CN116814780A - 基于基因甲基化，蛋白，和/或miRNA标记的早期肝癌诊断 - Google Patents
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Abstract
一种用于肝癌早筛的基因甲基化标记、蛋白标记、和/或miRNA联合标记检测方法以及相应的用于肝癌检测的试剂盒。其检测的甲基化基因包括选自CDKL2、USP44、ZNF783和F12的一个或多个基因，检测的miRNA包括选自hsa‑miR‑33B‑3p，hsa‑miR‑92B‑3p，hsa‑miR‑205‑5p，hsa‑miR‑374C‑5p，hsa‑miR‑4516‑3p，和hsa‑miR‑6803‑3p的一个或多个miRNA，检测的蛋白包括选自AFP、DCP、MCP‑1、和/或GDF‑15的一个或多个蛋白。检测的样本包括组织样本和血浆样本。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于基因甲基化标记、蛋白标记、和/或miRNA标记的肝癌检测方法，以及相应的用于肝癌检测的试剂盒，可用于肝癌的筛查。
相关申请的交叉引用
本申请要求2022年4月22日提交的中国专利申请号202210432017.9，2022年2月11日提交的中国专利申请号202210128906.6，2022年2月11日提交的中国专利申请号202210129809.9，2022年2月10日提交的中国专利申请号202210124651.6，2022年2月25日提交的中国专利申请号202210178482.4，2022年4月22日提交的中国专利申请号202210431016.2，以及2022年4月22日提交的中国专利申请号202210438932.9的优先权，各个专利申请的内容以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
肝癌在我国是发病率和死亡率均很高的癌症之一。国家癌症中心最新统计结果显示，2016年中国肝细胞癌(简称肝癌)发病数约38.9万，在所有癌种中排列第四位；而肝癌死亡数约33.6万，居我国恶性肿瘤死亡第二位。目前在国内，肝癌筛查的主要方法仍然是血清甲胎蛋白(AFP)联合超声影像检测。但AFP诊断早期肝癌的灵敏度只有45.3％～62％，具有约20％的假阳性率和约40％的假阴性率，故其性能并不够理想。腹部超声(US)影像对早期肝癌的诊断灵敏度较低(32％～63％)，也容易受到仪器性能、人为操作及医师主观判断的影响。对于肝癌患者而言，早期被发现的肝癌患者，其治疗和预后效果远优于进展期肝癌患者。我国肝癌患者的五年生存率较低，只有14.1％，其中的一个主要原因是我国肝癌的早期确诊率低，超过70％的患者在确诊时已经为中期或晚期，而晚期肝癌的治疗效果和预后均较差。因此，寻找新的肝癌标志物组合，并据此建立一套准确、便捷且经济的肝癌早期诊断方法便具有重要的价值和意义。
近年来，基于循环肿瘤细胞(CTC)、循环肿瘤DNA(ctDNA)、游离RNA(cfRNA)以及外泌体检测的液体活检技术逐渐应用于癌症辅助诊断和早筛。而国内外也有多家企业开发了基于多种类型靶标组合的癌症早筛早诊产品及服务。美国的Exact Sciences开发了一套包含3-5个DNA甲基化标志物与AFP、AFP-L3蛋白标志物的联合检测技术，用于肝癌早期诊断；该公司收购的Thrive企业曾联合DNA突变和蛋白检测方法，进行多种癌症的筛查；我国的泛生子则联合DNA突变、DNA甲基化和蛋白标志物进行肝癌检测。
DNA异常甲基化在肿瘤发生的早期就可出现，且伴随着肿瘤发展与转移而出现异常甲基化程度增加。DNA异常甲基化能引起基因表达量改变，从而通过影响细胞分裂、代谢及胞间连接来促进或抑制肿瘤发生及转移。因此，DNA甲基化检测可以用于肝癌的早期诊断。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一种单链的、长度较短的内源性非编码RNA，在转录后水平调控目的基因表达。miRNA广泛参与癌细胞增殖、代谢、分化侵袭及迁移，且与多种癌症发生发展及预后关系密切。另外，肝癌蛋白标志物也可被采用作为作为肝癌新标志物。综上，越来越多的研究报道发现了DNA甲基化、miRNA、或蛋白标志物能有效用于肿瘤的早筛早诊。而在此基础上，开发一种基于DNA甲基化、miRNA及蛋白标志物检测的方法和产品，将有望进一步提高肝癌早筛早诊的临床性能，并有效用于临床产业转化。
发明内容
具体地，本发明通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的技术问题。
本发明的一方面，提供了一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含选自基因核酸甲基化检测试剂、蛋白检测试剂、和/或miRNA检测试剂的一种或多种试剂。在一些实施例中，所述试剂盒包含基因核酸甲基化检测试剂、蛋白检测试剂、和miRNA检测试剂。
在一些实施例中，所述试剂盒包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含选自CDKL2、USP44、ZNF783和F12的一个，两个，三个，或全部四个基因。在一些实施例中，所述试剂盒包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含选自CDKL2、USP44、和ZNF783的一个或多个基因。在一些实施例中，所述试剂盒包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含选自CDKL2、USP44、和ZNF783的至少两个基因。在一些实施例中，所述试剂盒包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含CDKL2、USP44、和ZNF783三个基因。
在一些实施例中，所述试剂盒用B2M基因作为核酸甲基化的内参，并选取不含GpG位点的B2M片段作为目的序列。
在一些实施例中，所述CDKL2基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:1序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述CDKL2基因甲基化检测试剂包含选自SEQ ID NO:57-59的正向引物，选自SEQ ID NO:60-62的反向引物，和选自SEQ ID NO:63-65的探针。
在一些实施例中，所述USP44基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:2序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述USP44基因甲基化检测试剂包含选自SEQ ID NO:71-73的正向引物，选自SEQ ID NO:74-76的反向引物，和选自SEQ ID NO:77-79的探针。
在一些实施例中，所述ZNF783基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:3序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述ZNF783基因甲基化检测试剂包含选自SEQ ID NO:85-87的正向引物，选自SEQ ID NO:88-90的反向引物，和选自SEQ ID NO:91-93的探针。
在一些实施例中，所述F12基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述F12基因甲基化检测试剂包含选自SEQ ID NO:100-102的正向引物，选自SEQ ID NO:103-105的反向引物，和选自SEQ ID NO:106-108的探针。
在一些实施例中，在对甲基化标记基因进行检测之前，将所述核酸进行亚硫酸盐转化。
在一些实施例中，所述核酸为血浆游离核酸。在一些实施例中，所述血浆游离核酸为血浆游离DNA。在一些实施例中，所述试剂盒还包含针对血浆或血清的游离核酸提取试剂；优选地，所述血浆游离核酸提取试剂通过磁珠法提取并纯化血浆游离核酸。在一些实施例中，所述试剂盒的每个基因核酸甲基化的检测试剂包含至少一个正向引物，至少一个反向引物，和/或至少一个探针。
在一些实施例中，所述试剂盒包含蛋白检测试剂，所述蛋白包含选自甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(DCP)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和生长分化因子-15(GDF-15)的一个、两个，三个，或全部四个蛋白。在一些实施例中，所述蛋白包含AFP蛋白或DCP蛋白。在一些实施例中，所述蛋白包含AFP和DCP两个蛋白。在一些实施例中，所述蛋白检测试剂是用于选自ELISA、化学发光、免疫荧光、和流式芯片的一种或多种检测的检测试剂。在一些实施例中，所述蛋白为血浆或血清样本的蛋白。在一些实施例中，所述试剂盒包含针对血浆或血清样本的蛋白提取试剂。
在一些实施例中，所述试剂盒包含用于检测miRNA的检测试剂，所述miRNA包含选自hsa-miR-33B-3p，hsa-miR-92B-3p，hsa-miR-205-5p，hsa-miR-374C-5p，hsa-miR-4516-3p，和hsa-miR-6803-3p的一个、两个，三个，四个，五个，或全部六个miRNA。在一些实施例中，所述miRNA包含选自hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p、和hsa-miR-6803-3p的一个或多个miRNA。在一些实施例中，所述miRNA包含选自hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p、和hsa-miR-6803-3p的至少两个miRNA。在一些实施例中，所述miRNA包含hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p、和hsa-miR-6803-3p三个miRNA。在一些实施例中，所述试剂盒还包含检测内参miRNA的检测试剂，所述内参miRNA是hsa-miR-16-5p。在一些实施例中，所述试剂盒还包含检测外参miRNA的检测试剂，所述外参miRNA是Cel-miR-39-5p。在一些实施例中，所述miRNA检测试剂包含至少一个逆转录引物，至少一个扩增引物，和/或至少一个探针。
在一些实施例中，(i)所述检测hsa-miR-33B-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:115所示的逆转录引物、SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:118所示的探针；(ii)所述检测hsa-miR-92B-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:119所示的逆转录引物、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:122所示的探针；(iii)所述检测hsa-miR-205-5p的检测试剂包含SEQ ID NO:123所示的逆转录引物、SEQ IDNO:124和SEQ ID NO:125所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:126所示的探针；(iv)所述检测hsa-miR-374C-5p的检测试剂包含SEQ ID NO:127所示的逆转录引物、SEQ ID NO:128和SEQID NO:129所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:130所示的探针；(v)所述检测hsa-miR-4516-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:131所示的逆转录引物、SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:134所示的探针；和/或(vi)所述检测hsa-miR-6803-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:135所示的逆转录引物、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:138所示的探针。
在一些实施例中，所述miRNA为血浆或血清样本的miRNA。在一些实施例中，所述试剂盒还包括针对血浆或血清样本的miRNA提取试剂。
在一些实施例中，所述试剂盒包含针对表13中任一标志物组合的检测试剂。
在一些实施例中，所述试剂盒包含:(a)针对CDKL2、USP44和ZNF783基因核酸甲基化的检测试剂；(b)针对hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p和hsa-miR-6803-3p的检测试剂；以及(c)针对AFP和DCP蛋白的检测试剂。
在一些实施例中，所述试剂盒包含:(a)针对CDKL2、USP44和ZNF783基因核酸甲基化的检测试剂；(b)针对hsa-miR-92b-3p和hsa-miR-6803-3p的检测试剂；以及(c)针对AFP和DCP蛋白的检测试剂。
在一些实施例中，所述试剂盒包含:(a)针对CDKL2、USP44、ZNF783和F12基因核酸甲基化的检测试剂；(b)针对hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p和hsa-miR-6803-3p的检测试剂；以及(c)针对AFP和DCP蛋白的检测试剂。
在一些实施例中，所述肝癌包括早期肝癌。在一些实施例中，所述试剂盒是针对血浆或血清样本。在一些实施例中，所述试剂盒还包含针对血浆或血清样本处理的试剂。
本发明的一方面，提供了本发明所述的试剂盒在制备肝癌检测的产品的应用。
本发明的一方面，提供了一种检测肝癌的方法，其特征在于，所述方法包含以下三类标记检测的一种或多种：(i)基因核酸甲基化检测；(ii)蛋白检测；和/或(iii)miRNA检测。
本发明的一方面，提供了一种生物标记物检测产品在制备肝癌检测的产品的用途，其特征在于，所述产品包含以下三类标记检测的一种或多种：(i)基因核酸甲基化检测；(ii)蛋白检测；和/或(iii)miRNA检测。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途包含以下三类标记检测：(i)基因核酸甲基化检测；(ii)蛋白检测；和(iii)miRNA检测。
在一些实施例中，所述基因包含选自CDKL2、USP44、ZNF783和F12的一个，两个，三个，或全部四个基因。在一些实施例中，所述基因包含选自CDKL2、USP44、和ZNF783的一个或多个基因。在一些实施例中，所述基因包含选自CDKL2、USP44、和ZNF783的至少两个基因。在一些实施例中，所述基因包含CDKL2、USP44、和ZNF783三个基因。在一些实施例中，所述产品/方法/用途用B2M基因作为核酸甲基化的内参，并选取不含GpG位点的B2M片段作为目的序列。
在一些实施例中，所述CDKL2基因甲基化检测所检测的甲基化序列区段包含与SEQID NO:1序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述CDKL2基因甲基化检测的试剂包含选自SEQ ID NO:57-59的正向引物，选自SEQ ID NO:60-62的反向引物，和选自SEQ ID NO:63-65的探针。
在一些实施例中，所述USP44基因甲基化检测所检测的甲基化序列区段包含与SEQID NO:2序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述USP44基因甲基化检测的试剂包含选自SEQ ID NO:71-73的正向引物，选自SEQ ID NO:74-76的反向引物，和选自SEQ ID NO:77-79的探针。
在一些实施例中，所述ZNF783基因甲基化检测所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:3序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述ZNF783基因甲基化检测的试剂包含选自SEQ ID NO:85-87的正向引物，选自SEQ ID NO:88-90的反向引物，和选自SEQ ID NO:91-93的探针。
在一些实施例中，所述F12基因甲基化检测所检测的甲基化序列区段包含与SEQID NO:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。在一些实施例中，所述F12基因甲基化检测的试剂包含选自SEQ ID NO:100-102的正向引物，选自SEQ ID NO:103-105的反向引物，和选自SEQ ID NO:106-108的探针。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途在对甲基化标记基因进行检测之前，将所述核酸进行亚硫酸盐转化。在一些实施例中，所述核酸为血浆游离核酸。在一些实施例中，所述血浆游离核酸为血浆游离DNA。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途还包含针对血浆或血清的游离核酸提取步骤。在一些实施例中，所述血浆游离核酸提取步骤通过磁珠法提取并纯化血浆游离核酸。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途的每个基因核酸甲基化的检测使用至少一个正向引物，至少一个反向引物，和/或至少一个探针。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途的所述蛋白包含选自AFP、DCP、MCP-1、和/或GDF-15的一个、两个，三个，或全部四个蛋白。在一些实施例中，所述蛋白包含AFP蛋白或DCP蛋白。在一些实施例中，所述蛋白包含AFP和DCP两个蛋白。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途的蛋白检测是用于选自ELISA、化学发光、免疫荧光、和流式芯片的一种或多种检测方法。在一些实施例中，所述蛋白为血浆或血清样本的蛋白。在一些实施例中，所述产品/方法/用途包含针对血浆或血清样本的蛋白提取步骤。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途的所述miRNA包含选自hsa-miR-33B-3p，hsa-miR-92B-3p，hsa-miR-205-5p，hsa-miR-374C-5p，hsa-miR-4516-3p，和hsa-miR-6803-3p的一个、两个，三个，四个，五个，或全部六个miRNA。在一些实施例中，所述miRNA包含选自hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p、和hsa-miR-6803-3p的一个或多个miRNA。在一些实施例中，所述miRNA包含选自hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p、和hsa-miR-6803-3p的至少两个miRNA。在一些实施例中，所述miRNA包含hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p、和hsa-miR-6803-3p三个miRNA。在一些实施例中，所述产品/方法/用途还包含检测内参miRNA的检测，所述内参miRNA是hsa-miR-16-5p。在一些实施例中，所述产品/方法/用途还包含检测外参miRNA的检测，所述外参miRNA是Cel-miR-39-5p。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途的所述miRNA检测使用至少一个逆转录引物，至少一个扩增引物，和/或至少一个探针。在一些实施例中，(i)所述检测hsa-miR-33B-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:115所示的逆转录引物、SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:118所示的探针；(ii)所述检测hsa-miR-92B-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:119所示的逆转录引物、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:122所示的探针；(iii)所述检测hsa-miR-205-5p的检测试剂包含SEQID NO:123所示的逆转录引物、SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:125所示的扩增引物，和/或SEQID NO:126所示的探针；(iv)所述检测hsa-miR-374C-5p的检测试剂包含SEQ ID NO:127所示的逆转录引物、SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:130所示的探针；(v)所述检测hsa-miR-4516-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:131所示的逆转录引物、SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:134所示的探针；和/或(vi)所述检测hsa-miR-6803-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:135所示的逆转录引物、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:138所示的探针。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途的所述miRNA为血浆或血清样本的miRNA。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途还包括针对血浆或血清样本的miRNA提取的步骤。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途包含针对表13中任一标志物组合的检测。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途包含:(a)针对CDKL2、USP44和ZNF783基因核酸甲基化的检测；(b)针对hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p和hsa-miR-6803-3p的检测；以及(c)针对AFP和DCP蛋白的检测。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途包含:(a)针对CDKL2、USP44和ZNF783基因核酸甲基化的检测；(b)针对hsa-miR-92b-3p和hsa-miR-6803-3p的检测；以及(c)针对AFP和DCP蛋白的检测。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途包含:(a)针对CDKL2、USP44、ZNF783和F12基因核酸甲基化的检测；(b)针对hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p和hsa-miR-6803-3p的检测；以及(c)针对AFP和DCP蛋白的检测。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途检测的肝癌包括早期肝癌。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途是针对血浆或血清样本。
在一些实施例中，所述产品/方法/用途还包含针对血浆或血清样本的处理步骤。
附图说明
图1是利用血浆样本检测不同类型标志物的流程。
图2是实施例2中单一类型标志物与三种标志物联合检测所得的受试者工作曲线(ROC)图。
图3是实施例3中“CDKL2+USP44+ZNF783+miR92b+miR374c+miR6803+AFP+DCP”组合构建的诊断模型的ROC图。
图4是实施例4中组合A-组合E构建诊断模型的ROC图。
图5是实施例4中组合F-组合J构建诊断模型的ROC图。
图6为实施例5中CDKL2靶标基因的焦磷酸测序结果比较。
图7为实施例6中利用CDKL2三组引物探针检测60对肝癌/癌旁组织样本所得ROC曲线图。
图8为实施例6中三组CDKL2引物探针检测60对肝癌/癌旁组织样本所得ΔCt值统计图。
