JP2023510572A - 肝細胞がんを診断するための方法 - Google Patents

肝細胞がんを診断するための方法 Download PDF

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Abstract

患者における肝細胞がんを診断するための組成物、方法、およびキットが提供される。特に、メチル化無細胞ＤＮＡバイオマーカー、および患者が肝細胞がんを有するかどうかを決定するためにそれらを使用する方法が提供される。加えて、メチル化された無細胞ＤＮＡバイオマーカーは、肝硬変などの慢性肝疾患を有する肝細胞がんを有しない患者と、肝細胞がんを有する慢性肝疾患を有する患者とを区別するために使用され得る。特定されたバイオマーカーは、肝細胞がんの予後、診断、療法選択、または治療のモニタリングにおいて、単独で、または１つ以上の追加のバイオマーカーもしくは関連する臨床パラメータと組み合わせて使用され得る。【選択図】図１

Description

肝細胞がん（ＨＣＣ）の９０％は、肝硬変が基礎となり、これは多くの場合、ウイルス性肝炎または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）からの肝線維症の増加に起因する（Ｚｈａｎｇ ＆ Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５６，７６９－７７５（２０１２））。高感度のルールアウト診断試験を用いた肝硬変患者の監視は、改善された転帰を伴う早期治療のためのＨＣＣの診断に不可欠である。現在のケアの標準であるアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）試験は、臨床的に確立された２０ｎｇ／ｍＬのカットオフで高い特異度（９０％）を示すが、残念ながら、それらはまた低い感度（５９％）を示す（Ｍａｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３７，１１０－１１８（２００９））。
Ｚｈａｎｇ ＆ Ｆｒｉｅｄｍａｎ Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ５６，７６９－７７５（２０１２） Ｍａｒｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １３７，１１０－１１８（２００９）
患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）を診断するための組成物、方法、およびキットが提供される。特に、メチル化無細胞ＤＮＡバイオマーカー、および患者が肝細胞がんを有するかどうかを判定するためにそれらを使用する方法が提供される。加えて、メチル化された無細胞ＤＮＡバイオマーカーは、肝硬変などの慢性肝疾患を有する肝細胞がんを有しない患者と、肝細胞がんを有する慢性肝疾患を有する患者とを区別するために使用され得る。特定されたバイオマーカーは、ＨＣＣの予後、診断、療法選択、または治療のモニタリングにおいて、単独で、または１つ以上の追加のバイオマーカーもしくは関連する臨床パラメータと組み合わせて使用され得る。
一態様では、患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）を診断および治療する方法が提供され、本方法は、ａ）患者から循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を取得することと、ｂ）ｃｆＤＮＡの１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、１つ以上の遺伝子が、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択され、対照ｃｆＤＮＡ試料における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、患者由来のｃｆＤＮＡ試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加が、患者がＨＣＣについて陽性診断を有することを示す、検出することと、ｃ）患者がＣｐＧ部位でのメチル化の頻度に基づいてＨＣＣについて陽性診断を有する場合、ＨＣＣについて患者を治療することと、を含む。
ある特定の実施形態では、患者は、患者がよりＨＣＣを発症しやすくなる状態または疾患を有する。いくつかの実施形態では、患者は、肝疾患を有する。例示的な肝疾患としては、肝硬変、脂肪肝疾患、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、自己免疫性肝炎、薬剤性肝炎、ウイルス性肝炎、Ａ型肝炎ウイルス感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、Ｄ型肝炎ウイルス感染症、Ｅ型肝炎ウイルス感染症、遺伝性ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、原発性胆汁性肝硬変、およびα－１－抗トリプシン欠乏症が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、１つ以上のＣｐＧ部位は、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される（これらのＣｐＧ部位の位置は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋ Ｍａｎｉｆｅｓｔにおいて得られる）。いくつかの実施形態では、本方法は、ｃｆＤＮＡにおけるｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８ ＣｐＧ部位でのメチル化の頻度を測定することを含む。
ＣｐＧ部位のメチル化の頻度に基づいてＨＣＣについて陽性診断を有する患者は、抗がん療法で治療され得る。ＨＣＣを治療するための例示的な方法としては、ＨＣＣ腫瘍の外科的切除、ＨＣＣ腫瘍の高周波アブレーション（ＲＦＡ）、ＨＣＣ腫瘍の凍結アブレーション、エタノールもしくは酢酸でのＨＣＣ腫瘍の経皮的注射、経カテーテル動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）、選択的内部放射線療法（ＳＩＲＴ）、肝臓移植、高強度焦点超音波、外部ビーム療法、門脈塞栓術、放射性核種療法（例えば、イットリウム－９０、ロジン－１３１、レニウム－１８８、またはホルミウム－１６６）、化学療法（例えば、シスプラチン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル、カペシタビン、またはミトキサントロン）、標的療法（例えば、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、レンバチニブ、カボザンチニブ、ラムシルマブ、ニボルマブ、またはペムブロリズマブ）、免疫療法、もしくは生物学的療法、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位でのメチル化を検出するために、任意の好適な方法を使用し得る。例示的な技法としては、メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、またはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、およびメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の実施形態では、本方法は、１つ以上のアルゴリズムを使用して、ｃｆＤＮＡのＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７遺伝子におけるＣｐＧ部位でのメチル化頻度に基づいてＨＣＣリスクスコアを計算することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ＨＣＣの診断のために、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７遺伝子についてｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位のメチル化頻度の幾何平均スコアを計算すること、ならびに患者の幾何平均スコアを基準幾何平均スコア（メチル化バイオマーカーの層別分析（ＬＡＭＢ）－ＨＣＣ遺伝子メチル化スコア）と比較することをさらに含む。
特定の実施形態では、本方法は、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血液レベルを測定することをさらに含み、対照対象についてのＡＦＰの血液レベル、ならびにＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加と組み合わせて、ＡＦＰの血液レベルの増加の検出が、患者が、ＨＣＣについて陽性診断を有することを示す。
特定の実施形態では、ｃｆＤＮＡ試料は、ｃｆＤＮＡを含む血液試料または血漿試料である。
別の態様では、患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）をモニタリングする方法が提供され、本方法は、ａ）第１の時点での患者由来の第１の血液試料、およびそれより後の第２の時点での患者由来の第２の血液試料を取得することと、ｂ）第１の血液試料および第２の血液試料における循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、１つ以上の遺伝子が、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択され、第１の血液試料のｃｆＤＮＡと比較して、第２の血液試料のｃｆＤＮＡにおけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化の頻度の増加の検出が、ＨＣＣが進行していることを示し、第１の血液試料のｃｆＤＮＡと比較して、第２の血液試料のｃｆＤＮＡにおけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化の頻度の減少の検出が、ＨＣＣが進行していないことを示す、検出することと、を含む。いくつかの実施形態では、本方法は、ステップａ）およびｂ）を繰り返すことをさらに含む。
特定の実施形態では、ＨＣＣは、原発性腫瘍、転移、または再発である。
特定の実施形態では、第１の時点は、ＨＣＣについての患者の治療が開始される前であり、第２の時点は、治療中または治療後である。例えば、本方法は、ＨＣＣ腫瘍の外科的切除、ＨＣＣ腫瘍の高周波アブレーション（ＲＦＡ）、ＨＣＣ腫瘍の凍結アブレーション、エタノールもしくは酢酸でのＨＣＣ腫瘍の経皮的注射、経カテーテル動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）、選択的内部放射線療法（ＳＩＲＴ）、肝臓移植、高強度焦点超音波、外部ビーム療法、門脈塞栓術、放射性核種療法、化学療法、標的療法、免疫療法、もしくは生物学的療法、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない、治療の有効性をモニタリングするために使用され得る。いくつかの実施形態では、本方法は、ＨＣＣが進行している場合に、ＨＣＣについての治療の投薬量もしくは頻度を増加させること、異なる治療に変更すること、または患者に対する緩和ケアを開始することをさらに含む。
特定の実施形態では、本方法は、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血液レベルを測定することをさらに含み、第１の血液試料と比較して、第２の血液試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加と組み合わせて、ＡＦＰの血液レベルの増加の検出が、ＨＣＣが進行していることを示し、第１の血液試料と比較して、第２の血液試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の減少と組み合わせて、ＡＦＰの血液レベルの減少が、ＨＣＣが進行していないことを示す。
別の態様では、患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）の再発についてモニタリングし、その再発について患者を治療する方法が提供され、本方法は、ａ）患者が画像化または他の診断様式からがんを有しないと特徴づけられる第１の時点で、ＨＣＣの以前の発生についての治療後に、患者から第１の循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を取得することと、ｂ）第１のｃｆＤＮＡ試料由来のｃｆＤＮＡにおける１つ以上のバイオマーカー遺伝子のプロモーター領域における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化のレベルを測定することであって、１つ以上のバイオマーカー遺伝子が、ＡＫ０５５９５７、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＭ２、ＲＵＮＸ３、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＰＩＮＴ２、およびＷＩＦ１から選択される、測定することと、ｃ）再発のモニタリング期間中の第２の時点で患者から第２のｃｆＤＮＡ試料を取得することと、ｄ）第２のｃｆＤＮＡ試料由来のｃｆＤＮＡにおける１つ以上のバイオマーカー遺伝子のプロモーター領域における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化のレベルを測定することであって、１つ以上のバイオマーカー遺伝子が、ＡＫ０５５９５７、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＭ２、ＲＵＮＸ３、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＰＩＮＴ２、およびＷＩＦ１から選択され、第１のｃｆＤＮＡ試料のｃｆＤＮＡと比較して、第２のｃｆＤＮＡ試料のｃｆＤＮＡにおけるＡＫ０５５９５７、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＭ２、ＲＵＮＸ３、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＰＩＮＴ２、およびＷＩＦ１から選択される１つ以上のバイオマーカー遺伝子のプロモーター領域における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化のレベルの増加が、ＨＣＣが再発したことを示す、測定することと、ｅ）患者が１つ以上のＣｐＧ部位のメチル化のレベルに基づいてＨＣＣの再発について陽性診断を受けた場合、ＨＣＣの再発について患者を治療することと、ｆ）その後、再発についてのモニタリング期間中に、ステップｃ）～ｅ）を繰り返すことと、を含む。
特定の実施形態では、患者は、ＨＣＣ腫瘍の外科的切除、ＨＣＣ腫瘍の高周波アブレーション（ＲＦＡ）、ＨＣＣ腫瘍の凍結アブレーション、エタノールもしくは酢酸でのＨＣＣ腫瘍の経皮的注射、経カテーテル動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）、選択的内部放射線療法（ＳＩＲＴ）、肝臓移植、高強度焦点超音波、外部ビーム療法、門脈塞栓術、放射性核種療法、化学療法、標的療法、免疫療法、もしくは生物学的療法、またはそれらの組み合わせによって、ＨＣＣの再発について治療される。
特定の実施形態では、本方法は、患者のアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血液レベルを測定することをさらに含み、ＡＦＰの血液レベル、ならびにＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、患者由来のｃｆＤＮＡにおけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加と組み合わせて、ＡＦＰの血液レベルの増加が、患者が、ＨＣＣの再発について陽性診断を有することを示す。
別の態様では、ｃｆＤＮＡにおけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化を検出するための薬剤を含むキットが提供される。本キットは、本明細書に記載の方法に従って、患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）を診断するための説明書をさらに含み得る。特定の実施形態では、本キットは、メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、もしくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、またはメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析を実施するための薬剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、本キットは、バイサルファイト試薬、メチル化感受性制限酵素、ＣｐＧジヌクレオチドを含有するＤＮＡ領域を選択的に増幅するＰＣＲプライマー、メチル化特異的プライマー、メチル化特異的プローブ、またはそれらの組み合わせを含む。
特定の実施形態では、本キットは、配列番号１～４３２からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つのプローブを含む。
別の態様では、患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）を診断するインビトロ方法が提供され、本方法は、ａ）患者から循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を取得することと、ｂ）ｃｆＤＮＡの１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、１つ以上の遺伝子が、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択され、対照ｃｆＤＮＡ試料のｃｆＤＮＡにおける１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、患者由来のｃｆＤＮＡ試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加が、患者がＨＣＣについて陽性診断を有することを示す、検出することと、を含む。
別の態様では、患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）の診断における使用のための、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される少なくとも１つの遺伝子における１つ以上のメチル化ＣｐＧ部位を含む単離されたｃｆＤＮＡが提供される。
特定の実施形態では、患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）の診断のためのバイオマーカーとしての使用のための、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される、１つ以上のＣｐＧ部位でメチル化された単離無細胞ＤＮＡが、提供される。
メチル化バイオマーカーの層別分析（ＬＡＭＢ）を示す。３０９９個の対になったＨＣＣおよびＡＮＴのメタ分析を使用して、高メチル化遺伝子を同定した。候補遺伝子プロモーターを、１５３個の対になったＨＣＣおよびＡＮＴのマイクロアレイにおいて、メチル化頻度（β）および受信者動作特性曲線下面積（ＡＵＣ）－バイオマーカーの予測能力の測定基準によって差次的にメチル化されたＣｐＧについてスクリーニングした。次いで、１７２２個の対照血液試料ならびに血液中で差次的にメチル化されたＣｐＧ（ＬＡＭＢ－ＨＣＣ）についてＡＵＣおよびβ値によって人口統計学的に一致した１５９個のＨＣＣのマイクロアレイにおいて、部位をスクリーニングした。
外部ｃｆＤＮＡ検証データセットにおけるＬＡＭＢの性能を示す。図２Ａ、ＬＡＭＢによってスクリーニングされたＣｐＧのＡＵＣ（ｎ＝２２の肝硬変、肝硬変を伴う２２のＨＣＣ）。図２Ｂ、２００ｂｐのスパンにおける４つのＳＰＩＮＴ２ ＣｐＧのメチル化頻度（β）分布。図２Ｃ、４４個のｃｆＤＮＡ試料の遺伝子メチル化マッピング図および得られた遺伝子メチル化プロファイル。図２Ｄ、試験したパネルの幾何平均スコアリング式、受信者動作特性曲線、および性能統計。丸は、報告された感度および特異度を示す。ＬＡＭＢ－肝臓パネルには、結腸直腸、膵臓、および肺の腫瘍で低メチル化された６部位が含まれている（β＜０．２）。 外部ｃｆＤＮＡ検証データセットにおけるＬＡＭＢの性能を示す。図２Ａ、ＬＡＭＢによってスクリーニングされたＣｐＧのＡＵＣ（ｎ＝２２の肝硬変、肝硬変を伴う２２のＨＣＣ）。図２Ｂ、２００ｂｐのスパンにおける４つのＳＰＩＮＴ２ ＣｐＧのメチル化頻度（β）分布。図２Ｃ、４４個のｃｆＤＮＡ試料の遺伝子メチル化マッピング図および得られた遺伝子メチル化プロファイル。図２Ｄ、試験したパネルの幾何平均スコアリング式、受信者動作特性曲線、および性能統計。丸は、報告された感度および特異度を示す。ＬＡＭＢ－肝臓パネルには、結腸直腸、膵臓、および肺の腫瘍で低メチル化された６部位が含まれている（β＜０．２）。 外部ｃｆＤＮＡ検証データセットにおけるＬＡＭＢの性能を示す。図２Ａ、ＬＡＭＢによってスクリーニングされたＣｐＧのＡＵＣ（ｎ＝２２の肝硬変、肝硬変を伴う２２のＨＣＣ）。図２Ｂ、２００ｂｐのスパンにおける４つのＳＰＩＮＴ２ ＣｐＧのメチル化頻度（β）分布。図２Ｃ、４４個のｃｆＤＮＡ試料の遺伝子メチル化マッピング図および得られた遺伝子メチル化プロファイル。図２Ｄ、試験したパネルの幾何平均スコアリング式、受信者動作特性曲線、および性能統計。丸は、報告された感度および特異度を示す。ＬＡＭＢ－肝臓パネルには、結腸直腸、膵臓、および肺の腫瘍で低メチル化された６部位が含まれている（β＜０．２）。 外部ｃｆＤＮＡ検証データセットにおけるＬＡＭＢの性能を示す。図２Ａ、ＬＡＭＢによってスクリーニングされたＣｐＧのＡＵＣ（ｎ＝２２の肝硬変、肝硬変を伴う２２のＨＣＣ）。図２Ｂ、２００ｂｐのスパンにおける４つのＳＰＩＮＴ２ ＣｐＧのメチル化頻度（β）分布。図２Ｃ、４４個のｃｆＤＮＡ試料の遺伝子メチル化マッピング図および得られた遺伝子メチル化プロファイル。図２Ｄ、試験したパネルの幾何平均スコアリング式、受信者動作特性曲線、および性能統計。丸は、報告された感度および特異度を示す。ＬＡＭＢ－肝臓パネルには、結腸直腸、膵臓、および肺の腫瘍で低メチル化された６部位が含まれている（β＜０．２）。
ＬＡＭＢ－ＨＣＣ標的バイサルファイト配列決定アッセイを示す。図３Ａ、ＬＡＭＢ－ＨＣＣ標的バイサルファイト配列決定アッセイは、バイサルファイト変換、バイサルファイト変換後アダプタータグ付け（ＰＢＡＴ）ライブラリ調製、試料特異的インデックス付け、ＬＡＭＢ ＣｐＧの隣接領域についてのプローブを伴うプールハイブリダイゼーション捕捉（合計：約６ＫＢ）、プールＰＣＲ増幅、およびディープ配列決定（１００Ｘ＋深さ）からなる。メチル化、非メチル化、および５０：５０メチル化／非メチル化せん断ゲノムＤＮＡの試験により、配列決定バイアスが明らかになる。図３Ｂ、患者試料からの配列決定データを、図２ｂに示されるメチル化プロファイルおよび各リードにおけるすべてのＣｐＧのメチル化頻度（β）からの新しい１０遺伝子のメチル化プロファイルで分析する。図３Ｃ、インシリコサイズ選択（９０～１５０ｂｐ）による腫瘍ｃｆＤＮＡの濃縮も試験する。 ＬＡＭＢ－ＨＣＣ標的バイサルファイト配列決定アッセイを示す。図３Ａ、ＬＡＭＢ－ＨＣＣ標的バイサルファイト配列決定アッセイは、バイサルファイト変換、バイサルファイト変換後アダプタータグ付け（ＰＢＡＴ）ライブラリ調製、試料特異的インデックス付け、ＬＡＭＢ ＣｐＧの隣接領域についてのプローブを伴うプールハイブリダイゼーション捕捉（合計：約６ＫＢ）、プールＰＣＲ増幅、およびディープ配列決定（１００Ｘ＋深さ）からなる。メチル化、非メチル化、および５０：５０メチル化／非メチル化せん断ゲノムＤＮＡの試験により、配列決定バイアスが明らかになる。図３Ｂ、患者試料からの配列決定データを、図２ｂに示されるメチル化プロファイルおよび各リードにおけるすべてのＣｐＧのメチル化頻度（β）からの新しい１０遺伝子のメチル化プロファイルで分析する。図３Ｃ、インシリコサイズ選択（９０～１５０ｂｐ）による腫瘍ｃｆＤＮＡの濃縮も試験する。 ＬＡＭＢ－ＨＣＣ標的バイサルファイト配列決定アッセイを示す。図３Ａ、ＬＡＭＢ－ＨＣＣ標的バイサルファイト配列決定アッセイは、バイサルファイト変換、バイサルファイト変換後アダプタータグ付け（ＰＢＡＴ）ライブラリ調製、試料特異的インデックス付け、ＬＡＭＢ ＣｐＧの隣接領域についてのプローブを伴うプールハイブリダイゼーション捕捉（合計：約６ＫＢ）、プールＰＣＲ増幅、およびディープ配列決定（１００Ｘ＋深さ）からなる。メチル化、非メチル化、および５０：５０メチル化／非メチル化せん断ゲノムＤＮＡの試験により、配列決定バイアスが明らかになる。図３Ｂ、患者試料からの配列決定データを、図２ｂに示されるメチル化プロファイルおよび各リードにおけるすべてのＣｐＧのメチル化頻度（β）からの新しい１０遺伝子のメチル化プロファイルで分析する。図３Ｃ、インシリコサイズ選択（９０～１５０ｂｐ）による腫瘍ｃｆＤＮＡの濃縮も試験する。
