anticuerpos adicionales pueden ser criados de acuerdo con métodos conocidos al administrar el antígeno o epítope apropiado a un animal huésped seleccionado, por ejemplo, a partir de cerdos, vacas, caballos, conejos, cabras, ovejas, y ratones, entre otros. Varios adyuvantes conocidos en el arte pueden ser usados para mejorar la producción de anticuerpos.

Aunque los anticuerpos útiles en la práctica de la invención pueden ser policlonales, los anticuerpos monoclonales son preferidos . Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados y aislados utilizando cualquier técnica que se proporciona para la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Las técnicas para la producción y aislamiento incluyen pero no están limitadas a la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (Nature, 1975, 256: 495-497) ; la técnica del hibridoma de la célula B humana (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cote et al., 1983, Proc . Nati. Acad. Sci . USA 80: 2026-2030); y la técnica del hibridoma EBV (Colé et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96).

Alternativamente, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena (véase por ejemplo, Patente de los Estados Unidos No. 4,946,778) pueden ser adaptadas para producir anticuerpos de una sola cadena con especificidad deseada. Los inhibidores a base de anticuerpo útiles en la práctica de la presente invención tabién incluyen fragmentos de anticuerpo que incluyen pero no limitados a fragmentos F (ab ' ) . sub.2 , que pueden ser generados mediante digestión de pepsina de una molécula de anticuerpo intacta, y fragmentos de Fab, que pueden ser generados al reducir los puentes de disulfuro de los fragmentos de F(ab' ) .sub.2. Alternativamente, bibliotecas de expresión de Fab y/o scFv pueden ser construidas (véase por ejemplo, Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281) para permitir la identificación rápida de fragmentos que tienen la especificidad deseada.

Técnicas para la producción y aislamiento de anticuerpos monoclonales y fragmentos de anticuerpo son bien conocidas en el arte, y son descritas en Harlow y Lañe, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, y en J. W. Goding, 1986, The Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, Londres. Los anticuerpos anti-EGFR humanizados y fragmentos de anticuerpo también pueden ser preparados de acuerdo con técnicas conocidas tales como aquellas descritas en Vaughn, T. J. et al., 1998, Nature Biotech. 16:535-539 y referencias citadas en las mismas, y tales anticuerpos o fragmentos de los mismos también son útiles en la práctica de la presente invención.

Inhibidores para uso en la presente invención pueden alternativamente estar basados en constructos de oligonucleótido de antisentido. Oligonucleótidos antisentido, incluyendo moléculas de ARN anti-sentido y moléculas de AND anti-sentido, actuarían para bloquear directamente la traducción al mARN objetivo al enlazarse al mismo e impedir así la traducción de proteína o incrementar la degradación de mARN, disminuyendo así el nivel de la proteína objetivo, y así la actividad en una célula. Por ejemplo, oligonucleótidos antisentido de al menos alrededor de 15 bases y complementarios a regiones únicas a la secuencia del transcripto de mARN que codifican EGFR o HER2 pueden ser sintetizados, por ejemplo, mediante técnicas de fosfodiéster convencionales y administrados por ejemplo, mediante inyección intravenosa o infusión. Métodos para usar técnicas antisentido para inhibir específicamente la expresión genética de genes cuya secuencia es conocida, son bien conocidos en el arte (véase por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,566,135; 6,566,131; 6,365,354; 6,410,323; 6,107,091; 6,046,321; y 5,981,732).

Los ARN inhibidores pequeños (los siARN) también pueden funcionar como inhibidores para uso en la presente invención. La expresión genética objetivo puede ser reducida al poner en contacto el tumor, sujeto o célula con un ARN de doble hebra pequeño (dsARN) , o un vector o constructo provocando la producción de un ARN de doble hebra pequeño, de tal manera que la expresión del gen objetivo es inhibida específicamente (es decir, ARN de interferencia o ARNi) . Métodos para seleccionar un dsARN apropiada o vector de codificación de dsARN son bien conocidos en el arte para genes cuya secuencia es conocida (véase por ejemplo, Tuschi, T., et al. (1999) Genes Dev. 13 (24) : 3191-3197 ; Elbashir, S.M. et al. (2001) Nature 411:494-498; Hannon, G.J. (2002) Nature 418:244-251; McManus, M.T. y Sharp, P. A. (2002) Nature Reviews Genetics 3:737-747; Bremmelkamp, T.R. et al. (2002) Science 296:550-553; Patentes de los Estados Unidos Nos. 6,573,099 y 6,506,559; y Publicaciones de Patente Internacional Nos. WO Los ribozimas también pueden funcionar como inhibidores para uso en la presente invención. Los ribozimas son moléculas de ARN enzimáticas aptas de catalizar la escisión específica del ARN. El mecanismo de acción de la ribozima involucra hibridación específica de la molécula de ribozima al ARN objetivo complementario, seguido por escisión endonucleolítica . Moléculas de ribozima de horquilla o de porción de cabeza de martillo diseñadas que catalizan específica y eficientemente la escisión endonucleolítica de secuencias de mARN son mediante esto útiles en el alcance de la presente invención. Los sitios de escisión de ribozima específicos dentro de cualquier objetivo de ARN potencial son identificados inicialmente al explorar la molécula objetivo en cuanto a sitios de escisión de ribozima, que incluyen típicamente las siguientes secuencias, GUA, GUU, y GUC. Una vez identificadas, las secuencias de ARN cortas de entre alrededor de 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del gen objetivo que contiene el sitio de escisión puede ser evaluada en cuanto a elementos estructurales predichos, tales como estructura secundaria, que pueden volver a la secuencia de oligonucleótidos no apropiada. La conveniencia de objetivos candidatos puede también ser evaluada al probar su accesibilidad a la hibridación al probar su accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios, utilizando, por ejemplo, ensayos de protección de ribonucleasa .

Tanto los oligonucleótidos antisentido como los ribozimas útiles como inhibidores pueden ser preparados mediante métodos conocidos. Estas incluyen técnicas para la síntesis química tales como, por ejemplo, síntesis química de fosforamadita en fase sólida. Alternativamente, las moléculas de ARN anti-sentido puede ser generada mediante transcripción in vitro o in vivo de secuencias de ADN que codifican la molécula de ARN. Tales secuencias de ADN pueden ser incorporadas en una amplia variedad de vectores que incorporan promotores de polimerasa de ARN apropiados tales como los promotores de T7 o SP6 polimerasa. Varias modificaciones a los oligonucleótidos de la invención pueden ser introducidas como medios para incrementar la estabilidad intracelular y vida media. Las modificaciones posibles incluyen pero no están limitadas a la adición de secuencias de flanqueo de ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos para los extremos 5' y/o 3' de la molécula, o el uso de fosforotioato o 2 ' -0-metilo en lugar que enlaces fosfodiesterasa dentro de la cadena fundamental del oligonucleótido .

En el contexto de los métodos de tratamiento de esta invención, los inhibidores (tales como un inhibidor de EGFR) son usados como una composición comprendida de un portador aceptables farmacéuticamente y una cantidad terapéuticamente efectiva no tóxica de un compuesto inhibidor de cinasa de EGFR (incluyendo sales aceptables farmacéuticamente del mismo) .

El término "sales aceptables farmacéuticamente" se refiere a sales preparadas a partir de bases o ácidos no tóxicos aceptables farmacéuticamente. Cuando un compuesto de la presente invención es ácido, su sal correspondiente puede ser preparada convenientemente a partir de bases no tóxicas aceptables farmacéuticamente, incluyendo bases inorgánicas y bases orgánicas . Las sales derivadas de tales bases inorgánicas incluyen sales de aluminio, amonio, calcio, cobre (cúprico y cuproso) , férricas, ferrosa, de litio, de magnesio, de manganeso (mangánicas y manganosas) , de potasio, de sodio, de zinc y los semejantes. Particularmente preferidas son las sales de amonio, de calcio, de magnesio, de potasio y de sodio. Las sales derivadas a partir de bases no tóxicas orgánicas aceptables farmacéuticamente incluyen sales de aminas primarias, secundarias y terciarias, también como aminas cíclicas y aminas sustituidas tales como aminas sustituidas que se presentan en la naturaleza y sintetizadas . Otras bases no tóxicas orgánicas aceptables farmacéuticamente de las cuales sales pueden ser formadas incluyen resinas de intercambio iónico tales como, por ejemplo, arginina, betaína, cafeína, colina, ' ,?' -dibenciletilendiamina, dietilamina, 2-dietilaminoetanol, 2-dimetilaminoetanol, etanolamina, etilendiamina, N-etilmorfolina, N-etilpiperidina, glucamina, glucosamina, histidina, hidrabamina, isopropilamina, lisina, metilglucamina, morfolina, piperazina, piperidina, resinas de poliamina, procaína, purinas, teobromina, trietilameina, trimetilamina, tripropilamina, trometamina y los semejantes.

Cuando un compuesto usado en la presente invención es básico, su sal correspondiente puede ser preparada convenientemente a partir de ácidos no tóxicos aceptables farmacéuticamente, incluyendo ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos. Tales ácidos incluyen, por ejemplo, ácido acético, bencensulfónico, benzoico, alcanforsulfónico, cítrico, etansulfónico, fumárico, glucónico, glutámico, bronhídrico, clorhídrico, isetiónico, láctico, maleico, málico, mandélico, metansulfónico, múcico, nítrico, pamoico, pantoténico, fosfórico, succínico, sulfúrico, tartárico, p-toluensulfónico y los semejantes. Particularmente preferidos son los ácidos cítrico, bromhídrico, clorhídrico, maleico, fosfórico, sulfúrico y tartárico.

Las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención comprenden un compuesto inhibidor (incluyendo sales aceptables farmacéuticamente del mismo) como ingrediente activo, pueden incluir un portador aceptable farmacéuticamente y opcionalmente otros ingredientes o adyuvantes terapéuticos. Otros agentes terapéuticos pueden incluir aquellos agentes citotóxicos, quimioterapéuticos o anti-cáncer, o agentes que mejoran los efectos de tales agentes, como se enlista anteriormente. Las composiciones incluyen composiciones apropiadas para administración oral, rectal, tópica, y parenteral (incluyendo subcutánea, intramuscular, e intravenosa) , aunque la ruta más apropiada en cualquier caso dependerá del huésped particular, y naturaleza y severidad de las condiciones por las cuales el ingrediente activo es administrado. Las composiciones farmacéuticas pueden ser presentadas convenientemente en forma de dosificación unitaria y prepararse por cualquiera de los métodos bien conocidos en el arte de farmacia.

En la práctica, los compuestos inhibidores (incluyendo sales aceptables farmacéuticamente de los mismos) de esta invención pueden ser combinados como el ingrediente activo en mezcla íntima con un portador farmacéutico de acuerdo con técnicas de composición farmacéutica convencionales. El portador puede tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparación deseada para administración, por ejemplo oral o parenteral (incluyendo intravenosa) . Así, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden ser presentadas como unidades discretas apropiadas para administración oral tales como cápsulas, sacos o tabletas que cada una contiene una cantidad predeterminada del ingrediente activo. Además, las composiciones pueden ser presentadas como un polvo, como gránulos, como una solución, como una suspensión en un líquido acuoso, como un líquido no acuoso, como una emulsión de aceite en agua, o como una emulsión líquida de agua en aceite. Además de las formas de dosificación comunes resumidas anteriormente, un compuesto inhibidor (incluyendo sales aceptables farmacéuticamente de cada componente del mismo) también puede ser administradas por medios de liberación controlada y/o dispositivos de liberación. Las composiciones combinadas pueden ser preparadas por cualquiera de los métodos de farmacia. En general, tales métodos incluyen una etapa de traer en asociación los ingredientes activos con el portador que constituye uno o más ingredientes necesarios. En general, las composiciones son preparadas al mezclar uniforme e íntimamente el ingrediente activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos . El producto puede luego ser embalado convenientemente a la presentación deseada.

Un compuesto inhibidor (incluyendo sales aceptables farmacéuticamente del mismo) usado en esta invención, puede también ser incluido en las composiciones farmacéuticas en combinación con uno o más de otros compuestos terapéuticamente activos . Otros compuestos terapéuticamente activos pueden incluir aquellos agentes citotóxicos, quimioterapéuticos o anti-cáncer, o agentes que mejoran los efectos de tales agentes, como se enlistan anteriormente.

Así, en una modalidad de esta invención, la composición farmacéutica puede comprender un compuesto inhibidor en combinación con un agente anticáncer, en donde el agente anti-cáncer es un miembro seleccionado del grupo que consiste de fármacos alquilantes, antimetabolitos, inhibidores de microtúbulos , podofilotoxinas, antibióticos, nitrosoureas , terapias de hormonas, inhibidores de cinasa, activadores de apoptosis de células de tumor, y agentes antiangiogénicos .

El portador farmacéutico empleado puede ser, por ejemplo, un sólido, líquido, o gas. Ejemplos de portadores sólidos incluyen lactosa, tierra alba, sacarosa, talco, gelatina, agar, pectina, acacia, estearato de magnesio, y ácido esteárico. Ejemplos de portadores líquidos son jarabe de azúcar, aceite cacahuate, aceite de oliva, y agua. Ejemplos de portadores gaseosos incluyen dióxido de carbono y nitrógeno .

En la preparación de las composiciones para la forma de dosificación oral, cualquier medio farmacéutico conveniente puede ser empleado. Por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes, agentes saborizantes, conservadores, agentes colorantes, y los semejantes pueden ser usados para formar preparaciones líquidas orales tales como suspensiones, elíxires y soluciones; en tanto que portadores tales como almidones, azúcares, celulosa microcristalina, diluyentes, agentes de granulación, lubricantes, aglutinantes, agentes desintegrantes, y los semejantes pueden ser usados para formar preparaciones sólidas orales tales como polvos, cápsulas y tabletas. Debido a su facilidad de administración, las tabletas y cápsulas son las unidades de dosificación oral preferidas mediante lo cual se emplean portadores farmacéuticos sólidos. Opcionalmente, las tabletas pueden ser cubiertas mediante técnicas acuosas o no acuosas estándar.

Una tableta que contiene la composición usada para esta invención puede ser preparada mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más ingredientes o adyuvantes accesorios . Las tabletas comprimidas pueden ser preparadas mediante compresión, en una máquina apropiada, el ingrediente activo en una forma que fluye libremente tal como polvo o gránulos, opcionalmente mezclada con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, agente tensioactivo o dispersante. Las tabletas moldeadas pueden ser fabricadas mediante moldeo en una máquina apropiada, una mezcla del compuesto en polvo humedecida con un diluyente líquido inerte . Cada tableta preferiblemente contiene de alrededor de 0.05 mg a alrededor de 5 g del ingrediente activo y cada saco o cápsula contiene preferiblemente de alrededor de 0.05 mg a alrededor de 5 g del ingrediente activo.

Por ejemplo, una formulación destinada para la administración oral a humanos puede contener de alrededor de 0.5 mg a alrededor de 5 g de agente activo, combinado con una cantidad apropiada y conveniente de material portador que puede variar de alrededor de 5 a alrededor de 95 por ciento de la composición total. Las formas de dosificación unitarias en general contendrán de entre alrededor de 1 mg a alrededor de 2 g del ingrediente activo, comúnmente 25 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 400 mg, 500 mg, 600 mg, 800 mg o 1000 mg.

Las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención apropiadas para la administración parenteral pueden ser preparadas como soluciones o suspensiones de los compuestos activos en agua. Un surfactante apropiado puede ser incluido tal como, por ejemplo, hidroxipropilcelulosa . Las dispersiones también pueden ser preparadas en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos en aceites. Además, un conservador puede ser incluido para impedir el crecimiento perjudicial de microorganismos.