图9为实施例7中利用CDKL2三组引物探针检测400例临床血浆样本所得ROC曲线图。
图10为实施例8中USP44候选靶标基因的焦磷酸测序结果比较。
图11为实施例9中利用USP44三组引物探针检测60对肝癌/癌旁组织样本所得ROC曲线图。
图12为实施例9中三组USP44引物探针检测60对肝癌/癌旁组织样本所得ΔCt值统计图。
图13为实施例10中利用USP44三组引物探针检测400例临床血浆样本所得ROC曲线图。
图14为实施例11中ZNF783靶标序列对应的不同样本甲基化测序峰图。
图15为实施例12中利用本发明的ZNF783三组引物探针检测60对肝癌/癌旁组织样本所得ROC曲线图。
图16为实施例12中三组ZNF783引物探针检测60对肝癌/癌旁组织样本所得ΔCt值统计图。
图17为实施例13中本发明的三组ZNF783引物探针检测体系的灵敏度扩增曲线。
图18为实施例14中利用ZNF783三组引物探针检测200例临床血浆样本所得ROC曲线图。
图19为实施例15中F12靶标序列在HepG2、Huh-7、HT-29和HEH-2四种细胞DNA的甲基化测序峰图。
图20为实施例16中利用本发明的F12三组引物探针检测6种不同器官来源组织样本所得Ct值统计图。
图21为实施例17中本发明的三组F12引物探针检测体系的灵敏度扩增曲线。
图22为实施例18中利用F12三组引物探针检测400例临床血浆样本所得ROC曲线图。
图23为实施例19中单独分析AFP在早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图24为实施例19中单独分析AFP在中晚期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图25为实施例19中单独分析DCP在早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图26为实施例19中单独分析DCP在中晚期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图27为实施例19中单独分析MCP-1在早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图28为实施例19中单独分析MCP-1在中晚期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图29为实施例19中单独分析GDF-15在早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图30为实施例19中单独分析GDF-15在中晚期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图31为实施例19中利用AFP和DCP联合逻辑回归分析早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图32为实施例19中利用AFP和DCP联合逻辑回归分析中晚期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图33为实施例19中利用AFP、DCP和MCP1联合逻辑回归分析早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图34为实施例19中利用AFP、DCP和GDF15联合逻辑回归分析早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图35为实施例19中利用AFP、DCP、MCP1和GDF15联合逻辑回归分析早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC曲线图。
图36为6个miRNA靶标的ROC曲线分析。
发明详述
本发明提供了一种用于肝癌筛查和诊断的生物标志物组合，以及针对肝癌DNA甲基化、miRNA和/或蛋白标志物的检测试剂盒、以及相关的检测方法和应用。所述的生物标志物组合、检测试剂盒及检测方法具有优异的灵敏度和特异性。
在一些实施例中，所检测的核酸标记为DNA标记。在一些实施例中，所检测的核酸标记为RNA标记。
在一些实施例中，本发明采用的诊断标记(标志物)包含蛋白标记(蛋白标志物)，基因甲基化标记(基因甲基化标志物)、miRNA标记(miRNA标志物)的一种或多种。在一些实施例中，通过采集待测者的外周血样本，通过本发明的诊断方法或试剂，用于早期肝癌的筛查和辅助诊断。在一些实施例中，本发明的多种标记联合检测手段及对应的试剂盒，通过检测蛋白标记，基因甲基化标记、miRNA标记的一种或多种的表达水平，能达到肝癌筛查的目的。譬如，从肝癌高危人群(乙肝、肝硬化患者等)中进行肝癌筛查的目的。
在一些实施例中，本发明的优点包括，但不限于：
1)实现了基于血液的检测，具有无创性和非侵入性，无需进行手术和穿刺这类有创的组织活检。
2)本发明相较于常规的AFP血清学检测，具有更高的灵敏度和特异性，并且能检出AFP<20ng/ml的早期肝癌个体，进而实现“早诊早治”的目标。
3)相比起二代测序技术，实时荧光定量PCR检测周期更短，操作步骤更简便，经济成本更低。
在一些实施例中，本发明提供了一种用于肝癌检测的试剂盒。在一些实施例中，所述试剂盒包含选自miRNA检测试剂、核酸甲基化检测试剂、和/或蛋白检测试剂的一种或多种试剂。
在一些实施例中，所述核酸为血浆游离核酸。在一些实施例中，所述血浆游离核酸为血浆游离DNA(cfDNA)。在一些实施例中，所述血浆游离核酸为血浆游离RNA。
在一些实施例中，本发明提供了一种对有需要的个体治疗肝癌的方法，包含对所述个体提供药物、放疗、和/或手术治疗，其中，所述个体接受了以下a)-c)三类标记检测的一种或多种并被判断为肝癌阳性：
a)miRNA标记检测；
b)基因甲基化标记检测；
c)蛋白标记检测。
在一些实施例中，本发明提供了一种对有需要的个体治疗肝癌的方法，包含：
1)对所述个体进行以下a)-c)三类标记检测的一种或多种：
a)miRNA标记检测；
b)基因甲基化标记检测；
c)蛋白标记检测，
2)如检测结果显示肝癌阳性，提供肝癌治疗。在一些实施例中，所述肝癌治疗采用药物、放疗、手术、细胞疗法和/或溶瘤病毒治疗。
在一些实施例中，所述个体为人。在一些实施例中，所述方法包含提供治疗有效量的药物或放疗。相关的治疗方法包括并不限于以下文献中提到的方法：Liu et al.,ColdSpring Harb Perspect Med.2015Sep；5(9):a021535；Daher et al.,J Clin TranslHepatol.2018Mar 28；6(1):69–78。本申请通过引用并入这些文献的全部内容。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
在一些实施例中，本发明提供一种用于早期肝癌筛查和诊断的生物标志物组合，所述标志物组合包括以下4种基因中任意两种或两种以上基因组合的甲基化水平：CDKL2、USP44、F12、ZNF783。
在一些实施例中，所述标志物组合包括以下6种miRNA中任意两种或两种以上miRNA组合的表达水平：hsa-miR-33b-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374c-5p、hsa-miR-4516-3p、hsa-miR-6803-3p。
在一些实施例中，所述标志物组合包括以下4种蛋白中任意一种或一种以上蛋白的水平：AFP、DCP、MCP-1、GDF-15。
在一些实施例中，所述标志物是包括基因甲基化标记、蛋白标记、和miRNA标记的组合。
在一些实施例中，本发明提供一种肝癌检测试剂盒，所述试剂盒包括所述标志物的检测试剂。即核酸(例如DNA)甲基化标志物检测试剂和/或miRNA标志物检测试剂和/或蛋白标志物检测试剂。
在一些实施例中，所述试剂盒包含游离核酸提取试剂。在一些实施例中，所述游离核酸提取试剂通过磁珠法提取并纯化血浆游离核酸。
在一些实施例中，所述血浆游离核酸为血浆游离DNA。在一些实施例中，所述血浆游离核酸为血浆游离RNA。
在一些实施例中，用于基因甲基化标记检测的引物包括针对该基因的正向引物和反向引物。在一些实施例中，检测核酸标记的方式包括使用针对该标记的探针。在一些实施例中，探针5’端携带荧光基团，3’端携带淬灭基团。在一些实施例中，所述荧光基团可为FAM或VIC或CY5基团，对应的淬灭基团为BHQ1标记或BHQ2标记。
在一些实施例中，本发明所述的核酸扩增试剂可以包括：正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、核酸扩增酶、定量核酸扩增反应体系。在一些实施例中，所述核酸扩增酶可以为DNA扩增酶。在一些实施例中，所述定量核酸扩增反应体系可以包括定量缓冲液、dNTPs、纯水，及逆转录得到的cDNA。
在一些实施例中，所述DNA甲基化标志物检测试剂包括引物探针混合液、PCR Mix、Taq酶以及无核酸酶的水，还可包括DNA重亚硫酸盐转化试剂。
在一些实施例中，所述引物探针混合液中的甲基化检测引物和探针可包括(或可为)检测CDKL2甲基化的引物探针组合、检测USP44甲基化的引物探针组合、检测F12的引物探针组合、检测ZNF783甲基化的引物探针组合和/或检测内参B2M的引物探针组合。
在一些实施例中，所述甲基化检测引物终浓度为0.1-0.6μM，所述甲基化检测探针终浓度为0.05-0.4μM。
在一些实施例中，所述PCR Mix包含1-4mM的MgCl2、0.1-0.5mM的dNTP、10×TaqBuffer。
在一些实施例中，所述Taq酶应具有5’-3’外切酶活性和DNA聚合酶活性，其终浓度为1-3U/反应。
在一些实施例中，所述探针5’端均携带荧光基团，3’端均携带淬灭基团。所述荧光基团可为FAM、VIC或CY5基团，所述淬灭基团为BHQ1标记或BHQ2标记或MGB标记。
在一些实施例中，所述miRNA标志物检测试剂包括逆转录引物混合液、逆转录Mix、PCR引物探针混合液、PCR Mix以及无核酸酶的水。
在一些实施例中，特异性检测特定miRNA的检测试剂包含RNA逆转录引物、DNA扩增引物和/或DNA探针。在一些实施例中，检测试剂可包含RNA提取试剂、逆转录试剂、核酸扩增试剂、无RNA酶的纯水、阴性质控品、阳性质控品等。可选的，所述用于提取RNA的试剂为Trizol试剂、磁珠法抽提RNA所用的试剂、柱法抽提RNA所用的试剂。在一些实施例中，所述逆转录试剂包括：检测所述miRNA组合中的各miRNA的逆转录引物、逆转录酶、逆转录反应体系。在一些实施例中，所述逆转录酶可以为M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶。在一些实施例中，所述逆转录反应体系可以包括：逆转录缓冲液、dNTPs、无RNA酶的纯水，RNA酶抑制剂，及对照或提取出的RNA。
在一些实施例中，所述逆转录引物混合液中的逆转录引物可包括(或可为)hsa-miR-33b-3p的逆转录引物、hsa-miR-92b-3p的逆转录引物、hsa-miR-205-5p的逆转录引物、hsa-miR-374c-5p的逆转录引物、hsa-miR-4516-3p的逆转录引物、hsa-miR-6803-3p的逆转录引物、内参hsa-miR-16-5p的逆转录引物和/或外参Cel-miR-39-5p的逆转录引物。
在一些实施例中，所述逆转录Mix包含10×Reverse Transcription Buffer、0.3-2mM的dNTP、0.1-0.5U/反应的RNase抑制剂、20-100U/反应的RNA逆转录酶。所述逆转录酶可以为M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
在一些实施例中，所述cDNA PCR引物探针混合液中的检测引物探针可包括(或可为)检测hsa-miR-33b-3p逆转录产物的引物探针组合、检测hsa-miR-92b-3p逆转录产物的引物探针组合、检测hsa-miR-205-5p逆转录产物的引物探针组合、检测hsa-miR-374c-5p逆转录产物的引物探针组合、检测hsa-miR-4516-3p逆转录产物的引物探针组合、检测hsa-miR-6803-3p逆转录产物的引物探针组合、检测hsa-miR-16-5p逆转录产物的引物探针组合和/或Cel-miR-39-5p逆转录产物的引物探针组合。
在一些实施例中，所述用于检测miRNA标志物的PCR Mix可为包含DNA聚合酶的2×Taq Pro HS universal probe master mix或发明人配制的，含有DNA聚合酶、dNTP、PCR缓冲液的混合溶液。
在一些实施例中，为了避免扩增产生的误差，还可设置miRNA内参。在一些实施例中，以hsa-miR-16-5p作为内参。应理解，选择其它类似的基因作为内参也是可行的。在一些实施例中，为了避免扩增产生的误差，还可设置miRNA外参。在一些实施例中，以Cel-miR-39-5p作为外参。应理解，选择其它类似的基因作为外参也是可行的。
在一些实施例中，所述探针5’端均携带荧光基团，3’端均携带淬灭基团。所述荧光基团可为FAM、VIC或CY5基团，所述淬灭基团为BHQ1标记或BHQ2标记或MGB标记。
在一些实施例中，所述蛋白标志物检测试剂包括磁珠工作液、生物素抗体工作液和吖啶酯抗体工作液。
在一些实施例中，所述蛋白标志物检测试剂使用免疫法检测。在一些实施例中，所述免疫法包括酶联免疫法、化学发光免疫法、免疫比浊法、液相芯片分析法；作为优选的实施方式，所述免疫法包括化学发光免疫法和免疫比浊法；更优选地，所述免疫法包括化学发光免疫法。
在一些实施例中，本发明还提供了一种针对基因甲基化区域的检测方法。在一些实施例中，所述检测方法包括以下步骤：
(1)提取临床样本的DNA。样本若为组织，则使用组织DNA提取试剂盒进行基因组DNA提取；样本若为血浆，则使用血浆游离DNA(cfDNA)提取试剂盒进行cfDNA提取。
(2)使用DNA转化试剂盒对提取的组织DNA或血浆cfDNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，得到转化后的DNA。
(3)以完成步骤(2)的组织DNA或血浆cfDNA为模板，利用相应基因甲基化检测试剂或试剂盒对内参(例如B2M)和靶标基因进行荧光定量PCR检测，并获得内参和靶标对应的Ct值，若内参或靶标检测结果为Undetermined(无法确认)，则Ct值记为45。
(4)结果分析及判定：先判断检测结果是否有效，若内参B2M的Ct值≥35则结果无效，应重新检测；若内参B2M的Ct值≤35则结果有效，可进行下一步的阴阳性判断。之后计算靶标基因与内参基因(例如B2M)的ΔCt，ΔCt＝Ct靶标基因-Ct内参基因，并对样本的Ct值和ΔCt分别进行统计。若检测的生物标志物仅包含基因甲基化靶标，对于组织样本，如果ΔCt≤阈值，则结果为甲基化阳性，即已检测的组织为肝癌阳性样本；如果ΔCt>阈值，则结果为甲基化阴性，即已检测的组织DNA为肝癌阴性样本。对于血浆样本，如果Ct≤阈值，则结果为甲基化阳性，即已检测的血浆为肝癌阳性样本；如果Ct>阈值，则结果为甲基化阴性，即已检测的血浆为肝癌阴性样本。
在一些实施例中，本发明还提供一种肝癌检测方法。在一些实施例中，所述检测方法包括以下步骤：
(1)将用于检测的临床样本分为三份，分别用于检测DNA甲基化标志物、miRNA标志物和蛋白标志物。
(2)取第一份样本，利用商业试剂盒或自配试剂提取样本中的DNA；并使用DNA转化试剂盒对样本DNA进行重亚硫酸盐转化及纯化。
(3)对转化后的DNA进行甲基化标志物定量PCR检测，并获得内参和靶标基因对应的Ct值。
(4)取第二份样本，利用商业试剂盒或自配试剂提取样本中的RNA。
(5)将提取的RNA进行逆转录，获得内参、外参及靶标miRNA逆转录后的cDNA。
(6)以cDNA为模板，利用荧光定量PCR进行检测，并获得内参、外参及各靶标的Ct值。
(7)取第三份样本，利用免疫法检测蛋白标志物的水平。
(8)分析检测数据，得到逻辑回归分数，根据分数判断检测样本是否为肝癌阳性。
在一些实施例中，所述生物样品选自所述受试者的血液、血清、血浆、粪便、尿液、唾液、脑脊液和组织；作为优选的实施方式，所述的样本选自全血、血浆、血清和尿液；更优选地，所述样本选自血浆或血清。
在一些实施例中，所述DNA甲基化标志物包括CDKL2、USP44、F12和ZNF783中的两种或两种以上的组合。
在一些实施例中，所述外参miRNA和内参miRNA分别为Cel-miR-39-5p和hsa-miR-16-5p。
在一些实施例中，所述miRNA标志物包括hsa-miR-33b-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374c-5p、hsa-miR-4516-3p、hsa-miR-6803-3p中的两种或两种以上的组合。
在一些实施例中，所述蛋白标志物包括AFP、DCP、MCP-1、GDF-15中的一种或一种以上的组合。
在一些实施例中，所述逻辑回归分数综合了各项标志物数据经回归系数相乘后的得分，并由逻辑回归公式而得出。
在一些实施例中，逻辑回归公式为：P＝eK/(1+eK)；其中P为逻辑回归分数，e为自然常数，K为各项生物标志物数据乘以对应系数之和加上偏差参数所得。
在一些实施例中，所述样本的阴阳性判断法则为：如果逻辑回归分数大于或等于阈值，则样本为肝癌阳性；如果逻辑回归分数小于阈值，则样本为肝癌阴性。
在一些实施例中，所述肝癌包括早期肝癌。
在一些实施例中，肝癌分期采用巴塞罗那肝癌临床分期系统(Barcelona ClinicLiver Cancer(BCLC)，见下方表A)。在一些实施例中，所述早期肝癌包括巴塞罗那分期的A期。在一些实施例中，所述早期肝癌包括巴塞罗那分期的0期和A期。
表A：巴塞罗那肝癌临床分期
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在一些实施例中，肝癌分期采用中国肝癌的分期方案(China liver cancerstaging，CNLC)，包括：CNLC Ⅰa期、Ⅰb期、Ⅱa期、Ⅱb期、Ⅲa期、Ⅲb期、Ⅳ期，具体如下：
CNLC Ⅰa期：体力活动状态(performance status，PS)评分0～2分，肝功能Child-Pugh A/B级，单个肿瘤、直径≤5cm，无血管侵犯和肝外转移。
CNLC Ⅰb期：PS 0～2分，肝功能Child-Pugh A/B级，单个肿瘤、直径＞5cm，或2～3个肿瘤、最大直径≤3cm，无血管侵犯和肝外转移。
CNLC Ⅱa期：PS 0～2分，肝功能Child-Pugh A/B级，2～3个肿瘤、最大直径＞3cm，无血管侵犯和肝外转移。
CNLC Ⅱb期：PS 0～2分，肝功能Child-Pugh A/B级，肿瘤数目≥4个、肿瘤直径不论，无血管侵犯和肝外转移。
CNLC Ⅲa期：PS 0～2分，肝功能Child-Pugh A/B级，肿瘤情况不论、有血管侵犯而无肝外转移。
CNLC Ⅲb期：PS 0～2分，肝功能Child-Pugh A/B级，肿瘤情况不论、血管侵犯不论、有肝外转移。
CNLC Ⅳ期：PS 3～4，或肝功能Child-Pugh C级，肿瘤情况不论、血管侵犯不论、肝外转移不论。
在一些实施例中，所述早期肝癌包括中国肝癌分期(CNLC)的Ⅰa期。在一些实施例中，所述早期肝癌包括中国肝癌分期(CNLC)的Ⅰb期。在一些实施例中，所述早期肝癌包括中国肝癌分期(CNLC)的Ⅰa期和Ⅰb期。
在一些实施例中，用于肝癌诊断的标志物包括基因甲基化标记。
周期蛋白依赖性激酶样蛋白(CDKL2)位于人类基因组4号染色体上，是细胞分裂周期蛋白2(CDC2)相关的丝氨酸/苏氨酸激酶亚家族的成员之一，主要在细胞周期调控中起作用。近年研究表明，在多个癌种里面，CDKL2在肿瘤组织中的基因表达水平及蛋白水平均显著低于非肿瘤组织。Fang等利用过表达实验证明CDKL2过表达导致癌细胞增殖和侵袭受到抑制(Fang C-L,Uen Y-H,Chen H-K,et al.Loss of cyclin-dependent kinase-like2predicts poor prognosis in gastric cancer,and its overexpression suppressescells growth and invasion.Cancer Med.2018；00:1–10.)；Zhou等发现CDKL2在肝癌细胞系中的甲基化水平显著高于正常肝细胞，而其对应的mRNA表达水平则更低(Zhou Y.,QiuX.P.,Li Z.H.,Zhang S.,Rong Y.,Yang G.H.et al..(2019)Clinical significance ofaberrant cyclin-dependent kinase-like 2methylation in hepatocellularcarcinoma.Gene 683,35–40.)。
在一些实施例中，用于肝癌诊断标志物包括CDKL2目标序列甲基化程度。在一些实施例中，CDKL2基因的甲基化序列如下：
SEQ ID NO:1:CAmCGAGTCCAGGGmCGAAGCAGGCAGGGAGGCAGGTGGGCCTmCGGTCmCGCmCGCAAGCTCACACTTAGGAGGACCAmCGGGCmCGCATGCTGTmCGTmCGTCAAGGCAAmCGACCTCACTCTGTCCCCAACCATAGGCACAAAGTCTTGGGAGACAGATAmCGGCCCAGGTCAGAATGmCGTTCAmCGGCAGGCACCAACACCTGTGAAGGCCAAGGGCTAGAGAGCAATTAGCTGGGTGAGAGGCACCACCTCCCAGCTmCGTAAGGmCGCCCAGTACCTGGAGCCTGGGAACCTGCACmCGCTCCAACTACCCCTGGGmCGAAGGmCGTTGGCmCGmCGGAGCTGCAAGGGGGGGmCGGTTTCTCACCmCGCCCmCGAGAGmCGCCAGG
(mCG表示CpG岛的C可以发生或发生了甲基化修饰)。
在一些实施例中，CDKL2基因甲基化序列包含与SEQ ID NO:1序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
泛素特异性蛋白酶44(USP44)是去泛素化酶中USP家族成员之一，其基本功能是对靶蛋白去泛素化从而保护靶蛋白不被26S蛋白酶体泛素化降解。之前文献报道，USP44可通过去泛素化细胞周期蛋白复合体来调控细胞分裂，其启动子高甲基化和基因表达下降会导致癌细胞增殖和迁移。近年来，研究人员陆续发现USP44在多个癌种的肿瘤组织中的基因表达水平及蛋白水平均显著下调。而对于肝癌，Kang等通过蛋白质谱技术发现USP44蛋白在肝癌患者血清中的浓度远低于肝硬化人群(Kang X，Sun L，Guo K，et al.Serum proteinbiomarkers screening in HCC patients with liver cirrhosis by ICAT-LC-MS/MS.JCancer Res Clin Oncol，2010，136(8)：1151-1159)；Wang等发现USP44在肝细胞癌组织中的表达水平低于癌旁组织，且USP44组织低表达的肝癌患者出现明显的预后不良(Wang S,Lai J,Zhang L,et,al.Expression of USP44 in hepatocellular carcinoma and itscorrelation with the prognosis.J SUN Yat sen Univ(Med Sci)，2021，42(5)：746-755)。
在一些实施例中，用于肝癌诊断标志物包括USP44目标序列甲基化程度。在一些实施例中，USP44基因的甲基化序列如下：
SEQ ID NO:2:CAGGGmCGCTGGGGGGTCCTGAGAGAGGGAGAGCCTGGGGCTGmCGGGmCGmCGmCGGAAGGGAATGAGCmCGAGGGGmCGmCGmCGGmCGGmCGAmCGmCGTCmCGGmCGAATTTTGAATTGCCCCCCTGGGAAGTTTmCGGTGGGTTCTGmCGGmCGCTCmCGACCCTGTCCmCGGmCGGCAGCCTCAGAGTGCCmCGGAGATGCTGmCGGCAAGGmCGCAGmCGGGCTGGAGGGGGmCGAGCTGGGGGAGAAmCGGGmCGmCGGGmCGAGGGCTTmCGGGGACTGGAAGGGGCTTmCGmCGCTGATCCmCGGCAmCGAGmCGTmCGTGGAGAGGTGGGmCGmCGGGGCTGGCAmCGGGCTGGGmCGCTGTGTGGAGCAmCGCAAmCGCCmCGGGTCCAGCmCGCATCCCTCCACCCTCCmCGGATTACmCGmCGAGGTGATGCTmCGAAGCCCmCGGGGCACTTmCGGGAGGGmCGGTTGTGGCACTmCGGTTGAGGAGGAATGmCGCTTCCmCGGmCGTCTTGCCmCGCCTTCTCTCCATmCGATmCGGTCCCmCGmCGCTGCmCGGCACCTGCTGCmCG