メタ分析のための組織研究を選択するためのフロー図を示す。
メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。 メタ分析によって同定された遺伝子のフォレストプロットおよびカウントデータを示す。
ＨＣＣおよび肝硬変ｃｆＤＮＡの遺伝子メチル化頻度を示す。 ＨＣＣおよび肝硬変ｃｆＤＮＡの遺伝子メチル化頻度を示す。
最適なカットオフを有する試験したパネルの幾何平均スコアを示す。
ＬＡＭＢ＋ＡＦＰスクリーニングのワークフローを示す。
患者における肝細胞がんを診断するための組成物、方法、およびキットが提供される。特に、メチル化無細胞ＤＮＡバイオマーカー、および患者が肝細胞がんを有するかどうかを判定するためにそれらを使用する方法が提供される。
本発明の組成物、方法、およびキットを説明する前に、本発明は記載された特定の方法または組成物に限定されるものではなく、それ自体が勿論、変化し得ることを理解されたい。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
値の範囲が提供される場合、文脈上別段の指示のない限り、その範囲の上限と下限との間の各介在値も、下限のユニットの１０分の１まで具体的に開示されていることを理解されたい。任意の記載値または記載された範囲内の間に介在する値と、任意の他の記載値またはその記載された範囲内の間に介在する値との間の、それぞれより小さい範囲が、本発明に包含される。これらの小さい範囲の上限および下限は、独立して範囲に含まれていても、除外されていてもよく、いずれか、どちらでもない、または両方の限定が小さい範囲に含まれている各範囲も、記載されている範囲の中で任意の具体的に除外されている限定に従うことを条件として、本発明に包含される。記載された範囲が限定の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限定のいずれかまたは両方を除外する範囲も、同様に本発明に含まれる。
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験に使用することができるが、ここでは、いくつかの潜在的かつ好ましい方法および材料を説明する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用されることに関連して方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾がある場合、本開示は、組み込まれた刊行物の任意の開示に優先されることを理解されたい。
本開示を読むと当業者には明らかであろうように、本明細書に記載および例証される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲または趣旨から逸脱することなく、他の様々な実施形態のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、またはこれらと組み合わされ得る別個のコンポーネントおよび特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙された事象の順序、または論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に別段の指示のない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「バイオマーカー（ａ ｂｉｏｍａｒｋｅｒ）」への言及は、複数のかかるバイオマーカーを含み、「ｃｆＤＮＡ（ｔｈｅ ｃｆＤＮＡ）」への言及は、当業者に既知の１つ以上のｃｆＤＮＡおよびその等価物などを含む。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前に専らそれらの開示のために提供されている。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が先行発明を理由に、そのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、独立して確認する必要があり得る実際の刊行日とは異なる場合がある。
定義
本明細書で使用される「試料」という用語は、典型的には、必ずしもそうではないが、１つ以上の目的の分析物を含有する液体形態の材料または材料の混合物に関する。
本明細書で使用される場合、「循環無細胞ＤＮＡ」という用語は、患者の末梢血中を循環しているＤＮＡを指す。無細胞ＤＮＡのけるＤＮＡ分子は、１ｋｂ未満（例えば、５０ｂｐ～５００ｂｐ、８０ｂｐ～４００ｂｐ、または１００～１，０００ｂｐの範囲）の中央値サイズを有し得るが、この範囲外の中央値サイズを有する断片が存在してもよい。無細胞ＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）、すなわち、がん患者の血液中を自由に循環する腫瘍ＤＮＡ、または循環胎児ＤＮＡ（対象が妊婦である場合）を含有し得る。ｃｆＤＮＡは、高度に断片化され得、場合によっては、約１６５～２５０ｂｐの平均断片サイズを有し得る（Ｎｅｗｍａｎ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１４ ２０：５４８－５４）。ｃｆＤＮＡは、全血を遠心分離してすべての細胞を除去し、次いで、残りの血漿または血清からＤＮＡを単離することによって取得され得る。かかる方法は周知である（例えば、Ｌｏ ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ １９９８；６２：７６８－７５を参照されたい）。循環無細胞ＤＮＡは二本鎖であるが、変性によって一本鎖にすることができる。
バイオマーカー。本明細書で使用される「バイオマーカー」という用語は、健常な対照対象（すなわち、がんを有しない対象）由来の生体試料と比較したがんを有する患者由来の生体試料（例えば、血液または組織試料）など、別の試料と比較して、一方の試料における異なる濃度、レベル、または頻度で差次的に発現されるか、または存在する、ｃｆＤＮＡ、タンパク質、ｍＲＮＡ、代謝産物、または代謝副産物などの化合物を指す。バイオマーカーとしては、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７から選択される１つ以上のバイオマーカー遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でメチル化されたｃｆＤＮＡを含む肝細胞がん（ＨＣＣ）バイオマーカーが含まれるが、これらに限定されない。バイオマーカーには、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される位置決めされた１つ以上のＣｐＧでのメチル化の頻度またはレベルが増加したｃｆＤＮＡが含まれる（各バイオマーカー遺伝子のメチル化ＣｐＧ部位は表２に列挙されている）。
いくつかの実施形態では、バイオマーカーの濃度、頻度、またはレベルは、治療を患者に施す前および後に決定される。この治療は、患者がＨＣＣと診断された場合、例えば、ＨＣＣ腫瘍の外科的切除、ＨＣＣ腫瘍の高周波アブレーション（ＲＦＡ）、ＨＣＣ腫瘍の凍結アブレーション、エタノールもしくは酢酸でのＨＣＣ腫瘍の経皮的注射、経カテーテル動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）、選択的内部放射線療法（ＳＩＲＴ）、肝臓移植、高強度焦点超音波、外部ビーム療法、門脈塞栓術、放射性核種療法（例えば、イットリウム－９０、ロジン－１３１、レニウム－１８８、またはホルミウム－１６６）、化学療法（例えば、シスプラチン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル、カペシタビン、またはミトキサントロン）、標的療法（例えば、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、レンバチニブ、カボザンチニブ、ラムシルマブ、ニボルマブ、またはペムブロリズマブ）、免疫療法、もしくは生物学的療法、またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。バイオマーカーの濃度、頻度、またはレベルの変化の程度、またはそれらの欠如は、治療が所望の効果（例えば、抗腫瘍活性）を有するかどうかの指標として解釈される。換言すると、バイオマーカーの濃度またはレベルは、個体への治療を施す前および後に決定され、レベルにおける変化の程度、またはその欠如は、個体が治療に「応答性」であるかどうかの指標として解釈される。
バイオマーカーの「基準レベル」または「基準値」は、特定の疾患状態、表現型、または特定の疾患状態もしくは表現型を発症する素因、あるいはそれらの欠如、ならびに疾患状態、表現型、または特定の疾患状態もしくは表現型を発症する素因、またはそれらの欠如の組み合わせを示すバイオマーカーのレベルを意味する。バイオマーカーの「陽性」基準レベルは、特定の疾患状態または表現型を示すレベルを意味する。バイオマーカーの「陰性」基準レベルは、特定の疾患状態または表現型の欠如を示すレベルを意味する。バイオマーカーの「基準レベル」は、バイオマーカーの絶対的もしくは相対的な量もしくは濃度、バイオマーカーの存在もしくは非存在、バイオマーカーの量もしくは濃度の範囲、バイオマーカーの最小および／もしくは最大量もしくは濃度、バイオマーカーの平均量もしくは濃度、ならびに／またはバイオマーカーの中央値の量もしくは濃度であってもよく、加えて、バイオマーカーの組み合わせの「基準レベル」は、互いに対する２つ以上のバイオマーカーの絶対的または相対的な量または濃度の比であってもよい。特定の疾患状態、表現型、またはそれらの欠如に関するバイオマーカーの適切な陽性および陰性基準レベルは、１つ以上の適切な対象における所望のバイオマーカーのレベルを測定することによって決定され得、かかる基準レベルは、特定の対象の集団に合うように調整され得る（例えば、基準レベルは、特定の年齢または性別の対象からの試料におけるバイオマーカーレベルと、特定の年齢または性別群における特定の疾患状態、表現型、またはそれらの欠如に関する基準レベルとの間で比較が行われ得るように、年齢適合または性別適合であり得る）。かかる基準レベルはまた、試料中のバイオマーカーのレベルを測定するために使用される特定の技法（例えば、メチル化特異的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、定量的メチル化特異的ＰＣＲ、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、メチル化特異的パイロ配列決定、またはバイサルファイトゲノム配列決定）に合わせて調整され得、バイオマーカーのレベルは、使用される特定の技術に基づいて異なる場合がある。
類似値とは、比較される２つのものの間の類似性の程度を表す数値である。例えば、類似値は、特定の表現型関連バイオマーカーを使用した患者のバイオマーカープロファイルと、１つ以上の対照試料または基準プロファイル中のバイオマーカーの基準値範囲との間の全体的な類似性（例えば、「ＨＣＣ」ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルとの類似性）を示す数値であり得る。類似値は、相関係数などの類似性測定基準として表現されてもよく、または対照ｃｆＤＮＡ試料または基準ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルと比較して、患者試料におけるメチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーのｃｆＤＮＡメチル化頻度またはレベル、または遺伝子メチル化頻度の幾何平均スコアの差として単純に表現されてもよい。
「量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）」、「量（ａｍｏｕｎｔ）」、および「レベル」という用語は、本明細書で互換的に使用され、試料中の分子もしくは分析物の絶対定量化、または試料中の分子もしくは分析物の相対定量化、すなわち、本明細書で教示される基準値に対するなどの別の値に対するか、またはバイオマーカーに対する値の範囲に対する相対定量化を指し得る。これらの値または範囲は、単一の患者または患者の群から取得し得る。
個体に関して「ｃｆＤＮＡ試料」という用語は、個体から取得されたｃｆＤＮＡを含む血液または血漿試料などの試料を包含する。ｃｆＤＮＡ試料は、静脈穿刺などの任意の好適な方法により取得し得る。この定義はまた、試薬での処置、洗浄、遠心分離、または特定の種類の分子（メチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーなど）の濃縮など、調達後に任意の方法で操作された試料も含む。
試料の取得およびアッセイ。「アッセイする」という用語は、本明細書では、試料を操作して、試料に関連するデータを生成する物理ステップを含むように使用される。当業者によって容易に理解されるように、試料をアッセイする前に、試料を「取得」する必要がある。したがって、「アッセイする」という用語は、試料が取得されているという意味を含む。本明細書で使用される場合、「取得された」または「取得すること」という用語は、抽出または単離された試料を受け取る行為を包含する。例えば、試験施設は、試料をアッセイする前に、郵送で（または送達などを介して）試料を「取得する」ことができる。いくつかのかかる場合では、試料は、郵送（すなわち、送達、移送など）の前に、別の当事者によって個体から「抽出」または「単離」され、次いで、試料の到着時に、試験施設によって「取得」された。したがって、試験施設は、試料を取得し、次いで、試料をアッセイし、それによって、試料に関連するデータを生成することができる。
本明細書で使用される「取得された」または「取得すること」という用語は、対象からの試料の物理的抽出または単離を含むこともできる。したがって、試料は、試料を続いてアッセイする同じ人または同じ団体によって、対象から単離され（したがって、「取得され」）得る。試料が、第１の当事者または団体から「抽出」または「単離」され、次いで、第２の当事者に移送（例えば、配送、郵送など）されるとき、試料は、第１の当事者によって「取得」され（かつ第１の当事者によって「単離」され）、次いで、第２の当事者によって「取得」された（ただし、「単離」されなかった）。したがって、いくつかの実施形態では、取得するステップは、試料を単離するステップを含まない。
いくつかの実施形態では、取得するステップは、試料（例えば、処置前試料、処置後試料など）を単離するステップを含む。様々な試料（例えば、血液試料、血清試料、血漿試料、生検試料、吸引物など）を単離するための方法およびプロトコルは、当業者に既知であり、任意の好都合な方法が試料を単離するために使用され得る。
当業者であれば、場合によっては、試料をアッセイする前に、複数の試料（例えば、処置前試料および処置後試料）が取得されるまで待つことが好都合であることが理解されるであろう。したがって、場合によっては、単離された試料（例えば、処置前試料、処置後試料など）は、すべての適切な試料が取得されるまで保存される。当業者は、様々な異なる種類の試料を適切に保存する方法を理解し、特定の試料に適切な任意の好都合な保存方法（例えば、冷蔵）を使用し得る。いくつかの実施形態では、処置前試料は、処置後試料を取得する前にアッセイされる。場合によっては、処置前試料および処置後試料は、並行してアッセイされる。場合によっては、複数の異なる処置後試料および／または処置前試料が並行してアッセイされる。場合によっては、試料が取得された後、直ちに、または可能な限り速やかに処理される。
「決定する」、「測定する」、「評価する（ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ）」、「評価する（ａｓｓｅｓｓｉｎｇ）」、「アッセイする」、および「分析する」という用語は、任意の形態の測定を指すために本明細書で互換的に使用され、要素が存在するか否かを決定することを含む。これらの用語は、定量的および／または定性的決定の両方を含む。アッセイすることは、相対的であっても絶対的であってもよい。例えば、「アッセイする」は、メチル化レベルまたは頻度が特定の閾値未満であるか、または「それ以上」であるかを決定することであり得る（閾値は、予め決定することができるか、または対照試料をアッセイすることによって決定することができる）。一方、「メチル化レベルを決定するためにアッセイすること」は、ＣｐＧ部位でのメチル化レベルを表す定量値を（任意の好都合な測定基準を使用して）決定することを意味し得る。メチル化のレベルは、特定のアッセイと関連付けられた任意の単位（例えば、蛍光単位、例えば、平均蛍光強度（ＭＦＩ））で表され得るか、または定義された単位（例えば、ｃｆＤＮＡ遺伝子におけるメチル化ＣｐＧ部位の数、ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位でのメチル化の頻度など）で絶対値として表され得る。さらに、ＣｐＧ部位でのメチル化のレベルを、１つ以上の追加のＣｐＧ部位のメチル化レベルと比較して、正規化されたメチル化レベルを表す正規化された値を導出することができる。選択された特定の測定基準（または単位）は、同じ個体からの複数の試料（例えば、同じ個体から異なる時点で採取された試料）を評価するとき、同じ単位が使用される（または同じ単位への変換が実施される）限り、重要ではない。これは、一方の試料から次の試料（例えば、同じ個体から異なる時点で得られた試料）へのメチル化レベルにおける倍率変化を計算する（すなわち、比率を決定する）場合、単位が、無効になるからである。
本明細書で使用される場合、「メチル化」とは、シトシンのＣ５位もしくはＮ４位でのシトシンメチル化、アデニンのＮ６位、または他の種類の核酸メチル化を指す。典型的なインビトロＤＮＡ増幅方法は、増幅鋳型のメチル化パターンを保持しないため、インビトロ増幅ＤＮＡは通常、非メチル化される。しかしながら、「非メチル化ＤＮＡ」または「メチル化ＤＮＡ」は、それぞれ、元の鋳型が非メチル化またはメチル化された増幅ＤＮＡを指すこともできる。
したがって、本明細書で使用される場合、「メチル化ヌクレオチド」または「メチル化ヌクレオチド塩基」とは、ヌクレオチド塩基上のメチル部分の存在を指し、メチル部分は、認識された典型的なヌクレオチド塩基には存在しない。例えば、シトシンは、そのピリミジン環上にメチル部分を含有しないが、５－メチルシトシンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含有する。したがって、シトシンは、メチル化ヌクレオチドではなく、５－メチルシトシンは、メチル化ヌクレオチドである。別の例では、チミンは、そのピリミジン環の５位にメチル部分を含有するが、しかしながら、本明細書の目的の場合、チミンがＤＮＡの典型的なヌクレオチド塩基であるため、ＤＮＡに存在する場合、チミンはメチル化ヌクレオチドとはみなされない。
本明細書で使用される場合、「メチル化核酸分子」は、１つ以上のメチル化ヌクレオチドを含有する核酸分子を指す。
本明細書で使用される場合、核酸分子の「メチル化状態」、「メチル化プロファイル」、および「メチル化状況」は、核酸分子において１つ以上のメチル化ヌクレオチド塩基の非存在の存在を指す。例えば、メチル化シトシンを含有する核酸分子は、メチル化とみなされる（例えば、核酸分子のメチル化状態は、メチル化である）。任意のメチル化ヌクレオチドを含有しない核酸分子は、非メチル化とみなされる。
特定の核酸配列（例えば、本明細書に記載の遺伝子マーカーまたはＤＮＡ領域）のメチル化状態は、配列におけるすべての塩基のメチル化状態を示し得るか、または配列内の塩基のサブセット（例えば、１つ以上のシトシンの）のメチル化状態を示し得るか、またはメチル化が生じる配列内の位置の正確な情報の提供を伴って、もしくは伴わず、配列内の領域メチル化密度に関する情報を示し得る。
核酸分子におけるヌクレオチド遺伝子座のメチル化状態は、核酸分子における特定の遺伝子座でのメチル化ヌクレオチドの存在または非存在を指す。例えば、核酸分子における７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドが５－メチルシトシンである場合、核酸分子における７番目のヌクレオチドのシトシンのメチル化状態はメチル化されている。同様に、核酸分子における７番目のヌクレオチドに存在するヌクレオチドがシトシンである（５－メチルシトシンでない）場合、核酸分子における７番目のヌクレオチドのシトシンのメチル化状態は非メチル化である。
メチル化状況は、任意選択で、「メチル化値」（例えば、メチル化頻度、割合、比率、パーセントなどを表す）によって表されるか、または示されてもよい。メチル化値は、例えば、メチル化依存性制限酵素による制限消化後に存在する無傷の核酸の量を定量化することによって、またはバイサルファイト反応後の増幅プロファイルを比較することによって、またはバイサルファイト処置および未処置の核酸の配列を比較することによって生成され得る。したがって、値、例えば、メチル化値は、メチル化状況を表し、したがって、遺伝子座の複数のコピーにわたってメチル化状態の定量的指標として使用され得る。これは、試料における配列のメチル化状況を閾値または基準値と比較することが望ましい場合に特に有用である。
本明細書で使用される場合、「メチル化頻度」または「メチル化パーセント（％）」は、分子または遺伝子座がメチル化されていない場合の数に対する分子または遺伝子座がメチル化されている場合の数を指す。
このように、メチル化状態は、核酸（例えば、ゲノム配列）のメチル化の状態を説明する。加えて、メチル化状態は、メチル化に関連する特定の遺伝子座における核酸セグメントの特性を指す。かかる特性には、このＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基のうちのいずれかがメチル化されているかどうか、メチル化Ｃ残基の位置、核酸の任意の特定の領域にわたるメチル化Ｃの頻度またはパーセンテージ、および、例えば対立遺伝子の起源の違いに起因するメチル化における対立遺伝子の違いが含まれるが、これらに限定されない。「メチル化状態」、「メチル化プロファイル」、および「メチル化状況」という用語は、生体試料における核酸の任意の特定の領域にわたる、メチル化Ｃまたは非メチル化Ｃの相対濃度、絶対濃度、またはパターンも指す。例えば、核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基がメチル化されている場合、「高メチル化」または「メチル化の増加」と称され得、一方、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基がメチル化されていない場合、「低メチル化」または「メチル化の減少」と称され得る。同様に、核酸配列内のシトシン（Ｃ）残基が、別の核酸配列（例えば、異なる領域から、または別の個体からなど）と比較してメチル化されている場合、その配列は、他の核酸配列と比較して高メチル化、またはメチル化が増加しているとみなされる。あるいは、ＤＮＡ配列内のシトシン（Ｃ）残基が、別の核酸配列（例えば、異なる領域から、または異なる個体などからの）と比較してメチル化されていない場合、その配列は、他の核酸配列と比較して低メチル化、またはメチル化が減少しているとみなされる。さらに、本明細書で使用される「メチル化パターン」という用語は、核酸の領域にわたるメチル化および非メチル化ヌクレオチドの集合部位を指す。メチル化および非メチル化ヌクレオチドの数が領域全体で同じか、または類似するが、メチル化および非メチル化ヌクレオチドの位置が異なる場合、２つの核酸は、同じまたは類似のメチル化頻度またはメチル化パーセントを有し得るが、異なるメチル化パターンを有する。配列は、メチル化の程度（例えば、一方が他方に対してメチル化が増加または減少している）、頻度、またはパターンが異なる場合、「差次的にメチル化されている」、または「メチル化の差異」を有する、または「異なるメチル化状態」を有すると言われる。「差次的メチル化」という用語は、がん陰性試料における核酸メチル化のレベルまたはパターンと比較した、がん陽性試料における核酸メチル化のレベルまたはパターンの差異を指す。それはまた、術後にがんが再発した患者と再発していない患者との間のレベルまたはパターンの差異を指す場合もある。差次的メチル化およびＤＮＡメチル化の特定のレベルまたはパターンは、例えば、正しいカットオフ特性または予測特性が定義された場合、予後および予測バイオマーカーである。