Las composiciones farmacéuticas usadas en la presente invención apropiadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles. Además, las composiciones pueden estar en forma de polvos estériles para la preparación extemporánea de tales soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma inyectable final debe ser estéril y debe ser efectivamente fluida para una fácil aplicación con jeringa. Las composiciones farmacéuticas deben ser estables bajo las condiciones de manufactura y almacenamiento; así, preferiblemente deben ser conservadas contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido) , aceites vegetales, y mezclas apropiadas de los mismos .

Las composiciones farmacéuticas para la presente invención pueden estar en una forma apropiada para aplicación tópica tal como, por ejemplo, un aerosol, crema, pomada, loción, polvo fino, o los semejantes. Además, las composiciones pueden estar en una forma apropiada para uso en dispositivos transdérmicos . Estas formulaciones pueden ser preparadas, utilizando un compuesto inhibidor (incluyendo sales aceptables farmacéuticamente del mismo) , via métodos de procesamiento convencionales. Como un ejemplo, una crema o pomada se prepara al mezclar material hidrofílico y agua, junto con alrededor de 5% en peso a alrededor de 10% en peso del compuesto, para producir una crema o pomada que tenga una consistencia deseada.

Las composiciones farmacéuticas para esta invención pueden estar en una forma apropiada para administración rectal en donde el portador es un sólido. Es preferible que la mezcla forme supositorios de dosis unitaria. Los portadores apropiados incluyen mantequilla de cacao y otros materiales comúnmente usados en el arte. Los supositorios pueden ser formados convenientemente al mezclar primero la composición con el (los portador (es) reblandecidos o fundidos seguidos por enfriamiento y formación en moldes.

Además de los ingredientes de portador mencionados anteriormente, las formulaciones farmacéuticas descritas anteriormente pueden incluir, como sea apropiado, uno o más ingredientes de portador adicionales tales como diluyentes, soluciones reguladoras del pH, agentes saborizantes, aglutinantes, agentes tensioactivos , espesantes, lubricantes, conservadores (incluyendo anti-oxidantes) y los semejantes. Además, otros adyuvantes pueden ser incluidos para volver a la formulación isotónica con la sangre del recipiente destinado. Composiciones que contienen un compuesto inhibidor (incluyendo sales aceptables farmacéuticamente del mismo) pueden también ser preparadas en forma de polvo o en forma de concentrado líquido.

Los niveles de dosificación para los compuestos usados para llevar a la práctica está invención serán aproximadamente como se describe en la presente o como se describe en el arte para estos compuestos. Sin embargo, se entenderá que el nivel de dosis específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores incluyendo la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administración, ruta de administración, velocidad de excreción, combinación de fármacos y la severidad de la enfermedad particular que sufre terapia.

Muchos métodos experimentales alternativos conocidos en el arte pueden ser sustituidos exitosamente por aquellos descritos específicamente en la presente en la práctica de esta invención, por ejemplo como se describe en muchos de los excelentes manuales y libros de texto disponibles en las áreas de tecnologías relevantes a esta invención (por ejemplo, Using Antibodies, A Laboratory Manual, editado por Harlow, E. y Lañe, D., 1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (por ejemplo ISBN 0-87969-544-7); Roe B.A. et. al. 1996, DNA Isolation and Sequencing (Essential Techniques Series), John iley & Sons. (por ejemplo, ISBN 0-471-97324-0); Methods in Enzymology: Chimeric Genes and Proteins", 2000, ed. J.Abelson, M. Simón, S.Emr, J.Thorner. Academic Press ; Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2001, 3a edición, por Joseph Sambrook y Peter MacCallum, (the former Maniatis Cloning manual) (por ejemplo, ISBN 0-87969-577-3) ; Current Protocols in Molecular Biology, Ed. Fred M. Ausubel, et . al. John Wiley y Sons (por ejemplo, ISBN 0-471-50338-X) ; Current Protocols in Protein Science, Ed. John E. Coligan, John Wiley & Sons (por ejemplo, ISBN 0-471-11184-8) y Methods in Enzymology: Guide to protein Purification, 1990, Vol . 182, Ed. Deutscher, M.P., Acedemic Press, Inc. (por ejemplo, ISBN 0-12-213585-7) ) o como se describe en muchos de los sitios web de universidades y comerciales dedicados a describir métodos experimentales de biología molecular.

Se apreciará por aquel de habilidad en las artes médicas que la manera exacta de administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor como se describe en la presente (por ejemplo, un inhibidor de cinasa de EGFR, inhibidor de cinasa de EGFR bisespecífico o inhibidor de HER2) enseguida de la diagnosis de la sensibilidad probable del paciente al inhibidor será a discreción del médico que atiende. El modo de administración, incluyendo dosificación, combinación con otros agentes anti-cáncer, sincronización y frecuencia de administración y los semejantes serán afectados por la diagnosis de la sensibilidad probable del paciente al inhibidor, también como la condición o historia del paciente. Así, aun paciente diagnosticado con tumores predichos para ser relativamente insensibles al tipo de inhibidor todavía se pueden beneficiar del tratamiento con tal inhibidor, particularmente en combinación con otros agentes anti-cáncer o agentes que pueden alterarla sensibilidad del tumor al inhibidor.

Por propósitos de la presente invención, "coadministración de" y "co-administración" de un inhibidor con un agente anti-cáncer adicional (ambos componentes referidos posteriormente en la presente como los "dos agentes activos") se refieren a cualquier administración de los dos agentes activos, ya sea separada o conjuntamente, en donde los dos agentes activos son administrados como parte de un régimen de dosis apropiado diseñado para obtener el beneficio de la terapia combinada. Así, los dos agentes activos pueden ser administrados ya sea como parte de la misma composición farmacéutica o en composiciones farmacéuticas separadas. El agente adicional puede ser administrado antes de, al mismo tiempo como o subsecuente a la administración del inhibidor o en alguna combinación de los mismos . En donde el inhibidor es administrado al paciente a intervalos repetidos, por ejemplo durante un curso de tratamiento estándar, el agente adicional puede ser administrado antes de, al mismo tiempo como o subsecuente a cada administración del inhibidor o alguna combinación de los mismos o a intervalos diferentes en relación con el tratamiento del inhibidor o en una sola dosis antes de o en cualquier tiempo durante o subsecuente al curso del tratamiento con el inhibidor.

El inhibidor comúnmente será administrado al paciente en un régimen de dosis que provee el tratamiento más efectivo del cáncer (tanto desde puntos de vista de eficacia como de seguridad) para el cual el paciente es tratado, como es conocido en el arte y como se revela por ejemplo en la publicación de patente internacional WO 01/34574. Al llevar a cabo el método de tratamiento de la presente invención, el inhibidor puede ser administrado de cualquiera manera efectiva conocida en el arte, tal como mediante ruta oral, tópica, intravenosa, intra-peritoneal , intramuscular, intra-articular, subcutánea, intranasal, intra-ocular, vaginal, rectal o intradérmica, dependiendo del tipo de cáncer que es tratado, el tipo de inhibidor que es usado (por ejemplo, molécula pequeña, anticuerpo, ARNi, ribozima o constructo antisentido) y el juicio médico del médico que prescribe en base por ejemplo a los resultados de estudios clínicos publicados.

La cantidad de inhibidor administrado y la señalización de administración del inhibidor dependerán del tipo (especie, género, edad, peso, etc.) y la condición del paciente que es tratado, la severidad de la enfermedad o condición que es tratada y de la ruta de administración. Por ejemplo, inhibidores de molécula pequeña pueden ser administrados a un paciente en dosis que varían de 0.001 a 100 mg/kg de peso corporal por día o por semana en una sola dosis o dosis dividida o mediante infusión continua (véase, por ejemplo publicación de patente internacional WO 01/34574) . En particular, erlotinib HC1 puede ser administrado a un paciente en dosis que varían de 5-200 mg por día o 100-1600 mg por semana, en una sola dosis o dosis dividida o mediante infusión continúa. Una dosis preferida de 150 mg/día. Los inhibidores a base de anticuerpo o antisentido, ARNi o constructos de ribozima, pueden ser administrados a un paciente en dosis que varían de 0.1 a 100 mg/kg de peso corporal por día o por semana en una sola dosis o dosis dividida o mediante infusión continúa. En algunas instancias, niveles de dosificación por debajo del límite inferior del intervalo anterior pueden ser más que apropiados, mientras que en otros casos dosis todavía más grandes pueden ser empleadas sin provocar ningún efecto secundario dañino, a condición de que tales dosis más grandes sean divididos primero en varias dosis pequeñas para administración en todo el día.

Los inhibidores y otros agentes adicionales pueden ser administrados ya sea separada o conjuntamente por la misma ruta o rutas diferentes y en una amplia variedad de formas de dosificación diferentes. Por ejemplo, el inhibidor es administrado de preferencia oral o parenteralmente . En donde el inhibidor es erlotinib HCl (TARCEVA™) , la administración oral es preferible . Tanto el inhibidor como otros agentes adicionales pueden ser administrados en una sola dosis o múltiples dosis .

El inhibidor puede ser administrado con varios portadores inertes aceptables farmacéuticamente en forma de tabletas, cápsulas, pastillas, trociscos, caramelos duros, polvos, administraciones, cremas, salvas, supositorios, gelatinas, pastas, lociones, pomadas, elixires, jarabes y los semejantes. La administración de tales formas de dosificación se puede llevar a cabo en una sola dosis o múltiples dosis. Los portadores incluyen diluyentes sólidos o rellenos o cargas, medios acuosos estériles y varios solventes orgánicos no tóxicos, etc. Composiciones farmacéuticas orales pueden ser apropiadamente endulzadas y/o saborizadas.

El inhibidor puede ser combinado conjuntamente con varios portadores inertes aceptables farmacéuticamente en forma de atomizaciones, cremas, salvas, supositorios, gelatinas, geles, pastas, lociones, pomadas y los semejantes. La administración de tales formas de dosificación se puede llevar a cabo en una sola dosis o múltiples dosis. Los portadores incluyen diluyentes sólidos o rellenos, medios acuosos estériles y varios solventes orgánicos no tóxicos, etc.

Todas las formulaciones que comprenden inhibidores proteinaceos deben ser seleccionados para la desnaturalización y/o degradación y pérdida de actividad biológica del inhibidor.

Métodos para preparar composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor son conocidos en el arte y son descritos, por ejemplo en la publicación de patente internacional WO 01/34574. En vista de las enseñanzas de la presente invención, métodos para preparar composiciones farmacéuticas que comprenden un inhibidor serán evidentes de las publicaciones usadas anteriormente y de otras referencias conocidas, tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 18 edición (1990).

Para administración oral de inhibidores, tabletas que contienen uno o ambos de los agentes activos son combinados con cualquiera de varios excipientes, tales como por ejemplo celulosa microcristalina, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de dicalcico y glicina, junto con diversos desintegrantes tales como almidón (y preferiblemente almidón de maíz, almidón de patata o de tapioca) , ácido algínico y ciertos silicatos complejos, junto con aglutinantes de granulación como polivinilpirrolidona, sacarosa, gelatina y acacia. Adicionalmente, agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, lauril sulfato de sodio y talco son frecuentemente muy útiles para los propósitos de formación de tableta. Composiciones sólidas de un tipo similar pueden también pueden ser empleadas como rellenos en cápsulas de gelatina; materiales preferidos con respecto a esto también incluyen lactosa o azúcar de leche, también como polietilenglicoles de alto peso molecular. Cuando se desean suspensiones acuosas y/o elixires para administración oral, el inhibidor puede ser combinado con varios agentes endulzantes o saborizantes, materia colorante o tintes y si así se desea, agentes de emulsificación y/o agentes suspensión también, junto con tales diluyentes como agua, etanol, propilenglicol, glicerina y varias combinaciones semejantes de los mismos.

Para administración parenteral de uno u otro o ambos de los agentes activos, se pueden emplear soluciones ya sea en aceite de sésamo o de cacahuete o en propilenglicol acuoso, también como soluciones acuosas estériles que comprenden el agente activo o una sal soluble en agua correspondiente del mismo. Tales soluciones acuosas estériles son de preferencia reguladas en el pH convenientemente y son también preferiblemente vueltas isotónicas, por ejemplo, con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente apropiadas para propósitos de inyección intravenosa intraperitoneal, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. Las soluciones aceitosas son apropiadas para propósitos de inyección subcutánea intraarticular, intramuscular y subcutánea. La preparación de todas estas soluciones bajo condiciones estériles se lleva a cabo fácilmente mediante técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por aquellos experimentados en el arte. Cualquier formulación parenteral seleccionada para la administración de inhibidores proteinaceos debe ser seleccionada para evitar la desnaturalización y pérdida de actividad biológica del inhibidor.

Adicionalmente, es posible administrar tópicamente ya se uno u otro o ambos de los agentes activos por medio de, por ejemplo, cremas, lociones, gelatinas, geles, pastas, pomadas, salvas y los semejantes de acuerdo con la práctica farmacéutica estándar. Por ejemplo, una formulación tópica que comprende un inhibidor en una concentración de alrededor de 0.1 % (peso/volumen) a alrededor del 5 % (peso/volumen) puede ser preparado.

Por propósitos veterinarios, los agentes activos pueden ser administrados separada o conjuntamente a animales utilizando cualquiera de las formas y por cualquiera de las rutas descritas anteriormente. En una modalidad preferida, el inhibidor es administrado en forma de una cápsula, bolo, tableta, trocisco líquido, mediante inyección o como un implante. Como una alternativa, el inhibidor puede ser administrado con el alimento del animal y para este propósito un aditivo de alimento concentrado o premezcla puede ser preparada para un alimento de animal normal . Tales formulaciones son preparadas de manera convencional de acuerdo con la práctica veterinaria estándar.

Aquel de habilidad en las artes médicas, particularmente perteneciente a la aplicación de pruebas de diagnóstico y tratamiento con terapéuticos reconocerá que los sistemas biológicos pueden exhibir variabilidad y pueden no siempre ser completamente predecibles y asi muchas pruebas de diagnóstico o terapéuticos buenos son ocasionalmente no efectivos. Así, queda finalmente al juicio del médico que atiende determinar el curso de tratamiento más apropiado para un paciente individual, en base a los resultados de prueba, condición en historia del paciente y su propia experiencia. Pueden aun haber ocasiones, por ejemplo, cuando un médico escogerá tratar un paciente con un inhibidor de EGFR aun cuando un tumor no es predicho de ser particularmente sensible a inhibidores de cinasa de EGFR, en base a datos de pruebas de diagnóstico o de otros criterios, particularmente si todos o la mayoría de las otras opciones de tratamiento obvias han fallado o si se anticipa algo de sinergia cuando es dado con otro tratamiento. El hecho de que los inhibidores de EGFR como una clase de fármaco sean relativamente bien tolerados en comparación con muchos otros fármacos anti-cáncer, tales como agentes de quimioterapia o citotóxicos más tradicionales usados en su tratamiento de cáncer, hace esto una opción más viable .

Métodos de publicidad La invención en la presente también abarca un método para publicidad de un EGFR o una composición aceptable farmacéuticamente del mismo, que comprende proveer a una audiencia objetivo el uso del inhibidor o composición farmacéutica del mismo para tratar una población de pacientes con un tipo de cáncer que está caracterizado por un patrón de metilación indicador de un tumor semejante a epitelial o promover a la audiencia objetivo el no uso del inhibidor o composición farmacéutica del mismo para tratamiento de una población de pacientes con un tipo de cáncer que está caracterizado por un patrón de metilación indicador de un tumor semejante a mesenquimal .

La publicidad es en general comunicación pagada por medio de un no personal en el cual el patrocinador es identificado y el mensaje es controlado. La publicidad para los propósitos en la presente incluye publicidad, relaciones públicas, colocación del producto, patrocinio, suscripción y promoción de ventas . Este término también incluye noticias públicas de información patrocinadas que aparecen en cualquier medio de comunicación impreso diseñado para ser agradable a una audiencia en masa para persuadir, informar, promover, motivar o modificar de otra manera el comportamiento hacia un patrón favorable de compra, suerte o aprobación de la invención de la presente.