(mCG表示CpG岛的C可以发生或发生了甲基化修饰)。
在一些实施例中，USP44基因甲基化序列包含与SEQ ID NO:2序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
在一些实施例中，用于肝癌诊断标志物包括锌指蛋白783(ZNF783)基因目标序列甲基化程度。在一些实施例中，ZNF783基因的甲基化序列如下：
SEQ ID NO:3:CAGmCGmCGGCAGCTGTGCAGAGACTCAAmCGGGTTGmCGACmCGGGTGGACCCmCGCCCACATCCmCGAAGCCAGATCCCCATTGGCmCGGTGGTGGAAGCTCmCGCCCCCCACTTGGCTGGmCGCCTCmCGACCCAGTGCCAGCTTTTCATTGGCCAACCmCGGGAGGCCCmCGCCCCCACAGmCGTGmCGCmCGGGCCTTTGTGCAmCGCCmCGACAGGTGmCGAGmCGCCmCGCCCmCGGGCTGGTGCCCAACAGCCmCGCAGGTGTmCGCCAGCTGCCACmCGCCCmCGCAmCGGCCACTCACCTCCCAGAGAGCAGAAACCAGATCAAGmCGCAmCGCACTmCG
(mCG表示CpG岛的C可以发生或发生了甲基化修饰)。
在一些实施例中，ZNF783基因甲基化序列包含与SEQ ID NO:3序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
在一些实施例中，用于肝癌诊断标志物包括F12(凝血因子XII,Coagulationfactor XII)基因目标序列甲基化程度。在一些实施例中，F12基因的甲基化序列如下：
SEQ ID NO:4:GTTGTGCCTACCCTmCGAACTGGTGGCCCCAGCmCGGCCACCTGGCAGAGmCGTGGTCTmCGGAGGGTmCGmCGmCGGmCGCmCGCTTGGCAGGCACACmCGGCTGAAmCGTAAGGmCGACAGGAGmCGmCGCAGCTGCmCGTCmCGCATCCTCCTGAAGGmCGCAACAGAGCTAACCmCGGGmCGGAGAGGAGmCGTGAGGmCGGGGAmCGCmCGGGGCCCCAAGCTCTCTTCCmCGTCCCmCGmCGGGGmCGCCCCCAmCGCACCCAGGTmCGTGCTGGTAGCTGAmCGGGmCGAGAAGGCCTmCGTG
(mCG表示CpG岛的C可以发生或发生了甲基化修饰)。
在一些实施例中，F12基因甲基化序列包含与SEQ ID NO:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化CDKL2的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化CDKL2的单位浓度/含量比正常样本中的甲基化CDKL2高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化CDKL2的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化CDKL2的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本中的甲基化CDKL2高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化USP44的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化USP44的单位浓度/含量比正常样本中的甲基化USP44高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化USP44的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化USP44的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本中的甲基化USP44高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化ZNF783的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化ZNF783的单位浓度/含量比正常样本中的甲基化ZNF783高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化ZNF783的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化ZNF783的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本中的甲基化ZNF783高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化F12的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化F12的单位浓度/含量比正常样本中的甲基化F12高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化F12的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲基化F12的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本中的甲基化F12高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，用于肝癌诊断的标志物包括miRNA标记。
在一些实施例中，本发明提供了一种包含miRNA检测的产品/方法，以及miRNA特征标记在制备肝癌筛查及诊断试剂或试剂盒中的应用。在一些实施例中，其产品包含用于检测miRNA含量的引物、探针、检测试剂及试剂盒。在一些实施例中，通过从血浆样本中提取并检测一个或多个miRNA的表达水平，能够判断待检个体是否患有肝癌。本方法安全、无创，且具有较高的灵敏度和特异性，能够有效地用于肝癌早期诊断。
在一些实施例中，本发明的用于检测肝癌的试剂盒中包括选自：
特异性检测人hsa-miR-33B-3p的检测试剂；
特异性检测人hsa-miR-92B-3p的检测试剂；
特异性检测人hsa-miR-205-5p的检测试剂；
特异性检测人hsa-miR-374C-5p的检测试剂；
特异性检测人hsa-miR-4516-3p的检测试剂；和
特异性检测人hsa-miR-6803-3p的检测试剂；
的一个或多个检测试剂。在一些实施例中，所选试剂盒包括选自上述miRNA检测试剂的2，3，4，5，或6个检测试剂。在一些实施例中，所选试剂盒包括选自上述的全部6个miRNA检测试剂。
在一些实施例中，hsa-miR-4516-3p的序列为GGGAGAAGGGUCGGGGC(SEQ ID NO:109)。在一些实施例中，hsa-miR-374c-5p的序列为AUAAUACAACCUGCUAAGUGCU(SEQ ID NO:110)。在一些实施例中，hsa-miR-92b-3p的序列为UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC(SEQ ID NO:111)。在一些实施例中，hsa-miR-205-5p的序列为UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG(SEQ ID NO:112)。在一些实施例中，hsa-miR-6803-3p的序列为UCCCUCGCCUUCUCACCCUCAG(SEQ ID NO:113)。在一些实施例中，hsa-miR-33b-3p的序列为CAGUGCCUCGGCAGUGCAGCCC(SEQ ID NO:114)。
在一些实施例中，所述的试剂盒中，所述的检测试剂是RNA逆转录引物、DNA扩增引物和DNA探针。
在一些实施例中，所述的试剂盒中，特异性检测人hsa-miR-33B-3p的检测试剂是SEQ ID NO:115所示的逆转录引物、SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117所示的扩增引物，SEQID NO:118所示的探针；
在一些实施例中，所述的试剂盒中，特异性检测人hsa-miR-92B-3p的检测试剂是SEQ ID NO:119所示的逆转录引物、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121所示的扩增引物，SEQID NO:122所示的探针；
在一些实施例中，所述的试剂盒中，特异性检测人hsa-miR-205-5p的检测试剂是SEQ ID NO:123所示的逆转录引物、SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:125所示的扩增引物，SEQID NO:126所示的探针；
在一些实施例中，所述的试剂盒中，特异性检测人hsa-miR-374C-5p的检测试剂是SEQ ID NO:127所示的逆转录引物、SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129所示的扩增引物，SEQID NO:130所示的探针；
在一些实施例中，所述的试剂盒中，特异性检测人hsa-miR-4516-3p的检测试剂是SEQ ID NO:131所示的逆转录引物、SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133所示的扩增引物，SEQID NO:134所示的探针；
在一些实施例中，所述的试剂盒中，特异性检测人hsa-miR-6803-3p的检测试剂是SEQ ID NO:135所示的逆转录引物、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137所示的扩增引物，SEQID NO:138所示的探针；
在一些实施例中，所述的试剂盒中还包括：
特异性检测内参基因和外参基因的检测试剂；较佳地，所述的特异性检测内参基因的检测试剂是针对人hsa-miR-16-5p的逆转录引物、扩增引物和探针；更佳地，所述的特异性检测内参基因的检测试剂是SEQ ID NO:139所示的逆转录引物、SEQ ID NO:140和SEQID NO:141所示的扩增引物，SEQ ID NO:142所示的探针。所述的特异性检测外参基因的检测试剂是针对人Cel-miR-39-5p的逆转录引物、扩增引物和探针；更佳地，所述的特异性检测外参基因的检测试剂是SEQ ID NO:143所示的逆转录引物、SEQ ID NO:144和SEQ ID NO:145所示的扩增引物，SEQ ID NO:146所示的探针。
在一些实施例中，针对每一miRNA或内参的探针连接有特定的荧光基团。
在一些实施例中，该试剂盒中还包括：阴性质控品和/或阳性质控品。
在一些实施例中，该试剂盒中还包括：RNA提取试剂，逆转录反应试剂，PCR扩增试剂和/或使用说明书。
在本发明的另一方面，提供针对选自hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p的一个或多个miRNA进行检测的用途，可用于检测肝癌或制备检测肝癌的试剂或试剂盒。在一些实施例中，所述用途包括对选自上述miRNA的2，3，4，5，或6个miRNA进行检测。在一些实施例中，所述用途包括对上述全部6个miRNA进行检测。
在一些实施例中，所述的检测试剂是RNA逆转录引物、DNA扩增引物和DNA探针。
在一些实施例中，所述的“miRNA组合”是指由hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p中的一种或多种(例如全部六种)组成的一组miRNAs，该组合可应用于检测肝癌，特别是早期肝癌。
本发明人收集了其中发生肝癌的患者确诊半年至一年半以前的血浆，通过筛选出与未发生肝癌者相比差异表达的miRNAs谱，得到了能够预测病毒性肝炎患者高风险人群发生肝癌的可能性的特异性miRNAs分子标记。
基于本发明人的上述新发现，提供了特异性检测所述的hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p的检测试剂的用途，用于制备检测肝癌，特别是早期肝癌的试剂盒。
可采用各种本领域已知的技术来检测所述的hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p的存在或表达情况，这些技术均包含在本发明中。例如可用已有的技术如聚合酶链式反应技术(PCR)，Southern印迹法，原位杂交法，DNA序列分析等，这些方法也可结合使用。
本发明还提供了用于在分析物中检测所述的hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p的存在表达情况的试剂。作为一种优选方式，可以采用其特异性扩增引物或特异性探针，通过RCR法来确定所述miRNA的量。针对miRNA的特异性引物和探针的设计是本领域人员熟知的技术。
在一些实施例中，本发明的优选方式包含检测血浆或血清中的hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p。
在一些实施例中，用于检测肝癌的试剂盒包含选自以下的一种或多种检测试剂：特异性检测人hsa-miR-33B-3p的检测试剂；特异性检测人hsa-miR-92B-3p的检测试剂；特异性检测人hsa-miR-205-5p的检测试剂；特异性检测人hsa-miR-374C-5p的检测试剂；特异性检测人hsa-miR-4516-3p的检测试剂和特异性检测人hsa-miR-6803-3p的检测试剂。作为一种优选方式，所述的检测试剂是RNA逆转录引物、DNA扩增引物和DNA探针。
所述的试剂盒中还可包含RNA提取试剂、逆转录试剂、核酸扩增试剂、无RNA酶的纯水、阴性质控品、阳性质控品等。
可选的，所述用于提取RNA的试剂为Trizol试剂、磁珠法抽提RNA所用的试剂、柱法抽提RNA所用的试剂。
本发明所述的试剂盒中逆转录试剂包括：检测所述miRNA组合中的各miRNA的逆转录引物、逆转录酶、逆转录反应体系。
所述逆转录酶可以为M-MLV逆转录酶或AMV逆转录酶。
所述逆转录反应体系可以包括：逆转录缓冲液、dNTPs、无RNA酶的纯水，RNA酶抑制剂，及对照或提取出的RNA。
本发明所述的核酸扩增试剂可以包括：正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、核酸扩增酶、定量核酸扩增反应体系。
所述核酸扩增酶可以为DNA扩增酶；
所述定量核酸扩增反应体系可以包括定量缓冲液、dNTPs、纯水，及逆转录得到的cDNA。
本发明所述的阴性质控品可以为正常人血浆、无肝癌的慢性乙肝患者血浆、牛血清白蛋白溶液或生理盐水溶液；阳性质控品可以为经过测定为阳性的早期肝癌患者血浆，或为特定拷贝数的hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p寡核苷酸。
为了避免扩增产生的误差，还可设置内参。在本发明的实施例中，以hsa-miR-16-5p作为内参。应理解，选择其它类似的基因作为内参也是可行的。
为了避免扩增产生的误差，还可设置外参。在本发明的实施例中，以Cel-miR-39-5p作为外参。应理解，选择其它类似的基因作为外参也是可行的。
在一些实施例中，本发明还进一步提供了肝脏肿瘤极早期诊断相关血浆小分子核酸的检测方法，包括以下步骤：
(1)血浆标本中RNA的提取：
取待测病人血浆、阴性对照血浆、阳性对照血浆、合成的外参基因Cel-39-5p的mimic，按照所选用的RNA抽提试剂盒的标准操作方法，或使用的核酸抽提试剂盒的说明书，抽提血浆标本中的RNA；
(2)用上述试剂盒进行检测：
对内参、外参和所述miRNA组合同时进行定量测定。将提取的RNA加入至预混合的含有逆转录引物、逆转录酶、逆转录反应体系的反应管中，进行逆转录；然后使用cDNA加入至含有正向引物、反向引物、寡核苷酸探针、核酸扩增酶、定量核算扩增反应体系的定量核酸扩增反应管中，进行扩增，使用荧光定量PCR检测仪进行检测。
(3)通过logistic regression模型联合分析循环系统中多个特定的小分子核酸，用以判断肝癌发生的可行性：P＝eK/(1+eK)。
上式中，P为综合指数，其范围为0<P<1；e为自然常数；K＝(0.15501)+(0.01785)hsa-miR-33B-3p+(-0.02857)hsa-miR-92B-3p+(-0.01955)miR-205-5p+(0.03704)miR-374C-5p+(0.04277)miR-4516-3+(0.04277)miR-6803-3p。其中，hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p的表达水平是以miR-16-5p为内参和Cel-miR-39-5p为外参检测得到。根据临床样本检测数据(P值)的分布确定判定阈值，P≥所述阈值时检测结果判定为阳性，P<所述阈值时检测结果判定为阴性。
本发明首次提出通过检测患者血浆中(特别是循环系统中)特异性miRNAs分子标记的拷贝数，并利用诊断模型对病毒性肝炎患者发生肝癌的风险进行判定，在诊断肝细胞癌，尤其是在无症状高风险个体的群体中鉴定早期肝癌具有85％以上的准确性。
在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-205-5p的单位浓度/含量比正常样本低。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-205-5p的单位浓度/含量比正常样本低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-205-5p的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本低。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-205-5p的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-374C-5p的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-374C-5p的单位浓度/含量比正常样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-374C-5p的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-374C-5p的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-33B-3p的单位浓度/含量比正常样本低。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-33B-3p的单位浓度/含量比正常样本低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-33B-3p的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本低。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-33B-3p的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-92B-3p的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-92B-3p的单位浓度/含量比正常样本中高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-92B-3p的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-92B-3p的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本中高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-4516-3p的单位浓度/含量比正常样本低。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-4516-3p的单位浓度/含量比正常样本低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-4516-3p的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本低。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-4516-3p的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-6803-3p的单位浓度/含量比正常样本低。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-6803-3p的单位浓度/含量比正常样本低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-6803-3p的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本低。在一些实施例中，肝癌样本中的hsa-miR-6803-3p的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本低至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，用于肝癌诊断的标志物包括蛋白标志物。
在一些实施例中，所述蛋白标志物包含选自甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(DCP)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和生长分化因子-15(GDF-15)的一个、两个，三个，或全部四个蛋白。在一些实施例中，所述蛋白标志物包含AFP和DCP蛋白。在一些实施例中，所述蛋白标志物包含AFP和MCP-1蛋白。在一些实施例中，所述蛋白标志物包含AFP和GDF-15蛋白。在一些实施例中，所述蛋白标志物包含DCP和MCP-1蛋白。在一些实施例中，所述蛋白标志物包含DCP和GDF-15蛋白。在一些实施例中，所述蛋白标志物包含MCP-1和GDF-15蛋白。在一些实施例中，所述蛋白标志物包含AFP，DCP和MCP-1。在一些实施例中，所述蛋白标志物包含AFP，DCP和GDF-15。在一些实施例中，所述蛋白标志物包含AFP，MCP-1和GDF-15。在一些实施例中，所述蛋白标志物包含DCP，MCP-1和GDF-15。在一些实施例中，所述蛋白标志物包含AFP，DCP，MCP-1，和GDF-15四种蛋白。
甲胎蛋白(AFP；Uniprot ID:P02771；NCBI Gene ID:174)是原发性肝癌和卵黄巢肿瘤特异性较强的肿瘤标志物，比目前常用的B超、同位素扫描和血液生化检测等方法敏感，是人类发现的第一个真正有临床价值的脏器肿瘤标志物。由于AFP在肝癌早期已有变化，其诊断阳性率为60-70％，准确率高达90％以上。血清AFP≥400μg/L，排除妊娠、慢性或活动性肝病、生殖腺胚胎源性肿瘤以及消化道肿瘤后，高度提示肝癌。因此，AFP的检测对肝癌的人群普查、临床诊断、疗效检测和预后判断具有重要的价值。但AFP在小肝癌中的敏感度仅为40％左右。
在一些实施例中，肝癌样本中的甲胎蛋白(AFP)的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲胎蛋白(AFP)的单位浓度/含量比正常样本中的甲胎蛋白(AFP)高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的甲胎蛋白(AFP)的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的甲胎蛋白(AFP)的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本中的甲胎蛋白(AFP)高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