メチル化状態頻度は、個体の集団または単一の個体由来の試料を説明するために使用され得る。例えば、５０％のメチル化状態頻度を有するヌクレオチド遺伝子座は、５０％の例ではメチル化され、５０％の例では非メチル化される。かかる頻度は、例えば、個体の集団または核酸の集合において、ヌクレオチド遺伝子座または核酸領域がメチル化される程度を説明するために使用され得る。したがって、核酸分子の第１の集団またはプールにおけるメチル化が、核酸分子の第２の集団またはプールにおけるメチル化とは異なる場合、第１の集団またはプールのメチル化状態頻度は、第２の集団またはプールのメチル化状態頻度とは異なるであろう。かかる頻度は、例えば、単一の個体においてヌクレオチド遺伝子座または核酸領域がメチル化される程度を説明するためにも使用され得る。例えば、かかる頻度は、組織試料由来の細胞の群がヌクレオチド遺伝子座または核酸領域でメチル化または非メチル化される程度を説明するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド遺伝子座」は、核酸分子におけるヌクレオチドの位置を指す。メチル化ヌクレオチドのヌクレオチド遺伝子座は、核酸分子におけるメチル化ヌクレオチドの位置を指す。
典型的には、ヒトＤＮＡのメチル化は、シトシンがグアニンの５’に位置する隣接グアニンおよびシトシンを含むジヌクレオチド配列上で生じる（ＣｐＧジヌクレオチド配列とも称される）。ＣｐＧジヌクレオチド内のほとんどのシトシンは、ヒトゲノムにおいてメチル化されるが、しかしながら、いくらかは、ＣｐＧアイランドとして知られる特定のＣｐＧジヌクレオチドリッチゲノム領域において非メチル化のままである（例えば、Ａｎｔｅｑｕｅｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ ６２：５０３－５１４を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、「ＣｐＧアイランド」は、全ゲノムＤＮＡに対して増加した数のＣｐＧジヌクレオチドを含有するゲノムＤＮＡのＧ：Ｃリッチ領域を指す。ＣｐＧアイランドは、少なくとも１００、２００、またはそれ以上の塩基対長であり得、領域のＧ：Ｃ含量は、少なくとも５０％であり、予想頻度に対する観察されるＣｐＧ頻度の比率は、０．６であり、いくつかの例では、ＣｐＧアイランドは、少なくとも５００の塩基対長であり得、領域のＧ：Ｃ含量は、少なくとも５５％であり）、予想頻度に対する観察されるＣｐＧ頻度の比率は、０．６５である。観察されたＣｐＧ頻度は、Ｇａｒｄｉｎｅｒ－Ｇａｒｄｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：２６１－２８１において提供される方法に従って計算することができる。例えば、予想頻度に対する観察されたＣｐＧ頻度は、式Ｒ＝（Ａ×Ｂ）／（Ｃ×Ｄ）に従って計算することができ、式中、Ｒは、予想頻度に対する観察されたＣｐＧ頻度の比率であり、Ａは、分析された配列におけるＣｐＧジヌクレオチドの数であり、Ｂは、分析された配列におけるヌクレオチドの総数であり、Ｃは、分析された配列におけるＣヌクレオチドの総数であり、Ｄは、分析された配列におけるＧヌクレオチドの総数である。メチル化状態は、典型的には、ＣｐＧアイランドにおいて、例えば、プロモーター領域において決定される。ＣｐＡおよびＣｐＴなどのヒトゲノムにおける他の配列は、ＤＮＡメチル化となる傾向にあることは理解されよう（例えば、Ｒａｍｓａｈｏｙｅ（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：５２３７－５２４２、Ｓａｌｍｏｎ ａｎｄ Ｋａｙｅ（１９７０）Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃｔａ．２０４：３４０－３５１、Ｇｒａｆｓｔｒｏｍ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：２８２７－２８４２、Ｎｙｃｅ（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：４３５３－４３６７、Ｗｏｏｄｃｏｃｋ（１９８７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１４５：８８８－８９４を参照されたい）。
本明細書で使用される場合、核酸分子のメチル化状態の関数としての核酸分子のヌクレオチドを修飾する試薬、またはメチル化特異的試薬は、核酸分子のメチル化状態を反映する方法で核酸分子のヌクレオチド配列を変化させ得る化合物または組成物または他の薬剤を指す。核酸分子をかかる試薬で処置する方法は、必要に応じて、ヌクレオチド配列の所望の変化を達成するための追加のステップと連結して、核酸分子を試薬と接触させることを含み得る。核酸分子のヌクレオチド配列におけるかかる変化は、各メチル化ヌクレオチドが異なるヌクレオチドに修飾される核酸分子をもたらし得る。核酸ヌクレオチド配列におけるかかる変化は、各非メチル化ヌクレオチドが異なるヌクレオチドに修飾される核酸分子をもたらし得る。核酸ヌクレオチド配列におけるかかる変化は、非メチル化（例えば、各非メチル化シトシン）である選択されたヌクレオチドの各々が異なるヌクレオチドに修飾される核酸分子をもたらし得る。核酸ヌクレオチド配列を変更するかかる試薬の使用は、メチル化ヌクレオチドである各ヌクレオチド（例えば、各メチル化シトシン）が異なるヌクレオチドに修飾される核酸分子をもたらし得る。本明細書で使用される場合、選択されたヌクレオチドを修飾する試薬の使用は、試薬が他の３つのヌクレオチドを修飾することなく１つのヌクレオチドを修飾するように、核酸分子における典型的に生じる４つのヌクレオチド（ＤＮＡについてはＣ、Ｇ、Ｔ、およびＡ、ＲＮＡについてはＣ、Ｇ、Ｕ、およびＡ）のうちの１つのヌクレオチドを修飾する試薬を指す。一例示的な実施形態では、かかる試薬は、非メチル化の選択されたヌクレオチドを修飾して、異なるヌクレオチドを産生する。別の例示的な実施形態では、かかる試薬は、非メチル化シトシンヌクレオチドを脱アミノ化し得る。代表的な試薬は、バイサルファイトである。
本明細書で使用される場合、「バイサルファイト試薬」という用語は、いくつかの実施形態では、例えば、ＣｐＧジヌクレオチド配列において、メチル化シチジンおよび非メチル化シチジンを区別するためのバイサルファイト、ジスルファイト、ハイドロジェンスルファイトまたはそれらの組み合わせを含む試薬を指す。
「メチル化アッセイ」という用語は、核酸の配列内の１つ以上のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定するための任意のアッセイまたは方法を指す。例示的なメチル化アッセイには、メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、またはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、およびメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析が挙げられるが、これらに限定されない。
バイサルファイト配列決定は、配列決定の前にＤＮＡのバイサルファイト処置を使用して、メチル化部位を検出する。ＤＮＡをバイサルファイトで処置すると、シトシン残基がウラシルに変換されるが、メチル化シトシン残基には影響しない。バイサルファイト処置後、ＤＮＡに残っているシトシンは、メチル化シトシンのみである。したがって、バイサルファイト処置後のＤＮＡの配列決定は、単一ヌクレオチド分解能での個々のシトシン残基のメチル化状態を明らかにする。
ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲアッセイは、ＤＮＡを消化するためのメチル化感受性制限酵素、およびＣｐＧジヌクレオチドを含有する領域を選択的に増幅するＣＧリッチプライマーを用いたＰＣＲを使用する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：５９４－５９９を参照されたい）。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイは、ＤＮＡメチル化の検出のためのメチル化特異的プライミングおよびメチル化特異的蛍光プローブを用いたバイサルファイト依存性定量的蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲを使用する。Ｄｉｇｉｔａｌ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイをデジタルＰＣＲと組み合わせて、個々のメチル化分子の検出を可能にする（例えば、Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６、Ｃａｍｐａｎ ｅｔ ａｌ（２０１８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７０８：４９７－５１３を参照されたい）。
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙアッセイは、増幅プライマー間、またはそれによりカバーされるＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブ（本明細書ではブロッカーとも呼ばれる）を使用して、核酸試料のメチル化特異的選択的増幅を可能にする。
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイのバリエーションであり、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わせる。
Ｍｓ－ＳＮｕＰＥアッセイは、ＣｐＧ部位のすぐ上流にハイブリダイゼーションするように設計されたプライマーを使用するＰＣＲと組み合わせたＤＮＡのバイサルファイト処置、ならびに視覚化および定量のためのポリアクリルアミドゲルでの増幅産物の電気泳動を使用する。ＤＮＡ（ゲノムまたはｃｆＤＮＡ）のファイサルファイトナトリウムでの処置により、非メチル化シトシンがウラシルに変換され、ＰＣＲステップ中に、ウラシルがチミンとして複製され、メチルシトシンが増幅中にシトシンとして複製される。元のＣｐＧ部位でのメチル化対非メチル化シトシン（Ｃ対Ｔ）の比率は、ゲル単離されたＰＣＲ産物、プライマー、およびＴａｑポリメラーゼを［３２Ｐ］ｄＣＴＰまたは［３２Ｐ］ＴＴＰのいずれかとともにインキュベートし、続く変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動および蛍光体画像化分析によって決定され得る。Ｍｓ－ＳＮｕＰＥプライマーはまた、［３２Ｐ］ｄＡＴＰまたは［３２Ｐ］ｄＧＴＰのいずれかを反対側の鎖に組み込んで、分析されるＣｐＧ部位に応じたメチル化状態を評価するように設計され得る（例えば、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－２５３１、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２（８）：１９３１－６を参照されたい）。
ＭＳＰアッセイは、非メチル化シトシンのウラシルへの変換のためのＤＮＡのバイサルファイト処置、およびその後のメチル化対非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを用いた増幅を使用する（例えば、Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６、および米国特許第５，７８６，１４６号を参照されたい）。
ＣＯＢＲＡアッセイは、非メチル化シトシンのウラシルへの変換のためのＤＮＡのバイサルファイト処置、バイサルファイト変換ＤＮＡの遺伝子座特異的ＰＣＲ増幅、制限消化、ゲルでの制限パターンの電気泳動分析を使用する（例えば、Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４、Ｂｉｌｉｃｈａｋ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４５６：６３－７１を参照されたい）。
ＭＣＡアッセイは、ＤＮＡを消化するためのメチル化感受性制限酵素、続くアダプタのライゲーション、およびメチル化ＣｐＧリッチ配列を選択的に増幅するＰＣＲを使用する（例えば、Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７－１２、およびＷＯ００／２６４０１Ａ１を参照されたい）。
ＭＣＡＭアッセイは、ＣｐＧアイランドマイクロアレイと組み合わせてＭＣＡを使用して、ハイスループット方式でＤＮＡメチル化を検出する（例えば、Ｅｓｔｅｃｉｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１７（１０）：１５２９－１５３６を参照されたい）。
ＨＥＬＰアッセイは、ＤＮＡを切断するためのメチル化感受性制限酵素であるＨｐａＩＩ、対照としてメチル化非感受性アイソシゾマーであるＭｓｐＩを使用する。マイクロアレイ分析は、ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩ断片を検出するように設計されたプローブを含有するマイクロアレイで実施される。ＨＥＬＰ－ｓｅｑは、ＨＥＬＰアッセイをＤＮＡメチル化部位の大規模並列配列決定と組み合わせる（例えば、Ｇｒｅａｌｌｙ（２０１８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７０８：１９１－２０７、Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ５２（３）：２１８－２２を参照されたい）。
ＧＬＡＤ－ＰＣＲアッセイは、メチル化ＤＮＡのみを切断する部位特異的メチル指向性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、続くハイスループットＰＣＲのためのユニバーサルアダプターへのＤＮＡ断片のライゲーションを使用する（例えば、Ｍａｌｙｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａｃｔａ Ｎａｔｕｒａｅ １２（３）：１２４－１３３、Ｒｕｓｓｉａｎ Ｐａｔｅｎｔ ＲＵ ２５２５７１０を参照されたい）。
ＭｅＤＩＰアッセイは、５－メチルシトシンに対する抗体を使用して、メチル化ＤＮＡ断片を免疫沈降させる。この技法は、マイクロアレイハイブリダイゼーション（ＭｅＤＩＰ－ｃｈｉｐ）または次世代配列決定（ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）を使用するハイスループットＤＮＡ検出方法と組み合わせることができる。例えば、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７（８）：８５３－８６２、Ｐａｌｍｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ５３（２）：１７５－１８４、Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８（６）：１７８６－１７９６、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ａｎａｌｙｓｔ １４４（６）：１９０４－１９１５、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１１３（１－２）：４５－５４を参照されたい。
ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）は、１０－１１転座（ＴＥＴ）酵素を使用して、５－メチルシトシンおよび５－ヒドロキシメチルシトシンの５－カルボキシルシトシンへの酸化、続くピリジンボラン還元を触媒して、ジヒドロウラシルを産生する。非修飾シトシンは影響を受けない。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：４２４－４２９を参照されたい。
メチル化特異的巨大磁気抵抗性センサーベースのマイクロアレイ分析は、巨大磁気抵抗性（ＧＭＲ）バイオセンサー上でのメチル化特異的ＰＣＲおよびメルト曲線分析を組み合わせる。ＧＭＲバイオセンサーは、ＰＣＲ増幅産物におけるメチル化または非メチル化ＣｐＧ部位を標的とする合成ＤＮＡプローブを含む。ＰＣＲ増幅産物のＧＭＲバイオセンサーへのハイブリダイゼーション後、２種類のプローブ間の融解温度（Ｔｍ）の差を測定する。例えば、Ｒｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＡＣＳ Ｎａｎｏ．１１（９）：８８６４－８８７０、Ｎｅｓｖｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ １２４－１２５：１３６－１４２を参照されたい。
サザンブロッティングを使用して、ＤＮＡメチル化を検出することもできる。まず、ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化し、そして制限断片をサザンブロットによって分析する。
本明細書で使用される場合、「選択されたヌクレオチド」は、核酸分子における典型的に生じる４つのヌクレオチド（ＤＮＡについてはＣ、Ｇ、Ｔ、およびＡ、ならびにＲＮＡについてはＣ、Ｇ、Ｕ、およびＡ）のうちの１つのヌクレオチドを指し、典型的に生じるヌクレオチドのメチル化誘導体を含み得る（例えば、Ｃが選択されたヌクレオチドである場合、メチル化および非メチル化Ｃの両方が、選択されたヌクレオチドの意味内に含まれる）が、一方で、メチル化された選択されたヌクレオチドは、メチル化された典型的に生じるヌクレオチドを特異的に指し、非メチル化された選択されたヌクレオチドは、非メチル化の典型的に生じるヌクレオチドを特異的に指す。
「メチル化特異的制限酵素」または「メチル化感受性制限酵素」という用語は、その認識部位のメチル化状態に依存して核酸を選択的に消化する酵素を指す。認識部位がメチル化されていないか、またはヘミメチル化されている場合に特異的に切断する制限酵素の場合、認識部位がメチル化されている場合には切断は行われないか、または著しく低減した効率で行われる。認識部位がメチル化されている場合に特異的に切断する制限酵素の場合、認識部位がメチル化されていない場合には切断は行われないか、または著しく低減した効率で行われる。好ましくは、メチル化特異的制限酵素であり、その認識配列は、ＣＧジヌクレオチド（例えば、ＣＧＣＧまたはＣＣＣＧＧＧなどの認識配列）を含有する。いくつかの実施形態では、このジヌクレオチドにおけるシトシンが炭素原子Ｃ５でメチル化されている場合には切断しない制限酵素がさらに好ましい。
本明細書で使用される場合、「異なるヌクレオチド」は、選択されたヌクレオチドと化学的に異なるヌクレオチドを指し、典型的には、異なるヌクレオチドは、選択されたヌクレオチドとは異なるＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合特性を有し、それにより、選択されたヌクレオチドに相補的な典型的に生じるヌクレオチドは、異なるヌクレオチドに相補的な典型的に生じるヌクレオチドとは同じではない。例えば、Ｃが選択されたヌクレオチドである場合、ＵまたはＴが異なるヌクレオチドであり得、これは、ＣのＧに対する相補性、およびＵまたはＴのＡに対する相補性によって例示される。本明細書で使用される場合、選択されたヌクレオチドに相補的であるか、または異なるヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドは、高いストリンジェンシー条件下で、選択されたヌクレオチドと塩基対合するヌクレオチド、または４つの典型的に生じるヌクレオチドのうちの３つとの相補的なヌクレオチドの塩基対合よりも高い親和性を有する異なるヌクレオチドを指す。相補性の例は、ＤＮＡ（例えば、Ａ－ＴおよびＣ－Ｇ）およびＲＮＡ（例えば、Ａ－ＵおよびＣ－Ｇ）におけるＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対合である。したがって、例えば、高ストリンジェンシー条件下で、Ｇは、ＧがＧ、Ａ、またはＴへ塩基対合するよりも高い親和性で、Ｃへ塩基対合し、したがって、Ｃが選択されたヌクレオチドである場合、Ｇは、選択されたヌクレオチドに相補的なヌクレオチドである。
本明細書で使用される場合、所与のマーカーの「感度」は、新生物性試料および非新生物性試料を区別する閾値を上回るＤＮＡメチル化値を報告する試料のパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、陽性は、閾値（例えば、疾患に関連する範囲）を上回るＤＮＡメチル化値を報告する組織学的に確認された新生物として定義され、偽陰性は、閾値（例えば、疾患に関連しない範囲）を下回るＤＮＡメチル化値を報告する組織学的に確認された新生物として定義される。したがって、感度の値は、既知の疾患試料から取得された所与のマーカーについてのＤＮＡメチル化測定値が疾患関連測定値の範囲内にある可能性を反映する。本明細書で定義されるように、計算された感度値の臨床的関連性は、所与のマーカーが、その状態を有する対象に適用された場合に、臨床状態の存在を検出する可能性の推定を表す。
本明細書で使用される場合、所与のマーカーの「特異度」は、新生物性試料および非新生物性試料を区別する閾値を下回るＤＮＡメチル化値を報告する非新生物性試料のパーセンテージを指す。いくつかの実施形態では、陰性は、閾値（例えば、疾患に関連する範囲）を下回るＤＮＡメチル化値を報告する組織学的に確認された非新生物性試料として定義され、偽陽性は、閾値（例えば、疾患に関連する範囲）を上回るＤＮＡメチル化値を報告する組織学的に確認された非新生物性試料として定義される。したがって、特異度の値は、既知の非新生物性試料から取得された所与のマーカーについてのＤＮＡメチル化測定値が、疾患に関連しない測定値の範囲内にある可能性を反映する。本明細書で定義されるように、計算された特異度値の臨床的関連性は、所与のマーカーが、その状態を有しない患者に適用された場合に、臨床状態の非存在を検出する可能性の推定を表す。
本明細書で使用される場合、「ＡＵＣ」という用語は、「曲線下面積」の略語である。特に、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積を指す。ＲＯＣ曲線は、診断試験の種々の可能性のあるカットポイントの偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。選択したカットポイントに応じて、感度と特異度との間のトレードオフを示す（任意の感度の増加には特異度の減少が伴う）。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断試験の精度の尺度である（面積が大きいほど良く、最適は１であり、ランダムな試験では、ＲＯＣ曲線が対角線上にあり、その面積は０．５である。参考：Ｊ．Ｐ．Ｅｇａｎ．（１９７５）Ｓｉｇｎａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ＲＯＣ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。
本明細書で使用される「診断」は、概して、対象が所与の疾患、障害、または機能障害に影響される可能性が高いかどうかについての決定を含む。当業者は、多くの場合、１つ以上の診断指標、すなわち、バイオマーカーに基づいて診断を行い、その存在、非存在、頻度または量が、疾患、障害、または機能障害の存在または非存在を示す。
本明細書で使用される「予後」は、概して、臨床状態または疾患の可能な経過および転帰の予測を指す。患者の予後は、通常、疾患の好ましいか、または好ましくない経過または転帰を示す、疾患の因子または症状を評価することによって行われる。「予後」という用語は、必ずしも、１００％の精度で状態の経過または結果を予測する能力を指すものではないことを理解されたい。代わりに、当業者は、「予後」という用語が、特定の経過または転帰が生じる可能性の増加を指すこと、すなわち、経過または転帰が、所与の状態を示していない個体と比較して、所与の状態を示している患者で生じる可能性がより高いことを理解するであろう。