La publicidad y promoción del método de diagnóstico de la presente se puede llevar a cabo por cualquier medio. Ejemplos de medios de publicidad usados para entregar estos mensajes que incluyen televisión, radio, películas, revistas, periódicos, internet y vallas de anuncios, incluyendo comerciales que son mensajes que aparecen en los medios de difusión. Los anuncios también incluyen aquellos en los asientos de carros de tiendas de abarrotes , en las paredes de una vía de aeropuerto y en los costados de autobuses o escuchados en los mensaj es telefónicos o en sistemas de PA de almacenamiento o cualquier parte en que una comunicación visual o audible puede ser colocada .

Ej emplos más específicos de promoción o medios de publicidad incluyen televisión, radio, películas , internet tales como producciones web y binarios web , redes de computadora interactivas designadas para alcanzar usuarios simultáneos , vallas de anuncios fijas o electrónicas y otros signos públicos , carteles , literatura tradicional electrónica tales como revistas y periódicos , otras salidas de medios , presentaciones o contactos individuales , por ej emplo correo electrónico, teléfono, mensaj e instantáneo, postal , correo, masa o correo portador, visita en persona, etc .

El tipo de publicidad dependerá de muchos factores, por ejemplo de la naturaleza de la audiencia objetivo a ser alcanzada, por ejemplo hospitales, compañías de seguro, clínicas, médicos, enfermeras y pacientes, también como consideraciones de costo y las leyes jurisdiccionales relevantes y regulaciones que gobiernan la publicidad de medicamentos y diagnóstico. La publicidad puede ser individualizada o sobre medida en base a caracterizaciones de usuario definidas por la interacción del servicio y/u otros datos tales como demografía del usuario y ubicación geográfica.

TABLAS Tabla 1 nucleótido¾ de citosina metilado¾ asociados con fenotipo aies nquimal gen crom posición gen crom posición PON2 7 94888497 TBCD 17 78440559 1 113544125 TBCD 17 78440498 BET1 7 93459766 TBCD 17 78440426 X 48900705 MYST1, PRSSS 16 31050024 X 48900845 ARHGEF38 4 106693255 X 48900694 1 27023897 SCNN1A 12 6353969 LI A1 12 48882614 SCNN1A 12 6354033 7 80389667 SCNN1A 12 6354000 KIAA0182 16 84236385 ELM03 16 65791484 19 49971610 EL 03 16 65791362 19 49971605 NRBPl, KRTCAP3 2 27519047 ITG86 2 160822102 LOC643008, NRBPl, RTCAP3 2 27519011 RECQL5 17 71147845 LOC643008, KRTCAP3 2 27519215 RECQLS 17 71147779 RTCAP3 2 27519142 CCOC57 17 77655395 NRBPl, KRTCAP3 2 27518810 7 155407896 NRBPl, RTCAP3 2 27518521 7 155407740 NRBPl, KRTCAP3 2 27518632 7 155407629 NRBPl, KRTCAP3 2 27518654 16 86850497 NRBPl, KRTCAP3 2 27518645 16 86850474 NRBPl, RTCAP3 2 27518643 16 29204205 NRBPl, RTCAP3 2 27518583 16 29204115 M5T1R 3 49914707 16 29204298 SLC9A7 X 46499386 16 29204194 LYN 8 57066177 7 2447019 ACAP2 3 196640585 7 2447061 TBC1D14 4 7008013 T E 79 1 154520773 PITPN 3 17 6396092 LOC254559 15 87723993 10 11963508 CCDC19 1 158137355 1 41738700 CCDC19 1 158137539 ARHGAP39 S 145777560 4 129368833 ARHGAP39 S 145777354 1 24156244 COX10 17 14050396 3 135552584 7 27744012 CAM 2G 10 75302072 COL18A1.

SLC 19A1 21 45757802 2 74006703 RAB25 1 154297806 2 74006825 CGN 1 149753111 2 74006594 TBCD 17 78440835 2 74006721 TBCD 17 78440951 PPP1R13L 19 50595498 TBCD 17 78440786 3 49919159 Tabla 1 (eont ) micleóudos de ritouna meiilados asociados con fenotipo mesMiqwunal gen cromosoma posición gen cromosoma posición VPS37C 11 60682632 FIJRtN 15 89213122 NA. RCC1 1 28726284 BRE 2 28261767 CTNND1 11 57305264 11 67106174 EPHB2 1 23025895 11 67106217 6 134742250 11 67106166 FRMD6 14 51101498 11 67105913 GRHL2 8 102576558 11 67105885 P2RY6 11 72658514 SLC44A2 19 10596482 VTIIA 10 114516704 SLC44A2 19 10596548 S100A14 1 151855406 SLC44A2 19 10596578 S100A14 1 151855551 SLC44A2 19 10596594 PRSS8 16 31054183 RNF144A 2 7089748 THSD4 1S 69416262 1 201755387 2 189266325 QSOX1 1 178404541 Si AlLl 14 71183551 CCDC85C 14 99114910 ARL13B, 5TX19 3 9S2301G0 PLA2G4F 15 40236307 ARL13B. STX19 3 95230218 PLA2G4F 15 40236078 PVRL4 1 159326278 FTO 16 52372627 PVRL4 1 159326159 1 234153824 PVRL4 1 159326053 PPFIBP2 11 7578132 PVRL4 1 159326082 NINJ2 12 587066 ARHGAP32 11 128399061 2 30294748 ARHGAP32 11 128399150 4 189558130 8 125219633 4 189558238 15 76213522 1 206105036 PNKD 2 218868246 KRT8 12 51586560 CD44 11 35152089 4 185905387 ANKRD22 10 90600502 LIM 2 22 30001702 BOIA2, CEACA 19 19 49866511 GDPD3 16 30023636 CEACA 19 19 49866752 3 129636934 CEACAM19 19 49866521 4 154136934 11 71134595 9 131184926 11 71134808 19 1855554 SCYL3 1 168127429 8 102519033 CPA4 7 129749798 1 100204254 CLUAP1 16 3499552 I MP2L 7 110988180 CLUAP1 16 3499688 19 60699327 CLUAP1 16 3499569 PLEKHG6 12 6292029 S 28514725 PLEKHG6 12 6292067 JMJ07- ASAP2 2 9458210 PLA2G4B 15 39918027 Tabla 1 (conf .) iiut eótidos de citosuia mentados asociados con fenotipo mesenqumial gen crom posición gen crom posición JMJD7-PLA2G4B 15 39917942 2 216504192 JMJD7-PLA2G4B 15 39917954 PLEKHF1 19 34854611 P PLA8 7 107955947 PLE HF1 19 34854406 PNPLA8 7 107955918 10 6202160 PNPLA8 7 107955957 10 6202194 HIVEP3 1 41753450 10 6202124 RAI1 17 17572988 SH3KBP1 X 19812050 DIXDC1 11 111337086 10 28996094 BOLA2, TBX6 16 30009181 11 73806817 5EMA3A 7 83655334 8 8280623S 2 27833190 11 354805 TNFAIP8 5 118637864 11 354809 SNX8 7 2267181 11 354623 JARID2 6 15564181 11 354752 AHRR 5 439883 10 31428642 CDH5 16 64970341 17 52465903 CDH5 16 64970599 12 15846291 6 8381465 TES 2 1 45587219 SLC35B3 6 8381262 1 2456135 6 8381295 TSEN54 17 71032445 DAGLA 11 61221452 TSEN54 17 71032354 19 2105603 ACOT2 14 73109663 5VOPL 7 137999314 PDGFRA, LNXl 4 54153003 17 8252319 PDGFRA, LNXl 4 34152866 17 8252561 SLC40A1 2 190154739 17 8252360 ATL1 14 S0069808 17 8252425 ZNF398 7 148472457 IGF1R 15 97074397 17 37862949 WDR82 3 52277292 17 37862906 WDR82 3 52277190 4 40328026 FBX034 14 344?0 2 41940393 RAB11FIP1 8 37868570 AFF1 4 88113322 VPS37B 12 121944095 INPP5A 10 134254904 NAV2 11 19732081 INPP5A 10 134254935 C4orf36 4 88031692 M5T1R 3 49913008 PLXNB2 22 49062415 PHGDH 1 120075342 PLXNB2 22 49062595 GLI2 2 121266304 C19orf46 19 41191166 GL!2 2 121266336 2 70222288 GU2 2 121266195 VTtlA 10 114492308 C2orf54 2 241484135 Tabla 1 (cotrt.) iiucleotidos de citosnia metiiados asociados con fenotipo nieseiKpimal gen crom posición gen crom posición C2orf54 2 241484343 TBCD n 78426815 6 112413022 TBCD 17 78426927 4 100956161 TBCD 17 78427378 CCNY 10 35716880 TBCD 17 78427517 LPH 2 238063229 2 64687610 CDKAL1 6 21131464 16 52025113 GPR81 12 121777086 PPARD 6 35417845 17 41697531 8 144892671 F11R 1 159258976 8 144892697 F11R 1 159258982 8 144892896 CDC42SE2 5 130692428 8 144892814 FTO 16 52472915 LRPS 11 67866681 10 73752495 XAB2 19 7590468 MY018A 17 24529971 RAP1GAP2 17 2815637 MY018A 17 24529383 SLC37A1 21 42809566 DGAT1 8 145518703 13 109313445 SDC8P2 20 1258000 12 13179838 SDCBP2 20 1257800 OFCC1 6 10271555 SDCBP2 20 1257722 PTK7 6 43172438 TRA 1 3 42147101 TEAD 6 35562412 SCNN 1A 12 6354480 TEAD3 6 35562047 SCNN1A 12 6354974 TEAD3 6 35561916 SCNN1A 12 6354868 C16orf72 16 9097893 SCNN1A 12 6354990 ARID1A 1 26953185 SCNN1A 12 6354782 SG 223 8 8276184 ZCCHC14 16 86078911 GNA12 7 2739598 ZCC HC14 16 86078864 GNA12 7 2739653 GLIS1 1 53831204 GNA12 7 2739536 TSPAN1 1 46418811 PWWP2B 10 134072208 TSPAN1 1 46418555 PWWP2B 10 134072043 TSPAN1 1 46418745 S ARCD2 17 59270462 ST36AL2 16 68973602 GPR56 16 56211203 5T3GAL2 16 68973365 GPR56 16 56211170 C10orf95 10 104201478 GPR56 16 56211418 C10orf95 10 104201378 GPR56 16 56211405 CÍ0orf95 10 104201309 GPR110 6 47117696 C10or 95 10 104201286 GPR110 6 47118136 C10orf95 10 104201414 GPR110 6 47118050 C10orf95 10 104201318 EHF 11 34599461 TBCD 17 78426682 21 38521991 Tabla 1 (cont.) nucleótidos de citoana inetiiados asociados con fenotipo aieseaqmmai gen crom posición gen crom posición 14 64792338 CDS1 4 85724598 NSMCE2 8 126223268 GNAI3 1 109914827 PPCOC 15 73115889 NC0A2 8 71402682 W1SP1 8 134293893 12 103938284 iSPl 8 134294072 CPEB3 10 93872825 WISP1 8 134293996 TACC2 10 123744125 17 36932205 1 227296135 8 144727414 6 7477665 CH02 15 91266091 19 50356091 1 8053252 LL6L2 17 71057739 DDR1 6 30959396 ANKFY1 17 4098222 DDR1 6 30958847 CLON 7 17 7106144 DDR1 6 30958892 1 59052878 DDR1 6 30958855 17 75403317 DDR1 6 30959065 17 75403479 DDR1 6 30950)30 16 66828383 DDR1 6 30959048 ESRP2 16 66826542 DDR1 6 30958956 ESRP2 16 66826796 BAIAP2 17 76626137 OVOL1 11 65310618 BAJAP2 17 76625735 8 95720275 BAIAP2 17 76625947 FAM110A 20 770788 BA1AP2 17 76625872 SPINT1 15 38924311 MANF 3 51401417 GRHL2 8 102575162 PVRL4 1 159325891 SH3YL1 2 253559 PVRL4 1 159325951 5H3YL1 2 253656 RHOBTB3 5 95089583 T E 1S9, DNAH3 16 21078740 2 70221961 TMEM159, DNAH3 16 21078585 GPR56 16 56211848 TME 159, DNAH3 16 21078568 RAB25 1 154297433 TME 159, DNAH3 16 21078598 RAB25 1 154297468 Clorf210 1 43524150 3 53164930 Clor 210 1 43523857 RAB24 5 176661226 Clorf210 1 43524084 SPINT1 15 38925452 Clorf210 1 4352396.3 RAB24 S 176661618 Clorf210 1 43523950 8 8356184 Clorf210 1 43524056 20 36661934 Clorf210 1 43524091 1 113106832 Clorf210 1 43523957 CHD3 17 7732607 CLDN7 17 7105979 ABCF1 6 30667066 CLDN7 17 7105734 16 83945057 CLDN7 17 7106573 Tabla l (coat.) nu leóndo de citosuia mediados asociados con fenotipo mesenquimal gen crom posición gen crom posición CL0N7 17 7106633 1 1088914 CLDN7 17 7106571 1 1088855 CLDN7 17 7106564 AGAP3 7 150443215 CLDN7 17 7106566 ARHGEF1 19 47084177 CLDN7 17 7106555 4 100955681 GRHL2 8 10257S727 ARHGAP39 8 145777081 GRHL2 8 102575565 STX2 12 129869431 GRHL2 8 102575811 STX2 12 129869200 GRHL2 8 102574732 STX2 12 129869047 GRHL2 8 102574469 STX2 12 129869147 GRHL2 8 102574689 STX2 12 129868969 TME 30B 1 60817996 22 35136360 TMEM30B 14 60818107 22 35136601 T E 30B 14 60818193 22 35136526 TME 30B 1 60818089 22 35136389 PDGFRA. LNX1 4 54152685 CLDN15 7 100662856 PDGFRA, L X1 4 54152402 E2F4, EL 03 16 65790422 PDGFRA, LNX1 4 54152494 E2F4, EL 03 16 65790778 PDGFRA, LNX1 4 54152599 EL 03 16 65790933 PDGFRA, LMX1 4 54152503 PTPRF 1 43788610 GRHL2 8 102573922 PTPRF 1 43788636 GRHL2 8 102574035 PTPRF 1 43788601 GRHL2 8 102573658 PWWP2B 10 134071493 GRHL2 8 102573623 PWWP2B 10 134071845 GRHL2 8 102573655 PWWP2B 10 134071623 GRHL2 8 102573797 14 64239711 6RHL2 8 102573842 14 64239802 GRHL2 8 102573677 ETV6 12 11922571 GRHL2 8 102573740 SH3BP5 3 15344685 4 124687980 GAS8 16 88638299 4 124687986 SULT2B1 19 53747224 4 124688290 SULT2B1 19 53747250 1 117976728 SULT2B1 19 53747255 1 1088243 SULT2B1 19 53747202 1 1089514 SULT2B1 19 53747244 1 1089426 LAMA3 18 19707129 1 1089493 IAMA3 18 19706893 1 1089446 LA A3 18 19706728 1 1088763 LAMA3 18 19706786 1 10S9029 LAMAS 18 19706817 Tabla 1 (cont.) nucleótidos de ciíosma metilados asociados con fenotipo inesenquimal gen crom posición gen crom posición LAMA 3 18 19706827 APBB1 11 6375542 LAMA 3 18 19706842 ABCA7 19 1016712 NC RNA00093, DNMBP 10 101680658 ABCA7 19 1016728 Clorfl06 1 199130846 ABCA7 19 1016688 ClorflOS 1 199130930 11 66580163 12 6942075 11 66580192 12 6941973 11 66580260 12 6943440 AN 3 10 62162307 12 6943501 AN 3 10 62161917 12 6943503 AN 3 10 62162163 12 6943508 ABLIM1 10 116269176 12 6943525 14 53642609 12 6942988 XDH 2 31491126 12 6943026 XDH 2 31491353 12 6943152 DAPP1 4 100957034 12 6942957 DAPP1 4 100956844 TALDOl 11 753339 DAPP1 4 100956853 TALDOl 11 753485 TNS4 17 35911401 CN SR1 1 26376210 TNS4 17 35911460 CNKS 1 1 26376363 TNS4 17 35911441 CNKSR1 1 26376365 TNS4 17 35911475 CNKSR1 1 26376449 PARD3 10 34756309 CN SR1 1 26376445 RG12 6 33373111 CN SR1 1 26376434 RGL2 6 33373221 CNKSR1 1 26376520 RGL2 6 33373245 CNKSR1 1 26376566 19 17763242 CN SR1 1 26376606 1 150076158 CN 5R1 1 26376578 PCCA 13 99941258 3 37200270 RAP1GAP2 17 2855119 MERTK 2 112421048 EPHB3 3 185766002 RGS3 9 115383006 TNFRSF10C 8 23019312 PLXNB2 22 49062679 MICAL2 11 12226862 PLXNB2 22 49062940 S6SM2 17 2197812 16 86381426 RABGAP1L 1 173111020 10 75306867 RABGAP1L 1 173111113 FAM83A 8 124264314 ARHGEF10L 1 17750038 FAM83A 8 124264583 TBC 1D1 4 37666838 FAM83A 8 124264373 CGN 1 149751930 TAF1S 2 9955012 ELF3 1 200243703 ERI3 1 44566745 PROM2 2 95304202 Tabla 1 (cont.) nucleótidos de citosiaa metilado¾ asociados con fenotjpo inesenquiniai gen crorn posición gen crom posición PROM2 2 95304432 EPN3 17 45966053 P O 2 2 95303758 2 128333798 PRO 2 2 95303338 GJB3 1 35020553 PHEX X 22046472 C10orf91 10 134111645 ADAP1 7 952365 O0orf91 10 134111403 ADAP1 7 952156 C10orf91 10 134111470 ADAP1 7 952310 20 30796655 ADAP1 7 952245 DLEU1 13 49829837 ADAP1 7 952140 8 101497819 VCl 10 754S5630 22 28307949 11 67206458 22 28303158 11 67206243 16 86536340 14 51288831 UNC5A 5 176181830 14 51288704 4 154076297 21 36592419 4 154075997 14 34872148 4 154075953 PLA2G4F 15 40236052 USP43 17 9491021 1 201096568 USP43 17 9490981 FA 46B 1 27207475 USP43 17 9490898 OPA 3 19 50723356 USP 17 9490862 11 3454830 CXCL16 17 4588805 6 36205670 CXCL16 17 4588796 CST6 11 65535543 7 139750442 FGGY 1 59989219 7 139750014 15 72463284 7 139750140 FUT3 19 5802616 7 139750233 FUT3 19 5802465 7 139750195 FUT3 19 580250 7 139750252 PLS3 X 114734137 7 139750206 WWC1 5 167725172 7 139750225 8 15408729 CLDN4 7 72883980 RASA3 13 113862226 ARAP1, STAR DIO 11 72169819 ST3GAL4 11 125781207 9 131185398 ST3GAL4 11 125781216 CDKN1A 6 36758711 12 104024772 8P 18 72930014 IL17RE. CIDEC 3 9919512 ERBB2 17 35115639 IL17RE. CIDEC 3 9919537 C14orf43 14 73281541 SJGIRR, AN09 11 407907 MED16 19 834879 srrs 11 1812460 2 101234948 SYT8 11 1812427 2 101234788 Tabla 1 (cent.) nueleótidos de citosuia mentados asociados cotí fenotipo mes uquimal gen crom posición gen crom posición IL10RB 21 33563377 MACC 1 7 20223703 ESRP2 16 66825963 ACC1 7 20223521 ESRP2 16 66825753 MACO 7 20223687 SPINT2 19 43448222 1 27160055 CCDC120 X 48803602 5T14 11 129535669 CCDC120 X 48803499 ST14 11 129535471 C19orf46, AIKBH6 19 41191679 SPINT1 15 38923139 C19orf 6, AL BH6 19 41191561 5PINT1 15 38923085 C19orf 6. ALKBH6 19 41191506 SPINT1 15 38923161 CLDN7 17 7105010 SPINT1 15 38923192 PRSS8 16 31054518 Clorfl72 1 27159869 PRSS8 16 31054678 2 74064398 PRSS8 16 31054500 2 74064468 PRSS8 16 31054545 2 74064365 PRSS8 16 31054555 8 102573146 PRSS8 16 31054700 8 102573120 2 238165128 8 102573068 ANKRD22 10 90601891 POU6F2 7 39022925 AN RD22 10 90601835 LA B3 1 207892566 ITGB6 2 160764766 LA B3 1 207892295 ITGB6 2 160764885 LA B3 1 207892301 ITGB6 2 160764846 LAMB3 1 207892354 BO 2 242150379 LA B3 1 207892472 T C8, T C6 17 73640271 LA B3 1 207892370 T C8, TMC6 17 73640278 LAMB3 1 207892479 CRB3 19 6415885 3 129911695 EPS8L1 19 60279005 16 2999774 EPS8L1 19 60278851 BMF 15 38186296 12 88144203 BMF 15 38186393 7 64096077 BMF 15 38186423 KIAA0247 14 69194460 GALNT3 2 166357860 14 64239962 8 144893629 5 74369044 8 144893700 16 11613936 C20orfl51 20 60435990 NEURL1B 5 172048817 C20orfl51 20 60436252 CLDN4 7 72882009 C20orfl51 20 60436261 PA 4 19 44350154 C20orfl51 20 60436106 P2RY2 11 72616798 C20orfl 51 20 60436134 4 69806346 C20orfl51 20 60436052 MACC1 7 20223945 Tabla 1 (coat) micleótidos de citos a meülados asociados con fenotipo mesenquuual gen posición de cromosoma ADA TS16 hgl9 hr5:513916Q-5139859 ANKRD34A hgl9 chrl:145472863-145473562 ARID5A hgl9 chr2:97215439-97216138 APC2 hgl9 chrl9:1467602-1468301 B P4 hgl9 chrl4:54422575-54423274 CAI 2 hgl9 c rl5:63673688-63674360 CCK hgl9 chr3:42306174-42306873 CCNA1 hgl9 chrl3:37005581-37006453 CDH4 hgl9 chr20:59826862-59827561 CLDN7 hgl9 chrl7:7165943-7166642 DK 1 hgl9 chrl0:54072931-54073630 SEPTIN9 hgl9 chrl7:75404213-75404912 DLX1 hgl9 chr2:172950047-172950746 ERB84 hgl9 chr2:213402181-213402880 ESRP1 hgl9 chr8:95651545-95652244 F6FR1 hgl9 chr8:38279279-38279921 FOXA1 hgl9 chrl4:38061638-38062337 6ATA2 hgl9 chr3:1282O2381-1282O308O GNE hgl9 chrl0:54072931 54073630 GRHL2 hgl9 chr8:1025045O9-1025O52O8 GLI3 hgl9 chr7:42267369-42268068 HOAC4 hgl9 chr2:240113948-240114647 HOXA10 hgl9 chr7:27213776-27214475 HS3TS3B1 hgl9 chrl7:14202839- 14203538 ID2 hgl9 chr2:8823406-8824105 IT1H4 hgl9 chr3:52854493-52855192 LA A1 hgl9 chrl8:7013604-7014303 LAD1 hgl9 chrl:201368681-201369380 LHX9 hgl9 chrl:197889343-19789004 MAP6 hgl9 chrll:75378150-75378849 MEOX1 hgl9 chrl7:41738845-41739544 MGC45800 hgl9 chr4:183061951-183062650 MSX1 hgl9 chr4:4859635-4860334 MT R7 hgl9 chr8:17270755-17271454 PARD3 hgl9 chrl0:35104748-35105447 PAX6 hgl9 chrll:31833994-31834693 PCDHGA8 hgl9 chr5:140807001- 140807700 PI3KR5 hgl9 chrl7:8798216-8798915 RNF220 hgl9 chrl:44883347-44884046 RNLS hgl9 chrl0:90342854-90343553 RP56KA2 hgl9 chr6:lb7177930-167178629 SFRP1 hgl9 chr8:41167914-41168613 Tabla l(cont.) uucleótidbs de ciíosaia metilados asociados coii fenotipo mesenquúnal gen posición de cromosoma WNT5B hgl9 chrl2;1739567-1740266 EOX2 hgl9 chr7:15727091-15727790 TP73 hgl9 chrl:3569053-3569719 RASGRF1 hgl9 chrl5:79381517-79382216 TWIST hgl9 chr7:19157773-19158472 AGAP3 hgl8 chr7:150442790-150443639 ANKRD33B hgl8 chr5:10617913-10618612 ARHGEF1 hgl8 chrl9:47083827-47084526 C10orf91 hgl8 chrl0:134111053-134111752 CHD3 hgl8 chrl7:7732182-7733031 CXCL16 hgl8 chrl7:4588455-4589154 ESRP2 hgl8 chrl6:66828033-66828732 KIAA1688 hgl8 chr8:145777004-145777703 TBC1D1 hgl8 chr4:37654711-37655410 SERPINB5 hgl8 chrl8:59295387-59296621 STX2 hgl8 chrl2:129868969-129869727 miR200C hgl8 chrl2:6942800-69432OO ST1R hgl8 chr3:49916155-49916617 MACC1 hgl8 chr7:20223293-20224O58 HOXC4/HOXC5 hgl8 chrl2:52712961-52713967 CP2L3 hgl9 chr8:102504509-102505208 RON hgl8 chr3:49916155-49916617 TBCD hgl8 chrl7:78440426-78 40951 C20orf55 hgl8 chr20:770741-770860 ERBB2 hgl9 chrl7:37861100-37863650 Tabla 2 micleótido de otosina mediados asociados con fenotipo epitelial gen cromosoma posición gen cromosoma posición ALDH3B2 11 67204971 COLEGIO 8 120175608 2 62409583 5 147237412 A ICA1 11 117590946 5 147237649 TMPRSS13 11 117294776 5 147237518 1 20440804 1 167067800 20 1420914 DLG2 11 84558496 1 20374821 RAB19 7 139760606 PRR5-ARHGAP8.