异常凝血酶原(DCP；Uniprot ID:P00734；NCBI Gene ID:2147；SEQ ID NO:148)由肝细胞产生，一般情况下，凝血酶原是由在肝细胞中的γ-谷氨酰羧化酶依赖维生素K的条件下合成的。目前市面上不同厂家试剂检测结果存在一定差异，这主要与DCP的自身特点有关。DCP分子有很多种存在形式，主要区别在于包含的Glu数目和未被羧化的Glu的位置的差异，不同患者体内同时存在多种DCP的存在形式，这可能是不同来源试剂盒检测存在差异性的主要原因。近年来有研究发现血清DCP水平在慢性肝病中与肝功能严重程度相关，血清DCP的阳性率与肝功能严重程度分级显著相关，且肝功能越差，血清DCP水平越高，是诊断肝细胞癌的特异性肿瘤标志物。
在一些实施例中，肝癌样本中的异常凝血酶原(DCP)的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的异常凝血酶原(DCP)的单位浓度/含量比正常样本中的异常凝血酶原(DCP)高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的异常凝血酶原(DCP)的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的异常凝血酶原(DCP)的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本中的异常凝血酶原(DCP)高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
MCP-1又被称为CCL2(C-C motif chemokine ligand2，CCL2；Uniprot ID:P13500；NCBI Gene ID:6347；SEQ ID NO:149)，是第一个被发现的人CC趋化因子，位于17号染色体，由76个氨基酸残基组成，大小为13kDa。MCP-1对慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病、肝纤维化和肝硬化自发性细菌性腹膜炎等的发生、发展及预后有重要影响。MCP-1是肿瘤血管形成和代谢的关键介质。趋化因子及其受体在的炎症反应和再生中发挥主要作用。MCP-1作为炎症介质可调节炎症细胞的聚集，从而改变HCC发展的环境。此外，先天和适应性免疫细胞可能影响宿主应对癌症的反应。同时，肿瘤细胞可表达一种趋化因子受体，其生物学特点可能直接受同源配体的影响。肝癌患者中显著升高的血清MCP-1和催乳素可作为与甲胎蛋白互补的生物标志物，为肝癌提供更有效的早期检测。
在一些实施例中，肝癌样本中的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的单位浓度/含量比正常样本中的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本中的单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
生长分化因子-15(growth differentiation factor-15，GDF-15；Uniprot ID:Q99988；NCBI Gene ID:9518；SEQ ID NO:150)是一种应激反应蛋白，也称巨噬细胞抑制因子-1(macrophage inhibitory cytokine-1，MIC-1)，是转化生长因子-β超家族成员的一个远支，对GDF-15的早期研究已发现：GDF-15是编码高水平肿瘤相关蛋白的基因之一，GDF-15浓度在多种癌症患者的血清中显著升高。GDF-15在结直肠癌患者血清及肿瘤组织中明显升高，它通过与TGF-β受体结合，激活Smad2和Smad3通路，增强上皮-间质转化，从而促进结直肠癌细胞的转移。临床资料显示GDF-15在肝癌组织中过表达，并且与肝癌的病理分级呈正相关，GDF-15通过激活AKT/GSK-3β/β连环素信号通路促进肝癌细胞的生长与转移。
在一些实施例中，肝癌样本中的生长分化因子-15(GDF-15)的单位浓度/含量比正常样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的生长分化因子-15(GDF-15)的单位浓度/含量比正常样本中的生长分化因子-15(GDF-15)高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，肝癌样本中的生长分化因子-15(GDF-15)的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本高。在一些实施例中，肝癌样本中的生长分化因子-15(GDF-15)的单位浓度/含量比无肝癌但有慢性乙肝病毒感染的样本中的生长分化因子-15(GDF-15)高至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少50％，至少70％，至少100％，至少150％，至少200％，至少300％，至少400％，至少500％，至少600％，至少700％，至少800％，至少900％，或至少1000％。
在一些实施例中，本发明所述的阴性质控品可以为正常人血浆、无肝癌的慢性乙肝患者血浆、牛血清白蛋白溶液或生理盐水溶液。在一些实施例中，阳性质控品可以为经过测定为阳性的早期肝癌患者血浆，或为特定拷贝数相应甲基化基因片段/miRNA寡核苷酸，和/或特定含量的相应蛋白。
在一些实施例中，本发明通过检测血浆中三种生物标志物，即cfDNA中的靶标基因甲基化水平、cfRNA中miRNA组合的表达水平和蛋白标志物水平，进行肝癌检测，并从三个维度评估样本的阴阳性，比一种或两种标志物检测具有更高的灵敏度和特异性。在一些实施例中，本发明对应的检测方法无创，仅需要抽取个体5-10ml外周血样本即可完成标志物检测，避免了组织活检带来的痛苦及肝癌扩散风险。实时定量PCR和化学发光免疫检测相比于二代测序，其步骤更简单，检测周期更短，仅需一天即可完成三种标志物检测。因此本发明具有重要的应用价值。
在一些实施例中，治疗肝癌的方法包含手术治疗。在一些实施例中，治疗肝癌的方法包含经皮热消融方法，如射频消融(RFA)或微波消融(MWA)。在一些实施例中，治疗肝癌的方法包含经皮热消融方法、经动脉栓塞(TAE)、经动脉化疗栓塞(TACE)、高强度聚焦超声(HIFU)、微波消融(MWA)、不可逆电穿孔(IRE)、和/或局部酒精注射治疗(PEIT)。在一些实施例中，治疗肝癌的方法包含肝移植。
在一些实施例中，治疗肝癌的方法包含放射性疗法。在一些实施例中，治疗肝癌的方法包含选择性内部放射治疗(SIRT)。
在一些实施例中，治疗肝癌的方法包含药物疗法。在一些实施例中，所述药物包含Sorafenib。在一些实施例中，所述药物包含蛋白激酶抑制剂。在一些实施例中，所述药物为免疫疗法药物。在一些实施例中，所述免疫疗法药物为免疫检测点抑制剂，如PD-1抑制剂，PD-L1抑制剂，或CTLA4抑制剂。在一些实施例中，治疗肝癌的方法包含化疗。在一些实施例中，化疗药物包含doxorubicin，5-fluorouracil，或cisplatin。
在一些实施例中，治疗肝癌的方法包含溶瘤病毒疗法。在一些实施例中，治疗肝癌的方法包含细胞疗法。在一些实施例中，所述细胞疗法疗法包含嵌合抗原受体修饰T细胞(CAR-T)疗法或嵌合抗原受体修饰NK细胞(CAR-NK)疗法。
具体实施例
以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。给出的实施例仅为了阐明本发明，不代表对本发明保护范围的限制，其他人根据本发明理念所作出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。除非另有说明，本申请中使用的技术术语具有本发明所属领域技术人员通常理解的含义。
本发明实施例中的实验方法，如无特殊说明，均按照本领域内文献中描述的方法或仪器、试剂对应的产品说明书进行。本发明实施例中所用的试剂、耗材及仪器，如无特殊说明，均通过常规商业途径购得。本发明实施例的序列信息中，如无特殊说明，各核苷酸序列的首位均为相应DNA/RNA的5’末端核苷酸，末位均为相应DNA/RNA的3’末端核苷酸。
其中，实施例1-4主要描述了DNA甲基化、miRNA及蛋白作为联合靶标对肝癌的诊断性能，而实施例5-24中主要描述了在多维度靶标组合之前，对于各个甲基化位点、miRNA、和蛋白标记作为单一类型靶标的性能验证。
实施例1-肝癌标志物检测方法的建立
一、肝癌DNA甲基化、miRNA及蛋白联合诊断试剂盒的制备
本发明的发明人结合多种数据库信息挖掘、文献调研结果以及组织、血浆DNA/RNA测序数据，获得用于肝癌检测的DNA甲基化、miRNA和蛋白标志物组合。该标志物组合包括：CDKL2、USP44、F12、ZNF783这四个基因的任意两种或两种以上基因的甲基化程度，和/或hsa-miR-33b-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374c-5p、hsa-miR-4516-3p、hsa-miR-6803-3p这六个miRNA的任意两种或两种以上miRNA的表达水平，和/或AFP、DCP、MCP-1、GDF-15这四个蛋白的任意一种或一种以上蛋白的水平。
发明人针对CDKL2、USP44、F12和ZNF783基因的差异甲基化位点，设计并筛选出用于检测甲基化靶点的引物探针组合和内参B2M引物探针组合(见表1)。其中，FAM表示FAM荧光基团标记，CY5表示CY5荧光基团标记，BHQ1/BHQ2表示BHQ淬灭基团标记。
发明人也针对hsa-miR-33b-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374c-5p、hsa-miR-4516-3p、hsa-miR-6803-3p以及内参hsa-miR-16-5p和外参Cel-miR-39-5p的序列特征，设计并筛选出用于合成cDNA第一链的miRNA逆转录引物，和用于定量PCR的引物探针组合(见表1)。其中，FAM表示FAM荧光基团标记，MGB表示MGB淬灭基团标记。
发明人还针对AFP、DCP、MCP-1、GDF-15四个蛋白标志物进行了结合抗体的筛选和性能验证。
表1
检测甲基化标记和miRNA标记的引物探针组合
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本发明所述的肝癌生物标志物检测试剂盒包含试剂盒A、试剂盒B和试剂盒C三个试剂盒。其组分和主要成分如表2-表4所示，对应的样本检测技术路线如图1所示。
表2 试剂盒A的组分和主要成分
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表3
试剂盒B的组分和主要成分
表4
试剂盒C的组分和主要成分
| 编号 | 试剂名称 | 主要成分 |
| 1 | 磁珠工作液 | 链霉亲和素磁珠 |
| 2 | 生物素抗体工作液 | 生物素标志物蛋白单抗 |
| 3 | 吖啶酯抗体工作液 | 吖啶酯标志物蛋白单抗 |
| 4 | 校准品 | 特定浓度待检抗原 |
| 5 | 质控品 | 特定浓度待检抗原 |
其中，试剂盒A用于检测基因甲基化标志物，试剂盒B用于检测miRNA标志物，试剂盒C用于检测蛋白标志物。
二、DNA甲基化标志物检测的方法
(1)使用天根的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(货号DP710)提取血浆cfDNA。
(2)使用ZYMO RESEARCH的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，货号D5005)对提取的cfDNA以及阴阳性质控品DNA进行重亚硫酸盐转化及纯化，得到转化后的DNA。
(3)以转化后的cfDNA及质控品DNA为模板，进行荧光定量PCR反应。如表5配制PCR反应体系。
表5
cfDNA甲基化定量PCR反应体系
| 序号 | 组分 | 反应体积(μl) |
| 1 | PCR Mix | 8 |
| 2 | 引物探针混合液 | 5 |
| 3 | Taq酶 | 0.2 |
| 4 | 转化后DNA模板 | 5 |
| 5 | NF-H2O | 11.8 |
| 总共 | 30 |
其中，引物探针混合液指4个甲基化靶标基因(CDKL2、USP44、F12、ZNF783)中的其中一个基因与内参基因B2M对应的上游引物、下游引物和探针的混合液。
荧光定量PCR扩增反应条件如表6所示。每个反应均为内参与靶标的二重PCR反应。
表6
PCR反应过程
(4)数据处理：以Applied Biosystems 7500为例。自动设置基线，手动设置阈值线，根据实际的荧光曲线，FAM通道(靶标)的阈值线设为50000，VIC通道(靶标)的阈值线设为30000，CY5通道(内参)的阈值线设为20000，得到内参基因和靶标基因的Ct值。若扩增曲线不起峰或结果为Undetermined，则Ct值记为45。
三、miRNA标志物检测方法
(1)取待测个体的血浆以及合成的外参基因Cel-39-5p mimic，使用Norgen的血浆/血清循环RNA提取试剂盒(货号51000)提取血浆RNA。
(2)以提取的血浆RNA以及阴阳性对照为模板，进行RNA逆转录。逆转录反应体系如表7所示，反应条件如表8所示。
表7
miRNA逆转录反应体系
| 序号 | 组分 | 反应体积(μl) |
| 1 | 逆转录引物混合液 | 3 |
| 2 | 逆转录Mix | 7 |
| 3 | RNA模板 | 5 |
| 4 | NF-H2O | 5 |
| 总共 | 20 |
表8
miRNA逆转录反应程序
| 步骤 | 温度 | 时间 |
| Step 1 | 16℃ | 30min |
| Step 2 | 42℃ | 30min |
| Step 3 | 85℃ | 5min |
(3)以逆转录得到的cDNA为模板，在独立的反应孔中分别对内参、外参及靶标miRNA进行荧光定量PCR检测。如表9配制cDNA检测反应体系。
表9
cDNA荧光定量PCR反应体系
| 序号 | 组分 | 反应体积(μl) |
| 1 | PCR Mix | 10 |
| 2 | cDNA PCR引物探针混合液 | 2 |
| 3 | cDNA | 3 |
| 4 | NF-H2O | 5 |
| 总共 | 20 |
荧光定量PCR扩增反应条件如表10所示。每个反应均为内参或外参或靶标的单重PCR反应。
表10
cDNA定量PCR反应过程
(4)数据处理：以Applied Biosystems 7500为例。自动设置基线和阈值线，得到内参基因、外参基因和靶标基因的Ct值，并将独立反应孔中的各靶标Ct值与内参hsa-miR-16-5p、外参Cel-miR-39-5p的Ct值相减，得到ΔCt。若扩增曲线不起峰或结果为Undetermined，则Ct值记为45。
四、蛋白检测标志物方法
(1)使用全自动化学发光免疫平台，通过校准以及质控检测，合格后进行样本检测。
(2)加入样本、生物素抗体工作液、磁珠工作液和吖啶酯抗体工作液，按照预先设置的仪器程序进行样本检测，每个样本检测的时间不大于30min。
(3)数据处理：检测结束后，仪器软件会通过校准曲线对样本进行浓度返回，如AFP、MCP-1、GDF-15返回浓度为ng/mL、DCP返回浓度为mAU/mL。
五、利用逻辑回归算法建立诊断模型
检测数据的统计分析采用了R软件和MedCalc 20.0.4软件。逻辑回归模型的建立通过以下方式进行：构建训练集，训练集包含一定数量的肝癌患者和非肝癌人群。获得训练集中所有个体的DNA甲基化、miRNA及蛋白标志物检测数据及临床诊断结果用于建模。DNA甲基化标志物的数据输入形式为Ct值，miRNA标志物的数据输入形式为ΔCt值，蛋白标志物的数据输入形式为单个靶标测定结果的对数(底数为2)，临床诊断结果的输入形式为0或1(肝癌记为1，非肝癌记为0)。将上述数据导入R软件中，然后利用R进行回归系数优化，并获得每个标志物在公式中对应的系数及一个偏差参数，使该逻辑回归模型训练检测数据具有最大的似然值。最终算出的综合指数(逻辑回归分数)综合了各项标志物数据经回归系数相乘后的得分，并由逻辑回归公式而得出。逻辑回归分数的范围在0到1之间。
发明人获得训练集中所有个体的逻辑回归分数，并利用MedCalc 20.0.4制作受试者工作特征(ROC)曲线，并获得阈值(cutoff值)，即ROC曲线上约登指数(灵敏度+特异性-1)最大的值。当待测样本的逻辑回归分数大于或等于阈值时，判定该样本为肝癌阳性样本；当待测样本的逻辑回归分数小于阈值时，判定该样本为肝癌阴性样本。不同的标志物组合可训练出不同的逻辑回归模型，并可通过曲线下面积(AUC)、约登指数等进行模型性能对比以及各靶标重要性评估。
实施例2-单一类型标志物组合与多种类型标志物组合联检性能比较
此实施例的主要目的是分别评估DNA甲基化标志物组合、miRNA标志物组合、蛋白标志物组合以及上述三种类型标志物组合联合用于肝癌诊断的性能。所研究样本共170例，其中包括58例健康人样本、30例乙肝样本、27例肝硬化样本和65例肝癌样本，样本类型均为血浆。肝癌患者的入选标准为：经临床确诊为原发肝细胞癌，无既往恶性肿瘤史，入组前未接受手术、药物等抗肿瘤治疗。乙肝和肝硬化患者均经临床确诊。健康人均为未诉异常的体检个体样本。
所检测DNA甲基化标志物包括：CDKL2、USP44、F12和ZNF783。
所检测miRNA标志物包括：hsa-miR-33b-3p、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374c-5p、hsa-miR-4516-3p、hsa-miR-6803-3p。
所检测蛋白标志物包括：AFP、DCP、MCP-1、GDF-15。
检测步骤包括：
(1)将用于检测的临床血浆样本分为三份；
(2)利用天根的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒提取第一份血浆样本cfDNA，并按照实施例1中DNA甲基化标志物检测的方法，进行cfDNA转化、qPCR检测和数据分析。
(3)在第二份血浆样本中掺入一定量合成的外参基因Cel-39-5p mimic，并利用Norgen的血浆/血清循环RNA提取试剂盒提取血浆总RNA，之后按照实施例1中miRNA标志物检测的方法，进行逆转录、qPCR检测和数据分析。
(4)按照实施例1中蛋白标志物检测方法，利用全自动化学发光免疫平台检测第三份血浆样本的蛋白标志物。
(5)对检测数据进行分析：对于DNA甲基化标志物和miRNA标志物，首先整理Ct值，若扩增曲线不起峰或结果为Undetermined，则Ct值记为45；之后计算miRNA标志物的ΔCt值；对于蛋白标志物，获得检测数据后计算其对数值(以2为底)。
发明人完成170例血浆样本的标志物检测后，针对DNA甲基化标志物组合(4个标志物)、miRNA标志物组合(6个标志物)、蛋白标志物组合(4个标志物)以及结合上述三种标志物的联检组合(14个标志物)，分别构建逻辑回归诊断模型。再利用软件绘制ROC曲线，进而确定各联合诊断模型的cutoff值，并评估AUC值、灵敏度、特异性及约登指数。不同类型标志物组合对应的联合诊断模型的性能分析结果如表11和图2所示。
表11
不同类型标志物组合联检的ROC曲线分析结果
| 标志物组合 | AUC值 | 灵敏度 | 特异性 | 约登指数 |
| 4-甲基化Panel | 0.91 | 78.5％ | 96.2％ | 0.747 |
| 6-miRNA Panel | 0.901 | 89.2％ | 84.8％ | 0.74 |
| 4-蛋白Panel | 0.915 | 80％ | 90.5％ | 0.705 |
| 14-Marker Panel | 0.977 | 89.2％ | 99.1％ | 0.883 |
通过上述模型分析结果可知，与单一类型的标志物组合相比，三种标志物组合联合诊断模型具有更高的AUC值和约登指数，说明将DNA甲基化、miRNA和蛋白标志物组合，能够提升诊断模型的性能。
实施例3-使用本发明的8个标志物建立肝癌诊断模型
本实施例的样本选择同实施例2。
所检测的DNA甲基化标志物包括：CDKL2、USP44、ZNF783；所检测miRNA标志物包括：hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p、hsa-miR-6803-3p；所检测蛋白标志物包括：AFP和DCP。
发明人按照实施例1中的不同类型标志物检测方法，检测不同个体血浆样本中CDKL2、USP44和ZNF783基因的甲基化，hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p、hsa-miR-6803-3p的表达水平，以及AFP、DCP的浓度。之后将各DNA甲基化标志物的Ct值、各miRNA标志物的ΔCt值、各蛋白标志物检测值的对数以及样本对应个体临床诊断结果(转换为0或1)汇总，并构建逻辑回归诊断模型。各样本的检测结果如表12所示。
表12
170例样本的肝癌诊断结果
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/>
利用软件绘制ROC曲线，计算AUC值，并对cutoff值、灵敏度及特异性进行评估，结果如图3所示。当Cutoff值为0.333时，AUC值为0.977，灵敏度和特异性分别为92.3％和95.2％，约登指数为0.875。本实施例中的8标志物联合诊断模型性能，仅略低于实施例2中14标志物构建的诊断模型。
实施例4-利用不同标志物组合建立肝癌诊断模型
为验证实施例3中的8标志物组合是否足够用于肝癌诊断试剂盒开发，发明人利用包含DNA甲基化、miRNA和蛋白的不同标志物组合进行诊断模型建立及性能分析。具体而言，发明人将实施例2中170例样本的14个标志物检测结果汇总并整理，随后选取2-4个DNA甲基化标志物、2-6个miRNA标志物、1-4个蛋白标志物进行组合，并将标志物组合对应的检测数据建立逻辑回归模型，绘制ROC曲线并进行AUC值等性能分析。结果如表13和图4、图5所示。
表13
不同标志物组合对应的逻辑回归模型性能比较
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结果表明，组合A(与实施例2的组合一致)建立的肝癌诊断模型，具有较优的AUC值和约登指数。与组合A(8标志物组合)相比，组合B-E(减少1个标志物)的AUC值或约登指数明显下降，而组合F-J(增加1-3个标志物)的AUC值和约登指数未出现明显上升。说明包含CDKL2、USP44、ZNF783、hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p、hsa-miR-6803-3p、AFP、DCP上述8个标志物的肝癌联合检测产品在确保性能不受影响的前提下，具有最高的性价比。另外，在上述10个标志物组合中，组合F具有最高的灵敏度，而组合C具有最高的特异性，因此在实际使用场景下，可根据临床需求和具体的检测条件，选择最适合的组合进行诊断及分析。
本发明提供的DNA甲基化、miRNA、蛋白三种生物标志物组合，以及对应的检测试剂盒和检测方法，相较于单一类型标志物检测具有更高的AUC值和检测灵敏度，对肝癌和非肝癌样本有更准确的区分效果。
实施例5：检测CDKL2靶标基因及序列的选择
本发明的发明人结合TCGA、GEO数据库中肝癌患者的450K甲基化芯片数据分析结果，和前期研究中肝癌临床样本850K甲基化芯片数据分析结果，对比肝癌组织与癌旁组织的基因组DNA甲基化水平差异，并挑选出差异较大的CDKL2作为候选的肝癌检测靶标基因。由于甲基化芯片主要检测某一段包含若干CpG岛的序列在样本中的平均甲基化水平，为确定适合设计检测引物探针的甲基化位点，发明人采用焦磷酸测序方法对上述靶标基因的目标CpG位点逐一进行甲基化水平样本验证。
根据甲基化芯片分析结果，设计候选区域的扩增及测序引物，各基因对应的引物如下：
CDKL2扩增引物及测序引物包括：
CDKL2正向引物：SEQ ID NO:52
CDKL2反向引物：SEQ ID NO:53
CDKL2测序引物：SEQ ID NO:54
样本信息：
60对(120例)经手术后病理确定的肝组织临床样本，其中肝癌组织60例，配对的癌旁组织60例。
实验过程：
(1)收集确诊为肝癌的患者肝脏手术切除标本(包括肝癌组织和癌旁组织)，利用手术刀从每份标本切下绿豆粒大小的组织用于后续的DNA提取和检测。采用天根的TIANampGenomic DNA Kit(货号DP304)提取组织样本基因组DNA。
(2)将提取的基因组DNA溶液用Nanodrop分光光度计检测浓度，确保每份样本浓度不低于25ng/μl。
(3)采用ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(货号D5005)对提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份样本用于转化的量在0.5-1μg之间。
(4)将TaKaRa EpiTaqTM HS(货号R110)和引物等PCR试剂从-20℃取出，室温解冻。根据表14配制PCR反应体系，轻轻吹打混匀。
表14
配液体系
(5)向每个PCR管中加入23μl混好的PCR反应液，然后加入2μl亚硫酸氢盐处理后的DNA，混匀后按照表15的反应程序进行扩增。
表15
PCR反应过程
(4)取20μl PCR产物，用PyroMark Q96实时定量焦磷酸序列分析仪进行测序分析。