「治療」、「治療すること」、「治療する」などの用語は、概して、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指すために本明細書で使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点では予防的であり得、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な安定化もしくは治癒という点では治療的であり得る。「治療」という用語は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患もしくは症状にかかりやすい可能性があるが、疾患を有するとまだ診断されていない対象において、疾患および／もしくは症状が発生するのを予防すること、（ｂ）疾患および／もしくは症状を阻害すること、すなわち、それらの発症を阻止すること、または（ｃ）疾患症状を緩和すること、すなわち、疾患および／もしくは症状の退行を引き起こすことを含む。治療を必要とする者には、既に罹患している者（例えば、ＨＣＣを有するもの）だけでなく予防が望まれる者（例えば、ＨＣＣの感受性が増加するまたは可能性が増加する肝硬変または肝炎などの慢性肝疾患を有する者、ＨＣＣを有することが疑われる者など）が挙げられる。
治療的処置は、対象が投与前に罹患している場合の処置あり、予防的処置は、対象が投与前に罹患している場合の処置である。いくつかの実施形態では、対象は、治療前に罹患する可能性が増加しているか、または罹患していることが疑われる。いくつかの実施形態では、対象は、罹患いている可能性が増加していると疑われる。
「約」という用語は、特に所与の量に関して、プラスまたはマイナス５パーセントの偏差を包含することを意味する。
「レシピエント」、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、診断、治療、または療法が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。「哺乳動物」は、治療の目的では、哺乳動物に分類される任意の動物を指し、これには、ヒト、家畜および農場動物、ならびにイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの動物園、スポーツ、またはペット動物が含まれる。好ましくは、哺乳動物は、ヒトである。
「治療有効用量」または「治療用量」は、所望の臨床結果をもたらす（すなわち、治療有効性を達成する）ために十分な量である。治療有効用量は、１回以上の投与で投与することができる。
「単離された」とは、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを指す場合、示される分子が、その分子が天然に見られる生物全体から分離され、離れているか、または同じ種類の他の生物学的マクロ分子の実質的な非存在下で存在することを意味する。ポリヌクレオチドに関して「単離された」という用語は、天然において通常それと会合する配列の全体もしくは一部を欠く核酸分子、または天然に存在するが、それと関連する異種配列を有する配列、または染色体から解離した分子である。
「分析の提供」は、本明細書では、口頭または書面による分析（すなわち、文書、報告書など）の送達を指すために使用される。書面による分析は、印刷された文書または電子文書であり得る。好適な分析（例えば、口頭または書面による報告）は、以下の情報のうちのいずれかまたはすべてを提供する。対象の情報（名前、年齢など）を特定すること、何の種類の試料が使用されたか、かつ／もしくはそれがどのように使用されたかの説明、試料をアッセイするために使用された技法、アッセイの結果（例えば、測定されたｃｆＤＮＡ ＣｐＧメチル化のレベルもしくは頻度および／または経時的もしくは処置前アッセイと比較した処置後アッセイにおけるｃｆＤＮＡのレベルもしくは頻度の倍率変化）、個体がＨＣＣもしくはＨＣＣの再発を有すると決定されるかどうかに関する評価、治療のための推奨（例えば、特定の抗がん療法）、および／または療法を継続するか、もしくは変更するか、追加療法のための推奨戦略など。報告は、好適な媒体または基材（例えば、紙）上の印刷情報、または電子形式を含むが、これらに限定されない任意の形式であり得る。電子形式の場合、報告は、情報が記録された、コンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）、フラッシュドライブなどの中にあり得る。加えて、報告は、ウェブサイトアドレスとして存在し得、これをインターネットを介して使用して、リモートサイトで情報にアクセスすることができる。
本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正がなされ得ることは当業者には明らかであろう。
メチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーおよび診断方法
様々な遺伝子におけるプロモーターの調節領域および／または第１のエクソンにおけるＣｐＧアイランドの高メチル化は、様々ながんに関連付けられる。メチル化バイオマーカーの層別分析（ＬＡＭＢ）を使用して、ＨＣＣと関連付けられたメチル化無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）バイオマーカーを同定した（実施例を参照されたい）。同定されたＨＣＣバイオマーカーには、遺伝子、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５のプロモーター領域の１つ以上のＣｐＧ部位でメチル化されたｃｆＤＮＡが含まれる。これらのバイオマーカー遺伝子におけるＣｐＧ部位でのメチル化の頻度またはレベルの増加は、一般に、ＨＣＣ腫瘍に見出される。特に、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、ｃｇ２６３９７１８８（これらのＣｐＧ部位の位置は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０Ｋ Ｍａｎｉｆｅｓｔにおいて得られる）およびそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度またはレベルの増加は、ＨＣＣと関連付けられている。したがって、これらのＣｐＧ部位のメチル化の頻度またはレベルをモニタリングすることは、ＨＣＣの予後、診断、療法選択、および治療のモニタリングに有用である。
特定の実施形態では、ＨＣＣの診断における使用のためのメチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーのパネルが提供される。任意のサイズのバイオマーカーパネルが、主題の方法の実施において使用され得る。ＨＣＣを診断するためのバイオマーカーパネルは、典型的には、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個のメチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーなどの間の任意の数のバイオマーカーを含む、少なくとも２つのメチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーおよび最大２０個のメチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーを含む。特定の実施形態では、バイオマーカーパネルは、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つ、または少なくとも５つ、または少なくとも６つ、または少なくとも７つ、または少なくとも８つ、または少なくとも９つ、または少なくとも１０個、または少なくとも１１個、または少なくとも１２個、または少なくとも１３個、または少なくとも１４個、または少なくとも５個、または少なくとも１６個、または少なくとも１７個、または少なくとも１８個、または少なくとも１９個、または少なくとも２０個以上のメチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーを含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーパネルは、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を有するｃｆＤＮＡバイオマーカーを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態では、バイオマーカーパネルは、ＣｐＧ部位：ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８でのメチル化を有するｃｆＤＮＡバイオマーカーを含むか、またはそれらからなる。より小さいバイオマーカーパネルは通常、より経済的であるが、より大きなバイオマーカーパネル（すなわち、２０超のバイオマーカー）は、より詳細な情報を提供する利点を有し、主題の方法の実施においても使用され得る。
メチル化ｃｆＤＮＡを含む試料（すなわち、「ｃｆＤＮＡ試料」）は、対象から取得される。試料は、典型的には、対象から採取されたｃｆＤＮＡを含む血液または血漿試料である。「対照」試料は、本明細書で使用される場合、疾患ではない対象由来のｃｆＤＮＡ試料を指す。すなわち、対照試料は、正常または健常な対象（例えば、ＨＣＣを有しないことが既知の個体）から取得される。ｃｆＤＮＡ試料は、従来の技法によって対象から取得され得る。例えば、血液試料は、当技術分野で周知の方法に従って静脈穿刺によって取得され得る。
対象由来のｃｆＤＮＡ試料におけるＣｐＧ部位でのメチル化の頻度またはレベルを分析する場合、比較のために使用される基準値範囲は、ＨＣＣを有しない１つ以上の対象（すなわち、正常または健常な対照）由来のｃｆＤＮＡ試料におけるＣｐＧ部位でのＤＮＡメチル化の頻度またはレベルを表すことができる。あるいは、基準値は、ＨＣＣを有する１つ以上の対象由来のｃｆＤＮＡ試料におけるＣｐＧ部位でのメチル化の頻度またはレベルを表すことができ、基準値範囲との類似性は、対象がＨＣＣを有することを示す。
場合によっては、メチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーの組み合わせが、主題の方法において使用される。いくつかのかかる場合では、診断が行われるために、すべての測定されたバイオマーカーのレベルが（上述のように）変化する必要がある。いくつかの実施形態では、いくつかのバイオマーカーのみが、本明細書に記載の方法において使用される。例えば、単一のバイオマーカー、２つのバイオマーカー、３つのバイオマーカー、４つのバイオマーカー、５つのバイオマーカー、６つのバイオマーカー、７つのバイオマーカー、８つのバイオマーカー、９つのバイオマーカー、１０個のバイオマーカー、１１個のバイオマーカー、１２個のバイオマーカー、１３個のバイオマーカー、１４個のバイオマーカー、１５個のバイオマーカー、１６個のバイオマーカー、１７個のバイオマーカー、１８個のバイオマーカー、１９個のバイオマーカー、または２０個のバイオマーカーを任意の組み合わせで使用することができる。他の実施形態では、すべてのバイオマーカーが使用される。定量値は、個体のＨＣＣの１つ以上のリスクスコアを計算するために、線形または非線形の方法で組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、幾何平均スコアは、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５遺伝子のうちの２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個すべての遺伝子メチル化頻度プロファイルから計算され、幾何平均スコアは、個体がＨＣＣを有するか否かを示す。幾何平均スコアは、さらにＨＣＣを有しない対象に対してＨＣＣを有する対象を区別し得る。
本明細書に記載される方法を使用して、患者の適切な治療レジメンを、特に、患者がＨＣＣについて治療される必要があるどうかを決定し得る。例えば、患者が本明細書に記載されるように、ｃｆＤＮＡメチル化プロファイルに基づいてＨＣＣについて陽性診断を有する場合、患者は、ＨＣＣについての治療のために選択される。場合によっては、本明細書に記載の診断方法は、単独で使用されてもよく、または医学的画像化法と組み合わせて使用されて、診断を確認し、予後の決定および治療のための最適な戦略（例えば、手術、放射性核種療法、化学療法、標的療法、免疫療法、生物学的療法など）の評価において役立つがん性疾患の程度（がんがどの程度でどこに広がったか）をさらに評価してもよい。例示的な医用画像化技法としては、磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、単一光子放出コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、超音波画像化法（ＵＩ）、光学画像化法（ＯＩ）、光音響画像化法（ＰＩ）、蛍光透視法、および蛍光画像化法が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、メチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーは、アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）またはデス－ガンマカルボキシプロトロンビン（ＤＣＰ）などのＨＣＣを診断するための他のバイオマーカーと組み合わせて使用される。例えば、ＡＦＰもしくはＤＣＰ、またはそれらの組み合わせの血液レベルは、ｃｆＤＮＡバイオマーカーのメチル化に加えてモニタリングされ得る。対照ｃｆＤＮＡ試料における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、患者由来のｃｆＤＮＡ試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加と組み合わせて、２０ｎｇ／ｍｌを超えるＡＦＰの血液レベルは、患者がＨＣＣについて陽性診断を有することを示す。ＡＦＰおよび／またはＤＣＰのレベルの増加は、ＨＣＣが進行していることを示すが、ＡＦＰおよび／またはＤＣＰのレベルの減少は、ＨＣＣが治療に応答していることを示す。
ＨＣＣの例示的な治療としては、腫瘍外科的切除、高周波アブレーション（ＲＦＡ）、凍結アブレーション、経皮的エタノールまたは酢酸注射、経カテーテル動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）、選択的内部放射線療法（ＳＩＲＴ）、高強度焦点超音波、もしくは外部ビーム療法、肝臓移植、門脈塞栓術、または化学療法剤（例えば、シスプラチン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル、カペシタビン、またはミトキサントロン）、標的療法剤（例えば、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、レンバチニブ、またはカボザンチニブ）、免疫療法剤（例えば、ラムシルマブ、ニボルマブ、またはペムブロリズマブ）、もしくは放射性同位体（例えば、イットリウム－９０、ロジン－１３１、レニウム－１８８、またはホルミウム－１６６）などの抗がん治療剤の投与、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
ｃｆＤＮＡバイオマーカーは、患者におけるＨＣＣをモニタリングするために使用され得る。例えば、第１のｃｆＤＮＡ試料は、第１の時点で患者から取得され得、第２のｃｆＤＮＡ試料は、第２の時点で患者から取得され得る。いくつかの実施形態では、患者は、第１のｃｆＤＮＡ試料および第２のｃｆＤＮＡ試料におけるｃｆＤＮＡの１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することによって、ＨＣＣについてモニタリングされ、１つ以上の遺伝子は、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択され、第１のｃｆＤＮＡ試料と比較して、第２のｃｆＤＮＡ試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化の頻度の増加の検出は、ＨＣＣが進行していることを示し、第１のｃｆＤＮＡ試料と比較して、第２のｃｆＤＮＡ試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化の頻度の減少の検出は、ＨＣＣが進行していないことを示す。いくつかの実施形態では、間隔をおいてｃｆＤＮＡ試料を繰り返し収集し、ｃｆＤＮＡを分析することによって、患者を一定期間にわたってモニタリングし、ＨＣＣが進行しているか否かを決定する。原発性腫瘍、転移、または再発を含む、任意の進行段階でのＨＣＣがモニタリングされ得る。
主題の方法は、本明細書に記載されるように、患者がＨＣＣを発症しやすい慢性肝疾患、肝臓炎症、または肝臓損傷などの基礎状態または疾患を患者が有する場合、患者の診断またはモニタリングに特に有用である。ＨＣＣに対する感受性を増加させる例示的な肝疾患としては、肝硬変、脂肪肝疾患、肝炎（例えば、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、自己免疫性肝炎、薬剤性肝炎、ウイルス性肝炎）、Ａ型肝炎ウイルス感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、Ｄ型肝炎ウイルス感染症、Ｅ型肝炎ウイルス感染症、遺伝性ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、原発性胆汁性肝硬変、およびα－１－抗トリプシン欠乏症が挙げられるが、これらに限定されない。
主題の方法はまた、個体から取得された処置前および処置後のｃｆＤＮＡ試料をアッセイして、個体が処置に応答するか応答しないかを決定するために使用され得る。例えば、第１のｃｆＤＮＡ試料は、対象が療法を受ける前に対象から取得され得、第２のｃｆＤＮＡ試料は、対象が療法を受けた後に対象から取得され得る。一実施形態では、ＨＣＣに対する患者の処置の有効性は、第１のｃｆＤＮＡ試料および第２のｃｆＤＮＡ試料における、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度またはレベルを測定すること、ならびに治療の有効性を評価することによって、モニタリングされ、第１のｃｆＤＮＡ試料と比較して、第２のｃｆＤＮＡ試料における、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度およびレベルの増加の検出は、患者が悪化しているか、または処置に応答していないことを示し、ならびに第１のｃｆＤＮＡ試料と比較して、第２のｃｆＤＮＡ試料における、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度およびレベルの減少の検出は、患者が改善していることを示す。
処置前試料におけるｃｆＤＮＡバイオマーカー遺伝子のメチル化の頻度またはレベルは、第１の試料が、療法を施される前（すなわち、「処置前」）に個体から単離されるため、「処置前値」と称され得る。処置前試料におけるｃｆＤＮＡバイオマーカー遺伝子のメチル化の頻度またはレベルは、この値が「処置後」値と比較される値であるため、「ベースライン値」とも称され得る。場合によっては、ベースライン値（すなわち、「処置前値」）は、複数の（すなわち、１つ超、例えば、２つ以上、３つ以上、またはより多い場合、５つ以上などの）処置前試料におけるｃｆＤＮＡバイオマーカー遺伝子のメチル化の頻度またはレベルを決定することによって決定される。場合によっては、複数の処置前試料は、処置前のバイオマーカーレベルの自然変動を評価するために、異なる時点で個体から単離される。したがって、場合によっては、１つ以上（例えば、２つ以上、３つ以上、またはより多い場合、５つ以上など）の処置前試料が、個体から単離される。いくつかの実施形態では、処置前試料のすべては、同じ種類の試料（例えば、血液試料）である。場合によっては、２つ以上の処置前試料をプールして、試料におけるバイオマーカーのレベルを決定する。場合によっては、ｃｆＤＮＡバイオマーカー遺伝子のメチル化の頻度またはレベルは、２つ以上の処置前試料について別々に決定され、「処置前値」は、別々の測定値を平均化することによって計算される。
処置後試料は、療法が施された後に個体から単離される。したがって、処置後試料におけるｃｆＤＮＡバイオマーカー遺伝子のメチル化の頻度またはレベルは、「処置後値」と称され得る。いくつかの実施形態では、ｃｆＤＮＡバイオマーカー遺伝子のメチル化の頻度またはレベルは、追加の処置後試料（例えば、第２、第３、第４、第５などの処置後試料）で測定される。追加の処置後試料は、処置が施された後に個体から単離されるため、追加の試料におけるバイオマーカーのレベルは、「処置後値」とも称され得る。
本明細書で使用される場合、「応答性」という用語は、治療が、抗腫瘍効果などの所望の効果を有することを意味する。例えば、陽性治療応答は、疾患における以下の改善のうちの１つ以上を指す。（１）腫瘍サイズの減少、（２）がん細胞数の減少、（３）腫瘍成長の阻害（すなわち、ある程度遅延させること、好ましくは停止）、（４）末梢臓器へのがん細胞浸潤の阻害（すなわち、ある程度遅延させること、好ましくは停止）、（５）腫瘍転移の阻害（すなわち、ある程度遅延させること、好ましくは停止）、および（６）がんに関連する１つ以上の症状のある程度の緩和。個体が治療に応答して改善しない場合、個体のために異なる療法または治療レジメンを求めることが望ましい場合がある。
個体がＨＣＣを有するという決定は、１つ以上のｃｆＤＮＡバイオマーカー遺伝子のメチル化の頻度またはレベルと疾患との間の相関の能動的な臨床応用である。例えば、「決定する」には、能動的なアッセイステップ中に産生されるデータを確認し、個体がＨＣＣを有するか、もしくは有しないか、またはＨＣＣの治療のための療法に応答するかもしくは応答しないかを解決する能動的なステップが必要である。加えて、場合によっては、現在の治療（すなわち、療法）を進めるか、または代わりに治療を変更する決定がなされる。場合によっては、主題の方法は、治療を継続するステップまたは治療を変更するステップを含む。
「治療を継続する」（すなわち、療法を継続する）という用語は、本明細書では、現在の治療経過（例えば、療法を継続して施す）が継続されることを意味するように使用される。現在の治療経過がＨＣＣの治療において有効でない場合、治療は変更され得る。「療法を変更する」は、本明細書において、「療法を中止する」または「療法を変更する」（例えば、治療の種類を変更する、薬物の特定の用量および／または投与頻度を変更する、例えば、用量および／または投与頻度を増加させる）を意味するように使用される。場合によっては、個体が応答性であるとみなされるまで、療法は変更され得る。いくつかの実施形態では、療法を変更することは、施される治療の種類を変更すること、特定の治療を完全に中止することなどを意味する。
非限定的な例示的な例として、患者は、最初に化学療法剤で治療され得る。したがって、「治療を継続する」とは、この種類の治療を継続することであろう。現在の治療経過が効果的でない場合、治療を変更し得、例えば、ＨＣＣについての治療の投薬量もしくは頻度を増加させること、異なる治療に変更すること、または患者の緩和ケアを開始することである。治療の切り替えは、例えば、異なる化学療法剤を投与すること、または手術、放射線療法、免疫療法などの異なる種類の抗がん療法を施すことを含み得る。
換言すると、１つ以上のｃｆＤＮＡバイオマーカー遺伝子のメチル化の頻度またはレベルは、いつ療法を継続するか、および／またはいつ療法を変更するかを決定するためにモニタリングされ得る。したがって、処置後ｃｆＤＮＡ試料は、投与のうちのいずれかの後に単離され得、ｃｆＤＮＡ試料は、１つ以上のｃｆＤＮＡバイオマーカー遺伝子のメチル化の頻度またはレベルを決定するためにアッセイされ得る。したがって、主題の方法は、ＨＣＣについて治療されている個体が、治療に応答するか、または治療に対する応答性を維持しているかを決定するために使用され得る。