DAPP1 4 101009384 ARHGAP8 22 43564823 A ICA1 11 117590130 2 230797885 19 47895208 CHMP4C 8 82834065 MYOID 17 28170353 7 21037502 AFAP1 4 7945103 7 21031624 SPIN 5 5 147423445 20 36533851 5P1NK5 5 147423477 14 74735436 SP1NK5 5 147423260 MYCBPAP 17 45964331 AN03, UC1S 11 26538572 TMEM30B 14 60814048 3 183702446 9 84869514 3 183767276 10 100127021 SYT16 14 61608563 6 S0178446 SYT16 14 61532507 3 106815813 TC2N 14 91391048 CNGA1 4 47710738 TC2N 14 91375355 SLAMF9 1 158190485 CEACAM6 19 46966764 CD180 5 66513564 IAA0040 1 173395004 ESR1 6 152166508 KIAA0040 1 173396807 12 72730512 SY 9 92692359 MRVI1 11 10559098 SYK 9 92659288 CYP481 1 47037188 SEMA6D 15 45522047 MFSD4 1 203816771 ERP27 12 14982225 PLA2G2F 1 20338719 IVL 1 151148554 CYP4B1 1 47057214 IVL 1 151148439 CYP A22 1 47375597 KRTAP3-3 17 36403692 1 47036300 KRTAP3-3 17 36403856 SDR16C5 8 57375347 5 55990316 5 39796557 DHRS9 2 169653716 SAMD12 8 119525751 4 55490421 1 190775347 SPAM1 7 123353161 TAT 16 70168544 8 127777938 SALL3 18 74858829 8 120206280 11 128964767 COLEC10 8 120187865 P HD1 6 51787037 (cotit ) nucleótid v de citosina inefüados asociados con fmotjpo epitelial gen cromosoma posición gen cromosoma posición 11 2178652 ZC4H2 X 64171340 IRF6 1 208029710 TRAM2 6 52549027 UBXN10 1 20391491 BVES 6 105690909 7 7359082 BVES 6 105690842 SC EL 13 77066219 MLLT11 1 149299631 TMC1 9 74639567 MLLT11 1 149299586 8 127457153 MLLT11 1 149299347 4 55742586 2 42128114 PHLOB2 3 113112565 2 42128123 H HB1 5 143180348 1 113301372 7 19927552 12 95407994 16 68155671 TENC1 12 51729752 LAMA2 6 129245818 TENC1 12 51729851 LAMA2 6 129245899 3 42088628 11 65020493 SPRY4 5 141675957 SHAN 2 11 70217854 SPRY4 5 141679764 5HANK2 11 70350904 19 13808229 NFIC 19 3312374 19 13808284 NFIC 19 3312154 19 13808262 FLNB 3 58020380 19 13808473 TEAD4 12 2978486 19 13808469 ABCC3 17 46113650 DGAT1 8 145510701 T EM120B 12 120670919 NRM 6 30764049 SCNN1A 12 6347262 NRM 6 30764073 8 103890347 NFtM 6 30764003 SAMD11, NOC2L 1 869821 FLOT1 6 30817584 KIRREL 1 156231153 FLOT1 6 30817649 MYADM 19 59061828 19 52793249 INPP5B 1 38185106 LA 83 1 207868102 ¡NPP5B 1 38185405 LAMB3 1 207867974 INPP5B 1 38185271 AP1 2 19 10544470 INPP5B 1 38185275 MAP3K14 17 40747948 INPP5B 1 38185298 MAP3 14 17 4074S115 INPP5B 1 38185331 ELOVL7 5 60094877 PDE4D 5 58457316 ADAP1 7 913183 11 65013559 17 17470224 CADPS2 7 122024033 PT 2B 8 27325072 ITGA5 12 53098352 1 19211638 ZC4H2 X 64171392 17 54761551 ZC4H2 X 64171381 ITGB3 17 42685877 Tabla 2 (coiit.) nuclcótidos de citosuia metüados asociados con fenotipo epitelial gen cromosoma posición gen posición de cromosoma ITCB3 17 42686081 INPP5B hglS chrl:38184921-38185620 IT6B3 17 42685928 BVES hgl8 chr6:105G90492-105691191 ITGB3 17 42685861 ITGAS hgl8 chrl2:53098002-S3098701 ITCB3 17 42686060 ITGB hgl8 chrl7:42685578-42686277 C l loff70 11 101423920 JAK IP2 hgl8 chr5:147142066- 147142765 EPN3 17 45974036 LLT11 hglS chrl;149299281-149299980 1 20672639 NFIC hgl8 chrl9:3311804-3312503 LIX1L 1 144189643 NTNG2 hgl8 chr9:134026339-134O27O3S SIGIRR 11 403594 ZEB2 hglS chr2: 144989568- 144989952 17 73861330 PCDH8 hglS chrl3:523210O9-5232156O 11 32068730 PEX5L hglS chr3:181236933-181237780 KLF16 19 1810341 GALR1 hgl8 chrl8:7309O412-7309O797 1 28457982 10 129592716 LY6G6C 6 31795616 CDS1 4 85777370 M VI1 11 10562607 10 17309649 10 17309781 17 23722410 16 67990001 ZEB2 2 144994583 4 40953131 AN 3 10 62002852 5 10618263 5 66600290 NTNG2 9 134026689 JA IP2 5 147142568 JA MIP2 5 147142416 JAKMIP2 5 147142654 JAKMIP2 5 147142625 10 30178594 TBC1D1 4 37655153 TBC1D1 4 37655061 TBC1D1 4 37655126 Tabla 3 nucleótidos de cito ma mediados asociados con fenotipo niesenquimal Gen CROMOSOMA POSICIÓN IDEntrez Isla-CpG TSPA 14 10 82209390 81619 LFNG 7 2530782 3955 CpG_3 PR CH 14 61062573 5583 S0C4 20 43406736 6385 SCYL3 1 168127429 57147 TNXB 6 32162072 7148 ARHGAP39 8 145777560 80728 CpG_52 SPINT1 15 38937072 6692 SLC9A7 X 46499386 84679 3 49919159 TBCO 17 78440786 6904 WI1A 10 114492308 143187 LDL AP1 1 25767066 26119 PLE HG6 12 6291928 55200 PNPLA8 7 107955918 50640 PNPLA8 7 107955957 50640 A ID1A 1 26953185 8289 ABTB2 11 34241186 25841 SLC9A3R1 17 70267242 9368 7 2447061 GALNTL2 3 16220636 117248 ZNF321 19 58139084 399669 DÍP2B 12 49261110 57609 3 178603691 2 242481901 7 6491550 WDR82 3 52277292 80335 TRAF5 1 209569842 7188 PPARD 6 35417906 5467 CpG_65 LYN 8 57066177 4067 LOC254559 15 S7723993 254559 CpG_155 LOC254559 15 87723796 254559 CpG_155 7 27744012 T EM79 1 154520773 84283 8 102520036 JMJD7- PLA2G4B 15 39918027 8681 Tabla 3 (cont.) aueieótidos de citosma inetílados asociados con fenotipo mesenqutmal Gen CROMOSOMA POSICION IDEntrez tsla-CpG FTO 16 52372627 79068 15 78857906 Cp6_157 BAIAP2 17 76625735 10458 8 102520234 8 102520167 NRBP1, KRTCAP3 2 27518521 29959, 2006 CpG_42 PVRL2 19 50073777 5819 7 6491523 CSK 15 72868625 1445 PITPN 3 17 6396092 83394 GRHL2 S 102575811 79977 CpG_104 PVRL4 1 159325891 81607 LA A3 18 19706786 3909 8 144892697 8 144892671 STX2 12 129869200 2054 CpG_56 ST 2 12 129869147 2054 CpG_56 OBSCN 1 226625610 84033 CpG_30 6NA13 17 60466557 10672 ACAP2 3 196640585 23527 WDR82 3 52277190 80335 NSMCE2 8 126223268 286053 10 73752495 RAB24 5 176661226 53917 ETV6 12 11922571 2120 ENDOD1 11 94481032 23052 7 155407740 LIMA1 12 48882614 51474 TBCD 17 78426682 6904 TBCD 17 78426927 6904 TBCD 17 78426815 6904 C10orf91 10 134111645 170393 2 64687934 2 64687784 2 64687610 SPIRE1 18 12636025 56907 STX2 12 129869047 2054 CpG_56 LRP5 11 67866681 4041 OBSCN 1 226625713 84033 Cp6_30 Tabla 3 (cont.) micleótidos de citosuia mediados asociados con fenotipo nie enqimnat Gen CROMOSOMA POSICIÓN IDEntrez Isla-CpG OBSCN 1 226625944 84033 CpG_30 OBSCN 1 226625706 84033 Cp6_30 OBSCN 1 226625779 84033 CpG_30 CGN 1 149753111 57530 12 6943501 AB25 1 154297806 57111 12 6943503 12 6943508 TBCD 17 78440951 6904 MYST1, P SS8 16 31050024 84148, 5652 TBCD 17 78440835 6904 T8CD 17 78440498 6904 TBCD 17 78440559 6904 TBCD 17 78440426 6904 GRHL2 8 102574469 79977 CpG_104 GRHL2 8 102575727 79977 CpG_104 GPR110 6 47118050 266977 6 7477665 THSD4 15 69416262 79875 3 53164930 C20orfl51 20 60435990 140893 PWWP2B 10 134072208 170394 7 2447019 2 70221961 LAMA3 18 19706842 3909 LA A3 18 19706817 3909 RHOBTB3 5 95089583 22836 GPR56 16 56211848 9289 RAB25 1 154297468 57111 RAB25 1 154297433 57111 T EM159, DNAH3 16 21078585 57146, 55567 Clorf210 1 43524091 149466 CCDC19 1 158136950 25790 Clorf210 1 435240S4 149466 CLDN7 17 7105979 1366 CpG_159 GRHL2 8 102574035 79977 CpG_31 SPINT1 15 38925452 6692 Tabla 3 ícont.) imcleóíido de citosina metüados asociados con fenotipo mesenquimal Gen CROMOSOMA POSICION IDEntre? ADAP1 7 952140 11033 12 6943440 12 6943525 RAP1GAP2 17 2815637 23108 VPS37C 11 60682632 55048 IGF1R 15 97074597 3480 BOLA2, GDPD3 16 30023636 552900, 79153 22 28307742 22 28308158 NA, RCC1 1 28726284 751867, 1104 CTN D1 11 57305264 1500 2 101234788 MPRIP 17 16907618 23164 FR D6 14 51101498 122786 16 86381426 ARHGAP39 8 145777354 80728 MAP 13 6 36207101 5603 10 5583926 10 5583949 13 109313445 F11R 1 159258982 50848 SOCBP2 20 1257722 27111 F11R 1 159258976 50848 EHF 11 34599461 26298 ABL1 1 10 116269176 3983 MCCC2 5 70933152 64087 COX10 17 14050396 1352 SLC37A1 21 42809566 54020 Y018A 17 24529971 399687 IL17RE, CIDEC 3 9919537 132014, 63924 S100A14 1 151855406 57402 IL17RE, CIDEC 3 9919512 132014, 63924 TALDOl 11 75 485 6888 PHGDH 1 120075342 26227 SIPA1L1 14 71183551 26037 2 189266325 Tabla 3 (cont.) nudeóíidoi de citosma mehlados. asociados con fenotipo mesenquimal Gen CROMOSOMA POSICION IDEntrez Isla-CpG TME 159.