结果分析：
焦磷酸测序结束后，从PyroMark Q96焦磷酸序列分析仪中导出所有测序反应对应的测序峰图和CpG位点甲基化水平(％)统计数据，分别计算单个测定的CpG位点在肝癌组织、癌旁组织甲基化水平的平均值以及二者的差值。60对组织样本的后续甲基化区域焦磷酸测序分析结果如表16所示。
表16
CDKL2焦磷酸测序结果
将CDKL2靶标基因对应的各CpG位点对应的平均甲基化水平进行统计分析，结果如图6所示。焦磷酸测序结果显示，CDKL2在已测的7个CpG位点的差异甲基化水平均值超过30％，且上述位点在肝癌组织与配对癌旁组织的甲基化水平均具有显著性差异(p<0.01)。另外，已测的7个CpG位点在癌旁组织的甲基化水平均小于10％。由此推断，CDKL2差异甲基化区域可有效区分肝癌组织与癌旁组织样本，且对于非肝癌样本具有较高的检测特异性，故可作为DNA甲基化标志物用于肝癌的筛查与诊断。
实施例6：CDKL2在组织DNA中的检测
在选择甲基化检测位点时，有两点因素需要考虑。一是许多基因的启动子中，不同区域的甲基化水平可能不一致，实施例5中焦磷酸测序验证的CDKL2序列只涵盖其基因启动子的一部分；二是根据不同区域设计的甲基化引物探针序列，其分析性能和检测效能不相同，有的区域甚至很难设计出检测性能符合要求的引物探针。所以本发明实验过程中重新选定CDKL2目的甲基化区域，并设计了3对引物探针组合进行后续荧光定量PCR验证。表17列出了本发明实验过程中选用的CDKL2基因目的区域。
表17
CDKL2基因目的区域的序列
所述CDKL2正向引物(CDKL2-F)包括：
SEQ ID NO:57CDKL2-F1：GAAGTAGGTAGGGAGGTAGGTGG
SEQ ID NO:58CDKL2-F2：ATATTTAGGAGGATTACGGGTCG
SEQ ID NO:59CDKL2-F3：GTATCGTTTTAATTATTTTTGGGCGA
所述CDKL2反向引物(CDKL2-R)包括：
SEQ ID NO:60CDKL2-R1：ACGACCCGTAATCCTCCTAAATA
SEQ ID NO:61CDKL2-R2：CCCAAAACTTTATACCTATAATTAAA
SEQ ID NO:62CDKL2-R3：CTCGAAACGAATAAAAAACCGC
所述CDKL2探针(CDKL2-P)包括：
SEQ ID NO:63CDKL2-P1：FAM-AAACTTACGACGAACCGAAACCCA-BHQ1
SEQ ID NO:64CDKL2-P2：FAM-ATCGTTACCTTAACGACGACAACA-BHQ1
SEQ ID NO:65CDKL2-P3：FAM-ACTCCGCGACCAACGCCTTC-BHQ1
引物探针组合1：正向引物序列：SEQ ID NO:57；反向引物序列：SEQ ID NO:60；探针序列：SEQ ID NO:63。
引物探针组合2：正向引物序列：SEQ ID NO:58；反向引物序列：SEQ ID NO:61；探针序列：SEQ ID NO:64。
引物探针组合3：正向引物序列：SEQ ID NO:59；反向引物序列：SEQ ID NO:62；探针序列：SEQ ID NO:65。
另外，对于内部质控，用B2M基因作为内参，并针对该基因对应的亚硫酸氢盐转化后序列设计内控引物探针。内控引物探针可用的标准为：阳性对照品、阴性对照品和样本DNA检测结果出现明显的扩增曲线，而非模板体系检测结果不起线。
B2M内参基因的检测引物和探针分别为：
SEQ ID NO:17B2M-F：GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA
SEQ ID NO:18B2M-R：TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT
SEQ ID NO:19B2M-P：5‘CY5-TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACC-3’BHQ2
样本信息：
60对(120例)经手术后病理确定的肝组织临床样本，其中肝癌组织60例，配对的癌旁组织60例。
实验过程：
(1)收集确诊为肝癌的患者肝脏手术切除标本(包括肝癌组织和癌旁组织)，采用天根的TIANamp Genomic DNA Kit(货号DP304)提取组织样本基因组DNA。
(2)将提取的基因组DNA溶液用Nanodrop分光光度计检测浓度，并用1x TE溶液稀释至10ng/μl。
(3)取20μl稀释后的gDNA溶液，采用ZYMO RESEARCH的DNA转化试剂盒(EZ DNAMethylation-GoldTM Kit，货号D5005)对提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份转化的DNA用20μl洗脱液洗脱。
(4)利用荧光定量PCR检测转化后组织DNA中CDKL2甲基化水平。配制PCR检测反应体系，反应体系成分及含量如表18所示。
表18
组织DNA甲基化定量PCR配液体系
| 序号 | 组分 | 体积/反应 | 终浓度 |
| 1 | 10x PCR Buffer | 2μl | 1x |
| 2 | 50mM MgCl2 | 1μl | 2.5mM |
| 3 | dNTP Mix(10mM) | 0.4μl | 0.2mM |
| 4 | B2M正向引物(10μM) | 0.6μl | 0.3μM |
| 5 | B2M反向引物(10μM) | 0.6μl | 0.3μM |
| 6 | B2M探针(10μM) | 0.2μl | 0.1μM |
| 7 | CDKL2正向引物(10μM) | 0.6μl | 0.3μM |
| 8 | CDKL2反向引物(10μM) | 0.6μl | 0.3μM |
| 9 | CDKL2探针(10μM) | 0.3μl | 0.15μM |
| 10 | 50x ROX | 0.1μl | 0.25x |
| 11 | Taq酶(5U/μl) | 0.2μl | 1U/reaction |
| 12 | 超纯水 | 11.4μl | / |
| 13 | 亚硫酸氢盐处理后的DNA | 2μl | / |
| 总共 | 20μl | / |
荧光定量PCR扩增反应条件如表19所示。
表19
PCR反应过程
(5)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，FAM通道的阈值线设为0.04，CY5通道的阈值线设为0.02，得到内参基因和靶基因的Ct值，并计算ΔCt值(CtCDKL2-CtB2M)。
结果判定：
首先进行样本PCR结果有效性判定，若样本内参B2M对应的CY5通道有明显的扩增曲线且Ct值小于35，则结果有效，可用于阴阳性判断及靶标检测性能分析；若内参B2M对应的CY5通道无扩增曲线有扩增曲线且Ct值大于35，则结果无效，应进行样本重检测。本次检测的120例组织样本，其内参B2M对应的CY5通道均有明显的扩增曲线，且Ct值均小于35，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
利用ROC曲线对3组CDKL2引物探针组合的120例组织样本检测结果进行分析，其中ΔCt值为检验变量，病理结果为状态变量，计算出的约登指数(灵敏度+特异性-1)最大值对应的ΔCt即为Cutoff值。若样本ΔCt≤Cutoff值则结果为甲基化阳性；反之，若样本ΔCt>Cutoff值则结果为甲基化阴性。各样本的CDKL2甲基化标记检测结果(ΔCt)如表20所示：
表20 组织样本检测结果
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/>
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三组CDKL2甲基化检测引物探针区分肝癌与癌旁组织的性能(AUC值、灵敏度、特异性、Cutoff值)分析如表21和图7所示：
表21 组织样本检测性能对比
| 性能 | 引物探针组合1 | 引物探针组合2 | 引物探针组合3 |
| AUC值 | 0.912 | 0.838 | 0.865 |
| Cutoff值(ΔCt) | 4.49 | 5.24 | 4.18 |
| 灵敏度 | 85.0％ | 71.7％ | 78.3％ |
| 特异性 | 100％ | 100％ | 100％ |
| 约登指数 | 0.850 | 0.717 | 0.783 |
60对肝癌患者组织样本的检测结果显示，在特异性100％的情况下，CDKL2甲基化标记的检测灵敏度可达85％。从散点图(图8)看，CDKL2甲基化标记在肝癌组织与癌旁组织的甲基化水平分布具有显著差异。上述结果均证明CDKL2作为甲基化标记可有效用于肝癌临床诊断。
实施例7：CDKL2在血浆cfDNA中的检测
血浆中含有少量的游离DNA(cfDNA)，这些cfDNA来源于机体中不同组织，它们通过细胞凋亡、细胞坏死或细胞外分泌作用释放到血液中。对于健康人，肝组织来源的DNA是血浆游离DNA的重要来源之一，占比约1～2％，这是由于肝具有丰富的血液循环和细胞新陈代谢。早期肝癌细胞中，一些基因的CpG富集区域出现高甲基化，这些高甲基化区域往往与细胞癌变相关联，而部分包含高甲基化区域的循环肿瘤DNA(ctDNA)会释放到血液中。因此通过血浆分离、cfDNA提取、转化和PCR扩增，可检测出肝癌甲基化DNA标记物，进而实现肝癌早筛早诊。
为了验证血浆cfDNA中CDKL2甲基化标记能用于早期肝癌检测，本发明人通过下列实验评估CDKL2甲基化标记在肝癌与非肝癌临床样本中的检测效果。
各基因检测引物探针如下：
CDKL2正向引物包括：
SEQ ID NO:57CDKL2-F1：GAAGTAGGTAGGGAGGTAGGTGG
SEQ ID NO:58CDKL2-F2：ATATTTAGGAGGATTACGGGTCG
SEQ ID NO:59CDKL2-F3：GTATCGTTTTAATTATTTTTGGGCGA
CDKL2反向引物包括：
SEQ ID NO:60CDKL2-R1：ACGACCCGTAATCCTCCTAAATA
SEQ ID NO:61CDKL2-R2：CCCAAAACTTTATACCTATAATTAAA
SEQ ID NO:62CDKL2-R3：CTCGAAACGAATAAAAAACCGC
CDKL2探针包括：
SEQ ID NO:63CDKL2-P1：FAM-AAACTTACGACGAACCGAAACCCA-BHQ1
SEQ ID NO:64CDKL2-P2：FAM-ATCGTTACCTTAACGACGACAACA-BHQ1
SEQ ID NO:65CDKL2-P3：FAM-ACTCCGCGACCAACGCCTTC-BHQ1
引物探针组合1：正向引物序列：SEQ ID NO:57；反向引物序列：SEQ ID NO:60；探针序列：SEQ ID NO:63。
引物探针组合2：正向引物序列：SEQ ID NO:58；反向引物序列：SEQ ID NO:61；探针序列：SEQ ID NO:64。
引物探针组合3：正向引物序列：SEQ ID NO:59；反向引物序列：SEQ ID NO:62；探针序列：SEQ ID NO:65。
另外，B2M内参基因的检测引物和探针分别为：
SEQ ID NO:17B2M-F：GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA
SEQ ID NO:18B2M-R：TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT
SEQ ID NO:19B2M-P：5‘CY5-TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACC-3’BHQ2
样本信息：
400例血浆样本，包括200例肝癌患者样本和200例非肝癌对照样本，200例对照组样本中包含健康人样本30例，乙肝患者样本100例，肝硬化患者70例。
实验过程：
(1)收集肝癌患者及对照人群的血浆样本，使用天根的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(货号DP710)提取血浆游离DNA(每例血浆样本取1ml用于cfDNA提取)。
(2)使用ZYMO RESEARCH的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，货号D5005)对提取的游离DNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，得到转化后的cfDNA。
(3)利用荧光定量PCR检测转化后cfDNA中CDKL2甲基化水平。配制PCR检测反应体系，反应体系成分及含量如表22所示。
表22
cfDNA甲基化定量PCR配液体系
| 序号 | 组分 | 体积/反应 | 终浓度 |
| 1 | 10x PCR Buffer | 3μl | 1x |
| 2 | 50mM MgCl2 | 1.5μl | 2.5mM |
| 3 | dNTP Mix(10mM) | 0.6μl | 0.2mM |
| 4 | B2M正向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 5 | B2M反向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 6 | B2M探针(10μM) | 0.3μl | 0.1μM |
| 7 | CDKL2正向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 8 | CDKL2反向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 9 | CDKL2探针(10μM) | 0.45μl | 0.15μM |
| 10 | 50x ROX | 0.15μl | 0.25x |
| 11 | Taq酶(5U/μl) | 0.2μl | 1U/reaction |
| 12 | 超纯水 | 15.2μl | / |
| 13 | 转化后的cfDNA | 5μl | / |
| 总共 | 30μl | / |
荧光定量PCR扩增反应条件如表23所示。
表23 PCR反应过程
(4)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，FAM通道的阈值线设为0.04，CY5通道的阈值线设为0.02，得到内参基因和靶标基因的Ct值，并计算ΔCt值(CtCDKL2-CtB2M)。
结果判定：
首先进行样本PCR结果有效性判定，若样本内参B2M对应的CY5通道有明显的扩增曲线且Ct值小于35，则结果有效，可用于阴阳性判断及靶标检测性能分析；若内参B2M对应的CY5通道无扩增曲线有扩增曲线且Ct值大于35，则结果无效，应进行样本重检测。本次检测的400例血浆样本，其内参B2M对应的CY5通道均有明显的扩增曲线，且Ct值均小于35，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
利用ROC曲线对3组CDKL2引物探针组合的400例血样本检测结果进行分析，其中Ct/ΔCt值为检验变量，病理结果为状态变量，计算出的约登指数(灵敏度+特异性-1)最大值对应的Ct/ΔCt即为Cutoff值。若样本Ct/ΔCt≤Cutoff值则结果为甲基化阳性；反之，若样本Ct/ΔCt>Cutoff值则结果为甲基化阴性。将利用Ct值制作的ROC曲线和ΔCt值制作的ROC曲线进行对比后发现，利用Ct值进行靶标性能分析，其性能优于利用ΔCt的性能分析结果。三组CDKL2甲基化检测引物探针区分肝癌患者与对照人群血浆样本的性能(AUC值、灵敏度、特异性、Cutoff值)分析如表24和图9所示：
表24
血浆样本检测性能对比
| 性能 | 引物探针组合1 | 引物探针组合2 | 引物探针组合3 |
| AUC值 | 0.841 | 0.782 | 0.871 |
| Cutoff值(Ct) | 38.5 | 40.5 | 38.9 |
| 灵敏度 | 67.5％ | 59.5％ | 79.0％ |
| 特异性 | 95.5％ | 94.5％ | 88.0％ |
| 约登指数 | 0.630 | 0.540 | 0.670 |
400例肝癌患者/对照人群血浆样本的检测结果显示，在特异性约88-95％的情况下，CDKL2甲基化标记的检测灵敏度在59-79％之间，高于目前用于肝癌临床早筛的AFP性能(灵敏度45-63％，特异性80-90％)。
综合实施例5-7，本发明通过检测CDKL2基因启动子区的一段DNA序列甲基化水平，可有效鉴别组织样本或血浆样本来自肝癌患者或非肝癌个体。CDKL2甲基化标记及其对应的检测试剂盒、检测方法能够方便、无创地应用与肝癌高危人群的筛查与辅助诊断。
实施例8：检测USP44靶标基因及序列的选择
本发明的发明人通过挖掘前期研究中肝癌临床样本850K甲基化芯片数据分析结果，对比肝癌组织与癌旁组织的基因组DNA启动子区甲基化水平差异，并挑选出二者差异较大的USP44作为候选的肝癌检测靶标基因。由于甲基化芯片主要检测某一段包含若干CpG岛的序列在样本中的平均甲基化水平，为确定适合荧光定量PCR检测的甲基化位点，发明人采用焦磷酸测序的方法，对靶标基因USP44的候选CpG位点逐一进行组织样本的甲基化水平验证。
根据甲基化芯片的分析结果，设计USP44基因启动子候选区域对应的扩增及测序引物。
USP44扩增引物及测序引物包括：
SEQ ID NO:66USP44正向引物：GGGGAGAGTTGGGGGAGAA
SEQ ID NO:67USP44反向引物：AAAAACCCATTCCTCCTCAACC
SEQ ID NO:68USP44测序引物：GGTTTAGGGGATTGGAAG
样本信息：
60对(120例)经手术后病理确定的肝组织临床样本，其中肝癌组织60例，配对的癌旁组织60例。
实验过程：
(1)收集肝癌患者的肝脏手术切除标本(包括肝癌组织和癌旁组织)，利用手术刀从每份标本切下绿豆粒大小的组织。采用天根的TIANamp Genomic DNA Kit(货号DP304)提取组织样本基因组DNA。
(2)将提取的基因组DNA溶液用Nanodrop分光光度计检测浓度，确保每份样本浓度不低于25ng/μl。
(3)采用ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(货号D5005)对提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份样本用于转化的量在0.5-1μg之间。
(4)将TaKaRa EpiTaqTM HS(货号R110)和引物等PCR试剂从-20℃取出，室温解冻。根据表25配制PCR反应体系，轻轻吹打混匀。
表25
配液体系
| 序号 | 组分 | 体积/反应 | 终浓度 |
| 1 | 10x EpiTaq PCR Buffer | 2.5μl | 1x |
| 2 | 25mM MgCl2 | 2.5μl | 2.5mM |
| 3 | dNTP Mix(2.5mM each) | 3μl | 0.3mM each |
| 4 | 引物F(10μM) | 1μl | 0.4μM |
| 5 | 引物R(10μM) | 1μl | 0.4μM |
| 6 | EpiTaqTM HS(5U/μl) | 0.2μl | 1U/reaction |
| 7 | 超纯水 | 12.8μl | / |
| 8 | 亚硫酸氢盐处理后的DNA | 2μl | / |
| 9 | 总共 | 25μl | / |
(5)向每个PCR管中加入23μl混好的PCR反应液，然后加入2μl亚硫酸氢盐处理后的DNA，混匀后按照表26的反应程序进行扩增。
表26 PCR反应过程
(4)取20μl PCR产物，用PyroMark Q96实时定量焦磷酸序列分析仪进行测序分析。
结果分析：
焦磷酸测序结束后，从PyroMark Q96焦磷酸序列分析仪中导出所有测序反应对应的测序峰图和各CpG位点甲基化水平(％)的统计数据，并分别计算单个测定的CpG位点在肝癌组织、癌旁组织甲基化水平的平均值以及二者的差值。60对组织样本的后续甲基化区域焦磷酸测序分析结果如表27所示。
表27 USP44焦磷酸测序结果
将USP44靶标基因对应的各CpG位点对应的平均甲基化水平进行统计分析，结果如图10所示。焦磷酸测序结果表明，USP44在已测的13个CpG位点的差异甲基化水平均值超过30％，且上述位点在肝癌组织与配对癌旁组织的甲基化水平均具有显著性差异(p<0.01)。另外，表3中的3号CpG位点、8-11号CpG位点在癌旁组织的甲基化水平小于10％，而其余8个位点在癌旁组织的甲基化水平也不超过15％。由此推断，USP44差异甲基化区域可有效区分肝癌组织与癌旁组织样本，且对于非肝癌样本具有较高的检测特异性，故可作为DNA甲基化标志物用于肝癌的筛查与诊断。
实施例9：USP44在组织DNA中的检测
在选择用于荧光定量PCR的甲基化检测位点时，需要考虑两点因素。首先，许多基因的启动子中，不同区域乃至不同位点的甲基化水平可能不一致，实施例8中通过焦磷酸测序验证的USP44序列只涵盖其基因启动子的一部分，而不能保证其在肝癌/癌旁组织的差异甲基化水平优于其它区域/位点；其次，根据不同区域设计的甲基化引物探针序列，其分析性能和检测效能不相同，有的区域甚至很难设计出检测性能符合要求的引物探针。所以本发明实验过程中重新选定USP44目的甲基化区域和待检测的CpG位点，并设计了3对引物探针组合，用于后续荧光定量PCR验证。表28列出了本发明实验过程中选用的USP44基因目的区域。
表28 USP44基因目的区域的序列
所述USP44正向引物(USP44-F)包括：
SEQ ID NO:71USP44-F1：TACGGGTTGGGCGTTGTGT
SEQ ID NO:72USP44-F2：GCGGTAGTTTTAGAGTGTTCGG
SEQ ID NO:73USP44-F3：CGGTTGTGGTATTCGGTTGAGG
所述USP44反向引物(USP44-R)包括：
SEQ ID NO:74USP44-R1：CTCGCGATAATCCGAAAAAATAA
SEQ ID NO:75USP44-R2：CAACTCGCCCCCTCCAAC
SEQ ID NO:76USP44-R3：CAACGCGAAAACCGATCGATAA
所述USP44探针(USP44-P)包括：
SEQ ID NO:77USP44-P1：5’VIC-TACGACTAAACCCGAACGTTACGTACTC-3’BHQ1
SEQ ID NO:78USP44-P2：5’VIC-ATGTTGCGGTAAGGCGTAGCGG-3’BHQ1
SEQ ID NO:79USP44-P3：5’VIC-AATGCGTTTTTCGGCGTTTTGTTCG-3’BHQ1
引物探针组合1：正向引物序列：SEQ ID NO:71；反向引物序列：SEQ ID NO:74；探针序列：SEQ ID NO:77。
引物探针组合2：正向引物序列：SEQ ID NO:72；反向引物序列：SEQ ID NO:75；探针序列：SEQ ID NO:78。
引物探针组合3：正向引物序列：SEQ ID NO:73；反向引物序列：SEQ ID NO:76；探针序列：SEQ ID NO:79。
另外，对于PCR内部质控，用B2M基因作为内参，并针对该基因对应的亚硫酸氢盐转化后目的序列设计内控引物探针。内控引物探针可用的标准为：阳性对照品、阴性对照品和样本DNA检测结果出现明显的S形扩增曲线，而非模板体系检测结果不起线。
B2M内参基因的检测引物和探针分别为：
SEQ ID NO:17B2M-F：GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA
SEQ ID NO:18B2M-R：TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT
SEQ ID NO:19B2M-P：5’CY5-TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACC-3’BHQ2
样本信息：
60对(120例)经手术后病理确定的肝组织临床样本，其中肝癌组织60例，配对的癌旁组织60例。
实验过程：
(1)收集确诊为肝癌的患者肝脏手术切除标本(包括肝癌组织和癌旁组织)，采用天根的TIANamp Genomic DNA Kit(货号DP304)提取组织样本基因组DNA。
(2)将提取的基因组DNA溶液用Nanodrop分光光度计测定浓度，并用1x TE溶液稀释至10ng/μl。
(3)取20μl稀释后的基因组DNA溶液，采用ZYMO RESEARCH的DNA转化试剂盒(EZDNA Methylation-GoldTM Kit，货号D5005)对提取的基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份转化的DNA用20μl洗脱液洗脱。
(4)利用荧光定量PCR检测转化后组织DNA中USP44甲基化水平。配制PCR检测反应体系，反应体系成分及含量如表29所示。