療法は、処置前ｃｆＤＮＡ試料が個体から単離された後の任意の時間に、個体に施され得るが、処置前ｃｆＤＮＡ試料が単離された後（または、複数の処置前ｃｆＤＮＡ試料が単離される場合、最後の処置前ｃｆＤＮＡ試料が単離された後）と同時に、またはできるだけ早く（例えば、約７日以下、約３日以下、例えば、２日以下、３６時間以下、１日以下、２０時間以下、１８時間以下、１２時間以下、９時間以下、６時間以下、３時間以下、２．５時間以下、２時間以下、１．５時間以下、１時間以下、４５分以下、３０分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、２分以下、または１分以下）療法が施されることが好ましい。
場合によっては、１種類以上の療法が個体に施され得る。例えば、ＨＣＣを有する対象は、腫瘍の外科的切除に続いて化学療法剤または生物学的薬剤の投与を受け得る。全身療法は、がんが肝臓を超えて広がった場合、または転移を受けた場合に施され得る。
いくつかの実施形態では、メチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーは、患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）の再発のモニタリングのために使用される。例えば、第１のｃｆＤＮＡは、患者が画像化または他の診断様式からがんを有しないと特徴づけられる第１の時点で、以前のＨＣＣの発生についての治療後に患者から取得され得る。第１のｃｆＤＮＡ試料由来のｃｆＤＮＡにおける１つ以上のバイオマーカー遺伝子のプロモーター領域における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化のレベルまたは頻度が測定され得、１つ以上のバイオマーカー遺伝子は、ＡＫ０５５９５７、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＭ２、ＲＵＮＸ３、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＰＩＮＴ２、およびＷＩＦ１から選択される。第２のｃｆＤＮＡ試料は、再発についてのモニタリング期間中の第２の時点で患者から取得され得る。第２のｃｆＤＮＡ試料由来のｃｆＤＮＡにおける１つ以上のバイオマーカー遺伝子のプロモーター領域における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化のレベルまたは頻度が測定され得、１つ以上のバイオマーカー遺伝子は、ＡＫ０５５９５７、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＭ２、ＲＵＮＸ３、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＰＩＮＴ２、およびＷＩＦ１から選択され、第１のｃｆＤＮＡ試料のｃｆＤＮＡと比較して、第２のｃｆＤＮＡ試料のｃｆＤＮＡにおけるＡＫ０５５９５７、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＭ２、ＲＵＮＸ３、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＰＩＮＴ２、およびＷＩＦ１から選択される１つ以上のバイオマーカー遺伝子のプロモーター領域における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化のレベルまたは頻度の増加は、ＨＣＣが再発したことを示す。患者が１つ以上のＣｐＧ部位のメチル化のレベルまたは頻度に基づいてＨＣＣの再発について陽性診断を有する場合、患者はＨＣＣの再発について治療される必要がある。いくつかの実施形態では、間隔をおいてｃｆＤＮＡ試料を繰り返し収集し、ｃｆＤＮＡを分析することによって、患者を一定期間にわたって再発についてモニタリングし、患者がＨＣＣの再発を有するか否かを決定する。いくつかの実施形態では、患者は、本明細書に記載の方法によって、１ヶ月、２ヶ月、４ヶ月、６ヶ月、８ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年、またはそれ以上の期間にわたって繰り返し再発についてモニタリングされる。
いくつかの実施形態では、主題の方法は、個体がＨＣＣ、またはＨＣＣの再発を有すると決定されるかどうかを示す分析を提供することを含む。分析は、個体が、治療に応答性であるか、もしくは応答性でないか、または個体が、ＨＣＣについての治療に対する応答性を維持しているか、もしくは応答性を維持していないと決定されるかどうかの分析をさらに提供し得る。上述のように、分析は、口頭または書面による報告（例えば、文書または電子文書）であり得る。分析は、対象、対象の医師、検査施設などに提供することができる。分析は、インターネットを介してウェブサイトのアドレスとしてアクセスすることもできる。いくつかのかかる場合では、分析は、複数の異なる実体（例えば、対象、対象の医師、試験施設など）によってアクセス可能であり得る。
ｃｆＤＮＡのメチル化の検出
当該技術分野で既知の任意の好適な方法を使用して、ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位でのメチル化を検出し得る。メチル化を検出するための例示的な技法としては、メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、またはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、およびメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析が挙げられるが、これらに限定されない。
バイサルファイト配列決定は、配列決定の前にＤＮＡのバイサルファイト処置を使用して、メチル化部位を検出する。ＤＮＡをバイサルファイトで処置すると、シトシン残基がウラシルに変換されるが、メチル化シトシン残基には影響しない。バイサルファイト処置後、ＤＮＡに残っているシトシンは、メチル化シトシンのみである。したがって、バイサルファイト処置後のＤＮＡの配列決定は、単一ヌクレオチド分解能での個々のシトシン残基のメチル化状態を明らかにする（Ｒｅｉｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ ２（２）：２０９－２０、Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４０（１０）：ｅ７９、Ｗｒｅｃｚｙｃｋａ ｅｔ ａｌ（２０１７）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６１：１０５－１１５、Ｓｈａｆｉ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｂｒｉｅｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．１９（５）：７３７－７５３、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲアッセイは、ＤＮＡを消化するためのメチル化感受性制限酵素、およびＣｐＧジヌクレオチドを含有する領域を選択的に増幅するＣＧリッチプライマーを用いたＰＣＲを使用する（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ５７：５９４－５９９を参照されたい）。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイは、ＤＮＡメチル化の検出のためのメチル化特異的プライミングおよびメチル化特異的蛍光プローブを用いたバイサルファイト依存性定量的蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲを使用する。Ｄｉｇｉｔａｌ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイをデジタルＰＣＲと組み合わせて、個々のメチル化分子の検出を可能にする（例えば、Ｅａｄｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０２－２３０６、Ｃａｍｐａｎ ｅｔ ａｌ（２０１８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７０８：４９７－５１３を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙアッセイは、増幅プライマー間、またはそれによりカバーされるＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブ（本明細書ではブロッカーとも呼ばれる）を使用して、核酸試料のメチル化特異的選択的増幅を可能にする。
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイのバリエーションであり、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイを、増幅プライマー間のＣｐＧ位置をカバーするメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わせる。
Ｍｓ－ＳＮｕＰＥアッセイは、ＣｐＧ部位のすぐ上流にハイブリダイゼーションするように設計されたプライマーを使用するＰＣＲと組み合わせたＤＮＡのバイサルファイト処置、ならびに視覚化および定量のためのポリアクリルアミドゲルでの増幅産物の電気泳動を使用する。ＤＮＡ（ゲノムまたはｃｆＤＮＡ）のファイサルファイトナトリウムでの処置により、非メチル化シトシンがウラシルに変換され、ＰＣＲステップ中に、ウラシルがチミンとして複製され、メチルシトシンが増幅中にシトシンとして複製される。元のＣｐＧ部位でのメチル化対非メチル化シトシン（Ｃ対Ｔ）の比率は、ゲル単離されたＰＣＲ産物、プライマー、およびＴａｑポリメラーゼを［３２Ｐ］ｄＣＴＰまたは［３２Ｐ］ＴＴＰのいずれかとともにインキュベートし、続く変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動および蛍光体画像化分析によって決定され得る。Ｍｓ－ＳＮｕＰＥプライマーはまた、［３２Ｐ］ｄＡＴＰまたは［３２Ｐ］ｄＧＴＰのいずれかを反対側の鎖に組み込んで、分析されるＣｐＧ部位に応じたメチル化状態を評価するように設計され得る（例えば、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ＆ Ｊｏｎｅｓ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５２９－２５３１、Ｇｏｎｚａｌｇｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２（８）：１９３１－６を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＭＳＰアッセイは、非メチル化シトシンのウラシルへの変換のためのＤＮＡのバイサルファイト処置、およびその後のメチル化対非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーを用いた増幅を使用する（例えば、Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：９８２１－９８２６、および米国特許第５，７８６，１４６号を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＣＯＢＲＡアッセイは、非メチル化シトシンのウラシルへの変換のためのＤＮＡのバイサルファイト処置、バイサルファイト変換ＤＮＡの遺伝子座特異的ＰＣＲ増幅、制限消化、ゲルでの制限パターンの電気泳動分析を使用する（例えば、Ｘｉｏｎｇ ＆ Ｌａｉｒｄ（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：２５３２－２５３４、Ｂｉｌｉｃｈａｋ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４５６：６３－７１を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＭＣＡアッセイは、ＤＮＡを消化するためのメチル化感受性制限酵素、続くアダプタのライゲーション、およびメチル化ＣｐＧリッチ配列を選択的に増幅するＰＣＲを使用する（例えば、Ｔｏｙｏｔａ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５９：２３０７－１２、およびＷＯ００／２６４０１Ａ１を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＭＣＡＭアッセイは、ＣｐＧアイランドマイクロアレイと組み合わせてＭＣＡを使用して、ハイスループット方式でＤＮＡメチル化を検出する（例えば、Ｅｓｔｅｃｉｏ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１７（１０）：１５２９－１５３６を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＨＥＬＰアッセイは、ＤＮＡを切断するためのメチル化感受性制限酵素であるＨｐａＩＩ、対照としてメチル化非感受性アイソシゾマーであるＭｓｐＩを使用する。マイクロアレイ分析は、ＨｐａＩＩ／ＭｓｐＩ断片を検出するように設計されたプローブを含有するマイクロアレイを用いて実施される。ＨＥＬＰ－ｓｅｑは、ＨＥＬＰアッセイをＤＮＡメチル化部位の大規模並列配列決定と組み合わせる（例えば、Ｇｒｅａｌｌｙ（２０１８）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７０８：１９１－２０７、Ｓｕｚｕｋｉ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ５２（３）：２１８－２２を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＧＬＡＤ－ＰＣＲアッセイは、メチル化ＤＮＡのみを切断する部位特異的メチル指向性ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、続くハイスループットＰＣＲのためのユニバーサルアダプターへのＤＮＡ断片のライゲーションを使用する（例えば、Ｍａｌｙｓｈｅｖ ｅｔ ａｌ．（２０２０）Ａｃｔａ Ｎａｔｕｒａｅ １２（３）：１２４－１３３、Ｒｕｓｓｉａｎ Ｐａｔｅｎｔ ＲＵ ２５２５７１０を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる）。
ＭｅＤＩＰアッセイは、５－メチルシトシンに対する抗体を使用して、メチル化ＤＮＡ断片を免疫沈降させる。この技法は、マイクロアレイハイブリダイゼーション（ＭｅＤＩＰ－ｃｈｉｐ）または次世代配列決定（ＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ）を使用するハイスループットＤＮＡ検出方法と組み合わせることができる。例えば、Ｗｅｂｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３７（８）：８５３－８６２、Ｐａｌｍｋｅ ｅｔ ａｌ．（２０１１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ５３（２）：１７５－１８４、Ｑｕａｃｋｅｎｂｕｓｈ ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６８（６）：１７８６－１７９６、Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ａｎａｌｙｓｔ １４４（６）：１９０４－１９１５、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．１１３（１－２）：４５－５４を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる。
ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）は、１０－１１転座（ＴＥＴ）酵素を使用して、５－メチルシトシンおよび５－ヒドロキシメチルシトシンの５－カルボキシルシトシンへの酸化、続くピリジンボラン還元を触媒して、ジヒドロウラシルを産生する。非修飾シトシンは影響を受けない。例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３７：４２４－４２９を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる。
メチル化特異的巨大磁気抵抗性センサーベースのマイクロアレイ分析は、巨大磁気抵抗性（ＧＭＲ）バイオセンサー上でのメチル化特異的ＰＣＲおよびメルト曲線分析を組み合わせる。ＧＭＲバイオセンサーは、ＰＣＲ増幅産物におけるメチル化または非メチル化ＣｐＧ部位を標的とする合成ＤＮＡプローブを含む。ＰＣＲ増幅産物のＧＭＲバイオセンサーへのハイブリダイゼーション後、２種類のプローブ間の融解温度（Ｔｍ）の差を測定する。例えば、Ｒｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．（２０１７）ＡＣＳ Ｎａｎｏ．１１（９）：８８６４－８８７０、Ｎｅｓｖｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０１９）Ｂｉｏｓｅｎｓ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎ １２４－１２５：１３６－１４２を参照されたく、参照により本明細書に組み込まれる。
サザンブロッティングを使用して、ＤＮＡメチル化を検出することもできる。まず、ＤＮＡをメチル化感受性制限酵素で消化し、そして制限断片をサザンブロットによって分析する。
配列は、メチル化の程度（例えば、一方が他方に対してメチル化が増加または減少している）、頻度、またはパターンが異なる場合、「差次的にメチル化されている」、または「メチル化の差異」を有する、または「異なるメチル化状態」を有すると言われる。「差次的メチル化」という用語は、がん陰性試料における核酸メチル化のレベルまたはパターンと比較した、がん陽性試料における核酸メチル化のレベルまたはパターンの差異を指す。それはまた、術後にがんが再発した患者と再発していない患者との間のレベルまたはパターンの差異を指す場合もある。
メチル化状況は、任意選択で、「メチル化値」（例えば、メチル化頻度、割合、比率、パーセントなどを表す）によって表されるか、または示されてもよい。メチル化値は、例えば、メチル化依存性制限酵素による制限消化後に存在する無傷の核酸の量を定量化することによって、またはバイサルファイト反応後の増幅プロファイルを比較することによって、またはバイサルファイト処置および未処置の核酸の配列を比較することによって生成され得る。したがって、値、例えば、メチル化値は、メチル化状況を表し、したがって、遺伝子座の複数のコピーにわたってメチル化状態の定量的指標として使用され得る。これは、試料における配列のメチル化状況を閾値または基準値と比較することが望ましい場合に特に有用である。
メチル化状態は、特定の部位を含む試料におけるＤＮＡの総集団に対して、特定の部位でメチル化されるＤＮＡの個々の鎖の割合またはパーセンテージの観点で表され得る。本明細書で使用される場合、「メチル化頻度」または「メチル化パーセント（％）」は、分子または遺伝子座がメチル化されていない場合の数に対する分子または遺伝子座がメチル化されている場合の数を指す。
データ分析
いくつかの実施形態では、１つ以上のパターン認識方法を、ｃｆＤＮＡメチル化のためのデータの分析において使用することができる。定量値は、個体のＨＣＣの１つ以上のリスクスコアを計算するために、線形または非線形の方法で組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、メチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーまたはバイオマーカーの組み合わせの測定値は、線形もしくは非線形モデルまたはアルゴリズム（例えば、「バイオマーカー署名」）に定式化され、尤度スコアに変換される。この尤度スコアは、ｃｆＤＮＡ試料が、疾患の証拠がない患者またはＨＣＣを有する患者由来である可能性を示す。尤度スコアを使用して、がんの進行の種々の段階を区別することもできる。モデルおよび／またはアルゴリズムは、機械可読フォーマットで提供され得、それを使用して、ｃｆＤＮＡバイオマーカー遺伝子またはバイオマーカープロファイルにおけるＣｐＧ部位でのメチル化の頻度またはレベルを疾患状態と相関させ得る、かつ／または患者もしくは患者のクラスの治療様式を指定し得る。
複数のバイオマーカーのレベルを分析することには、アルゴリズムまたは分類子の使用を含み得る。いくつかの実施形態では、機械学習アルゴリズムを使用して、ＨＣＣを有するとして患者を分類する。機械学習アルゴリズムは、教師あり学習アルゴリズムを含み得る。教師あり学習アルゴリズムの例としては、平均１依存推定器（Ａｖｅｒａｇｅ Ｏｎｅ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ Ｅｓｔｉｍａｔｏｒ）（ＡＯＤＥ）、人工ニューラルネットワーク（例えば、バックプロパゲーション）、ベイズ統計（例えば、ナイーブベイズ分類子、ベイズネットワーク、ベイズ知識ベース）、事例ベースの推論、決定木、帰納的論理プログラミング、ガウスプロセス回帰、データ処理のグループ法（ＧＭＤＨ）、学習オートマトン、学習ベクトル量子化、最小メッセージ長（決定木、決定グラフなど）、遅延学習（Ｌａｚｙ ｌｅａｒｎｉｎｇ）、インスタンスベースの学習最近傍アルゴリズム、類推モデリング、確率的で近似的に正しい学習（ＰＡＣ）学習、リップルダウンルール、知識獲得方法論、シンボリック機械学習アルゴリズム、サブシンボリック機械学習アルゴリズム、サポートベクトルマシン、ランダムフォレスト、分類子のアンサンブル、ブートストラップ集約（バッギング）、およびブースティングが挙げられ得る。教師あり学習は、回帰分析および情報ファジーネットワーク（ＩＦＮ）などの順序分類を含み得る。あるいは、教師あり学習方法は、ＡＯＤＥ、線形分類子（例えば、フィッシャーの線形判別子、ロジスティック回帰、ナイーブベイズ分類子、パーセプトロン、およびサポートベクトルマシン）、二次分類子、ｋ近傍、ブースティング、決定木（例えば、Ｃ４．５、ランダムフォレスト）、ベイズネットワーク、および隠れマルコフモデルなどの統計的分類を含み得る。
機械学習アルゴリズムはまた、教師なし学習アルゴリズムを含み得る。教師なし学習アルゴリズムの例としては、人工ニューラルネットワーク、データクラスタリング、期待値最大化アルゴリズム、自己組織化マップ、動径基底関数ネットワーク、ベクトル量子化、生成地形図、情報ボトルネック法、およびＩＢＳＥＡＤが挙げられ得る。教師なし学習は、Ａｐｒｉｏｒｉアルゴリズム、Ｅｃｌａｔアルゴリズム、およびＦＰ成長アルゴリズムなどの関連付けルール学習アルゴリズムも含み得る。単一結合クラスタリングやコンセプチュアル（Ｃｏｎｃｅｐｔｕａｌ）クラスタリングなどの階層的クラスタリングも使用され得る。代替的に、教師なし学習は、Ｋ平均アルゴリズムおよびファジークラスタリングなどの部分的なクラスタリングを含み得る。
いくつかの例では、機械学習アルゴリズムは、強化学習アルゴリズムを含む。強化学習アルゴリズムの例としては、時間差学習、Ｑ学習、および学習オートマトンが挙げられるが、これらに限定されない。代替的に、機械学習アルゴリズムは、データ前処理を含み得る。
好ましくは、機械学習アルゴリズムは、平均一依存推定器（ＡＯＤＥ）、フィッシャーの線形判別子、ロジスティック回帰、パーセプトロン、多層パーセプトロン、人工ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン、二次分類子、ブースティング、決定木、Ｃ４．５、ベイズネットワーク、隠れマルコフモデル、高次元判別子分析、およびガウス混合モデルが含まれ得るが、これらに限定されない。機械学習アルゴリズムは、サポートベクトルマシン、ナイーブベイズ分類子、ｋ最近傍、高次元判別分析、またはガウス混合モデルを含み得る。いくつかの例では、機械学習アルゴリズムは、ランダムフォレストを含む。
キット