DNAH 16 21078740 57146, 55567 PPCDC 15 73115889 60490 GPR56 16 56211418 9289 LLGL2 17 71057739 3993 SPINT1 15 38923139 6692 CpG_135 CLON15 7 100662856 24146 Cp6_54 CNKSR1 1 26376445 10256 GRB7 17 35149701 2886 NRBP1.

KRTCAP3 2 27519047 29959, 200634 CpG_42 KRTCAP3 2 27519215 200634 CpG_42 16 8394S057 6PR56 16 56211405 9289 TACC2 10 123744125 10579 ADAT3, SCAMP4 19 1858677 113179, 113178 CpG_34 CHD2 15 91266091 1106 GRHL2 8 102575565 79977 CpG_104 7 139750195 8 102573120 1 227296135 PDGF A, LNXl 4 54152503 5156, 84708 PDGFRA. LNXl 4 54152494 5156, 84708 11 3454830 IT6B6 2 160764885 3694 PDGFRA, LNXl 4 54152866 5156, 84708 20 36661934 1 1088243 CpG_183 ST14 11 129535669 6768 CpG_64 7 139750206 C20orflSl 20 60436134 .140893 7 139750140 LOC643008, RECQL5 17 71147779 643008, 9400 GR87 17 35147553 2886 GRB7 17 35147540 2886 Clorf210 1 43523857 149466 Tabla 3 (coa! .) nucleótidos de citosma metilados asociados con tenotipo mesenqiuinal Gen CROMOSOMA POSICION IDEntrez Is!a-CpG CN SR1 1 26376606 10256 C NKSR1 1 26376566 10256 CLD 7 17 7106571 1366 CpG_159 CLDN7 17 7106564 1366 CpG_159 CLDN7 17 7106566 1366 CpG_159 Clorf210 1 43523950 149466 Clorf210 1 5 149466 CLDN4 7 72883688 1364 CpG_46 CLD 7 17 7105734 1366 CpG_159 Clorf210 1 43523963 149466 CLDN7 17 7106573 1366 CpG_159 KRTCAP3 2 27519142 200634 CpG_42 MST1 3 49914707 4486 CpG_23 ST1R 3 49915923 4486 CpG_53 XAB2 19 7590468 56949 KIAA0182 16 84236385 23199 PWWP2B 10 134072043 170394 CCDC57 17 77655395 284001 NRBP1, KRTCAP3 2 27518810 29959, 200634 Cp6_42 NRBP1, KRTCAP3 2 27518583 29959, 200634 CpG_42 NRBP1, RTCAP3 2 27518645 29959, 200634 CpG_42 MOCOS 18 32022494 55034 CpG_141 PWWP2B 10 134071493 170394 LAMA 3 18 19706893 3909 12 6943152 12 6942988 12 6943026 12 6942957 14 64239711 PRSS8 16 31054518 5652 17 75403479 CpG_427 C20orfl51 20 60436252 140893 GRHL2 8 102574732 79977 CpG_104 C20orfl51 20 60436106 140893 Tabla 3 (coirt.) nucleótidos de citosina mediados asociados con fenotipo mesenqumial Gen CROMOSOMA POSICIÓN IDEntrez Isla-CpG SULT2B1 19 53747255 6820 SULT2B1 19 53747244 6820 SULT2B1 19 53747224 6820 SULT2B1 19 53747250 6820 CBLC 19 49973124 23624 N BP1, RTCAP3 2 27519011 29959, 200634 CpG_42 N BP1, KRTCAP3 2 27518654 29959, 200634 CpG_42 GRHL2 8 102573658 79977 CpG_31 DOK7 4 3457234 285489 FA 110A 20 770788 83541 CpG_71 NRBP1.

KRTCAP3 2 27518643 29959, 200634 CpG_42 PW P28 10 134071623 170394 TALDOl 11 753339 6888 OVOL1 11 65310618 5017 CpG_204 SH3YL1 2 253656 26751 CpG_176 7 139750225 LAD1 1 199635571 3898 CpG_54 TMEM159, DNAH3 16 21078568 57146, 55567 GRHL2 8 102573922 79977 Cp6_31 PP6FRA, LNX1 4 54152402 5156, 84708 LAD1 1 199635569 3898 CpG_54 LAD1 1 199635537 3898 CpG_54 KRT8 12 51586560 3856 3 135552584 19 49971605 ITGB6 2 160822102 3694 AOAP1 7 952310 11033 ADAP1 7 952245 11033 PRO 2 2 95304202 150696 PROM2 2 95304432 150696 PROM2 2 95303758 150696 SYT8 11 1811862 90019 16 70401148 17 15737821 QSOX1 1 178404541 5768 CCDC85C 14 99114910 317762 Tabla 3 (cout ) nucleotidos de citosma mediados asociados con fenotipo uiesenquimal Gen CROMOSOMA POSICIÓN IDEntrez Isla-CpG Clorflie 1 205273070 79098 GRHL2 8 102576558 79977 C19orf46 19 41191166 163183 CBLC 19 49973366 23624 CA 2G 10 75302072 818 SCNN1A 12 6354990 6337 SCNN1A 12 6354868 6337 JUP 1? 37182909 3728 19 60699327 VCL 10 75485630 7414 BOLA2, TBX6 16 30009181 552900, 6911 IMMP2L 7 110988180 83943 SLC44A2 19 10596548 57153 CpG_46 8 144726627 RAI1 17 17572988 10743 SYT1 12 78333487 6857 8 28514725 6 134742250 GPR56 16 56211203 9289 EPN3 17 45967146 55040 GPR56 16 56211170 9289 C4orf36 4 88031692 132989 ARL13B, STX19 3 95230218 200894, 415117 2 70222288 CpG_118 PVRL4 1 159326053 81607 1 27066922 6PR11G 6 47117696 266977 EPHB2 1 23025895 2048 ANKRD22 10 90601891 118932 ZNF398 7 148472457 57541 PW P2B 10 134071845 170394 ARHGAP32 11 128399061 9743 7 80389667 4 154136934 1 27023897 19 1855554 BAIAP2 17 76626137 10458 PLXNB2 22 49062595 23654 Tabla 3 (cont.) nucleótidos de citosma mefcilados asociados con fenotipo nieseaquimal Gen CROMOSOMA POSICIÓN IDEntrez Isla-CpG ACAA1 3 38150460 30 DNAIC17 15 38867650 55192 7 72795287 COL18A1, 5LC19A1 21 45757802 80781, 6573 LOC64300S, RECOX5 17 71147845 643008, 9400 MANF 3 51401417 7873 T AK1 3 42147101 22906 6RB7 17 35147329 2886 Clorf210 1 43524150 149466 RNF144A 2 7089548 9781 GRB7 17 35147290 2886 19 58230499 1 234153824 PPFI8P2 11 7578132 8495 GPR81 12 121777086 27198 19 5823Q69S 8 101497819 CPEB3 10 93872825 22849 RABGAP1L 1 173111113 9910 RABGAP1L 1 173111020 9910 RNF207 1 6202430 388591 UC1 1 153429495 4582 1 2456135 PLEKHG6 12 6292029 55200 PLE HG6 12 6292067 55200 PNPLA8 7 107955947 50640 RASA3 13 113862226 22821 ARL13B, STX19 3 95230100 200894, 415117 VTtlA 10 114516704 143187 COL21A1 6 56342813 8157S 2 74064468 SDCBP2 20 1258000 27111 FA 167A 8 11340393 83648 S100A14 1 151855551 57402 PRSS8 16 31054183 5652 HIVEP3 1 41753450 59269 Tabla 3 (cont.) nucl ótidos de «tesina metalados asociados con fenotipo mesenquimal Gen CROMOSOMA POSICION iDEntrez Isla-CpG PRSS8 16 31054700 5652 SULT281 19 53747202 6820 C19orf46, ALKBH6 19 41191679 163183, 84964 CpG_49 C19orf46, AL BH6 19 41191506 163183, 84964 C19or 46.

AL BH6 19 41191561 163183, 84964 CpG_49 17 52465903 RAP1GAP2 17 2855119 23108 C10orf91 10 134110971 170393 8 144892814 9 131184926 CpG_71 BMF 15 38186423 90427 RGS3 9 115383006 599S 19 17763242 19 50356091 DLEU1 13 49829837 10301 MBP 18 72930014 4155 1 150076158 1 JD7- PLA2G4B 15 39917942 8681 PARD3 10 34756309 56288 ICAL2 11 12226862 9645 AN FY1 17 4098222 51479 CD N1A 6 36758711 1026 19 49971610 JARID2 6 15564181 3720 SGSM2 17 2197812 9905 SMARCD2 17 59270462 6603 PN D 2 218868246 25953 EVPLL 17 18221746 645027 EVPLL 17 18221574 645027 MED16 19 834879 10025 RAB24 S 176661618 53917 7 155407629 ERBB2 17 35115639 2064 CGN 1 149751930 57530 8 8356184 Tabla 3 (cont ) micleótidos de citosina meülados asociados con fenotipo mesenqumial Gen CROMOSOMA POSICIÓN IDEntrez Isla-CpG GNAI3 1 109914827 2773 8 37880723 ANKRD22 10 90601835 118932 15 81670543 PAK4 19 44350154 10298 PR 15L 17 43390182 79170 RAB17 2 238164820 64284 P2RY2 11 72616798 5029 22 28307949 8 144893700 CpG_78 SPINT1 15 38923085 6692 CpG_135 PVRL4 1 159326159 81607 6 13981646 CpG_39 Clorf210 1 43524056 149466 7 139750233 TBC1D1 4 37666838 23216 7 72795153 2 238165064 ARHGAP32 11 128399150 9743 12 88144203 T CS 17 73650109 147138 ABCF1 6 30667066 23 ST3GAL4 11 125781216 6484 ST36AL4 11 125781207 6484 STAP2 19 4289769 55620 STAP2 19 4289932 55620 LAMA3 13 19706827 3909 1 201096568 CpG_80 GSDMC 8 130868275 56169 AFF1 4 88113322 4299 17 71380179 14 34872148 ASB13 10 5742089 79754 CLON 7 17 7106144 1366 CpG_159 CDC42BPG 11 64367663 55561 FAM46B 1 27207475 115572 EPS8L1 19 60278851 54869 16 70401060 Cp6_91 Tabla 3 (cont ) nucleótidos de citosina mediados asociados con fenotipo mesenqiumal Gen C ROMOSOMA POSICION IDEntrez Isla-CpG ESRP2 16 66825963 80004 iHO B 21 33563377 3588 C14orf43 14 73281541 91743 CCDC120 X 48803602 90060 CCDC120 X 48803499 90060 ESRP2 16 66825753 80004 CN SR1 1 26377135 10256 CLDN7 17 7107442 1366 CpG_159 SCNN1A 12 6354974 6337 MUC1 1 153429380 4582 PRSS8 16 31054500 5652 5LC35B3 6 8381262 51000 CpG_68 12 13179838 EPS8L1 19 60279005 54869 GPR110 6 47118136 266977 LAMA3 18 19706728 3909 PVRL4 1 159325951 81607 PVRL4 1 159326082 81607 RSPK4 21 42058454 54101 NEURL1B 5 172048817 54492 PRO 2 2 95303838 150696 FAM167A 8 11340449 83648 CLDN4 7 72882009 1364 8 102573068 CANT1 17 74513111 124583 PRR15L 17 43390296 79170 MICALL2 7 1461837 79778 NCOA2 S 71402682 10499 ITGB6 2 160764766 3694 ITGB6 2 160764846 3694 14 64792338 8 102573146 NRBP1, KRTCAP3 27518632 29959, 2006 4 CpG_42 TMEM159, DNAH3 16 21078598 57146, 55567 ADAP1 7 952156 11033 Tabla 3 (cont ) imcíeóíidos de eitesma maulados asociados con fenoüpo mesenquinial Gen CROMOSOMA POSICION IDEntrez Isla-CpG TME 1S9.