表29
组织DNA甲基化定量PCR配液体系
| 序号 | 组分 | 体积/反应 | 终浓度 |
| 1 | 10x PCR Buffer | 2μl | 1x |
| 2 | 50mM MgCl2 | 1μl | 2.5mM |
| 3 | dNTP Mix(10mM) | 0.4μl | 0.2mM |
| 4 | B2M正向引物(10μM) | 0.6μl | 0.3μM |
| 5 | B2M反向引物(10μM) | 0.6μl | 0.3μM |
| 6 | B2M探针(10μM) | 0.2μl | 0.15μM |
| 7 | USP44正向引物(10μM) | 0.6μl | 0.3μM |
| 8 | USP44反向引物(10μM) | 0.6μl | 0.3μM |
| 9 | USP44探针(10μM) | 0.3μl | 0.15μM |
| 10 | 50x ROX | 0.1μl | 0.25x |
| 11 | Taq酶(5U/μl) | 0.2μl | 1U/reaction |
| 12 | 超纯水 | 11.4μl | / |
| 13 | 亚硫酸氢盐处理后的DNA | 2μl | / |
| 总共 | 20μl | / |
荧光定量PCR扩增反应条件如表30所示。
表30
PCR反应过程
(5)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，VIC通道的阈值线设为0.03，CY5通道的阈值线设为0.02，得到内参基因和靶基因的Ct值，并计算ΔCt值(CtUSP44-CtB2M)。
结果判定：
首先进行样本PCR结果有效性判定，若样本内参B2M对应的CY5通道有明显的S形扩增曲线且Ct值小于35，则结果有效，可用于阴阳性结果判断及靶标检测性能分析；若内参B2M对应的CY5通道无扩增曲线，或有扩增曲线但Ct值大于35，则结果无效，应重新进行样本检测。本次检测的120例组织样本，其内参B2M对应的CY5通道均有明显的S形扩增曲线，且Ct值均小于35，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
利用ROC曲线对3组USP44引物探针组合的120例组织样本检测结果进行分析，其中ΔCt值为检验变量，病理结果为状态变量，计算出的约登指数(灵敏度+特异性-1)最大值对应的ΔCt即为Cutoff值。若样本ΔCt≤Cutoff值则结果为甲基化阳性；反之，若样本ΔCt>Cutoff值则结果为甲基化阴性。各样本的USP44甲基化标记检测结果(ΔCt)如表31所示：
表31 组织样本检测结果
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/>
三组USP44甲基化检测引物探针区分肝癌与癌旁组织的性能(AUC值、灵敏度、特异性、Cutoff值)分析如表32和图11所示：
表32 不同USP44引物探针组合的组织样本检测性能对比
60对肝癌患者组织样本的检测结果显示，在特异性96.7-100％的情况下，USP44甲基化标记的检测灵敏度可达61.7-80％。从ROC曲线(图11)看出，USP44引物探针组合2和组合3对肝癌与癌旁组织DNA区分性能优于引物探针组合1。从散点图(图12)看出，USP44甲基化标记在肝癌组织与癌旁组织的甲基化水平分布具有显著差异。由上述结果可知，USP44作为甲基化标记可有效用于肝癌临床诊断。
实施例10：USP44在血浆cfDNA中的检测
血浆中含有少量的游离DNA(cfDNA)，这些cfDNA来源于机体中不同组织，它们通过细胞凋亡、细胞坏死或细胞外分泌作用释放到血液中。对于健康人，肝组织来源的DNA是血浆游离DNA的重要来源之一，占比约1～2％，这是由于肝具有丰富的血液循环和新陈代谢。早期肝癌细胞中，一些基因的CpG富集区域出现高甲基化，这些高甲基化区域往往与细胞癌变相关联，而部分包含高甲基化区域的循环肿瘤DNA(ctDNA)会释放到血液中。因此通过血浆分离、cfDNA提取、转化和PCR扩增，可检测出肝癌甲基化DNA标记物，进而实现肝癌早筛早诊。
为了验证血浆cfDNA中USP44甲基化标记能用于早期肝癌检测，本发明人通过下列实验评估USP44甲基化标记在肝癌与非肝癌临床样本中的检测效果。
各基因检测引物探针如下：
所述USP44正向引物(USP44-F)包括：
SEQ ID NO:71USP44-F1：TACGGGTTGGGCGTTGTGT
SEQ ID NO:72USP44-F2：GCGGTAGTTTTAGAGTGTTCGG
SEQ ID NO:73USP44-F3：CGGTTGTGGTATTCGGTTGAGG
所述USP44反向引物(USP44-R)包括：
SEQ ID NO:74USP44-R1：CTCGCGATAATCCGAAAAAATAA
SEQ ID NO:75USP44-R2：CAACTCGCCCCCTCCAAC
SEQ ID NO:76USP44-R3：CAACGCGAAAACCGATCGATAA
所述USP44探针(USP44-P)包括：
SEQ ID NO:77USP44-P1：5’VIC-TACGACTAAACCCGAACGTTACGTACTC-3’BHQ1
SEQ ID NO:78USP44-P2：5’VIC-ATGTTGCGGTAAGGCGTAGCGG-3’BHQ1
SEQ ID NO:79USP44-P3：5’VIC-AATGCGTTTTTCGGCGTTTTGTTCG-3’BHQ1
引物探针组合1：正向引物序列：SEQ ID NO:71；反向引物序列：SEQ ID NO:74；探针序列：SEQ ID NO:77。
引物探针组合2：正向引物序列：SEQ ID NO:72；反向引物序列：SEQ ID NO:75；探针序列：SEQ ID NO:78。
引物探针组合3：正向引物序列：SEQ ID NO:73；反向引物序列：SEQ ID NO:76；探针序列：SEQ ID NO:79。
另外，B2M内参基因的检测引物和探针分别为：
SEQ ID NO:17B2M-F：GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA
SEQ ID NO:18B2M-R：TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT
SEQ ID NO:19B2M-P：5’CY5-TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACC-3’BHQ2
样本信息：
400例血浆样本，包括200例肝癌患者样本和200例非肝癌对照样本，200例对照组样本中包含健康人样本30例，乙肝患者样本100例，肝硬化患者70例。
实验过程：
(1)收集肝癌患者及对照人群的血浆样本，使用天根的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(货号DP710)提取血浆游离DNA(每例血浆样本取1ml用于cfDNA提取)。
(2)使用ZYMO RESEARCH的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，货号D5005)对提取的游离DNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，得到转化后的cfDNA。
(3)利用荧光定量PCR检测转化后cfDNA中USP44甲基化水平。配制PCR检测反应体系，反应体系成分及含量如表33所示。
表33
cfDNA甲基化定量PCR配液体系
| 序号 | 组分 | 体积/反应 | 终浓度 |
| 1 | 10x PCR Buffer | 3μl | 1x |
| 2 | 50mM MgCl2 | 1.5μl | 2.5mM |
| 3 | dNTP Mix(10mM) | 0.6μl | 0.2mM |
| 4 | B2M正向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 5 | B2M反向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 6 | B2M探针(10μM) | 0.3μl | 0.15μM |
| 7 | USP44正向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 8 | USP44反向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 9 | USP44探针(10μM) | 0.45μl | 0.15μM |
| 10 | 50x ROX | 0.15μl | 0.25x |
| 11 | Taq酶(5U/μl) | 0.2μl | 1U/reaction |
| 12 | 超纯水 | 15.2μl | / |
| 13 | 转化后的cfDNA | 5μl | / |
| 总共 | 30μl | / |
荧光定量PCR扩增反应条件如表34所示。
表34
PCR反应过程
(4)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，FAM通道的阈值线设为0.03，CY5通道的阈值线设为0.02，得到内参基因和靶标基因的Ct值，并计算ΔCt值(CtUSP44-CtB2M)。
结果判定：
首先进行样本PCR结果有效性判定，若样本内参B2M对应的CY5通道有明显的扩增曲线且Ct值小于35，则结果有效，可用于阴阳性判断及靶标检测性能分析；若内参B2M对应的CY5通道无扩增曲线有扩增曲线且Ct值大于35，则结果无效，应进行样本重检测。本次检测的400例血浆样本，其内参B2M对应的CY5通道均有明显的扩增曲线，且Ct值均小于35，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
利用ROC曲线对3组USP44引物探针组合的400例血样本检测结果进行分析，其中Ct/ΔCt值为检验变量，病理结果为状态变量，计算出的约登指数(灵敏度+特异性-1)最大值对应的Ct/ΔCt即为Cutoff值。若样本Ct/ΔCt≤Cutoff值则结果为甲基化阳性；反之，若样本Ct/ΔCt>Cutoff值则结果为甲基化阴性。将利用Ct值制作的ROC曲线和ΔCt值制作的ROC曲线进行对比后发现，利用Ct值进行靶标性能分析，其性能优于利用ΔCt的性能分析结果。三组USP44甲基化检测引物探针区分肝癌患者与对照人群血浆样本的性能(AUC值、灵敏度、特异性、Cutoff值)分析如表35和图13所示：
表35
血浆样本检测性能对比
| 性能 | 引物探针组合1 | 引物探针组合2 | 引物探针组合3 |
| AUC值 | 0.794 | 0.885 | 0.834 |
| Cutoff值(Ct) | 44.3 | 39.9 | 43.2 |
| 灵敏度 | 62.0％ | 78.5％ | 73.5％ |
| 特异性 | 95.0％ | 91.5％ | 88.0％ |
| 约登指数 | 0.57 | 0.70 | 0.615 |
400例肝癌患者/对照人群血浆样本的检测结果显示，在特异性约88-95％的情况下，USP44甲基化标记的检测灵敏度在59-79％之间，高于目前用于肝癌临床早筛的AFP性能(灵敏度45-63％，特异性80-90％)。
综合实施例8-10，本发明通过检测USP44基因启动子区的一段DNA序列甲基化水平，可有效鉴别组织样本或血浆样本来自肝癌患者或非肝癌个体。USP44甲基化标记及其对应的检测试剂盒、检测方法能够方便、无创地应用与肝癌高危人群的筛查与辅助诊断。
实施例11：检测ZNF783靶基因及目标序列的选择
DNA甲基化一般发生于基因的特定部位，发生甲基化的CpG富集区域往往位于基因转录起始位点上游或外显子。本发明的发明人结合TCGA、GEO数据库中肝癌患者的450K甲基化芯片数据分析结果，和前期研究中肝癌临床样本850K甲基化芯片数据分析结果，对比肝癌组织与癌旁组织的基因组DNA甲基化水平差异，并挑选出二者差异较大的ZNF783作为候选的肝癌检测靶标基因。
为确定适合设计检测引物探针的甲基化位点，发明人采用甲基化一代测序方法对靶标基因ZNF783 CpG岛区域的目标C位点逐一进行甲基化水平验证。设计ZNF783候选区域的扩增及测序引物用于位点验证，具体引物信息如下：
ZNF783扩增引物及测序引物包括：
SEQ ID NO:80ZNF783引物F：GGTAGTTGTGTAGAGATTTAA
SEQ ID NO:81ZNF783引物R：ATTTCTACTCTCTAAAAAATAAATAACC
SEQ ID NO:82ZNF783测序引物：GGTYGGTGGTGGAAGT
样本信息：
24对(48例)经手术后病理确定的肝组织临床样本，其中肝癌组织24例，配对的癌旁组织24例。另外准备两种培养好的细胞系，分别为Huh-7(人肝癌细胞系)和HIE-2(人胚胎肠粘膜细胞)。
实验过程：
(1)收集确诊为肝癌的患者肝脏手术切除标本(包括肝癌组织和癌旁组织)，利用手术刀从每份标本切下绿豆粒大小的组织，另外收集培养好的悬浮细胞(每株约1x106cells)，用1x PBS溶液洗涤一遍。采用天根的TIANamp Genomic DNA Kit(货号DP304)提取细胞和组织的基因组DNA。
(2)将提取的基因组DNA溶液用Nanodrop分光光度计检测浓度，确保每份gDNA样本浓度不低于25ng/μl。
(3)采用ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(货号D5005)对提取的细胞gDNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份样本用于转化的量在200-500mg之间。
(4)将TaKaRa EpiTaqTM HS(货号R110)和引物等PCR试剂从-20℃取出，室温解冻。根据表36配制PCR反应体系，轻轻吹打混匀。
表36
配液体系
| 序号 | 组分 | 体积/反应 | 终浓度 |
| 1 | 10x EpiTaq PCR Buffer | 2.5μl | 1x |
| 2 | 25mM MgCl2 | 2.5μl | 2.5mM |
| 3 | dNTP Mix(2.5mM each) | 3μl | 0.3mM each |
| 4 | 引物F(10μM) | 1μl | 0.4μM |
| 5 | 引物R(10μM) | 1μl | 0.4μM |
| 6 | EpiTap HS(5U/μl) | 0.2μl | 1U/reaction |
| 7 | 超纯水 | 12.8μl | / |
| 8 | 亚硫酸氢盐处理后的DNA | 2μl | / |
| 9 | 总共 | 25μl | / |
(5)向每个PCR管中加入23μl混匀的PCR反应液，然后加入2μl亚硫酸氢盐转化后的DNA，混匀后按照表37的反应程序进行扩增。
表37
PCR反应过程
(6)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下含有ZNF783目的产物的胶块，送至测序公司进行一代测序验证。
结果分析：
根据一代测序结果对应的测序峰图，分别估算测序区域里各CpG位点在不同样本DNA中的甲基化水平，并对各位点的甲基化水平(高或低)进行定量分析。ZNF783目标区域在不同DNA样本甲基化测序的峰图如图14所示。经分析测序结果，发现有16个CpG位点在肝癌组织样本与癌旁组织样本中的甲基化水平存在极显著差异(p<0.01)，差异位点测序分析结果如表38所示。
表38
ZNF783
CpG位点在组织样本中的甲基化测序结果分析
测序结果显示，上述16个ZNF783 CpG位点的在肝癌组织与癌旁组织的甲基化水平均具有显著性差异，且其中10个CpG位点的差异甲基化水平均值超过30％。由此推断，ZNF783差异甲基化区域可有效区分肝癌组织与癌旁组织样本，且对于非肝癌样本具有较高的检测特异性，故可作为DNA甲基化标志物用于肝癌的筛查与诊断。另外，Huh-7细胞DNA和HIE-2细胞DNA可分别用作阳性对照和阴性对照。
实施例12：ZNF783在组织DNA中的检测
由于实施例11中经测序确认的16个差异甲基化位点均可作为潜在的肝癌甲基化靶标位点，且根据不同区域设计的甲基化引物探针序列，其靶标检测性能不一致。所以本发明实验过程中针对涵盖16个差异甲基化位点的ZNF783基因CpG富集区域，设计了3对引物探针组合进行后续荧光定量PCR验证。表39列出了本发明实验过程中选用的ZNF783基因目的区域。
表39
ZNF783基因目的区域的序列
所述ZNF783正向引物(ZNF783-F)包括：
SEQ ID NO:85ZNF783-F1：TATTGGTTAATTCGGGAGGTTTC
SEQ ID NO:86ZNF783-F2：GGAGGTTTCGTTTTTATAGCGTG
SEQ ID NO:87ZNF783-F3：GTACGTTCGATAGGTGCGAG
所述ZNF783反向引物(ZNF783-R)包括：
SEQ ID NO:88ZNF783-R1：CGCACCTATCGAACGTACACAA
SEQ ID NO:89ZNF783-R2：CTATTAAACACCAACCCGAAACG
SEQ ID NO:90ZNF783-R3：GTACGAAACGATAACAACTAACGAC
所述ZNF783探针(ZNF783-P)包括：
SEQ ID NO:91ZNF783-P1：5’CY5-AACCCGACGCACGCTATAAAAACGA-3’BHQ2
SEQ ID NO:92ZNF783-P2：5’CY5-ACGCTCGCACCTATCGAACGTACA-3’BHQ2
SEQ ID NO:93ZNF783-P3：5’CY5-ACGAACTATTAAACACCAACCCGAAACGA-3’BHQ2
引物探针组合1：正向引物序列：SEQ ID NO:85；反向引物序列：SEQ ID NO:88；探针序列：SEQ ID NO:91。
引物探针组合2：正向引物序列：SEQ ID NO:86；反向引物序列：SEQ ID NO:89；探针序列：SEQ ID NO:92。
引物探针组合3：正向引物序列：SEQ ID NO:87；反向引物序列：SEQ ID NO:90；探针序列：SEQ ID NO:93。
另外，对于PCR内部质控，用B2M基因作为内参，并针对其对应的亚硫酸氢盐转化后目的序列设计内控引物探针。内控检测引物探针可用的标准为：阳性对照品、阴性对照品和样本DNA检测结果出现明显的S形扩增曲线，而非模板体系(如水对照)检测结果扩增曲线不起峰。
B2M内参基因的检测引物和探针分别为：
SEQ ID NO:17B2M-F：GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA
SEQ ID NO:18B2M-R：TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT
SEQ ID NO:94B2M-P：5’VIC-TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACC-3’BHQ1
样本信息：
60对(120例)经手术后病理确定的肝组织临床样本，其中肝癌组织60例，配对的癌旁组织60例。
实验过程：
(1)收集不同器官来源的组织样本，采用天根的TIANamp Genomic DNA Kit(货号DP304)提取组织样本gDNA。
(2)将提取的组织gDNA溶液用Nanodrop分光光度计检测浓度，并用1x TE溶液稀释至10ng/μl。
(3)取20μl稀释后的gDNA溶液，采用ZYMO RESEARCH的DNA转化试剂盒(EZ DNAMethylation-GoldTM Kit，货号D5005)对提取的gDNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份转化的DNA用20μl洗脱液洗脱。
(4)利用荧光定量PCR检测转化后组织DNA中ZNF783甲基化水平。配制PCR检测反应体系，反应体系成分及含量如表40所示。
表40
组织DNA甲基化定量PCR配液体系
荧光定量PCR扩增反应条件如表41所示。
表41
PCR反应过程
(5)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，CY5通道的阈值线设为30000，VIC通道的阈值线设为30000，得到内参基因和靶基因的Ct值，并计算ΔCt值(CtZNF783-CtB2M)。
结果分析：
首先进行样本PCR结果有效性判定，若样本内参B2M对应的CY5通道有明显的扩增曲线且Ct值小于35，则结果有效，可用于阴阳性判断及靶标检测性能分析；若内参B2M对应的CY5通道无扩增曲线有扩增曲线且Ct值大于35，则结果无效，应进行样本重检测。本次检测的120例组织样本，其内参B2M对应的CY5通道均有明显的扩增曲线，且Ct值均小于35，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
利用ROC曲线对3组ZNF783引物探针组合的120例组织样本检测结果进行分析，其中ΔCt值为检验变量，病理结果为状态变量，计算出的约登指数(灵敏度+特异性-1)最大值对应的ΔCt即为Cutoff值。若样本ΔCt≤Cutoff值则结果为甲基化阳性；反之，若样本ΔCt>Cutoff值则结果为甲基化阴性。各样本的ZNF783甲基化标记检测结果(ΔCt)如表42所示：
表42
组织样本检测结果
/>
/>
/>
三组ZNF783甲基化检测引物探针区分肝癌与癌旁组织的性能(AUC值、灵敏度、特异性、Cutoff值)分析如表43和图15所示：
表43
组织样本检测性能对比
| 性能 | 引物探针组合1 | 引物探针组合2 | 引物探针组合3 |
| AUC值 | 0.919 | 0.879 | 0.885 |
| Cutoff值(ΔCt) | 6.29 | 5.38 | 5.62 |
| 灵敏度 | 80.0％ | 81.7％ | 71.7％ |
| 特异性 | 96.7％ | 96.7％ | 100％ |
| 约登指数 | 0.767 | 0.784 | 0.717 |
60对肝癌患者组织样本的检测结果显示，在特异性96.7-100％的情况下，ZNF783甲基化标记的检测灵敏度可达71.7-81.7％。从散点图(图16)看，ZNF783甲基化标记在肝癌组织与癌旁组织的甲基化水平分布具有显著差异。上述结果均证明ZNF783作为甲基化标记可有效用于肝癌临床诊断。
实施例13：ZNF783甲基化靶标的分析灵敏度验证
在血浆中，ZNF783异常甲基化主要发生于来自肝癌细胞的循环肿瘤DNA(ctDNA)，而早期肝癌患者血浆游离DNA(cfDNA)中，肝癌ctDNA占比只有1％甚至更低。为提高ZNF783甲基化检测试剂的临床性能，需要确保ZNF783甲基化靶标的检出限能达到1％甚至更低。发明人采用本发明中的三组ZNF783引物探针组合对10ng阴性DNA背景下不同比例的甲基化率进行检测，评估本发明的ZNF783甲基化检测试剂在10ng DNA背景下的检测灵敏度。
各基因检测引物探针如下：
所述ZNF783正向引物(ZNF783-F)包括：
SEQ ID NO:85ZNF783-F1：TATTGGTTAATTCGGGAGGTTTC
SEQ ID NO:86ZNF783-F2：GGAGGTTTCGTTTTTATAGCGTG
SEQ ID NO:87ZNF783-F3：GTACGTTCGATAGGTGCGAG
所述ZNF783反向引物(ZNF783-R)包括：
SEQ ID NO:88ZNF783-R1：CGCACCTATCGAACGTACACAA
SEQ ID NO:89ZNF783-R2：CTATTAAACACCAACCCGAAACG
SEQ ID NO:90ZNF783-R3：GTACGAAACGATAACAACTAACGAC
所述ZNF783探针(ZNF783-P)包括：
SEQ ID NO:91ZNF783-P1：5’CY5-AACCCGACGCACGCTATAAAAACGA-3’BHQ2
SEQ ID NO:92ZNF783-P2：5’CY5-ACGCTCGCACCTATCGAACGTACA-3’BHQ2
SEQ ID NO:93ZNF783-P3：5’CY5-ACGAACTATTAAACACCAACCCGAAACGA-3’BHQ2
引物探针组合1：正向引物序列：SEQ ID NO:85；反向引物序列：SEQ ID NO:88；探针序列：SEQ ID NO:91。
引物探针组合2：正向引物序列：SEQ ID NO:86；反向引物序列：SEQ ID NO:89；探针序列：SEQ ID NO:92。
引物探针组合3：正向引物序列：SEQ ID NO:87；反向引物序列：SEQ ID NO:90；探针序列：SEQ ID NO:93。
另外，对于PCR内部质控，用B2M基因作为内参，并针对其对应的亚硫酸氢盐转化后目的序列设计内控引物探针。内控检测引物探针可用的标准为：阳性对照品、阴性对照品和样本DNA检测结果出现明显的S形扩增曲线，而非模板体系(如水对照)检测结果扩增曲线不起峰。
B2M内参基因的检测引物和探针分别为：