本明細書に記載のメチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーを検出するために使用され得るキットも提供される。かかるキットは、ＨＣＣを有する対象を診断する、ＨＣＣの再発を検出する、療法選択、または治療に対する応答をモニタリングするために使用され得る。本キットは、メチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーの検出のための１つ以上の薬剤、ＨＣＣを有すると疑われるヒト対象から単離されたｃｆＤＮＡを含む生体試料（例えば、血液または血漿）を保持するための容器、および薬剤を生体試料または生体試料の一部と反応させて、生体試料におけるｃｆＤＮＡにおける１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度またはレベルを検出するための印刷された説明書を含み得る。薬剤は、別々の容器に包装されてもよい。本キットは、メチル化アッセイ（例えば、バイサルファイト配列決定、ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）、Ｄｉｇｉｔａｌ ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）、Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＣＯＢＲＡ、ＭＣＡ、ＭＣＡＭ、ＨＥＬＰ、ＨＥＬＰ－ｓｅｑ、ＧＬＡＤ－ＰＣＲ、ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ、ＭｅＤＩＰ－ｃｈｉｐなど）を実施するための１つ以上の対照基準試料および試薬をさらに含み得る。例えば、本発明のキットは、バイサルファイト試薬、メチル化感受性制限酵素、ＣｐＧジヌクレオチドを含有するＤＮＡ領域を選択的に増幅するＰＣＲプライマー、メチル化特異的プライマー、メチル化特異的プローブ、またはそれらの組み合わせなどのメチル化の頻度またはレベルを決定するための薬剤を含み得る。
例えば、本キットは、本明細書に記載のバイオマーカーの１つ以上のメチル化を検出するために使用され得、それは、健常な対照対象またはがんを有しない対象と比較して、ＨＣＣを有する患者由来のｃｆＤＮＡ試料におけるメチル化の頻度の増加を示す。いくつかの実施形態では、本キットは、遺伝子：ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５のプロモーター領域における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度またはレベルを決定するための薬剤を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度またはレベルを決定するための薬剤を含む。いくつかの実施形態では、本キットは、ＣｐＧ部位：ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８でのメチル化の頻度またはレベルを決定するための薬剤を含む。
本キットは、キットに含まれる組成物のための１つ以上の容器を含み得る。組成物は、液体形態であり得るか、または凍結乾燥させることができる。組成物に好適な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む様々な材料から形成することができる。
上記の構成要素に加えて、主題のキットは、（特定の実施形態では）主題の方法を実施するための説明書をさらに含み得る。これらの説明書は、様々な形態で主題のキット内に存在し得、そのうちの１つ以上が、キット内に存在し得る。これらの説明書が存在し得る１つの形態は、例えば、情報が印刷される１枚または複数枚の紙などの好適な媒体または基板上、キットのパッケージ中、添付文書などの中の印刷情報としてである。これらの説明書のさらに別の形態は、情報が記録されたコンピュータ可読媒体、例えば、ディスケット、コンパクトディスク（ＣＤ）、ＤＶＤ、フラッシュドライブなどである。存在し得る、これらの説明書のさらなる別の形態は、離れた場所で情報にアクセスするために、インターネットを介して使用され得るウェブサイトアドレスである。
本開示の非限定的な態様の例
上述の本主題の態様（実施形態を含む）は、単独で、または１つ以上の他の態様または実施形態と組み合わせて有益であり得る。先の説明を限定することなく、番号１～４７の本開示の特定の非限定的な態様を以下に提供する。本開示を読むと当業者には明らかであろうように、個々に番号付けされた態様の各々は、前述の態様のいずれかまたは個々に番号付けされた態様に続く態様のいずれかと使用または組み合わせられ得る。これは、態様のすべてのかかる組み合わせのサポートを提供することを意図しており、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されない。
１． 患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）を診断および治療する方法であって、
ａ）患者から循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を取得することと、
ｂ）ｃｆＤＮＡの１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、１つ以上の遺伝子が、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択され、対照ｃｆＤＮＡ試料における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、患者由来のｃｆＤＮＡ試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加が、患者がＨＣＣについて陽性診断を有することを示す、検出することと、
ｃ）患者がＣｐＧ部位でのメチル化の頻度に基づいてＨＣＣについて陽性診断を有する場合、ＨＣＣについて患者を治療することと、を含む、方法。
２． １つ以上のＣｐＧ部位が、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される、態様１に記載の方法。
３． メチル化を上記検出することが、ｃｆＤＮＡにおけるｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８ ＣｐＧ部位でのメチル化の頻度を測定することを含む、態様２に記載の方法。
４． １つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲が、ＨＣＣを有しない１つ以上の対照対象由来の１つ以上の血液試料由来のｃｆＤＮＡから取得される、態様１～３のいずれか１つに記載の方法。
５． １つ以上のアルゴリズムを使用して、ｃｆＤＮＡのＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７遺伝子におけるＣｐＧ部位でのメチル化頻度に基づいてＨＣＣリスクスコアを計算することをさらに含む、態様１～４のいずれか１つに記載の方法。
６． ＨＣＣについて患者を上記治療することが、ＨＣＣ腫瘍の外科的切除、ＨＣＣ腫瘍の高周波アブレーション（ＲＦＡ）、ＨＣＣ腫瘍の凍結アブレーション、エタノールもしくは酢酸でのＨＣＣ腫瘍の経皮的注射、経カテーテル動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）、選択的内部放射線療法（ＳＩＲＴ）、肝臓移植、高強度焦点超音波、外部ビーム療法、門脈塞栓術、放射性核種療法、化学療法、標的療法、免疫療法、または生物学的療法を含む、態様１～５のいずれか１つに記載の方法。
７． 標的療法が、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、レンバチニブ、カボザンチニブ、ラムシルマブ、ニボルマブ、もしくはペムブロリズマブ、またはそれらの組み合わせを投与することを含む、態様６に記載の方法。
８． 化学療法が、シスプラチン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル、カペシタビン、もしくはミトキサントロン、またはそれらの組み合わせを投与することを含む、態様６に記載の方法。
９． 放射性核種療法が、イットリウム－９０、ロジン－１３１、レニウム－１８８、またはホルミウム－１６６を投与することを含む、態様６に記載の方法。
１０． ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位のメチル化を上記検出することが、メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、もしくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、またはメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析を実施することを含む、態様１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１． ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位のメチル化を上記検出することが、配列番号１～４３２からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つのプローブを使用することを含む、態様１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２． アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血液レベルを測定することをさらに含み、対照対象についてのＡＦＰの血液レベル、ならびにＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加と組み合わせて、ＡＦＰの血液レベルの増加の検出が、患者が、ＨＣＣについて陽性診断を有することを示す、態様１～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３． ｃｆＤＮＡ試料が、ｃｆＤＮＡを含む血液試料または血漿試料である、態様１～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４． 患者が、肝疾患を有する、態様１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５． 肝疾患が、肝硬変、脂肪肝疾患、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、自己免疫性肝炎、薬剤性肝炎、ウイルス性肝炎、Ａ型肝炎ウイルス感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、Ｄ型肝炎ウイルス感染症、Ｅ型肝炎ウイルス感染症、遺伝性ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、原発性胆汁性肝硬変、またはα－１－抗トリプシン欠乏症である、態様１４に記載の方法。
１６． 患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）をモニタリングする方法であって、
ａ）第１の時点での患者由来の第１の血液試料、およびそれより後の第２の時点での患者由来の第２の血液試料を取得することと、
ｂ）第１の血液試料および第２の血液試料における循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、１つ以上の遺伝子が、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択され、第１の血液試料のｃｆＤＮＡと比較して、第２の血液試料のｃｆＤＮＡにおけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化の頻度の増加の検出が、ＨＣＣが進行していることを示し、第１の血液試料のｃｆＤＮＡと比較して、第２の血液試料のｃｆＤＮＡにおけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化の頻度の減少の検出が、ＨＣＣが進行していないことを示す、検出することと、を含む、方法。
１７． ＨＣＣが、原発性腫瘍、転移、または再発である、態様１６に記載の方法。
１８． 第１の時点が、ＨＣＣについての患者の治療が開始される前であり、第２の時点が、治療中または治療後である、態様１６または１７に記載の方法。
１９． 治療が、ＨＣＣ腫瘍の外科的切除、ＨＣＣ腫瘍の高周波アブレーション（ＲＦＡ）、ＨＣＣ腫瘍の凍結アブレーション、エタノールもしくは酢酸でのＨＣＣ腫瘍の経皮的注射、経カテーテル動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）、選択的内部放射線療法（ＳＩＲＴ）、肝臓移植、高強度焦点超音波、外部ビーム療法、門脈塞栓術、放射性核種療法、化学療法、標的療法、免疫療法、または生物学的療法である、態様１７に記載の方法。
２０． ステップａ）およびｂ）を繰り返すことをさらに含む、態様１６～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１． ＨＣＣが進行している場合に、ＨＣＣについての治療の投薬量もしくは頻度を増加させること、異なる治療に変更すること、または患者に対する緩和ケアを開始することをさらに含む、態様１６～２０のいずれか１つに記載の方法。
２２． １つ以上のＣｐＧ部位が、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される、態様１６～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３． メチル化を上記検出することが、ｃｆＤＮＡにおけるｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８ ＣｐＧ部位でのメチル化の頻度を測定することを含む、態様２２に記載の方法。
２４． アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血液レベルを測定することをさらに含み、第１の血液試料と比較して、第２の血液試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加と組み合わせて、ＡＦＰの血液レベルの増加の検出が、ＨＣＣが進行していることを示し、第１の血液試料と比較して、第２の血液試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の減少と組み合わせて、ＡＦＰの血液レベルの減少が、ＨＣＣが進行していないことを示す、態様１６～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５． ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位のメチル化を上記検出することが、メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、もしくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、またはメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析を実施することを含む、態様１６～２５のいずれか１つに記載の方法。
２６． 患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）の再発についてモニタリングする方法であって、
ａ）患者が、画像化または他の診断様式からがんを有しないと特徴づけられる第１の時点で、ＨＣＣの以前の発生についての治療後に、患者から第１の循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を取得することと、
ｂ）第１のｃｆＤＮＡ試料由来のｃｆＤＮＡにおける１つ以上のバイオマーカー遺伝子のプロモーター領域における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、１つ以上のバイオマーカー遺伝子が、ＡＫ０５５９５７、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＭ２、ＲＵＮＸ３、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＰＩＮＴ２、およびＷＩＦ１から選択される、検出することと、
ｃ）再発についてのモニタリング期間中の第２の時点で患者から第２のｃｆＤＮＡ試料を取得することと、
ｄ）第２のｃｆＤＮＡ試料由来のｃｆＤＮＡにおける１つ以上のバイオマーカー遺伝子のプロモーター領域における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、１つ以上のバイオマーカー遺伝子が、ＡＫ０５５９５７、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＭ２、ＲＵＮＸ３、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＰＩＮＴ２、およびＷＩＦ１から選択され、第１のｃｆＤＮＡ試料のｃｆＤＮＡと比較して、第２のｃｆＤＮＡ試料のｃｆＤＮＡにおけるＡＫ０５５９５７、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＭ２、ＲＵＮＸ３、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＰＩＮＴ２、およびＷＩＦ１から選択される１つ以上のバイオマーカー遺伝子のプロモーター領域における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加が、ＨＣＣが再発したことを示す、検出することと、
ｅ）その後、再発についてのモニタリング期間中に、ステップｃ）～ｅ）を繰り返すことと、を含む、方法。
２７． 患者が１つ以上のＣｐＧ部位のメチル化のレベルに基づいてＨＣＣの再発について陽性診断を有する場合、ＨＣＣの再発について患者を治療することをさらに含む、態様２６に記載の方法。
２８． ＨＣＣの再発について患者を上記治療することが、ＨＣＣ腫瘍の外科的切除、ＨＣＣ腫瘍の高周波アブレーション（ＲＦＡ）、ＨＣＣ腫瘍の凍結アブレーション、エタノールもしくは酢酸でのＨＣＣ腫瘍の経皮的注射、経カテーテル動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）、選択的内部放射線療法（ＳＩＲＴ）、肝臓移植、高強度焦点超音波、外部ビーム療法、門脈塞栓術、放射性核種療法、化学療法、標的療法、免疫療法、または生物学的療法を含む、態様２６または２７に記載の方法。
２９． １つ以上のＣｐＧ部位が、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される、態様２６～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０． メチル化を上記検出することが、ｃｆＤＮＡにおけるｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８ ＣｐＧ部位でのメチル化の頻度を測定することを含む、態様２９に記載の方法。
３１． 患者のアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血液レベルを測定することをさらに含み、ＡＦＰの血液レベル、ならびにＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、患者由来のｃｆＤＮＡにおけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加と組み合わせて、ＡＦＰの血液レベルの増加が、患者が、ＨＣＣの再発について陽性診断を有することを示す、態様２６～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２． ｃｆＤＮＡ試料が、ｃｆＤＮＡを含む血液試料または血漿試料である、態様２６～３１のいずれか１つに記載の方法。
３３． ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位のメチル化を上記検出することが、メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、もしくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、またはメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析を実施することを含む、態様２６～３２のいずれか１つに記載の方法。
３４． ｃｆＤＮＡにおけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化を検出するための薬剤を含む、キット。
３５． 上記ＣｐＧ部位が、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される１つ以上のＣｐＧ部位を含む、態様３４に記載のキット。
３６． 上記ＣｐＧ部位が、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８を含む、態様３５に記載のキット。
３７． メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、もしくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、またはメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析を実施するための薬剤をさらに含む、態様３４～３６のいずれか１つに記載のキット。
３８． 上記薬剤が、バイサルファイト試薬、メチル化感受性制限酵素、ＣｐＧジヌクレオチドを含有するＤＮＡ領域を選択的に増幅するＰＣＲプライマー、メチル化特異的プライマー、メチル化特異的プローブ、またはそれらの組み合わせを含む、態様３４～３７のいずれか１つに記載のキット。
３９． 上記薬剤が、配列番号１～４３２からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つのプローブを含む、態様３４～３８のいずれか１つに記載のキット。
４０． ＡＦＰを測定するための試薬をさらに含む、態様３４～３９のいずれか１つに記載のキット。
４１． 肝細胞がん（ＨＣＣ）の診断、ＨＣＣの再発の検出、またはＨＣＣの治療のモニタリングのためにキットを使用するための説明書をさらに含む、態様３４～４０のいずれか１つに記載のキット。
４２． 患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）を診断するインビトロ方法であって、
ａ）患者から循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を取得することと、
ｂ）ｃｆＤＮＡの１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、１つ以上の遺伝子が、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択され、対照ｃｆＤＮＡ試料のｃｆＤＮＡにおける１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、患者由来のｃｆＤＮＡ試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加が、患者がＨＣＣについて陽性診断を有することを示す、検出することと、を含む、方法。
４３． ＣｐＧ部位が、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される、態様４２に記載の方法。
４４． メチル化のレベルを上記測定することが、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８ ＣｐＧ部位のメチル化のレベルを測定することを含む、態様４３に記載の方法。
４５． ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位のメチル化を上記検出することが、メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、もしくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、またはメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析を実施することを含む、態様４２～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６． 患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）の診断、ＨＣＣの再発の検出、またはＨＣＣの治療のモニタリングのためのバイオマーカーとして使用するための、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される、１つ以上のＣｐＧ部位でメチル化された、無細胞ＤＮＡ。