DNAH3 16 21078428 57146, 55567 SH3YL1 2 26751 CpG_176 7 139750252 PRSS22 16 2848212 64063 PRSS22 16 2848220 64063 SDCBP2 20 1257800 27111 LAMA3 18 19707129 3909 2 74064398 CpG_113 2 74064365 CpG_113 DAPP1 4 100956844 27071 DAPP1 4 100956853 27071 DAPP1 4 100957034 27071 1 999308 ATG9B 7 150352451 285973 CLON 7 17 7107017 1366 Cp6_159 9 131185398 CpG_71 STX2 12 129868969 2054 CpG_56 C NKSR1 1 26376578 10256 E2F4» ELM03 16 65790778 1874, 79767 E2F4, ELM03 16 65790422 1874, 79767 CN S 1 1 26376365 10256 CNKSR1 1 26376363 10256 ARAP1, STARDIO 11 72169819 116985, 10809 C G_41 CNKSR1 1 26376520 10256 CNKSR1 1 26376434 10256 CNKSR1 1 26376449 10256 MUC1 1 153429376 4582 PRSS8 16 31054545 5652 PRSS8 16 31054555 5652 7 72795319 PDGFRA, LNX1 54152685 5156, 84708 C20orfl51 20 60436261 140893 LAD1 1 199635654 3898 CpG_54 PDGFRA, LNX1 4 54152599 5156, 84708 12 50912694 CpG_79 Tabla 3 (cont.) nucleótidos de citosuia metilados asociados con fenotipo mesenquimal Gen C ROMOSOMA POSICION IDEntrez Isla-CpG GRHL2 8 102573655 79977 CpG_31 GRHL2 8 102573677 79977 CpG_31 GRHL2 8 102574689 79977 CpG_104 GRHL2 8 102573797 79977 CpG_31 GRHL2 8 102573623 79977 CpG _31 RNF144A 2 7089414 9781 ICRNA00093, 100188954, DNMBP 10 101680658 23268 PR CA 17 62088295 5578 IAA0247 14 69194460 9766 ELF3 1 200246387 1999 ELF3 1 200246469 1999 ELF3 1 200246561 1999 GASS 16 88638299 2622 HSH2D 19 16115489 84941 ClOorfól 10 134111403 170393 12 88143460 SYT8 11 1812078 90019 SYT8 11 1812322 90019 10 126879805 4 8587017 ERGIC1 5 172264397 57222 12 50911753 SYT8 11 1812236 90019 8 144727414 16 11613936 CLDN7 17 7106555 1366 CpG_159 5 74369044 BAIAP2 17 76625947 10458 BAIAP2 17 76625872 10458 OPA3 19 50723356 80207 GRHL2 8 102573740 79977 CpG_31 6RHL2 8 102573842 79977 CpG_31 8 102085088 CLDN7 17 7106633 1366 CpG_159 CLDN7 17 7107214 1366 CpG_159 ERBB3 12 54761038 2065 CpG_116 Tabla 3 (cont ) nucleótidos de citostna metilados asociados con fenotipo mesenqutmal Gen CROMOSOMA POSICION IDEntrez Isla-CpG CLDN7 17 7105010 1366 CpG_159 16 2999774 15 72610634 11 66579429 ANKRD22 10 90601762 118932 14 64239802 14 64239962 8 144893629 CpG_78 SLC44A2 19 10596578 57153 CpG_46 Tabla 4 nucleótidos de citosma metüados asociados con fenotipo epitelial Gen CROMOSOMA POSICION IDEntrez Isla-CpG HBOl 16 170343 3049 CpG_150 HBQl 16 170341 3049 CpG_150 10 118912877 CpG_110 17 44427906 CpG_255 IGF2BP1 17 44430879 10642 CpG_255 4 25120404 TC2N 14 91391048 123036 ALDH3B2 11 67204971 222 MY01D 17 28170353 4642 SYK 9 92692359 6850 SY 9 92659288 6850 AMICA1 11 117590130 120425 MAL2 8 120326244 114569 MACROD2 20 14267035 140733 OVOL2 20 17972215 58495 CAPN13 2 30821257 92291 PLG 6 161094476 5340 Tabla 4 (cont } nucleótidos de citosma met liados asociados con fenotipo epitelial Gen CROMOSOMA POSICIÓN IDEntrez Isla-CpG NCALD 102871791 83988 6 147353266 14 100245858 CpG_79 14 100245905 CpG_79 14 100246063 CpG_79 TRIM9 14 50630238 114088 CpG_199 KIAA0040 1 173395004 9674 KIAA0040 1 173396807 9674 7 50601267 S 127777938 7 50601390 7 50601219 SYDE1 19 15079713 85360 CpG_56 11 65013559 NUAK1 12 104998452 9891 M P2 16 54071026 4313 CpG.42 ZNF521 18 21184882 25925 ZNF521 18 21185001 25925 IRF6 1 208029710 3664 SRD5A2 2 31656355 6716 P2 16 54070981 4313 CpG_42 ÍGF2ESP1 17 44430854 10642 CpG_255 ZC4H2 X 64171686 55906 CpG_71 12 72730512 IGF2BP1 17 44430757 10642 CpG_255 PAX7 1 18830954 5081 CpG_205 17 44427856 CpG_255 LLT11 1 149299347 10962 CpG_53 MLLT11 1 149299586 10962 6 114284192 6 114284228 6 114284034 6 114284022 10 118912831 CpG_110 10 118912483 CpG_110 10 118912726 CpG_110 X 64171940 CpG_71 La presente invención se comprenderá mejor de los ejemplos que siguen. Sin embargo, el experimentado en el arte apreciará fácilmente que los métodos y resultados específicos discutidos son solamente ilustrativos de la invención como se describe más plenamente en las reivindicaciones que siguen después de esto y no serán consideradas de ninguna manera limitada a la misma.

EJEMPLOS Ejemplo 1-Materiales y métodos Análisis de expresión de fluidigm. El análisis de expresión de EMT se llevó a cabo en 82 líneas celulares NSCLC utilizando la plataforma de expresión genética de 96 x 96 de BioMark (Fluidigm) y un panel de expresión de EMT de 20 genes (tabla 1S complementaria y métodos) . Los valores de ACt fueron usados para agrupar líneas celulares de acuerdo con niveles de expresión genética de EMT utilizando los elementos de programación Cluster v.3.0 y Treeview v.1.60.

Análisis de IIlumina Infinium: Los datos de microarreglo fueron recolectados en Expression Analysis, Inc. (Durham, N.C.) utilizando el chip de perla Illumina Human Methylation 450 (Illumina, San Diego, CA) as como se describe posteriormente en la presente. Los datos del arreglo fueron analizados y un clasificador de metilación fue establecido utilizando una estrategia de validación cruzada "dejar uno fuero" (descrita posteriormente y en las referencias 25, 26) . Los datos de arreglo han sido presentados a la base de datos Omnibus de Gen Expression (número de acceso GSE36216) .

Líneas celulares; Todas las líneas celulares de NSCLC fueron compradas de la American Type Cell Culture Collection (ATCC) o fueron provistas por Adi Gazdar y John Minna en UT Southwestern. Las líneas celulares epitelial bronquial inmortalizada (gBECs) y de vía aérea pequeña (gSACs) fueron creadas en Genentech utilizando un vector tricistrónico que contiene cdk4, hTERT y G418 como marcador de selección. El vector tricistrónico fue diseñado de la cadena fundamental pQCXIN que contienen hTERT. El proceso de inmortalización estuvo basado en protocolos publicados previamente con alguna modificación (Ramírez, Sheridan et al. 2004; Sato, Vaughan et al. 2006) . El gBECs y gSACs tienen un cariotipo diploide y no son tumorigénicos . El tratamiento de líneas celulares como en 5-azadC, erlotinib o TG ? se llevó a cabo como se describe .

Tejido de pulmón normal con NSCLC, tumor primario y tejido de biopsia: 31 tejidos de tumor primario recién congelados de NSCL (N=28 adenocarcinoma, 3 carcinoma de célula escamoso) representativos de tumores resecables quirúrgicamente, de etapa temprana y 60 biopsias de NSCLC embebidas en parafina fijadas con formalina (FFPE) de pacientes que avanzaron a quimioterapia de línea frontal fallida. 35 tejidos de pulmón normal recién congelados (31 coincidieron con tej idos de tumor primario fueron también parte de esta colección) . Todas las muestras fueron obtenidas con consentimiento por escrito bajo un protocolo aprobado por IRB. Todas las muestras fueron evaluadas por un patólogo en cuanto a calidad del tejido y etapa del tumor, grado y contenido de tumor. Células mononucleares de sangre periférica (N = 20) fueron obtenidas de voluntarios saludables en la clínica de Genentech.

Tratamiento con 5-aza-dC y tratamiento con GF l: Las células fueron cultivadas en RMPI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10% y L-glutamina 2 mM. Las células fueron sembradas en el día 0 a 4000-9000 células/cm2 y dosificadas con 5-aza-2 ' -desoxicitidina (5-aza-dC) 1 (SIGMA-ALDRICH Cat No. A3656) O testigo de DMSO (Cat No. D2650) en los días 1, 3 y 5. En el día 6 las células fueron lavadas una vez en PBS frío y cosechadas mediante raspado en Trizol (Invitrogen, Cat No 15596018) y extraídas en cuanto a ARN o congeladas de manera instantánea para posterior extracción de ARN. Para inducción de EMT, las células fueron depositadas a 20000-50000 células/lOcm2 en medio completo y complementadas con 2 ng/ml de factor beta 1 de crecimiento transformante (?TG ?) humano (R&D Systems, Cat No 100-B/CF) o testigo de PBS. El medio y TGF i fueron reemplazados cada 3 días y el ARN extraído a 4-5 semanas enseguida de la inducción por ?TGß? de EMT. Los cambios de expresión genética fueron determinados usando ensayos de Tagman para el panel de EMT de 20 genes (figura 1) .

Tratamiento con erlotinib: para la determinación de IC50 de erlotinib, las células fueron depositadas por cuadruplicado a 3 x 102 células por cavidad en placas de 384 cavidades en RPMI que contiene FBS al 0.5% (medio de ensayo) e incubadas de la noche a la mañana. 24 horas más tarde, las células fueron tratadas con medio de ensayo que contiene TGF 3 nM y erlotinib a un intervalo de dosis de concentración final de 10 µ? - 1 pM. Después de 72 h, la viabilidad celular fue medida usando el ensayo de viabilidad celular luminiscente Celltiter-Glo (Promega) . La concentración de erlotinib que da como resultado 50% de inhibición de viabilidad celular fue calculada a partir de un análisis de curva de 4 parámetros y fue determinada a partir de un mínimo de 2 experimentos. Las líneas celulares que exhiben una IC50 de erlotinib = 2.0 µ? fueron definidas como sensibles, 2.0 -8.0 µ como intermedias y = 8.0 µ? como resistantes.

Análisis de expresión genética de Fluidigm: 2 µ? de ARN total fueron transcritos de manera inversa a cADN y preamplificados en una sola reacción usando Superscript III/Platinum Taq (Invitrogen) y mezcla de reacción de preamplificación (Invitrogen) . 20 conjuntos de cebador/sonda de Taqman seleccionadas para el panel de expresión de EMT (figura 1) fueron incluidos en la reacción de preamplificación a una dilución final de concentración de ensayo de Taqman original de 0.05 x (Applied Biosystems) . Las condiciones de ciclos térmicos fueron como sigue: 1 ciclo de 50°C por 15 minutos, 1 ciclo de 70°C por 2 minutos, luego 14 ciclos de 95°C por 15 segundos y 60°C por 4 minutos.

El cADN preamplificado fue diluido 1.94 veces y luego amplificado usando la mezcla MasterMix de PCR universal de Taqman (Applied Biosystems) en la plataforma BMK-M-96.96 de BioMark (Fluidigm) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las muestras fueron ensayadas por triplicado. Dos genes de referencia diseñados sobre pedido que fueron previamente evaluados en cuanto a su estabilidad de expresión a través de múltiples líneas celulares, muestras de tejido recién congeladas y muestras de tejido FFPE, AL-1377271 y VPS-33B, fueron incluidas en el panel de expresión. Se calculó una media de los valores de Ct para los dos genes de referencia para cada muestra y los niveles de expresión de genes objetivo de EMT fueron determinados usando el método de delta Ct (dCt) como sigue: Ct medio (gen objetivo) - Ct medio (genes de referencia) .

Análisis de Illumina Infinum: Los datos de microarreglo fueron recolectados en Expression Analysis, Inc. (Durham, NC; www.expressionanalysis.com) usando el chip BeadChip IlluminaHumanMethylation450 BeadChip (Illumina) . Estos arreglos contienen sondas para aproximadamente 450,000 sitios de CpG. El objetivo fue preparado e hibridizado de acuerdo con el "Illumina Infinium HD Methylation Assay, Manual Protocol" (Illumina Part # 15019522 Rev. A) .

Conversión por bisulfito: Se usó una reacción de conversión por bisulfito usando 500 ng de ADN genómico de acuerdo con el protocolo del fabricante para el kit de metilación de ADN Zymo EZ (Zymo Research) . El ADN fue agregado a la solución reguladora del pH M-dilution de Zymo e incubado por 15 minutos a 37°C. El reactivo de conversión de CT fue luego agregado y la mezcla fue desnaturalizada mediante calentamiento a 95°C por 30 segundos seguido por incubación por 1 hora a 50°C. Este ciclo de desnaturalización/incubación fue repetido por un total de 16 horas. Después de la conversión por bisulfito, el ADN fue enlazado a una columna de centrifugación Zymo y desulfonado sobre la columna usando el reactivo de desulfonación según el protocolo del fabricante. El ADN convertido por bisulfito fue eluido de la columna en 10 µ? de solución reguladora de elución.

Ensayo de metilación Infinum: 4 µ? del producto convertido por bisulfito fueron transferidos a una nueva placa con una cantidad igual de NaOH 0.1 N y 20 ul de reactivo MA1 (Illumina) , luego se deja incubar a temperatura ambiente por 10 minutos. Inmediatamente enseguida de la incubación se agregaron 68 ul de reactivo MA2 y 75 ul de reactivo de MSM (ambos de Illumina) y la placa fue incubada a 37°C de la noche a la mañana para amplificación. Después de la amplificación, el ADN fue fragmentado enzimáticamente, precipitado y resuspendido en solución reguladora de hibridización de RAI .