SEQ ID NO:17B2M-F：GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA
SEQ ID NO:18B2M-R：TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT
SEQ ID NO:94B2M-P：5’VIC-TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACC-3’BHQ1
实验过程：
(1)样本选择：选用Huh-7细胞系作为甲基化阳性样本，HIE-2细胞株作为甲基化阴性样本。
(2)细胞DNA提取：采用天根的TIANamp Genomic DNA Kit(货号DP304)提取细胞基因组DNA，将提取的基因组DNA溶液用Nanodrop分光光度计检测浓度。
(2)以HIE-2细胞DNA作为阴性背景，Huh-7肝癌细胞系DNA作为阳性模板，配制4种比例的阳性对照品。4种阳性对照品的DNA总浓度均为2ng/μl，而含ZNF783甲基化阳性DNA的比例分别为5％、1％、0.5％、0.25％，分别命名为5％ PC、1％ PC、0.5％ PC和0.25％ PC。另外以2ng/μl的HIE-2细胞DNA作为阴性对照品。
(3)上述不同比例的阳性对照品及阴性对照品均分装为20μl/管，随后用ZYMORESEARCH的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，货号D5005)进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份转化的DNA用20μl洗脱液洗脱。
(4)利用荧光定量PCR检测不同比例阳性对照品及阴性对照品的ZNF783甲基化水平，每种比例的阳性对照品均做20个复孔。反应体系成分及含量如表44所示。
表44
ZNF783甲基化定量PCR配液体系
荧光定量PCR扩增反应条件如表41所示。
(5)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，CY5通道的阈值线设为30000，VIC通道的阈值线设为30000，得到内参基因和靶基因的Ct值，。
结果分析：
首先进行样本PCR结果有效性判定，若样本内参B2M对应的VIC通道有明显的扩增曲线且Ct值小于32，则结果有效，可用于阴阳性判断及靶标检测性能分析；若内参B2M对应的VIC通道无扩增曲线有扩增曲线且Ct值大于32，则结果无效，应进行样本重检测。本次检测的不同比例阴阳性对照品，其内参B2M对应的CY5通道均有明显的扩增曲线，且Ct值均小于32，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
使用本发明的三组ZNF783引物探针对，检测5％ PC、1％ PC、0.5％ PC和0.25％PC四种阳性对照品的荧光曲线示意图如图17所示。若ZNF783荧光曲线起峰，且Ct值小于45，则判定为阳性检出。不同阳性对照品具体的阳性检出比例如表45所示。
表45
不同阳性对照品的ZNF783甲基化靶标阳性检出比例
| 模板 | 引物探针组合1 | 引物探针组合2 | 引物探针组合3 |
| 5％PC | 20/20 | 20/20 | 20/20 |
| 1％PC | 20/20 | 20/20 | 20/20 |
| 0.5％PC | 18/20 | 16/20 | 17/20 |
| 0.25％PC | 12/20 | 10/20 | 14/20 |
灵敏度验证结果显示，三组ZNF783甲基化靶标检测引物探针组合均能检出全部的5％PC和1％ PC模板，而0.5％ PC和0.25％PC模板的检测结果中，ZNF783甲基化阳性检出率未达到95％。故本发明检测产品可准确检出10ng DNA背景下1％甲基化。
实施例14：ZNF783在血浆cfDNA中的检测
为了验证血浆cfDNA中ZNF783甲基化标记能用于早期肝癌检测，本发明人通过下列方法评估ZNF783甲基化标记在肝癌患者与非肝癌人群临床血浆样本中的检测效果。
各基因检测引物探针如下：
所述ZNF783正向引物(ZNF783-F)包括：
所述ZNF783正向引物(ZNF783-F)包括：
SEQ ID NO:85ZNF783-F1：TATTGGTTAATTCGGGAGGTTTC
SEQ ID NO:86ZNF783-F2：GGAGGTTTCGTTTTTATAGCGTG
SEQ ID NO:87ZNF783-F3：GTACGTTCGATAGGTGCGAG
所述ZNF783反向引物(ZNF783-R)包括：
SEQ ID NO:88ZNF783-R1：CGCACCTATCGAACGTACACAA
SEQ ID NO:89ZNF783-R2：CTATTAAACACCAACCCGAAACG
SEQ ID NO:90ZNF783-R3：GTACGAAACGATAACAACTAACGAC
所述ZNF783探针(ZNF783-P)包括：
SEQ ID NO:91ZNF783-P1：5’CY5-AACCCGACGCACGCTATAAAAACGA-3’BHQ2
SEQ ID NO:92ZNF783-P2：5’CY5-ACGCTCGCACCTATCGAACGTACA-3’BHQ2
SEQ ID NO:93ZNF783-P3：5’CY5-ACGAACTATTAAACACCAACCCGAAACGA-3’BHQ2
引物探针组合1：正向引物序列：SEQ ID NO:85；反向引物序列：SEQ ID NO:88；探针序列：SEQ ID NO:91。
引物探针组合2：正向引物序列：SEQ ID NO:86；反向引物序列：SEQ ID NO:89；探针序列：SEQ ID NO:92。
引物探针组合3：正向引物序列：SEQ ID NO:87；反向引物序列：SEQ ID NO:90；探针序列：SEQ ID NO:93。
另外，对于PCR内部质控，用B2M基因作为内参，并针对其对应的亚硫酸氢盐转化后目的序列设计内控引物探针。内控检测引物探针可用的标准为：阳性对照品、阴性对照品和样本DNA检测结果出现明显的S形扩增曲线，而非模板体系(如水对照)检测结果扩增曲线不起峰。
B2M内参基因的检测引物和探针分别为：
SEQ ID NO:17B2M-F：GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA
SEQ ID NO:18B2M-R：TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT
SEQ ID NO:94B2M-P：5’VIC-TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACC-3’BHQ1
样本信息：
200例血浆样本，包括80例肝癌患者样本和120例非肝癌对照样本，120例对照组样本中包含健康人样本40例，乙肝患者样本39例，肝硬化患者41例。
实验过程：
(1)收集肝癌患者及对照人群的血浆样本，使用天根的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(货号DP710)提取血浆游离DNA(每例血浆样本取1ml用于cfDNA提取)。
(2)使用ZYMO RESEARCH的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，货号D5005)对提取的游离DNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，得到转化后的cfDNA。
(3)利用荧光定量PCR检测转化后cfDNA中ZNF783甲基化水平。使用的PCR仪器为ABI7500，反应体积为30μl，反应体系成分及含量如表46所示。
表46
cfDNA甲基化定量PCR配液体系
| 序号 | 组分 | 体积/反应 | 终浓度 |
| 1 | 10x PCR Buffer | 3μl | 1x |
| 2 | 50mM MgCl2 | 1.5μl | 2.5mM |
| 3 | dNTP Mix(10mM) | 0.6 μl | 0.2mM |
| 4 | B2M正向引物(10μM) | 0.6μl | 0.2μM |
| 5 | B2M反向引物(10μM) | 0.6μl | 0.2μM |
| 6 | B2M探针(10μM) | 0.3μl | 0.1μM |
| 7 | ZNF783正向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 8 | ZNF783反向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 9 | ZNF783探针(10μM) | 0.45μl | 0.15μM |
| 10 | Taq酶(5U/μl) | 0.2μl | 1U/reaction |
| 11 | 超纯水 | 15.95μl | / |
| 12 | 转化后的cfDNA | 5μl | / |
| 总共 | 30μl | / |
荧光定量PCR扩增反应条件如表41所示。
(4)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，CY5通道的阈值线设为30000，VIC通道的阈值线设为30000，得到内参基因和靶基因的Ct值。
结果判定：
首先进行样本PCR结果有效性判定，若样本内参B2M对应的VIC通道有明显的扩增曲线且Ct值小于35，则结果有效，可用于阴阳性判断及靶标检测性能分析；若内参B2M对应的VIC通道无扩增曲线有扩增曲线且Ct值大于35，则结果无效，应进行样本重检测。本次检测的200例血浆样本，其内参B2M对应的VIC通道均有明显的扩增曲线，且Ct值均小于35，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
利用ROC曲线对3组ZNF783引物探针组合的200例血样本检测结果进行分析，其中Ct值为检验变量，病理结果为状态变量，计算出的约登指数(灵敏度+特异性-1)最大值对应的Ct即为Cutoff值。若样本Ct≤Cutoff值则结果为甲基化阳性；反之，若样本Ct>Cutoff值则结果为甲基化阴性。
三组ZNF783甲基化检测引物探针区分肝癌患者与对照人群血浆样本的性能(AUC值、灵敏度、特异性、Cutoff值)分析如表47和图18所示：
表47
血浆样本检测性能对比
| 性能 | 引物探针组合1 | 引物探针组合2 | 引物探针组合3 |
| AUC值 | 0.830 | 0.843 | 0.792 |
| Cutoff值(Ct) | 43.0 | 40.3 | 40.1 |
| 灵敏度 | 67.5％ | 72.5％ | 58.8％ |
| 特异性 | 96.7％ | 94.2％ | 99.1％ |
| 约登指数 | 0.642 | 0.667 | 0.579 |
200例肝癌患者/对照人群血浆样本的检测结果显示，在特异性约94.2-99.1％的情况下，ZNF783甲基化标记的检测灵敏度在58.8-72.5％之间。其对肝癌的检测特异性高于现行的AFP血清学与超声影像检测方法。故本发明的ZNF783甲基化检测产品可作为一种补充技术用于肝癌的早期筛查和辅助诊断。
综合实施例11-14，本发明通过检测ZNF783基因的一段DNA序列甲基化水平，可有效鉴别组织样本或血浆样本来自肝癌患者或非肝癌个体。ZNF783甲基化标记及其对应的检测试剂盒、检测方法能够方便、无创地应用与肝癌高危人群的筛查与辅助诊断。
实施例15：F12在不同细胞系DNA中的甲基化水平比较
本发明的发明人基于TCGA、GEO数据库中不同癌种的癌旁组织与健康人群全血甲基化芯片数据分析结果，筛选出肝(癌旁)组织特异性高甲基化的F12作为肝组织特异性甲基化候选标记。由于甲基化芯片主要检测某一段包含若干CpG岛的序列在样本中的平均甲基化水平，为确定适合设计检测引物探针的甲基化位点，发明人采用甲基化一代测序方法对上述靶标基因的目标CpG位点逐一进行甲基化水平验证。
根据甲基化芯片分析结果，设计F12候选区域的扩增及测序引物，具体引物信息如下：
F12扩增引物及测序引物包括：
SEQ ID NO:95F12引物F：ATTTTTGTTTTTAGTAGTTGTGTTTATTTT
SEQ ID NO:96F12引物R：AAAACAAAAAACTTCCCCAAAAC
SEQ ID NO:97F12测序引物：GAATTGGTGGTTTTAGT
样本信息：
8种培养好的细胞系，分别为HepG2(人肝癌细胞系)、Huh-7(人肝癌细胞系)、HT-29(人结肠癌细胞系)、AGS(人胃癌细胞系)、PC-3(人前列腺癌细胞系)、T24(人膀胱癌细胞系)、HEH-2(人胚胎心肌细胞)和Jurkat(人T细胞白血病细胞)。
实验过程：
(1)收集培养好的悬浮细胞(每株约1x106cells)，用1x PBS溶液洗涤一遍。采用天根的TIANamp Genomic DNA Kit(货号DP304)提取细胞基因组DNA。
(2)将提取的细胞gDNA溶液用Nanodrop分光光度计检测浓度，确保每份gDNA样本浓度不低于20ng/μl。
(3)采用ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-GoldTM Kit(货号D5005)对提取的细胞gDNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份样本用于转化的量在200-500mg之间。
(4)将TaKaRa EpiTaqTM HS(货号R110)和引物等PCR试剂从-20℃取出，室温解冻。根据表48配制PCR反应体系，轻轻吹打混匀。
表48
配液体系
| 序号 | 组分 | 体积/反应 | 终浓度 |
| 1 | 10x EpiTaq PCR Buffer | 2.5μl | 1x |
| 2 | 25mM MgCl2 | 2.5μl | 2.5mM |
| 3 | dNTP Mix(2.5mM each) | 3μl | 0.3mM each |
| 4 | 引物F(10μM) | 1μl | 0.4μM |
| 5 | 引物R(10μM) | 1μl | 0.4μM |
| 6 | EpiTap HS(5U/μl) | 0.2μl | 1U/reaction |
| 7 | 超纯水 | 12.8μl | / |
| 8 | 亚硫酸氢盐处理后的DNA | 2μl | / |
| 9 | 总共 | 25μl | / |
(5)向每个PCR管中加入23μl混匀的PCR反应液，然后加入2μl亚硫酸氢盐转化后的DNA，混匀后按照表49的反应程序进行扩增。
表49 PCR反应过程
(6)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，切下含有F12目的产物的胶块，送至测序公司进行一代测序验证。
结果分析：
根据一代测序结果对应的测序峰图，分别估算测序区域里各CpG位点在不同细胞DNA中的甲基化水平，并对各位点的甲基化水平(高或低)进行定量分析。F12目标区域在不同细胞甲基化测序的峰图如图19所示。部分位点测序分析结果如表50所示。
表50
F12在不同细胞DNA中的Sanger测序结果
从结果推断，F12靶标区域仅在肝组织来源的细胞系出现高甲基化，而在其它组织和器官来源的细胞系中均出现低甲基化，故F12具有组织特异性甲基化的特征，具有作为组织特异性甲基化标志物的潜能。
实施例16：F12甲基化的组织特异性研究
由于实施例15中选用的细胞系大多为癌细胞，相比与未发生癌变的细胞，癌细胞本身可能在基因组部分区域已经发生异常甲基化。所以本发明实验过程中针对F12基因启动子区序列中发现的若干CpG位点，设计了3对引物探针组合进行后续荧光定量PCR验证。验证的对象为不同器官来源的组织DNA样本。表51列出了本发明实验过程中选用的F12基因目的区域。
表51
F12基因目的区域的序列
所述F12正向引物包括：
SEQ ID NO:100 F12-F1：TTGGTAGAGCGTGGTTTCGG
SEQ ID NO:101 F12-F2：CGTTTGGTAGGTATATCGGTTG
SEQ ID NO:102 F12-F3：GGACGTCGGGGTTTTAAGTT
所述F12反向引物包括：
SEQ ID NO:103 F12-R1：CGCCTTACGTTCAACCGATA
SEQ ID NO:104 F12-R2：CGCCTTCAAAAAAATACGAACGAC
SEQ ID NO:105F12-R3：GTCAACTACCAACACGACCT
所述F12探针包括：
SEQ ID NO:106F12-P1：5’ROX-TCGCGCGGCGTCGTTTG-3’BHQ2
SEQ ID NO:107F12-P2：5’ROX-ACGTAAGGCGATAGGAGCGCGTA-3’BHQ2
SEQ ID NO:108F12-P3：5’ROX-TTTTCGTTTTCGCGGGGCGTTTT-3’BHQ2
引物探针组合1：正向引物序列：SEQ ID NO:100；反向引物序列：SEQ ID NO:103；探针序列：SEQ ID NO:106。
引物探针组合2：正向引物序列：SEQ ID NO:101；反向引物序列：SEQ ID NO:104；探针序列：SEQ ID NO:107。
引物探针组合3：正向引物序列：SEQ ID NO:102；反向引物序列：SEQ ID NO:105；探针序列：SEQ ID NO:108。
另外，对于PCR内部质控，用B2M基因作为内参，并针对其对应的亚硫酸氢盐转化后目的序列设计内控引物探针。内控检测引物探针可用的标准为：阳性对照品、阴性对照品和样本DNA检测结果出现明显的S形扩增曲线，而非模板体系(如水对照)检测结果扩增曲线不起峰。
B2M内参基因的检测引物和探针分别为：
SEQ ID NO:17B2M-F：GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA
SEQ ID NO:18B2M-R：TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT
SEQ ID NO:19B2M-P：5’CY5-TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACC-3’BHQ2
样本信息：
来自不同器官的组织或细胞共48例。其中肝组织8例，均为手术切除的癌旁组织；胃组织8例，均为用于活检的胃粘膜；结肠组织8例，均为手术切除的肠息肉；子宫颈组织8例，均为手术切除的宫颈癌旁组织；肺组织8例，均为手术切除的肺结节；血液细胞8例，均为血液离心后分离的白细胞。
实验过程：
(1)收集不同器官来源的组织样本，采用天根的TIANamp Genomic DNA Kit(货号DP304)提取组织样本gDNA。
(2)将提取的组织gDNA溶液用Nanodrop分光光度计检测浓度，并用1x TE溶液稀释至10ng/μl。
(3)取20μl稀释后的gDNA溶液，采用ZYMO RESEARCH的DNA转化试剂盒(EZ DNAMethylation-GoldTM Kit，货号D5005)对提取的gDNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份转化的DNA用20μl洗脱液洗脱。
(4)利用荧光定量PCR检测转化后组织DNA中F12甲基化水平。配制PCR检测反应体系，反应体系成分及含量如表52所示。
表52
组织DNA甲基化定量PCR配液体系
荧光定量PCR扩增反应条件如表53所示。
表53
PCR反应过程
(5)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，ROX通道的阈值线设为50000，CY5通道的阈值线设为20000，得到内参基因和靶基因的Ct值。
结果分析：
首先进行样本PCR结果有效性判定，若样本内参B2M对应的CY5通道有明显的扩增曲线且Ct值小于35，则结果有效，可用于阴阳性判断及靶标检测性能分析；若内参B2M对应的CY5通道无扩增曲线有扩增曲线且Ct值大于35，则结果无效，应进行样本重检测。本次检测的48例组织样本，其内参B2M对应的CY5通道均有明显的扩增曲线，且Ct值均小于35，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
使用本发明的三组F12引物探针对，检测6种组织DNA的Ct值散点图如图20所示。结果显示，F12甲基化靶标在肝组织DNA中检测的Ct值均小于35，而其它组织DNA检测的F12靶标Ct值均大于35，其中血液、胃、子宫颈、肺组织样本大部分未检出F12靶标，说明F12靶标区域在肝组织DNA中高甲基化，在其它组织DNA中未发生甲基化或者甲基化水平非常低。
实施例17:F12甲基化靶标的分析灵敏度验证
血浆中含有少量的游离DNA(cfDNA)，这些cfDNA来源于机体中不同组织，它们通过细胞凋亡、细胞坏死或细胞外分泌作用释放到血液中。健康人的cfDNA在人体内的浓度约为10ng/ml，其肝组织来源的cfDNA约占总cfDNA的1-2％。由于cfDNA半衰期短(0.5-2h)，容易发生降解，故需要确保F12甲基化靶标的检出限小于1％。本发明人通过下列实验评估三组F12引物探针组合在10ng阴性模板DNA背景下，对F12阳性靶标的最低检出限。
各基因检测引物探针如下：
F12正向引物包括：
SEQ ID NO:100F12-F1：TTGGTAGAGCGTGGTTTCGG
SEQ ID NO:101F12-F2：CGTTTGGTAGGTATATCGGTTG
SEQ ID NO:102F12-F3：GGACGTCGGGGTTTTAAGTT
F12反向引物包括：
SEQ ID NO:103F12-R1：CGCCTTACGTTCAACCGATA
SEQ ID NO:104F12-R2：CGCCTTCAAAAAAATACGAACGAC
SEQ ID NO:105F12-R3：GTCAACTACCAACACGACCT
F12探针包括：
SEQ ID NO:106F12-P1：5’ROX-TCGCGCGGCGTCGTTTG-3’BHQ2
SEQ ID NO:107F12-P2：5’ROX-ACGTAAGGCGATAGGAGCGCGTA-3’BHQ2
SEQ ID NO:108F12-P3：5’ROX-TTTTCGTTTTCGCGGGGCGTTTT-3’BHQ2
引物探针组合1：正向引物序列：SEQ ID NO:100；反向引物序列：SEQ ID NO:103；探针序列：SEQ ID NO:106。
引物探针组合2：正向引物序列：SEQ ID NO:101；反向引物序列：SEQ ID NO:104；探针序列：SEQ ID NO:107。
引物探针组合3：正向引物序列：SEQ ID NO:102；反向引物序列：SEQ ID NO:105；探针序列：SEQ ID NO:108。
另外，对于PCR内部质控，用B2M基因作为内参，并针对其对应的亚硫酸氢盐转化后目的序列设计内控引物探针。内控检测引物探针可用的标准为：阳性对照品、阴性对照品和样本DNA检测结果出现明显的S形扩增曲线，而非模板体系(如水对照)检测结果扩增曲线不起峰。
B2M内参基因的检测引物和探针分别为：
SEQ ID NO:17B2M-F：GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA
SEQ ID NO:18B2M-R：TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT
SEQ ID NO:19B2M-P：5’CY5-TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACC-3’BHQ2
实验过程：
(1)取一支人白细胞DNA和一支Huh-7肝癌细胞系DNA，其中白细胞DNA经鉴定为F12靶标甲基化阴性，Huh-7肝癌细胞系DNA经鉴定为F12靶标甲基化阳性。将两支DNA分别稀释到10ng/μl。
(2)以白细胞DNA作为阴性背景，Huh-7肝癌细胞系DNA作为阳性模板，配制4种比例的阳性对照品。4种阳性对照品的DNA总浓度均为2ng/μl，而含F12甲基化阳性DNA的比例分别为5％、1％、0.5％、0.25，分别命名为5％ PC、1％ PC、0.5％ PC和0.25％ PC。
(3)上述不同比例的阳性对照品均分装为20μl/管，随后用ZYMO RESEARCH的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，货号D5005)对提取的gDNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，每份转化的DNA用20μl洗脱液洗脱。
(4)利用荧光定量PCR检测不同比例阳性对照品的F12甲基化水平，每种比例的阳性对照品均做12个复孔。反应体系成分及含量如表54所示。
表54
F12甲基化定量PCR配液体系
| 序号 | 组分 | 体积/反应 | 终浓度 |
| 1 | 10x PCR Buffer | 3μl | 1x |