以下の実施例は、当業者に、本発明の作製および使用方法の完全な開示および説明を提供するために提示されるものであり、発明者が発明とみなす範囲を限定することを意図せず、また、以下の実験が行われるすべてまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関する正確性を確保する努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮される必要がある。別段の指示のない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
本明細書において引用されたすべての刊行物および特許出願は、各個々の刊行物または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、本発明の実施のための好ましいモードを含むように、本発明者によって見出されるか、または提供される特定の実施形態に関して説明されている。当業者は、本開示に照らして、本発明の意図される範囲から逸脱することなく、例示される特定の実施形態で多数の修正および変更を行うことができることを理解されたい。例えば、コドン冗長性によって、タンパク質配列に影響を与えることなく、基礎となるＤＮＡ配列の変更を行うことができる。生物学的機能的等価性を考慮することによって、種類または量において生物学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造の変更を行うことができる。かかる修正はすべて、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
実施例１
大規模なメタ分析およびＣｐＧマイクロアレイのデータを統合することにより、肝硬変患者における肝細胞がんの有望な無細胞ＤＮＡバイオマーカーが同定される
がんの発症は、腫瘍抑制遺伝子のプロモーター領域におけるＣｐＧジヌクレオチドのメチル化を介して、腫瘍抑制遺伝子の機能的サイレンシングに関連している３。肝硬変患者由来の無細胞ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）におけるメチル化ＨＣＣ ＤＮＡの検出は、有望な精度を示している４～６。これらの研究のバイオマーカーは、少数の患者の群（＜５０）由来の試料の統計分析（多重仮説検定、回帰分析など）によって発見された。統計的方法は、バイオマーカーの生物学的関連性を考慮していない。この制限は、発見の試料サイズが小さいことと組み合わさり、かかる方法が、他の患者コホートにおける低い予測力であるバイオマーカーを同定する原因となり得る。これらのリスクを軽減するために、生物学的に根源的なｃｆＤＮＡバイオマーカーについて腫瘍抑制因子をスクリーニングするために、３４１１人のＨＣＣ患者および１７２２人の健常な対照からのメチル化データを組み込んだ、生理学的に触発されたバイオマーカー発見方法論であるメチル化バイオマーカーの層別分析（ＬＡＭＢ）を作成した。
ＬＡＭＢは、メタ分析データを介して組織における高メチル化腫瘍抑制因子を同定し、マイクロアレイデータを介して腫瘍抑制因子のプロモーターにおける差次的にメチル化されたＣｐＧを同定する。対になったＨＣＣおよび隣接非がん性組織（ＡＮＴ）の遺伝子高メチル化カウントデータを、１１７個の研究から収集した（図１Ａ、図４）。各研究における遺伝子の診断オッズ比（ＤＯＲ）を計算した。ランダム効果メタ分析は、３つ以上の研究における遺伝子について調整されたＤＯＲが計算された（図５）。メタ分析により、二元分類モデルにおいてＨＣＣと肝硬変ｃｆＤＮＡとの間の高い予測力を示す（ＡＵＣ＞０．８）７つの腫瘍抑制因子と組み合わせた１５つの腫瘍抑制因子が同定された５～６（図１Ａ、表１）。
候補の腫瘍抑制プロモーターにおけるＣｐＧについてＩｌｌｕｍｉｎａ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０（４５０Ｋ）マイクロアレイデータからのメチル化頻度（ｂ）を、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）および他の２つの研究からの１５３人の患者の対になったＨＣＣおよびＡＮＴから抽出した７～９。ＡＮＴにおける高メチル化を伴うか、または単変量ロジスティック回帰モデルにおけるＨＣＣとＡＮＴとの間の低い予測力を伴う、ＨＣＣにおける平均メチル化がＡＮＴよりも低いＣｐＧを除去した（図１Ａ）。
健常対照において、ｃｆＤＮＡの大部分は造血細胞死に由来し、肝細胞はｃｆＤＮＡの約１～１０％を占める１０～１１。造血ｃｆＤＮＡから区別可能なメチル化ＣｐＧを選択するために、健常対照由来の１７２２個の溶解血液試料に対して部位をスクリーニングした（図１Ｂ）。５つの研究から４５０Ｋの血液データを組み合わせた１２～１６。１５９個のＴＣＧＡ ＨＣＣを、年齢、性別、および人種によりに血液と一致させた。単変量ロジスティック回帰モデルにおいてＨＣＣ組織と対照血液との間の低い予測力を示すＣｐＧを除去した。バックグラウンドのメチル化が低いバイオマーカーを同定するために、ＣｐＧを残りの１５６３個の血液試料におけるメチル化頻度によってフィルター処理した。
ＬＡＭＢパイプラインは、１０個の腫瘍抑制因子からの２０個のＣｐＧのｃｆＤＮＡバイオマーカーパネル（ＬＡＭＢ－ＨＣＣ）を同定した（表２）。 組織メタ分析によって６つの腫瘍抑制因子が同定され（ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１）、４つは、血漿研究から見出され（ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＡＫ０５５９５７）、両方の研究型からの遺伝子を組み込むことの価値を強調した。除外された遺伝子は、それらの研究において差次的なメチル化を示すが、４５０Ｋデータにおいてはこの効果は示されておらず、これらの遺伝子が肝硬変患者におけるＨＣＣの集団全体の予測因子ではない可能性があることを示唆した。
次いで、ＬＡＭＢ－ＨＣＣパネルを、基礎として肝硬変を有する２２人のＨＣＣ患者ならびに肝機能および線維症によって一致された２２人の肝硬変患者からのｃｆＤＮＡの独立した４５０Ｋ検証データセットで評価した４。単変量ロジスティック回帰モデルにおけるＣｐＧ ＡＵＣは、組織および血液分析によって除外されたＣｐＧからＬＡＭＢ－ＨＣＣ ＣｐＧへの予測力の増加を示し、ＬＡＭＢの生理学的に触発されたスクリーニングの影響を強調した（図２Ａ）。
肝硬変の肝臓による局所的なｃｆＤＮＡの寄与の増加に起因して、ｃｆＤＮＡは肝硬変患者の血管系に均一に分布していないと仮定した。したがって、ＣｐＧのメチル化頻度は、同じ患者由来の血液試料間で変動する可能性がある。検証データセットでは、ｃｆＤＮＡのＣｐＧメチル化頻度は、密接に位置付けられた部位（約５０塩基）において同様の分布を示したが、同じ遺伝子における部位であっても、より長い距離で分布は逸脱した（図２Ｂ）。この変動を説明するために、ＬＡＭＢ－ＨＣＣパネルを、１０個の遺伝子のメチル化プロファイルを捕捉した２０個のＣｐＧとしてみた。遺伝子のプロモーターにおけるＬＡＭＢ－ＨＣＣ ＣｐＧの最大メチル化頻度をその遺伝子にマッピングし、４４人のｃｆＤＮＡ患者の１０遺伝子のメチル化頻度プロファイルをもたらした（図６、図２Ｃ）。
検証データでＬＡＭＢ－ＨＣＣパネルを偏りのない方法で試験するために、１０遺伝子のメチル化頻度プロファイルを介して、各患者の幾何平均スコアを計算した（図２Ｄ）。頻度が出力スコアの重み付けを支配しないように、幾何平均式は、入力メチル化頻度を正規化する。ＬＡＭＢ－ＨＣＣ遺伝子メチル化スコアは、ＨＣＣと肝硬変ｃｆＤＮＡとの間で高い予測力を実証した（ＡＵＣ：０．８５、図２Ｄ）。
肝炎およびＮＡＳＨ肝硬変患者は、結腸直腸がん、膵臓がん、および肺がんのリスクの増加を示す１７～１８。ＴＣＧＡ由来の４１１個の結腸直腸腫瘍、１８４個の膵臓腫瘍、および８４３個の肺腫瘍におけるＬＡＭＢ－ＨＣＣ ＣｐＧメチル化頻度を検査し、非肝臓がんにおいては高メチル化されていない（β平均＜０．２）４つの遺伝子内の６つのＣｐＧを同定した（表２）。このＬＡＭＢ－肝臓パネルからの幾何平均スコアは、ＡＵＣのわずかな減少にもかかわらず、ＨＣＣと肝硬変ｃｆＤＮＡとの間で高い予測力を示し、ＬＡＭＢ方法ががん特異的バイオマーカーを同定することができることを示唆した（図２Ｄ、図７）。
次に、ＬＡＭＢパネルがＡＦＰスクリーニングと組み合わせてどのように機能するかを検査した。２０ｎｇ／ｍＬの臨床カットオフでは、１３／２２人のＨＣＣ患者が陽性（５９％の感度）であり、一方でＡＦＰ検査値を有するすべての肝硬変患者が陰性（１００％の特異度）であった。これらの値は、他の患者コホートにおいて観察される値と同様である（感度：５９％、特異度：９０％）２。誤診されたＨＣＣ患者を同定するために、ＬＡＭＢ－ＨＣＣおよびＬＡＭＢ－肝臓パネルを用いて、ＡＦＰ値が２０ｎｇ／ｍＬ未満の９人のＨＣＣ患者および全２２人の肝硬変患者を試験した（図８）。ＬＡＭＢ－ＨＣＣ＋ＡＦＰおよびＬＡＭＢ－肝臓＋ＡＦＰは、優れた予測力（それぞれ、ＡＵＣ：０．９３および０．９２、図２Ｄ）を示し、ＡＦＰスクリーニングを補完するパネルの能力を強調した（図７）。
２つの豊富なメチル化データ源、公開された研究および４５０Ｋデータをマイニングして、集団全体のメチル化ｃｆＤＮＡバイオマーカーを見出すことを目標に、ＬＡＭＢ方法を作成した。組織研究および血漿研究の両方を利用することにより、公開されたｃｆＤＮＡバイオマーカーを補完する新しい腫瘍抑制遺伝子が同定される。この情報を生理学的に触発された方法で４５０Ｋデータに組み込むことにより、ＬＡＭＢ方法は、複数のデータ型、試料型、および患者集団にわたるバイオマーカーを試験し、腫瘍および人々のエピジェネティックな多様性を再現しようとする。対になった組織試料からメチル化カウントおよび頻度データを選択的に収集し、人口統計学的情報によって血液試料に腫瘍を一致させることにより、バイオマーカーをスクリーニングするための偏りのない測定基準としてＤＯＲおよびＡＵＣを使用するために必要な症例および対照のバランスが提供される。その結果として、ＬＡＭＢパイプラインは、外部検証データセットにおいて高い予測力を示した肝硬変患者におけるＨＣＣについての１０遺伝子のｃｆＤＮＡパネルを同定した。最終的な臨床採用には、ＡＦＰおよびＣｐＧメチル化検出技法を用いたパネルの追加の検証が必要である。それにもかかわらず、これらの検証結果と連結したＬＡＭＢ方法は、他の疾患の集団全体の生物学的に根源的なバイオマーカーを同定するための、他の生理学的に触発されたデータマイニングアプローチの作成を促進し得る。
参考文献
１． Ｚｈａｎｇ， Ｄ．Ｙ． ＆ Ｆｒｉｅｄｍａｎ， Ｓ． Ｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．５６，７６９－７７５（２０１２）．
２． Ｍａｒｒｅｒｏ， Ｊ．Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１３７，１１０－１１８（２００９）．
３． Ｄａｓ， Ｐ．Ｍ． ＆ Ｓｉｎｇａｌ， Ｒ． Ｊ．Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ．２２，４６３２－４６４２（２００４）．
４． Ｈｌａｄｙ， Ｒ．Ａ． ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．９，７２３９－７２５０（２０１９）．
５． Ｋｉｓｉｅｌ， Ｊ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．６９，１１８０－１１９２（２０１９）．
６． Ｏｕｓｓａｌａｈ， Ａ． ｅｔ ａｌ．ＥＢｉｏＭｅｄｉｃｉｎｅ．３０，１３８－１４７（２０１８）．
７． Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ Ｎｅｔｗｏｒｋ． Ｃｅｌｌ．１６９，１３２７－１３４１（２０１７）．
８． Ｋｕｒａｍｏｔｏ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ．３８，２６１－２７０（２０１７）．
９． Ｓｈｅｎ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．８，３４－４３（２０１３）．
１０． Ｍｏｓｓ， Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．９，５０６８（２０１８）．
１１． Ｓｕｎ， Ｋ． ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１２，Ｅ５５０３－Ｅ５５１２（２０１５）．
１２． Ｃｈｕａｎｇ， Ｙ． ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｍｅｄ．９，７６（２０１７）．
１３． Ｈａｎｎｏｎ Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１７，１７６（２０１６）．
１４． Ｈｏｒｖａｔｈ， Ｓ． ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ．１７，１７１（２０１６）．
１５． Ｃｈｏ． Ｓ．Ｈ． ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３５，８０７－８１８（２０１５）．
１６． Ｈａｎｎｕｍ， Ｇ． ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．４９，３５９－３６７（２０１３）．
１７． Ｋａｌａｉｔｚａｋｉｓ， Ｅ． ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ． Ｈｅｐａｔｏｌ．９，１６８－１７４（２０１１）．
１８． Ｓｏｒｅｎｓｅｎ， Ｈ．Ｔ． ｅｔ ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２８，９２１－９２５（１９９８）．
実施例２
方法
組織メチル化研究のメタ分析
「（（（（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）ＯＲ ＨＣＣ）ＯＲ ｈｅｐａｔｏｍａ）ＯＲ ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）ＡＮＤ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ」について、ＰｕｂＭｅｄ検索を実施し、２００２個の要約（２０１９年１０月１日現在）が得られた。要約をＨＣＣ組織メチル化との関連性についてスクリーニングし、６１２個の該当する組織メチル化論文を得た（図４）。これらの論文を、メチル化頻度データについてスクリーニングし、３１７個の研究が得られた。残りの論文を、まず、同じ患者由来のＨＣＣおよびＡＮＴの試験についてスクリーニングし、次いで、メチル化特異的ＰＣＲの使用についてスクリーニングし、１１７個の論文に至った。１１７個の論文についてカウントデータを照合し、ＨＣＣおよびＡＮＴについての高メチル化プロモーターをそれぞれ真陽性および偽陽性として処理した。Ｒの「ｍｅｔａｆｏｒ」ライブラリを使用して、３つ以上の研究で試験した遺伝子に対して、Ｈａｒｔｕｎｇ－Ｋｎａｐｐ－Ｓｉｄｉｋ－Ｊｏｎｋｍａｎ法を利用したランダム効果メタ分析を実施し、９５％信頼区間を有するＤＯＲ（診断オッズ比）の調整された自然対数がもたらされた（表１）。対数信頼区間が０未満の遺伝子を廃棄した。メタ分析によって同定された遺伝子についてフォレストプロットを生成した（図５）。Ｒ．Ｐ．、Ａ．Ｙ．、およびＰ．Ｂ．Ｒ．は、要約／論文のスクリーニングを独立して実施し、得られた論文からカウントデータを収集した。同定された論文およびカウントデータの違いが議論され、３人全員が最終決定に同意した。ＨＣＣおよび肝硬変患者の血漿メチル化研究は、この探査中に同定され、ロジスティック予測モデルを介して高い予測能力（ＡＵＣ＞０．８）を示す遺伝子を調査した。３人全員が、血漿研究に同意し、遺伝子５－６は、４５０Ｋ組織解析のために繰り越された。
ＨＣＣおよびＡＮＴにおけるプロモーターＣｐＧメチル化分析
４５０Ｋメチル化頻度データを、ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ－ＬＩＨＣ）７からダウンロードした。再発腫瘍を除去し、対になった原発性ＨＣＣおよびＡＮＴを有する５０人の患者のデータを使用した。対になった組織（ＧＳＥ５４５０３）を有する６６人の患者および対になった組織（ＧＳＥ８９８５２）を有する３７名の患者の４５０ＫデータをＧＥＯ８－９からダウンロードした。これらのデータセットは、公開された人口統計情報があるために選択され、これは、関連する研究において見出すことができる。３つのデータセットをすべて組み合わせて単一のデータセットとし、組織試料において欠損していた任意のＣｐＧを除去し、１５３人の患者についての３２６，３２２個のＣｐＧに至った。データを、ロジット変換し、Ｒにおける「ＣｏｍＢａｔ」パッケージを利用して、データセット間のバッチ効果を補正し、データを、逆ロジット変換した。残りのＣｐＧを、Ｉｌｌｕｍｉｎａの４５０Ｋアノテーションファイルを介して、遺伝子、特徴、および染色体位置に連結した。組織メタ分析および血漿研究分析由来の２２遺伝子についてのＴＳＳ１５００およびＴＳＳ２００におけるＣｐＧについてのメチル化頻度データを、全１５３人の患者、および６１個の早期腫瘍を有する６７人の患者のコホートについて抽出した。Ｒの「ｐＲＯＣ」ライブラリを介して、ＨＣＣとＡＮＴとの間の平均ＨＣＣメチル化、平均ＡＮＴメチル化、および単変量ＣｐＧ部位ＡＵＣを、１５３人の患者のすべておよび６７人の患者コホートについて計算した（表２）。ＨＣＣにおける平均メチル化がＡＮＴよりも低いＣｐＧ、ＡＮＴにおいて相対的に高メチル化（０．２超のメチル化頻度）であるＣｐＧ、またはすべての患者の単変量ロジスティック回帰モデルにおけるＡＵＣが０．８未満であるＣｐＧは、４５０Ｋ血液分析から除外された。
全血におけるプロモーターＣｐＧメチル化分析
４５０Ｋメチル化頻度データを、ＧＥＯ（ＧＳＥ８４７２７、ＧＳＥ８０４１７、ＧＳＥ４０２７９、ＧＳＥ７２７７３、ＧＳＥ１１１６２９、ＧＳＥ５３７４０）から３０５、１２７、６２２、２７２、２３６、および１６０人の健常対照についてダウンロードし、組み合わせ、ロジット変換した１２～１６。データセットは、溶解した全血を分析し、健常な対照が同定されやすいように構造化された。データは、Ｐｙｔｈｏｎにおける「ＣｏｍＢａｔ」パッケージを介してバッチ効果について補正され、次いで逆ロジット変換された。４５０Ｋ ＨＣＣ／ＡＮＴ分析において同定されたＣｐＧについてのメチル化頻度データを、組み合わせた血液データから抽出した。ＨＣＣ組織の血液に対する差次的メチル化分析を行うために、１６３個の別個のＴＣＧＡ ＨＣＣについての４５０Ｋデータをダウンロードした。これらの腫瘍のうちの１５９個を、患者の年齢、性別、および人種に基づいて全血試料と一致させた。それらの元のデータセットによる一致した血液試料の比率は、それらの元のデータセットによる全血液試料の比率を反映した。単変量ロジスティック回帰モデルから０．８未満のＡＵＣを有するＣｐＧを廃棄した（表２）。残りの１５６３個の血液試料における残りのＣｐＧの平均メチル化頻度を計算した。メチル化頻度が０．１未満のＣｐＧを、ＬＡＭＢ ＣｐＧとして同定した（表２）。
無細胞ＤＮＡにおけるＬＡＭＢ－ＨＣＣパネル分析
基礎となる肝硬変を有する２２人のＨＣＣ患者および２２人の肝硬変患者について、４５０Ｋのメチル化頻度データをダウンロードした（ＧＳＥ１２９３７４）４。２０１９年１０月現在、ＧＳＥ１２９３７４は、ＨＣＣおよび肝硬変患者由来の無細胞ＤＮＡについて利用可能な唯一のメチル化頻度データであり、これらの患者は、肝機能および線維症によって一致していた。ロジスティック回帰モデルを介した単変量ＡＵＣを、ＬＡＭＢの４５０Ｋフィルターによって分析したすべてのＣｐＧについて計算した。ＬＡＭＢ ＣｐＧのデータを抽出し、遺伝子プロモーターにおけるＬＡＭＢ ＣｐＧの最大メチル化頻度をその遺伝子にマッピングして、全４４人の患者についての１０遺伝子のメチル化プロファイルを作製した（図２Ｃ、図６）。１０遺伝子のメチル化プロファイルの各々の幾何平均を計算した（図２Ｄ）。Ｒにおける「ｐＲＯＣ」パッケージを用いて、ＲＯＣ曲線を作成し、幾何平均スコアからＡＵＣを見出した。９５％ＡＵＣ信頼区間を、１０００回の反復ブートストラッピングで計算した。
無細胞ＤＮＡにおけるＬＡＭＢ－肝臓パネル分析
ＴＣＧＡ（ＴＣＧＡ－ＣＯＡＤ、ＴＣＧＡ－ＲＥＡＤ、ＴＣＧＡ－ＰＡＡＤ、ＴＣＧＡ－ＬＵＳＣ、ＴＣＧＡ－ＬＵＡＤ）から、４１１個の結腸直腸、１８４個の膵臓、および８４３個の肺原発腫瘍についての４５０Ｋデータをダウンロードした。ＬＡＭＢ ＣｐＧについての平均メチル化頻度を、各がん型について抽出した。これらのがんにおいて平均メチル化頻度が０．２未満である６個のＣｐＧを、ＬＡＭＢ－肝臓パネルのために選択した。遺伝子プロモーターにおけるＬＡＭＢ－肝臓ＣｐＧの最大メチル化頻度をその遺伝子にマッピングして、すべての４４個のｃｆＤＮＡ試料について４遺伝子のメチル化プロファイルを作成した。４遺伝子のメチル化プロファイルの各々の幾何平均を計算した（図２Ｄ）。Ｒにおける「ｐＲＯＣ」パッケージにおいて、ＲＯＣ曲線を作成し、幾何平均スコアからＡＵＣを見出した。９５％ＡＵＣ信頼区間を、１０００回の反復ブートストラッピングで計算した。
無細胞ＤＮＡにおけるＬＡＭＢ－ＨＣＣ＋ＡＦＰおよびＬＡＭＢ－肝臓＋ＡＦＰパネル分析
ＡＦＰ血清レベルは、論文の捕捉からの４５０Ｋ ｃｆＤＮＡ検証データセットにおける患者について見出された４。２２人の肝硬変患者のうち３人のＡＦＰレベルは利用できなかった。残りの患者については、２２人のＨＣＣ患者のうち９人および１９人の肝硬変患者すべてが２０ｎｇ／ｍＬの臨床的カットオフを下回るＡＦＰレベルを有した。２０ｎｇ／ｍＬを上回るＡＦＰレベルを有する１３人のＨＣＣ患者を陽性として分類し、残りの９人のＨＣＣ患者および２２人の肝硬変患者についてのＬＡＭＢ－ＨＣＣおよびＬＡＭＢ－肝臓の幾何平均スコアを試験した。Ｒにおける「ｐＲＯＣ」パッケージにおいて、ＲＯＣ曲線を作成し、幾何平均スコアからＡＵＣを見出した。９５％ＡＵＣ信頼区間を、１０００回の反復ブートストラッピングで計算した。
Figure 2023510572000002
Figure 2023510572000003
Figure 2023510572000004
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Claims (46)

  1. 患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）を診断および治療する方法であって、
    ａ）前記患者から循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を取得することと、
    ｂ）前記ｃｆＤＮＡの１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、前記１つ以上の遺伝子が、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択され、対照ｃｆＤＮＡ試料における前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、前記患者由来の前記ｃｆＤＮＡ試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される前記１つ以上の遺伝子における前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加が、前記患者が前記ＨＣＣについて陽性診断を有することを示す、検出することと、
    ｃ）前記患者が前記ＣｐＧ部位での前記メチル化の頻度に基づいて前記ＨＣＣについて前記陽性診断を有する場合、前記ＨＣＣについて前記患者を治療することと、を含む、方法。
  2. 前記１つ以上のＣｐＧ部位が、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. メチル化を前記検出することが、前記ｃｆＤＮＡにおける前記ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８ ＣｐＧ部位でのメチル化の頻度を測定することを含む、請求項２に記載の方法。