Hibridización y escaneo: El ADN fragmentado fue dispersado sobre los BeadChxps HumanMethylation de multicanal y la hibridización fue efectuada en un horno de hibridización de Illumina por 20 horas. Los BeadChxps fueron lavados, cebador extendidos y teñidos según los protocolos del fabricante . Los BeadChips fueron recubiertos y luego representados en imagen en un Lector iScan de Illumina y las imágenes fueron procesadas con los elementos de programación de GenomeStudio del módulo de metilación (versión 1.8 o posterior) .

Análisis de Infinum: Los datos de metilación fueron procesados usando el paquete de elementos de programación Bioconductor lumi (Du, Kibbe et al. 2008) . La plataforma Infinium 450K incluye los ensayos Infinium I y II en el mismo arreglo. El ensayo Infinum I emplea dos tipos de perla por sitio de CpG, el estado metilado es reportado por el tinte rojo en algunos casos y el tinte verde en otros (idénticos a la plataforma Infinium 27K previa) . El ensayo Infinium II usa un tipo de perla y siempre reporta el estado metilado con el mismo tinte, haciendo el sesgo o polarización del tinte una preocupación. Se aplicó un procedimiento de normalización de dos etapas a los arreglos: primero, para cada arreglo, una curva de corrección por sesgo de color fue estimada de los datos de Infinum I usando un método de normalización cuantil uniforme; esta curva de corrección fue luego aplicada a todos los datos de aquel arreglo; en segundo lugar, los arreglos fueron normalizados entre sí mediante la aplicación de normalización estándar cuantil a todas las señales colorcorregidas. Después del pre-procesamiento, ambos valores de M-metilación (proporciones log2 de sondas metiladas a sin metilar) y valores - (un reescalamiento de los valores al intervalo 0 y 1 vía transformada logística) fueron calculados para cada muestra (Du, Zhang et al. 2010). Para visualización, el agrupamiento jerárquico aglomerativo de valores - fue efectuado usando enlace completo y distancia euclidiana.

Clasificador de metilación: Se usó una estrategia de validación cruzada de 10 x 10 veces para seleccionar un conjunto de sitios de CpG metilados diferencialmente (DRM) y evaluar simultáneamente la exactitud de un clasificador de EL vs. ML a base de metilación. Las líneas celulares fueron divididas en 10 grupos dimensionados igualmente. Usando 9 décimos de las líneas (el conjunto de entrenamiento) , los DRM candidatos fueron identificados al calcular primero un promedio móvil para cada valor M de línea celular (ventanas de 500 pares de bases centrados sobre los sitios de CpG interrogados) ; luego se usó una prueba t para contrastar las puntuaciones de ventana asociadas a líneas de entrenamiento semejantes a epiteliales versus semejantes a mesenquimales . Los valores p de D R fueron ajustados para controlar la proporción de descubrimientos falsos (Benjamini and Hochberg 1995) y comparados con un corte de 0.01. Para enriquecer fenómenos más biológicamente relevantes, se requería que los candidatos tengas puntuaciones de ventana promedio que (i) difirieran por al menos 1 unidad entre las líneas epiteliales y mesenquimales y (ii) tuvieran signo opuesto en los dos conjuntos de líneas celulares. Este proceso produjo ambos DRM candidatos mesenquimal-asociados (señal positiva) y epitelial-asociados (señal negativa) . Para determinar el desempeño, el 1 décimo de líneas mantenidas fuera para las pruebas fueron puntuadas al sumar su señal en cuanto a DRM positivos y restar la señal por DRM negativos y luego dividir por el número total de DRM. Los marcadores epitelial vs. mesenquimal conocidos para las líneas de prueba fueron comparados con el signo del resultado. Finalmente, el proceso de validación cruzada fue repetido cada décimo que toma el papel de conjunto de prueba. Finalmente, el proceso de valdación cruzada mismo fue repetido 9 veces más y la determinación de exactitud global fue el promedio de las 100 proporciones de exactitud de conjunto de prueba diferentes. Para construir un conjunto final de DRM, solamente se retuvieron candidatos identificados como relevantes en el 100% de las divisiones de validación cruzada. Los DRM contiguos que satisfacen este criterio fueron fusionados a un solo DMR si se separaban por menos de 2 kb.

Puntuación de EMT a base de expresión: Se observó que el comportamiento de algunos genes en el panel de expresión de Fluidigm de 20 genes difieren entre líneas celulares y muestras de tumor. Para identificar un subconjunto más rubosto de este panel por propósitos de clasificción de EL vs. ML, se tomó la expresión de CDH1 como ancla o afianzador de EMT y luego se seleccionaro genes (13 en total) cuya correlación con CDH1 mostró el mismo signo en ambas líneas celulares y muestras de tumor. Para asignar una puntuación de expresión de EMT a las muestras de tumor, los valores de -dCT para cada uno de los 13 genes fueron primero centrados para tener media 0 y escalados para tener desviación estándar de 1. Enseguida, los signos fueron cambiados para aquellos genes que muestran correlación negativa con CDH1. Finalmente, las puntuaciones de muestra de tumor individual fueron calculadas al promediar los resultados estandarizados y de signo ajustado.

Secuenciación por bisulfito y análisis: El ADN genómico fue convertido por bisulfito usando el kit Methyation-Gold de ADN EZ (Zymo Research) . Los cebadores específicos al ADN convertido fueron diseñados usando los elementos de programación Methyl Primer Express vl.O (Applied Biosystems) (Las secuencias están disponibles sobre pedido) . La amplificación de PCR fue efectuada con 1 µ? del ADN convertido por bisulfito en una reacción de 25-µ1 usando la supermezcla de PCR Platinum (Invitrogen) . Las condiciones de ciclos térmicos de PCR fueron como sigue: 1 ciclo de desnaturalización inicial de 95°C por 10 minutos, seguido por 10 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 65°C por 1 minuto y disminución por 1°C cada ciclo y 72°C por 1 minuto, seguido por 30 ciclos de 94 °C por 30 segundos, 55°C por 1.5 minutos y 72 °C por 1 minuto, seguido por una extensión final a 72°C por 15 minutos. Los productos de PCR fueron resueltos mediante electroforesis usando geles de agarosa E al 2% que contienen bromuro de etidio (Invitrogen) y visualizados usando una cámara FluorChem 8900 (Alpha Innotech) .

Los productos de PCR fueron ligados al vector pCR4-TOPO usando el kit de clonación TOPO TA (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 2 µ? de AND de plásmido ligado fueron transformados a bacterias TOPO10 competentes (Invitrogen) y 100 µ? de bacterias transformadas fueron depositadas sobre placas de LB-agar que contienen 50 ig/ml de carbenicilina (Teknova) e incubadas de la noche a la mañana a 37°C. Doce colonias por línea celular para cada sitio candidato fueron inoculadas a 1 mi de LB que contiene 50 g/ml de carbenicilina y cultivadas de la noche a la mañana a 37°C. El ADN del plásmido fue aislado usando el kit miniprep de Qiaprep en un formato de 96 cavidades (Qiagen) y secuenciado en un analizador de ADN 3730x1 (Applied Biosystems) .

Análisis de secuenciación por bisulfito: Los datos de secuenciación fueron analizados usando los elementos de programación Sequencher v 4.5 y elementos de programación BiQ Analyzer (Bock, Reither et al. 2005) .

Pirosecuenciación: Cebadores de PCR bisulfito-específicos (BSP) fueron diseñados usando los elementos de programación Methyl Primer Express software v 1.0 (Applied Biosystems) o los elementos de programación de diseño de ensayo PyroMark software v 2.0 (Qiagen) . Los cebadores de PCR fueron sintetizados con un marcador de 5'biotina ya sea sobre el cebador delantero o inverso para facilitar el enlace del producto de PCR a perlas de estreptavidina Sepharose . Los cebadores de secuenciación fueron diseñados en la dirección inversa del cebador de PCR 5'-biotina marcado usando los elementos de programación de diseño de ensayo PyroMark v 2.0 (Qiagen) . Las secuencias de cebador están disponibles sobre pedido. 1 µ? de AND modificado por bisulfite fue amplificado en una reacción de 25 µ? usando la supermezcla de PCR Platinum (Invitrogen) y 20 µ? del producto de PCR fueron usados para secuenciación en el Pyromark Q24 (Qiagen) . Los productos de PCR fueron incubados con perlas de estreptavidina Sepharose por 10 minutos, seguido por lavados con etanol al 70%, solución de desnaturalización de Pyromark y solución reguladora de lavado Pyromark. Los productos de PCR desnaturalizados fueron luego secuenciados usando cebador de secuenciación 0.3 µ?. Los pirogramas fueron visualizados y evaluados en cuanto a calidad de secuencia y el por ciento de metilación en los sitios de CpG individuales fue determinado usando los elementos de programación PyroMark versión 2.0.4 (Qiagen) .

PCR específica de metilación cuantitativa: Ensayos de PCR específicos de metilación cuantitativos (qMSP) que apuntan a DMR identificados mediante perfilado de Infinium fue diseñado. El ADN convertido por bisulfito de sodio fue amplificado con varios ensayos de Taqman sobre pedido 20x utilizando la mezcla maestra de PCR universal de TaqMan®, No AmpErase® UNG (Applied Biosystems) con condiciones de ciclo 95 °C 10 minutos, luego 50 ciclos de 95 °C por 15 segundos y 60 °C por 1 minuto. La amplificación se hizo en un dispositivo 7900HT y analizado utilizando elementos de programación de SDS (Applied Biosystems) . El contenido de ADN fue normalizado utilizando el ensayo de Taqman de meRNasaP. El qMSP del material de FFPE fue efectuado utilizando un procedimiento de pre-amplificación.

Pre-amplificación de material de tumor de FFPE: Un método de pre-amplificación para análisis de metilación de cantidades de pico gramos de ADN extraxdo del tej ido embebido en parafina formalina-fijado (FFPE) fue desarrollado como sigue. 2 µ? (equivalente a 100 pg - 1 ng) de ADN convertido por bisulfito fueron amplificados primero en una reacción de 20 µ? con concentraciones de cebador-sonda de qMSP de 0. lx utilizando la mezcla maestra de PCR universal TaqMan®, No AmpErase® UNG (Applied Biosystems, no. de catálogo 4324018) y condiciones de ciclo de 95 °C 10 min, luego 14 ciclos de 95 °C por 15 segundos y 60 °C por 1 minuto. 1 µ? del material pre-amplificado fue luego amplificado en una segunda reacción de PCR con condiciones de ciclos de 95 °C 10 minutos, luego 50 ciclos de 95 'C por 15 segundos y 60 °C por 1 minuto. El contenido de ADN fue confirmado utilizando una pre-amplificación con el ensayo de Taqman de meRNasaP de referencia y solamente muestras que fueron positivas para meRNasaP fueron incluidas en análisis adicional de reacciones de qMSP. Todas las reacciones fueron efectuadas por duplicado.

Ejemplo 2 - Las firmas de expresión epitelial-semejantes y mesenquimal-semejantes se correlacionan con la sensibilidad a erlotinib in vitro.

Una firma de expresión genética que se correlaciona con la sensibilidad in vitro de las líneas celulares de NSCLC a erlotinib fue definida previamente (11) . Este conjunto genético fue altamente enriquecido por genes involucrados en EMT. Un panel de expresión de EMT a base de PCR de transcriptasa inversa cuantitativo en la plataforma nano fluida de fluidigm (figura 1) fue desarrollado. Una comparación del conjunto de 100 sondas del estudio de Yauch, et al (11) y el panel de fluidigm de EMT de 20 genes para 42 de las líneas perfiladas en el estudio de Yauch, et al mostraron que este panel de expresión de 20 genes es un clasificador representativo de EMT (referencia 11) .

Para evaluar adicionalmente si el panel de 20 genes era representativo de los cambios fenotípicos asociados con un EMT, dos líneas celulares fueron tratadas con ?T?ß?. Los resultados de este estudio mostraron que ?TGß? indujo cambios morfológicos asociados con un EMT. Los genes asociados con fenotipo epitelial fueron regulados hacia abajo y los genes asociados con un fenotipo mesenquimal fueron regulados hacia arriba en estas líneas celulares.

Para determinar si el perfilado de metilación de ADN podría ser usado para clasificar líneas celulares de NSCLC en grupos epitelial-semejantes y mesenquimal-semejantes, el panel de expresión de 20 genes fue usado para asignar el estatus epitelial-semejante versus mesenquimal-semejante a 82 líneas celulares. Las líneas celulares de NSCLC usadas en este estudio incluyen la mayoría de las líneas perfiladas en el estudio de Yauch, et al (11) 52 líneas adicionales, que incluían 6 líneas con mutaciones de EGFR. De las 82 líneas celulares, 36 fueron clasificadas como epitelial-semejantes y 34 fueron clasificadas como mesenquimal-semejantes en base a su expresión de estos marcadores (figura 2A-B) . Los datos de expresión fueron normalizados y media centrados (muestras y genes) . El verde indica un bajo nivel o ninguna expresión de mARN para los genes indicados; rojo indica alta expresión. Doce líneas (indicadas en el grupo inferior de la figura 2A-B) fueron clasificadas como semejantes a epiteliales pero expresan una combinación de marcadores epiteliales y mesenquimales, indicando que estas líneas representan una biología distinta diseñada como intermedia. Así, de las 82 líneas de NSCLC 89% podrían ser clasificadas claramente como epiteliales o mesenquimales. Por la mayor parte, este fenotipo de expresión semejante a epitelial versus semejante a mesenquimal fue mutuamente exclusivo, reflejando posiblemente una biología fundamental distinta, que puede estar enlazada a perfiles de metilación de ADN distintos. Un resumen de descripciones de línea celular incluyendo histología es mostrado en las figuras 8A1-B2.

Ejemplo 3 - Los perfiles de metilación genoma-amplios se correlacionan con firmas de EMT a base de fluidigm en lineas celulares de NSCLC El arreglo de 450K Illumina Infxnium fue analizado como una plataforma para perfilado de metilación de alto rendimiento al comparar los valores ß para 52 sondas y datos de secuenciación de bisulfito de sodio sobre un subconjunto de líneas celulares (N = 12) . Una correlación positiva fuerte altamente significativa entre metilación llama por el arreglo de Infinium y secuenciación de bisulfito directo fue observado (r = 0.926).

Para identificar DMR que se distinguieron entre líneas celulares epitelial-semejantes y mesenquimal-semejantes, una estrategia de validación cruzada que construyó simultáneamente un clasificador a base de metilación fue usada y su exactitud de predicción determinada, como se describe en el ejemplo 1. Cuando es aplicado al conjunto de entrenamiento de 69 líneas celulares, este análisis produjo 549 DMR que representan 915 sitios de CpG individuales que fueron seleccionados ya que definen líneas celulares de NSCLC epitelial-semejantes versus mesenquimal-semejantes con un valor P proporción ajustado de descubrimiento falso por debajo de 0.01 en 100% de las iteraciones de validación cruzada. La exactitud estimada de validación cruzada del clasificador a base de metilación fue de 88.0% (±2.4%, intervalo de confianza de 95%) .