  4. 前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の前記基準値範囲が、ＨＣＣを有しない１つ以上の対照対象由来の１つ以上の血液試料由来のｃｆＤＮＡから取得される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. １つ以上のアルゴリズムを使用して、前記ｃｆＤＮＡの前記ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７遺伝子における前記ＣｐＧ部位での前記メチル化頻度に基づいてＨＣＣリスクスコアを計算することをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記ＨＣＣについて前記患者を前記治療することが、ＨＣＣ腫瘍の外科的切除、ＨＣＣ腫瘍の高周波アブレーション（ＲＦＡ）、ＨＣＣ腫瘍の凍結アブレーション、エタノールもしくは酢酸でのＨＣＣ腫瘍の経皮的注射、経カテーテル動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）、選択的内部放射線療法（ＳＩＲＴ）、肝臓移植、高強度焦点超音波、外部ビーム療法、門脈塞栓術、放射性核種療法、化学療法、標的療法、免疫療法、または生物学的療法を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記標的療法が、ソラフェニブ、レゴラフェニブ、レンバチニブ、カボザンチニブ、ラムシルマブ、ニボルマブ、もしくはペムブロリズマブ、またはそれらの組み合わせを投与することを含む、請求項６に記載の方法。
  8. 前記化学療法が、シスプラチン、ゲムシタビン、オキサリプラチン、ドキソルビシン、５－フルオロウラシル、カペシタビン、もしくはミトキサントロン、またはそれらの組み合わせを投与することを含む、請求項６に記載の方法。
  9. 前記放射性核種療法が、イットリウム－９０、ロジン－１３１、レニウム－１８８、またはホルミウム－１６６を投与することを含む、請求項６に記載の方法。
  10. 前記ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位の前記メチル化を前記検出することが、メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、もしくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、またはメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析を実施することを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位の前記メチル化を前記検出することが、配列番号１～４３２からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つのプローブを使用することを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血液レベルを測定することをさらに含み、対照対象についてのＡＦＰの血液レベル、ならびにＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される前記１つ以上の遺伝子における前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される前記１つ以上の遺伝子における前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加と組み合わせて、ＡＦＰの血液レベルの増加の検出が、前記患者が、前記ＨＣＣについて陽性診断を有することを示す、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記ｃｆＤＮＡ試料が、ｃｆＤＮＡを含む血液試料または血漿試料である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記患者が、肝疾患を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記肝疾患が、肝硬変、脂肪肝疾患、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎、自己免疫性肝炎、薬剤性肝炎、ウイルス性肝炎、Ａ型肝炎ウイルス感染症、Ｂ型肝炎ウイルス感染症、Ｃ型肝炎ウイルス感染症、Ｄ型肝炎ウイルス感染症、Ｅ型肝炎ウイルス感染症、遺伝性ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、原発性胆汁性肝硬変、またはα－１－抗トリプシン欠乏症である、請求項１４に記載の方法。
  16. 患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）をモニタリングする方法であって、
    ａ）第１の時点での前記患者由来の第１の血液試料、およびそれより後の第２の時点での前記患者由来の第２の血液試料を取得することと、
    ｂ）前記第１の血液試料および前記第２の血液試料における循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、前記１つ以上の遺伝子が、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択され、前記第１の血液試料の前記ｃｆＤＮＡと比較して、前記第２の血液試料の前記ｃｆＤＮＡにおけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される前記１つ以上の遺伝子における前記ＣｐＧ部位のメチル化の頻度の増加の検出が、前記ＨＣＣが進行していることを示し、前記第１の血液試料の前記ｃｆＤＮＡと比較して、前記第２の血液試料の前記ｃｆＤＮＡにおけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される前記１つ以上の遺伝子における前記ＣｐＧ部位のメチル化の頻度の減少の検出が、前記ＨＣＣが進行していないことを示す、検出することと、を含む、方法。
  17. 前記ＨＣＣが、原発性腫瘍、転移、または再発である、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記第１の時点が、ＨＣＣについての前記患者の治療が開始される前であり、前記第２の時点が、前記治療中または治療後である、請求項１６または１７に記載の方法。
  19. 前記治療が、ＨＣＣ腫瘍の外科的切除、ＨＣＣ腫瘍の高周波アブレーション（ＲＦＡ）、ＨＣＣ腫瘍の凍結アブレーション、エタノールもしくは酢酸でのＨＣＣ腫瘍の経皮的注射、経カテーテル動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）、選択的内部放射線療法（ＳＩＲＴ）、肝臓移植、高強度焦点超音波、外部ビーム療法、門脈塞栓術、放射性核種療法、化学療法、標的療法、免疫療法、または生物学的療法である、請求項１７に記載の方法。
  20. ステップａ）およびｂ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記ＨＣＣが進行している場合に、ＨＣＣについての治療の投薬量もしくは頻度を増加させること、異なる治療に変更すること、または前記患者に対する緩和ケアを開始することをさらに含む、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記１つ以上のＣｐＧ部位が、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される、請求項１６～２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. メチル化を前記検出することが、前記ｃｆＤＮＡにおける前記ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８ ＣｐＧ部位でのメチル化の頻度を測定することを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. アルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血液レベルを測定することをさらに含み、前記第１の血液試料と比較して、前記第２の血液試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される前記１つ以上の遺伝子における前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加と組み合わせて、ＡＦＰの血液レベルの増加の検出が、前記ＨＣＣが進行していることを示し、前記第１の血液試料と比較して、前記第２の血液試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される前記１つ以上の遺伝子における前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の減少と組み合わせて、ＡＦＰの血液レベルの減少が、前記ＨＣＣが進行していないことを示す、請求項１６～２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位の前記メチル化を前記検出することが、メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、もしくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、またはメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析を実施することを含む、請求項１６～２５のいずれか一項に記載の方法。
  26. 患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）の再発についてモニタリングする方法であって、
    ａ）前記患者が、画像化または他の診断様式からがんを有しないと特徴づけられる第１の時点で、ＨＣＣの以前の発生についての治療後に、前記患者から第１の循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を取得することと、
    ｂ）前記第１のｃｆＤＮＡ試料由来のｃｆＤＮＡにおける１つ以上のバイオマーカー遺伝子のプロモーター領域における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、前記１つ以上のバイオマーカー遺伝子が、ＡＫ０５５９５７、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＭ２、ＲＵＮＸ３、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＰＩＮＴ２、およびＷＩＦ１から選択される、検出することと、
    ｃ）前記再発についてのモニタリング期間中の第２の時点で前記患者から第２のｃｆＤＮＡ試料を取得することと、
    ｄ）前記第２のｃｆＤＮＡ試料由来のｃｆＤＮＡにおける前記１つ以上のバイオマーカー遺伝子の前記プロモーター領域における前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、前記１つ以上のバイオマーカー遺伝子が、ＡＫ０５５９５７、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＭ２、ＲＵＮＸ３、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＰＩＮＴ２、およびＷＩＦ１から選択され、前記第１のｃｆＤＮＡ試料の前記ｃｆＤＮＡと比較して、前記第２のｃｆＤＮＡ試料の前記ｃｆＤＮＡにおけるＡＫ０５５９５７、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＭ２、ＲＵＮＸ３、ＳＥＰＴＩＮ９、ＳＰＩＮＴ２、およびＷＩＦ１から選択される前記１つ以上のバイオマーカー遺伝子の前記プロモーター領域における前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加が、前記ＨＣＣが再発したことを示す、検出することと、
    ｅ）その後、前記再発についてのモニタリング期間中に、ステップｃ）～ｅ）を繰り返すことと、を含む、方法。
  27. 前記患者が前記１つ以上のＣｐＧ部位のメチル化のレベルに基づいて前記ＨＣＣの前記再発について陽性診断を有する場合、前記ＨＣＣの前記再発について前記患者を治療することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
  28. ＨＣＣの前記再発について患者を前記治療することが、ＨＣＣ腫瘍の外科的切除、ＨＣＣ腫瘍の高周波アブレーション（ＲＦＡ）、ＨＣＣ腫瘍の凍結アブレーション、エタノールもしくは酢酸でのＨＣＣ腫瘍の経皮的注射、経カテーテル動脈化学塞栓術（ＴＡＣＥ）、選択的内部放射線療法（ＳＩＲＴ）、肝臓移植、高強度焦点超音波、外部ビーム療法、門脈塞栓術、放射性核種療法、化学療法、標的療法、免疫療法、または生物学的療法を含む、請求項２６または２７に記載の方法。
  29. 前記１つ以上のＣｐＧ部位が、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される、請求項２６～２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. メチル化を前記検出することが、前記ｃｆＤＮＡにおける前記ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８ ＣｐＧ部位でのメチル化の頻度を測定することを含む、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記患者のアルファ－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の血液レベルを測定することをさらに含み、ＡＦＰの血液レベル、ならびにＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される前記１つ以上の遺伝子における前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、前記患者由来の前記ｃｆＤＮＡにおけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される前記１つ以上の遺伝子における前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加と組み合わせて、ＡＦＰの血液レベルの増加が、前記患者が、前記ＨＣＣの再発について陽性診断を有することを示す、請求項２６～３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記ｃｆＤＮＡ試料が、ｃｆＤＮＡを含む血液試料または血漿試料である、請求項２６～３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位の前記メチル化を前記検出することが、メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、もしくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、またはメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析を実施することを含む、請求項２６～３２のいずれか一項に記載の方法。
  34. ｃｆＤＮＡにおけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化を検出するための薬剤を含む、キット。
  35. 前記ＣｐＧ部位が、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される１つ以上のＣｐＧ部位を含む、請求項３４に記載のキット。
  36. 前記ＣｐＧ部位が、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８を含む、請求項３５に記載のキット。
  37. メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、もしくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、またはメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析を実施するための薬剤をさらに含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載のキット。
  38. 前記薬剤が、バイサルファイト試薬、メチル化感受性制限酵素、ＣｐＧジヌクレオチドを含有するＤＮＡ領域を選択的に増幅するＰＣＲプライマー、メチル化特異的プライマー、メチル化特異的プローブ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載のキット。
  39. 前記薬剤が、配列番号１～４３２からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つのプローブを含む、請求項３４～３８のいずれか一項に記載のキット。
  40. ＡＦＰを測定するための試薬をさらに含む、請求項３４～３９のいずれか一項に記載のキット。
  41. 肝細胞がん（ＨＣＣ）の診断、ＨＣＣの再発の検出、またはＨＣＣの治療のモニタリングのために前記キットを使用するための説明書をさらに含む、請求項３４～４０のいずれか一項に記載のキット。
  42. 患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）を診断するインビトロ方法であって、
    ａ）前記患者から循環遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）試料を取得することと、
    ｂ）前記ｃｆＤＮＡの１つ以上の遺伝子における１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化を検出することであって、前記１つ以上の遺伝子が、ＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択され、対照ｃｆＤＮＡ試料の前記ｃｆＤＮＡにおける前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の基準値範囲と比較して、前記患者由来の前記ｃｆＤＮＡ試料におけるＳＰＩＮＴ２、ＲＵＮＸ３、ＰＲＤＭ２、ＡＰＣ、ＧＳＴＰ１、ＷＩＦ１、ＳＥＰＴ９、ＨＯＸＡ１、ＰＦＫＰ、およびＡＫ０５５９５７からなる群から選択される前記１つ以上の遺伝子における前記１つ以上のＣｐＧ部位でのメチル化の頻度の増加が、前記患者が前記ＨＣＣについて陽性診断を有することを示す、検出することと、を含む、方法。
  43. 前記ＣｐＧ部位が、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される、請求項４２に記載の方法。
  44. メチル化のレベルを前記測定することが、前記ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８ ＣｐＧ部位のメチル化のレベルを測定することを含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 前記ｃｆＤＮＡにおけるＣｐＧ部位の前記メチル化を前記検出することが、メチル化感受性任意プライミングポリメラーゼ連鎖反応（ＭＳ ＡＰ－ＰＣＲ）、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｓ－ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、メチル化感受性ＤＮＡ制限酵素分析、制限酵素ベースの配列決定、制限酵素ベースのマイクロアレイ分析、複合バイサルファイト制限分析（ＣＯＢＲＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）、メチル化ＣｐＧアイランド増幅およびマイクロアレイ（ＭＣＡＭ）、ライゲーション媒介ＰＣＲによるＨｐａＩＩ極小フラグメント濃縮（ＨＥＬＰ）、バイサルファイト配列決定、バイサルファイトマイクロアレイ分析、メチル化特異的パイロ配列決定、ＨＥＬＰ配列決定（ＨＥＬＰ－ｓｅｑ）、ＴＥＴ支援ピリジンボラン配列決定（ＴＡＰＳ）、Ｇｌａｌ加水分解およびライゲーションアダプター依存ＰＣＲ（ＧＬＡＤ－ＰＣＲ）、メチル化ＤＮＡ免疫沈降配列決定（ＭｅＤＩＰ－Ｓｅｑ）、もしくはメチル化ＤＮＡ免疫沈降マイクロアレイ分析（ＭｅＤＩＰチップ）、メチル感受性制限酵素でのサザンブロッティング、またはメチル化特異的巨大磁気抵抗センサーベースのマイクロアレイ分析を実施することを含む、請求項４２～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 患者における肝細胞がん（ＨＣＣ）の診断、ＨＣＣの再発の検出、またはＨＣＣの治療のモニタリングのためのバイオマーカーとして使用するための、ｃｇ１５６０７５３８、ｃｇ０８５７２７３４、ｃｇ００５７７９３５、ｃｇ０３６６７９６８、ｃｇ０８５７１８５９、ｃｇ０２６５９０８６、ｃｇ０４６７３５９０、ｃｇ０９４２０４３９、ｃｇ２６７４４３７５、ｃｇ０８４６５８６２、ｃｇ１４２５０１３０、ｃｇ００９２２３７６、ｃｇ０５３４６８４１、ｃｇ２６４２１３１０、ｃｇ１３６２９５６３、ｃｇ０６８４８１８５、ｃｇ１７３００５４４、ｃｇ２２５２２０６６、ｃｇ２４１６６８６４、およびｃｇ２６３９７１８８、ならびにそれらの２００ヌクレオチド内に位置するＣｐＧ部位から選択される、１つ以上のＣｐＧ部位でメチル化された、無細胞ＤＮＡ。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4256074A1 (en) * 2020-12-01 2023-10-11 Tensor Biosciences, Inc Methods for classification of liver disease
JP2024504603A (ja) * 2021-01-12 2024-02-01 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー がんの診断および予後予測において使用するためのメチル化バイオマーカーの層解析
AU2022318379A1 (en) * 2021-07-27 2024-02-08 The Chancellor, Masters And Scholars Of The University Of Oxford Compositions and methods related to tet-assisted pyridine borane sequencing for cell-free dna
CN115851921A (zh) * 2021-09-24 2023-03-28 圣湘生物科技股份有限公司 引物探针组合产品、试剂盒及其在鼻咽癌甲基化检测中的应用
WO2023066972A1 (en) * 2021-10-19 2023-04-27 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Dna methylation signature for diagnosing hepatocellular carcinoma
CN113862370B (zh) * 2021-12-02 2022-03-22 广州滴纳生物科技有限公司 用于筛查肝癌的引物和探针、试剂盒及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6709541B2 (ja) * 2014-10-17 2020-06-17 国立大学法人東北大学 大腸癌に対する薬物療法の感受性を予測する方法
EP4293128A3 (en) * 2016-09-02 2024-03-20 Mayo Foundation for Medical Education and Research Detecting hepatocellular carcinoma

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