Enseguida, los sitios de CpG incluidos en el clasificador de EMT a base de metilación fueron usados para agrupar las 69 líneas celulares de NSCLC (incluyendo 6 líneas EGFR-mutantes, erlotinib-sensibles) y 2 cepas celulares de pulmón normal primarias y sus contrapartes inmortalizadas. Este análisis reveló una segregación sorprendente de líneas epitelial-semejantes, mesenquimal-semejantes y normales (figura 3) . En este ensayo, 72 líneas celulares de NSCLC y células epiteliales de pulmón normal fueron perfiladas utilizando la plataforma de arreglo de metilación 450K de Illumina Infinium. El agrupamiento jerárquico supervisado fue llevado a cabo utilizando 915 sondas que fueron metiladas diferencialmente de manera significativa entre líneas celulares epitelial-semejantes y mesenquimal-semejantes (proporción de descubrimiento falso = 0.01; ejemplo 1). Los conjuntos de sondas anotados y utilizados para el análisis de grupo son enlistados. Cada hilera representa una sonda individual sobre el arreglo de Infinium 450K y cada columna representa una línea celular. Las regiones sombreadas de azul en el mapa de calor representan regiones sin metilar, las regiones sombreadas con rojo representan regiones metiladas. La barra de color superior muestra columnas que representan estatus epitelial-semejante o mesenquimal-semejante de cada línea celular tal como se determina mediante análisis de expresión genética de EMT de fluidigm. Verde indica semejante a epitelial y negro indica líneas celulares mesenquimal-seme antes. Las barras de color inferior indican el fenotipo e respuesta a erlotinib de cada línea celular. Rojo indica líneas de erlotinib-sensibles ; negro indica líneas erlotinib-resistentes ; gris indica líneas con sensibilidad intermedia a erlotinib. Una métrica de distancia euclidiana fue usada para agrupamiento sin centrado; el esquema de color representa diferencias de metilación absoluta.

Notablemente, la señal de metilación de estos sitios de CpG agruparon las líneas celulares epitelial-semejantes y mesenquimal-semejantes a sus respectivos grupos epitelial-semejantes y mesenquimal-semejantes con solamente seis excepciones: las líneas mesenquimal-semejantes H1435, HCC4017, H647, H2228, H1755 y HCC15 agrupadas con el grupo epitelial-semejantes. Interesantemente, cinco de estas seis líneas agrupadas estrechamente de manera conjunta a un subconjunto distinto de líneas mesenquimal-semejantes mediante análisis de expresión genética de EMT, sugiriendo que este fenotipo de expresión genética se asocia con una firma de metilación fundamental un tanto distinta. Importantemente, el fenotipo mesenquimal-semejante alberga una proporción más grande de sitios hipermetilados que el fenotipo epitelial . Esto sugiere que se pueden requerir cambios en metilación para estabilizar las alteraciones fenotípicas adquiridas durante una EMT en las NSCLC.

Las NSCLC EGFR-mutantes presentes comúnmente como adenocarcinomas bien diferenciados en el pulmón periférico. En base a su fenotipo de expresión epitelial-semejante y su histología característica, las líneas celulares EGFR-mutantes se comportaron más similarmente a las líneas epitelial, semejantes que a las líneas mesenquimal-semejantes . Se notó un patrón de segregación de las líneas celulares en base a la sensibilidad in vitro a erlotinib (figura 3, indicada por sensibilidad en la parte media) . Casi todas las líneas erlotinib-sensibles fueron asociadas con un fenotipo epitelial-semejante mientras que casi todas las líneas mesenquimal-semejantes fueron resistentes a erlotinib. Sin embargo, no todas las líneas epitelial-semejantes fueron sensibles a erlotinib. Diez de las líneas erlotinib-resistentes agrupadas con las líneas epitelial-semejantes y cuatro líneas erlotinib-sensibles , H838, H2030, RERF-LC-MS y SK-MES-1, se agruparon con las líneas mesenquimal-semejantes . Notablemente, H838 y SK-MES-1 como valores atípicos con respecto a sensibilidad a erlotinib cuando son agrupados mediante expresión genética utilizando la firma de expresión de EMT definida previamente (11) . Algunos de los otros valores atípicos con respecto a sensibilidad a erlotinib tienen mutaciones que explican su resistencia aparente. Por ejemplo, la línea epitelial-semejante H1975 alberga una mutación de T790M en EGFR y H1993 alberga una amplificación de EMT. Estás alteraciones genéticas confieren resistencia a erlotinib específicamente, sugiriendo que las firmas epigenéticas observadas son subrogados por el estado biológico de la línea celular en lugar de por sensibilidad a erlotinib, per se.

Ejemplo 4 - Secuenciación por bisulfito de sodio de DMR seleccionados valida el perfilado de metilación de Infinium 17 DMR identificados por Infinium (figura 4A-B) que estuvieron espacialmente asociados con genes (en la isla 5' CpG o intragenica) fueron examinados en cuanto a su estatus de metilación mediante secuenciación directa de fragmentos clonados de ADN bisulfito de sodio-convertido . Cinco líneas epitelial-semejantes, cuatro líneas mesenquimal-semejantes y una línea intermedia fueron seleccionadas para validación de secuenciación. La secuenciación por bisulfito de aproximadamente 10 clones por línea celular por 10 sitios revelo que casi todos estos marcadores fueron casi completamente metilados en por lo menos cuatro de las líneas celulares mesenquimal-semejantes y en la línea intermedia H522. En contraste, estos sitios estuvieron completamente sin metilar en todas las cinco de las líneas epitelial-semejantes. Cuatro de diez marcadores que fueron metilados en líneas mesenquimal-semejantes, ESRPl y CP2L3/GRHL2, miR200C y MST1R/R0N, están involucrados en la diferenciación epitelial (2, 27, 28) . ESRP1 es un regulador epitelial-específico de empalme alternativo que es regulado hacia abajo en células mesenquimales y CP2L3/GRHL2 es un regulador transcripcional del complejo de unión apical (27, 28) ; miR200C es un regulador negativo conocido del inductor de EMT ZEB1 (29) . La expresión de ESRP1 y GRHL2 fue regulada hacia abajo en un panel más grande de líneas mesenquimal-semejantes en relación con todas las líneas epitelial-semejantes, consistente con la ausencia conocida de proteínas de ESRP en células mesenquimales y la habilidad d estas proteínas para regular transcriptos epiteliales que cambian el empalme durante EMT. El análisis de pirosecuenciación indico que GRHL2 fue también hipermetilado en este panel más amplio de líneas mesenquimal-semejantes en relación con las líneas epitelial-semejantes .

Ejemplo 5 - Relevancia biológica de los DMR Para evaluar el papel de metilación en regular la expresión de los genes asociados con DMR seleccionados, se llevó a cabo PCR cuantitativa en un panel de 34 líneas celulares de NSCLC tratadas con 5-aza-2 ' -dexocitidina (5-aza-dC) y tratadas con sulfóxido de dimetilo. No todos los DMR estuvieron asociados con cambios de expresión genética obvios enseguida del tratamiento con 5-aza-dC pero se notó una inducción significativa de transcriptos de GRHL2, ESRP1 y CLDN7 en líneas semejantes a mesenquimales versus epitelial-semejantes. De este grupo de genes, CLDN7 fue seleccionado como un marcador representativo de EMT y su estatus de metilación fue cuantificado mediante pirosecuenciación en un panel extendido de 42 líneas celulares. Casi todas las líneas mesenquimal-semejantes fueron metiladas en la región de promotor de CLDN7 y exhibieron inducción gramática de la expresión de CLDN7 (>10 veces) en respuesta al tratamiento con 5-aza-dC (figura 5A y B) . En contraste, CLDN7 fue expresado en la mayoría de las líneas celulares epitelial-semejantes y no fue inducido adicionalmente por el tratamiento con 5-aza-dC. Estos datos muestran un enlace directo entre la hipermetilación de ADN sitio-específica y el silenciamiento transcripcional en un subconjunto de genes asociados con estados epitelial-semejantes y mesenquimal-semejante en líneas celulares de NSCLC.

En la figura 5A, se determinó la metilación cuantitativa en siete sitios de CpG por los elementos de programación de análisis de PyroMark utilizando la ecuación: % de metilación = (C altura pico x 100/C altura pico + T altura pico) . Los datos son representados como la media ± porcentaje de SD de metilación en 7 sitios de CpG. En la figura 5B, la expresión relativa del mARN de CLDN7 fue determinada utilizando un método de ACt estándar en 42 líneas celulares de NSCLC (n = 20 epitelial-semejante, 19 mesenquimal-semejante, 3 intermedias) DMSO-tratadas y 5-aza-dC-tratadas . Los valores de expresión fueron calculados como veces de cambio en las células tratadas con 5-aza-dC con células testigo tratadas con DMSO. Los datos son normalizados al gen de mantenimiento GAPDH y representados como la media de 2 réplicas. DMSO, sulfóxido de dimetilo; GAPDH, gliceraldehído-3 -fosfato deshidrogenasa .

Ejemplo 6 - MSP cuantitativa clasifica las lineas celulares de NSCLC en subtipos epiteliales y mesenquimales y predice la sensibilidad a erlotinib Enseguida de la validación independiente del estatus de metilación de 17 marcadores mediante análisis de secuenciación directa, 70 líneas celulares de NSCLC fueron analizadas para determinar si estos marcadores podrían clasificar correctamente los fenotipos epitelial-semej antes y mesenquimal-semej antes . En base al análisis de secuenciación de bisulfito de sodio, las regiones metiladas fueron seleccionadas que distinguen mejor las líneas epitelial-semejantes de líneas mesenquimal-semejantes y ensayos de PCR metilación cuantitativa-específicos (qMSP) fueron diseñados en base a la tecnología de Taqman. qMSP como una plataforma de ensayo debido a que ha mostrado tener uso en detectar hipermetilación de promotor tumor-específica en especímenes obtenidos de pacientes con cáncer. Este método es altamente sensible y específico para cuantificar alelos metilados y es fácilmente adaptable a formatos de alto rendimiento, haciéndolo apropiado para aplicaciones clínicas (30-33) . La tecnología de TaqMan es superior a los diseños de SYBR para MSP debido a la especificidad incrementada del ensayo impartida por la sonda fluorescente, que no actúa como cebador. Para normalizar muestras para entrada de ADN, un ensayo de referencia de RNasa P bisulfito-modificado fue diseñado para amplificar el ADN de entrada independientemente de su estatus de metilación. Se llevaron a cabo curvas de titulación utilizando ADN metilado testigo, ADN derivado de monocitos de sangre periférica (N = 20) y ADN de líneas celulares con estatus de metilación conocido por cada DMR. De notarse, casi todos los ensayos desarrollados dieron como resultado salidas especialmente binarias en cuanto a la presencia o ausencia de metilación, lo que elimina la necesidad de definir puntos de corte.

Treces marcadores candidatos de estatus epitelial (E) o mesenquimal (M) fueron probados para determinar si diferenciaban las líneas celulares epitelial-semejantes de las mesenquimal-semejantes en base a la clasificación de expresión genética de EMT, incluyendo RON/MST1R (M) , STX2 (M) , HOXC5 (M) , PEX5L (E) , FAM110A (M) , ZEB2 (E) , ESRP1 (M) , BCAR3 (E) , CLDN7 (M) , PCDH8 (E) , NKX6.2 (M) , ME3 (E) y GRHL2 (M) . Diez de 13 marcadores estuvieron asociados significativamente con el estatus epitelial-semejante o mesenquimal-semejante utilizando un valor de corte P < 0.05 (figura 6A-H) . En este ensayo, los ensayos de qMSP fueron usados para determinar metilación en líneas celulares de NSCLC epitelial-semejantes (n = 36) y mesenquimal-semej ante (n = 34) . El ADN de entrada total fue normalizado utilizando una sonda de TaqMan de RNasa P bisulfito-específica. En la figura 6A-H, los niveles de metilación son gráficos como -ACt (indicado como objetivo-RNasa P) para cada muestra en el eje Y. Un valor de -ACt incrementado indica metilación incrementada. Las líneas celulares son agrupadas por estatus epitelial-semejante/mesenquimal-semejante en el eje X. Los valores P fueron determinados utilizando una prueba t de Student sin aparear de dos colas . Gráficos características de operación de receptor (ROC) para (B) RON, (D) FAM110A, (F) GRHL2 y (H) ESRP1 son presentadas . Los valores P fueron determinados utilizando una prueba de suma de rango de Wilcoxon.

Estos mismos marcadores fueron examinados para determinar si son predictivos de sensibilidad a erlotinib in vitro. Siete de 13 DMR fueron fuertemente predictivos de resistencia a erlotinib (P individual < 0.005; figura 7A-M) y 3 de 13 DMR, PEX5L, ME3 y ZEB2 , fueron asociados significativamente con un fenotipo epitelial pero no fueron estadísticamente predictivos de sensibilidad a erlotinib. En este ensayo, la amplificación de qMSP de 58 muestras de ADN de líneas celulares de NSCLC fue efectuada utilizando los ensayos de qMSP indicados. Curvas de ROC para líneas celulares sensibles a erlotinib versus resistentes a erlotinib fueron generadas utilizando los elementos de programación estadísticos R. El valor P fue determinado utilizando una prueba t de Student. La figura 7A-M y figura 8A1-B2.

Incorporación por referencia Todas las patentes, solicitudes de patentes publicadas y otras referencias reveladas en la presente son incorporadas expresamente en la presente por referencia.

Equivalentes Aquellos experimentados en el arte reconocerán o serán aptos de indagar utilizando no más que experimentación de rutina, muchos equivalentes a modalidades específicas de la invención descrita específicamente en la presente. Se pretende que tales equivalentes sean abarcados en el alcance de las siguientes reivindicaciones. El término "que comprende" como se usa en la presente es no limitante e incluye los elementos especificados sin limitar la inclusión de elementos adicionales .

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar si una célula de tumor tiene fenotipo mesenquimal, caracterizado porque comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en un sitio de CpG en por lo menos un gen seleccionado de por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de CLDN7, H0XC4 , P2L3, TBCD, ESPR1, GRHL2 , erbB2 y C20orf55, en donde la presencia de metilación de los sitios de CpG indica que la célula de tumor tiene un fenotipo mesenquimal .

2. Un método para determinar la sensibilidad del crecimiento de tumor a inhibición por un inhibidor de cinasa de EGFR, caracterizado porque comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en un sitio de CpG en por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de CLDN7, H0XC4, P2L3, TBCD, ESPR1, GRHL2 , erbB2 y C20orf55 en una célula de tumor de muestra, en donde la presencia de metilación en el sitio de CpG indica que el crecimiento del tumor es resistente a inhibición con el inhibidor de EGFR.

3. Un método para identificar un paciente con cáncer que es probable de beneficiarse del tratamiento con un inhibidor de EGFR, caracterizado porque comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en un sitio de CpG en por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de CLDN7, H0XC4 , P2L3, TBCD, ESPR1, GRHL2 y C20orf55 en una muestra de cáncer del paciente, en donde el paciente es identificado por ser probable de beneficiarse del tratamiento con el inhibidor de EGFR si se detecta la ausencia de metilación del ADN del sitio de CpG.

4. El método de la reivindicación 3, caracterizado porque comprende además administrar al paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de EGFR si el paciente es identificado como uno que probablemente se beneficiará del tratamiento con el inhibidor de EGFR.

5. Un método de tratamiento de un cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un inhibidor de EGFR para el paciente, en donde el paciente, antes de la administración del inhibidor de EGFR, fue diagnosticado con un cáncer que exhibe ausencia de metilación de ADN en un sitio de CpG en por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de CLDN7, H0XC4, P2L3, TBCD, ESPR1, GRHL2 y C20orf55.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 2-5, caracterizado porque el inhibidor de EGFR es erlotinib, cetuximab o panitumumab.

7. Un método para determinar si una célula de tumor tiene un fenotipo epitelial, caracterizado porque comprende detectar la presencia o ausencia de metilación de ADN en un sitio de CpG en por lo menos un gen seleccionado del grupo que consiste de PCDH8, PEX5L, GALR1, y ZEB2 , en donde la presencia de metilación en el sitio de CpG indica que la célula de tumor tiene un fenotipo epitelial.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la presencia o ausencia de metilación es detectada mediante pirosecuenciación.

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el ADN es aislado de un tejido embebido en parafina formalina-fijado (FFPE) o de tejido congelado nuevo.

10. El método de la reivindicación 9, caracterizado porque el ADN aislado de la muestra de tejido es pre-amplificada antes de pirosecuenciación.

11. El método de la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la célula de tumor es una célula de NSCLC.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, caracterizado porque el cáncer es NSCLC.