| 2 | 50mM MgCl2 | 1.5μl | 2.5mM |
| 3 | dNTP Mix(10mM) | 0.6μl | 0.2mM |
| 4 | B2M正向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 5 | B2M反向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 6 | B2M探针(10μM) | 0.3μl | 0.15μM |
| 7 | F12正向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 8 | F12反向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 9 | F12探针(10μM) | 0.45μl | 0.15μM |
| 10 | Taq酶(5U/μl) | 0.2μl | 1U/reaction |
| 11 | 超纯水 | 15.35μl | / |
| 12 | 转化后的基因组DNA | 5μl | / |
| 总共 | 30μl | / |
荧光定量PCR扩增反应条件如表53所示。
(5)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，ROX通道的阈值线设为50000，CY5通道的阈值线设为20000，得到内参基因和靶基因的Ct值。
结果分析：
首先进行样本PCR结果有效性判定，若样本内参B2M对应的CY5通道有明显的扩增曲线且Ct值小于35，则结果有效，可用于阴阳性判断及靶标检测性能分析；若内参B2M对应的CY5通道无扩增曲线有扩增曲线且Ct值大于35，则结果无效，应进行样本重检测。本次检测的不同比例阴阳性对照品，其内参B2M对应的CY5通道均有明显的扩增曲线，且Ct值均小于35，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
使用本发明的三组F12引物探针对，检测5％ PC、1％ PC、0.5％ PC和0.25％ PC四种阳性对照品的荧光曲线示意图如图21所示。具体的阳性检出比例如表55所示。
表55 不同阳性对照品的F12甲基化靶标阳性检出比例
| 模板 | 引物探针组合1 | 引物探针组合2 | 引物探针组合3 |
| 5％PC | 12/12 | 12/12 | 12/12 |
| 1％PC | 12/12 | 12/12 | 12/12 |
| 0.5％PC | 11/12 | 11/12 | 12/12 |
| 0.25％PC | 9/12 | 7/12 | 9/12 |
结果显示，三组F12甲基化靶标检测引物探针组合能检出全部的5％ PC和1％ PC模板，而0.5％ PC模板的检测结果中，每组未检出的反应孔也不超过一个。这说明F12三组引物探针组合对靶标的阳性检出限均在1％之内，符合cfDNA样本检测的分析性能要求。
实施例18：F12在血浆cfDNA中的检测
肝癌患者的血液可能含有更多来源于肝组织的cfDNA，这是因为一方面，肝癌细胞的增殖、凋亡与坏死较正常细胞更为频繁；另一方面，癌变会导致肝部出现一定损伤，导致一些来源于正常肝细胞的DNA也释放到血液中。因此F12的组织特异甲基化标记区域具有肝癌诊断的潜能，可通过血浆分离、cfDNA提取、转化和PCR扩增，进而对肝组织来源的cfDNA进行定量分析，实现肝癌早筛早诊。
为了验证血浆cfDNA中F12甲基化标记能用于早期肝癌检测，本发明人通过下列实验评估F12甲基化标记在肝癌与非肝癌临床血浆样本中的检测效果。
各基因检测引物探针如下：
F12正向引物包括：
SEQ ID NO:100F12-F1：TTGGTAGAGCGTGGTTTCGG
SEQ ID NO:101F12-F2：CGTTTGGTAGGTATATCGGTTG
SEQ ID NO:102F12-F3：GGACGTCGGGGTTTTAAGTT
F12反向引物包括：
SEQ ID NO:103F12-R1：CGCCTTACGTTCAACCGATA
SEQ ID NO:104F12-R2：CGCCTTCAAAAAAATACGAACGAC
SEQ ID NO:105F12-R3：GTCAACTACCAACACGACCT
F12探针包括：
SEQ ID NO:106F12-P1：5’ROX-TCGCGCGGCGTCGTTTG-3’BHQ2
SEQ ID NO:107F12-P2：5’ROX-ACGTAAGGCGATAGGAGCGCGTA-3’BHQ2
SEQ ID NO:108F12-P3：5’ROX-TTTTCGTTTTCGCGGGGCGTTTT-3’BHQ2
引物探针组合1：正向引物序列：SEQ ID NO:100；反向引物序列：SEQ ID NO:103；探针序列：SEQ ID NO:106。
引物探针组合2：正向引物序列：SEQ ID NO:101；反向引物序列：SEQ ID NO:104；探针序列：SEQ ID NO:107。
引物探针组合3：正向引物序列：SEQ ID NO:102；反向引物序列：SEQ ID NO:105；探针序列：SEQ ID NO:108。
另外，对于PCR内部质控，用B2M基因作为内参，并针对其对应的亚硫酸氢盐转化后目的序列设计内控引物探针。内控检测引物探针可用的标准为：阳性对照品、阴性对照品和样本DNA检测结果出现明显的S形扩增曲线，而非模板体系(如水对照)检测结果扩增曲线不起峰。
B2M内参基因的检测引物和探针分别为：
SEQ ID NO:17B2M-F：GTAGGTTTGGGTAATTTTAAATAGTGGA
SEQ ID NO:18B2M-R：TTCTTTCAAAATATCATCCCCCAAT
SEQ ID NO:19B2M-P：5’CY5-TTCCTACAAATCTTCCCCCAAACACC-3’BHQ2
样本信息：
400例血浆样本，包括200例肝癌患者样本和200例非肝癌对照样本，200例对照组样本中包含健康人样本30例，乙肝患者样本100例，肝硬化患者70例。
实验过程：
(1)收集肝癌患者及对照人群的血浆样本，使用天根的磁珠法大体积游离核酸提取试剂盒(货号DP710)提取血浆游离DNA(每例血浆样本取1ml用于cfDNA提取)。
(2)使用ZYMO RESEARCH的DNA转化试剂盒(EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，货号D5005)对提取的游离DNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化，得到转化后的cfDNA。
(3)利用荧光定量PCR检测转化后cfDNA中F12甲基化水平。配制PCR检测反应体系，反应体系成分及含量如表56所示。
表56
cfDNA甲基化定量PCR配液体系
| 序号 | 组分 | 体积/反应 | 终浓度 |
| 1 | 10x PCR Buffer | 3μl | 1x |
| 2 | 50mM MgCl2 | 1.5μl | 2.5mM |
| 3 | dNTP Mix(10mM) | 0.6μl | 0.2mM |
| 4 | B2M正向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 5 | B2M反向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 6 | B2M探针(10μM) | 0.3μl | 0.1μM |
| 7 | F12正向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 8 | F12反向引物(10μM) | 0.9μl | 0.3μM |
| 9 | F12探针(10μM) | 0.45μl | 0.15μM |
| 10 | Taq酶(5U/μl) | 0.3μl | 1U/reaction |
| 11 | 超纯水 | 15.35μl | / |
| 12 | 转化后的cfDNA | 5μl | / |
| 总共 | 30μl | / |
荧光定量PCR扩增反应条件如表53所示。
(4)数据处理：自动设置基线，手动设置阈值线。根据实际的荧光曲线，ROX通道的阈值线设为50000，CY5通道的阈值线设为20000，得到内参基因和靶基因的Ct值。
结果判定：
首先进行样本PCR结果有效性判定，若样本内参B2M对应的CY5通道有明显的扩增曲线且Ct值小于35，则结果有效，可用于阴阳性判断及靶标检测性能分析；若内参B2M对应的CY5通道无扩增曲线有扩增曲线且Ct值大于35，则结果无效，应进行样本重检测。本次检测的400例血浆样本，其内参B2M对应的CY5通道均有明显的扩增曲线，且Ct值均小于35，故检测结果有效，可用于后续数据分析。
利用ROC曲线对3组F12引物探针组合的400例血样本检测结果进行分析，其中Ct值为检验变量，病理结果为状态变量，计算出的约登指数(灵敏度+特异性-1)最大值对应的Ct即为Cutoff值。若样本Ct≤Cutoff值则结果为甲基化阳性；反之，若样本Ct>Cutoff值则结果为甲基化阴性。
三组F12甲基化检测引物探针区分肝癌患者与对照人群血浆样本的性能(AUC值、灵敏度、特异性、Cutoff值)分析如表57和图22所示：
表57
血浆样本检测性能对比
| 性能 | 引物探针组合1 | 引物探针组合2 | 引物探针组合3 |
| AUC值 | 0.880 | 0.904 | 0.864 |
| Cutoff值(Ct) | 36.25 | 35.14 | 36.40 |
| 灵敏度 | 83.5％ | 84.0％ | 78.5％ |
| 特异性 | 79.0％ | 80.0％ | 83.0％ |
| 约登指数 | 0.625 | 0.640 | 0.615 |
400例肝癌患者/对照人群血浆样本的检测结果显示，在特异性约79-83％的情况下，F12甲基化标记的检测灵敏度在78.5-84％之间。其对肝癌的检测灵敏度高于现行的AFP血清学检测方法。故本发明的F12甲基化检测产品可作为一种补充技术用于肝癌的早期筛查和辅助诊断。
综合实施例15-18，本发明通过检测F12基因启动子区的一段DNA序列甲基化水平，可有效鉴别血浆中来源于肝组织的cfDNA。利用其组织溯源和定量分析性能，F12甲基化标记及其对应的检测试剂盒、检测方法既能单独应用，也能与其它核酸靶标与蛋白靶标联合地应用与肝癌高危人群的筛查与辅助诊断。
实施例19：基于蛋白生物标记物的检测
1.材料与方法
1.1研究对象：从合作单位收集的确诊为早期肝细胞癌的初诊患者120例，中晚期肝癌患者85例；慢性乙型肝炎病毒感染对照组患者93例，包括胆管疾病9例，胆囊疾病12例，肝炎疾病40例，肝硬化25例，肝囊肿5例、肝血管瘤1例和局灶性结节性增生1例。
其中入选的肝硬化患者诊断符合以下标准：参考《乙型肝炎纺织指南》，临床特征或影像学诊断为肝硬化；肝穿病理组织学诊断标准提示存在肝硬化；病例相关信息均完整；排除肝癌及其他恶性肿瘤。
1.2血浆蛋白水平检测
蛋白水平的检测采用化学发光免疫分析仪和流式荧光法进行定量检测。所有数据通过标准曲线进行返回样本的实际浓度，后采用统计软件进行统计分析。
1.3蛋白单独和联合检测的数据处理分析
DCP和AFP等单独或联合检测的数据处理，通过SPSS统计学软件进行ROC曲线分析，确定DCP和AFP对早中晚期肝癌进行诊断的诊断临界值(Cut-off)。血浆DCP和AFP水平相对其相应的诊断临界值的倍数采用Mcut-off表示。本发明通过Mcut-off之和乘以相应比重来评价联合检测在早期HCC的诊断价值。
1.4诊断模式的确定
通过DCP和AFP等单独或联合检测，再根据患者和对照组血浆中表达水平，以在早期HCC中存在明显身高的指标或存在明显降低的指标的水平建立不同诊断模式的原则来达到诊断和鉴别诊断的目的。然后采用ROC曲线分析不同诊断模式的曲线下面积，以曲线下面积较大的诊断模式确定为诊断早期肝癌的诊断模式，评价在早期肝癌诊断中的诊断价值。
1.5统计学分析
采用SPSS统计学软件完成，实验数据采用中位数(四分位间距)表示，多项目联合建立的诊断模式采用逻辑回归，其诊断采用相应指标检测结果计算所得的指数表示。两组人群比较采用Pearson Chi-square test，两组间数据比较采用Mann-Whitney U检验，ROC曲线确定诊断临界值、曲线下面积、诊断灵敏度和特异性。所有检验的统计显著性通过双尾检验确定位P<0.05。
2.结果
表58 病人特征及不同蛋白联合检测的数据
上述各种标志物在标记为*的肝癌组与慢性肝炎病毒感染比较均有显著性差异(P<0.05)
2.3不同诊断模式比较分析
2.3.1单诊断标志物ROC曲线分析
单独分析AFP在早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC结果如图23(AUC＝0.831，P＜0.001)，或者在中晚期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC结果如图24(AUC＝0.855，P＜0.001)，可见在保证特异性大于95％的条件下，灵敏度均不足80％(70.00％和74.63％)，表明单独AFP检测筛查肝癌灵敏度不足。
单独分析DCP在早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC结果如图25(AUC＝0.664，P＜0.001)，或者在中晚期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC结果如图26(AUC＝0.747，P＜0.001)，可见在保证特异性大于95％的条件下，灵敏度均不足80％(33.33％和50.73％)，表明单独DCP检测筛查肝癌灵敏度不足，但是从检测结果中可见对AFP检测可做适当的补充，提高肝癌筛查的灵敏度。
单独分析MCP-1在早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC结果如图27(AUC＝0.673，P＜0.001)，或者在中晚期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC结果如图28(AUC＝0.724，P＜0.001)，可见在保证特异性大于95％的条件下，灵敏度均不足80％(20.83％和25.37％)，表明单独MCP-1检测筛查肝癌灵敏度不足。
单独分析GDF-15在早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC结果如图29(AUC＝0.809，P＜0.001)，或者在中晚期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC结果如图30(AUC＝806，P＜0.001)，可见在保证特异性大于95％的条件下，灵敏度均不足80％(38.33％和36.10％)，表明单独GDF-15检测筛查肝癌灵敏度不足。
2.3.2 AFP+DCP联合逻辑回归ROC曲线分析
当将AFP和DCP联合逻辑回归进行ROC曲线分析时，回归模型表示为LAD，在早期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC结果如图31(AUC＝0.856)，或者在中晚期肝癌与慢性乙肝病毒感染患者中的水平差异的ROC结果如图32(AUC＝0.888)，可见在保证特异性大于95％的条件下，灵敏度均不足80％(70.3％和76.10％)，表明AFP+DCP筛查肝癌灵敏度仍不满足诊断特异性超过95％，诊断灵敏度超过90％。
2.3.3 AFP+DCP+联合诊断标志物逻辑回归ROC曲线分析
当将AFP+DCP+MCP-1联合逻辑回归进行ROC曲线分析时，回归模型表示为LADM，在保证特异性大于95％的条件下，灵敏度为0.916％，AUC为0.958，对应逻辑回归方程为：Y＝(-26.0574)+3.4124*log(AFP)+4.0796*log(DCP)+7.6454*log(MCP1)，Mcut-off为0.380(图33)。
当将AFP+DCP+GDF-15联合逻辑回归进行ROC曲线分析时，回归模型表示为LADG，在保证特异性大于95％的条件下，灵敏度为92.67％，AUC为0.972，对应逻辑回归方程为：Y＝(-27.271)+4.683*log(AFP)+2.775*log(DCP)+6.716*log(GDF15)，Mcut-off为0.466(图34)。
当将AFP+DCP+MCP-1+GDF-15联合逻辑回归进行ROC曲线分析时，回归模型表示为LADMG，在保证特异性大于95％的条件下，灵敏度为94.2％，AUC为0.986，对应逻辑回归方程为：Y＝(-44.609)+4.275*log(AFP)+3.393*log(DCP)+6.730*log(MCP1)++6.885*log(MCP1)，Mcut-off为0.521(图35)。
2.4最优诊断模式的选择和验证
通过对诊断模式的比较分析，选择AFP+DCP+MCP-1和AFP+DCP+GDF-15联合检测均能满足诊断特异性超过95％，同时诊断灵敏度超过90％。选择更好的组合AFP+DCP+GDF-15进行验证。根据Youden指数最大原则，以0.508为Mcut-off。在训练组中，对早期肝癌的特异性为96.78％，诊断灵敏度为93.61％，曲线下面积AUC为0.975；在验证组中，对早期肝癌的特异性为95.92％，诊断灵敏度为93.86％，曲线下面积AUC为0.964；由于模型的Youden指数几乎相同并符合最大值的原则，模型的灵敏度和特异性接近，可得出该模型可用于对早期肝癌的筛查诊断。
3.讨论
综上所述，联合诊断模式是一种适用于诊断早期肝癌的一种诊断模式，诊断的结果明显优于AFP和DCP单独或联合使用。当然，对于少部分结果为阴性的病例，可通过MRI和随访等手段来进一步提高诊断效率。
本专利的实施例只是针对一定数量的临床样本进行分析所得的结果，但是已经能够获得本专利所描述的目的，所有以这几种标志物联合检测分析的情形均在作者要求内。
实施例20:筛选能够预测病毒性肝炎患者高风险人群发生肝癌可能性的特异性miRNAs分子标记
收集了其中发生肝癌的患者的确诊患病的半年至一年半以前的血浆，筛选出与未发生肝癌者相比差异表达的miRNAs谱，筛选能够预测病毒性肝炎患者高风险人群发生肝癌的可能性的特异性miRNAs分子标记。
研究用的血浆样本中，慢性乙肝表面抗原(HBsAg)阳性(HBsAg-阳性)的患者70例，丙型肝炎患者40例，肝癌患者80例；
针对上述样本进行二代测序筛选二者之间的差异表达miRNAs谱，得到10个差异表达的miRNAs(见表59)。
表59 差异表达的miRNAs
通过进一步扩大样本量，获取30个慢性乙肝病毒感染患者及40个极早期肝癌患者作为训练集，用定量RT-PCR方法对10个候选miRNAs进行进一步的验证。结果发现，下列6个miRNAs可以显著地区分干扰组及肝癌组：hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516和hsa-miR-6803-3p，在早期肝癌患者中它们的表达的上调或下调与表59相符，该结果表明这6个循环miRNAs是肝癌筛查的新的标志物。
各个miRNA的序列分别如下：
hsa-miR-4516-3p：GGGAGAAGGGUCGGGGC(SEQ ID NO:109)
hsa-miR-374c-5p：AUAAUACAACCUGCUAAGUGCU(SEQ ID NO:110)
hsa-miR-92b-3p：UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC(SEQ ID NO:111)
hsa-miR-205-5p：UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUG(SEQ ID NO:112)
hsa-miR-6803-3p：UCCCUCGCCUUCUCACCCUCAG(SEQ ID NO:113)
hsa-miR-33b-3p：CAGUGCCUCGGCAGUGCAGCCC(SEQ ID NO:114)
实施例21:miRNA检测试剂准备及病人血浆进行检测
1.引物设计
设计如下逆转录引物和上下引物及探针：
针对hsa-miR-33b-3p:
逆转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGGCTGCA-3’(SEQ IDNO:115)
上游引物：5’-ATTCATCAGTGCCTCGGCAG-3’(SEQ ID NO:116)
下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’(SEQ ID NO:117)
探针：5’-TTCAGTTGAGGGGCTGCA-3’(SEQ ID NO:118)。该探针的5’端带有FAM；3’端带有MGB。
针对hsa-miR-92b-3p:
逆转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGAGGCCG-3’(SEQ IDNO:119)
上游引物：5’-ACAGCGTATTGCACTCGTCC-3’(SEQ ID NO:120)
下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’(SEQ ID NO:121)
探针：5’-TTCAGTTGAGGGAGGCCG-3’(SEQ ID NO:122)。该探针的5’端带有FAM；3’端带有MGB。
针对hsa-miR-205-5p:
逆转录引物：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAGACTCC-3’(SEQ IDNO:123)
上游引物：5’-GCCGAGTCCTTCATTCCACC-3’(SEQ ID NO:124)
下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’(SEQ ID NO:125)
探针：5’-TTCAGTTGAGCAGACTCC-3’(SEQ ID NO:126)。该探针的5’端带有FAM；3’端带有MGB。
针对hsa-miR-374c-5p:
逆转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAGCACTTA-3’(SEQ IDNO:127)
上游引物：5’-CGTCCGAGATAATACAACCTGC-3’(SEQ ID NO:128)
下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’(SEQ ID NO:129)
探针：5’-TTCAGTTGAGAGCACTTA-3’(SEQ ID NO:130)。该探针的5’端带有FAM；3’端带有MGB。
针对hsa-miR-4516-3p:
逆转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCCCCGAC-3’(SEQ IDNO:131)
上游引物：5’-AACTATCGTACCGGGAGAAGG-3’(SEQ ID NO:132)
下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’(SEQ ID NO:133)
探针：5’-TTCAGTTGAGGCCCCGAC-3’(SEQ ID NO:134)。该探针的5’端带有FAM；3’端带有MGB。
针对hsa-miR-6803-3p:
逆转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCTGAGGGT-3’(SEQ IDNO:135)
上游引物：5’-ATAGAGTCCCTCGCCTTCTC-3’(SEQ ID NO:136)
下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’(SEQ ID NO:137)
探针：5’-TTCAGTTGAGCTGAGGGT-3’(SEQ ID NO:138)。该探针的5’端带有FAM；3’端带有MGB。
以hsa-miR-16-5p为内参，相关引物如下：
逆转录引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA-3’(SEQ IDNO:139)
上游引物：5’-GCCGAGTAGCAGCACGTAAA-3’(SEQ ID NO:140)
下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’(SEQ ID NO:141)
探针：5’-TTCAGTTGAGCGCCAATA-3’(SEQ ID NO:142)。该探针的5’端带有FAM；3’端带有MGB。
以Cel-miR-39-5p为外参，相关引物如下：
逆转录引物：
5’-CTCAACTGGTGTC GTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCAAGCTGA-3’(SEQ ID NO:143)
上游引物：5’-GCCGAGTCACCGGGTGTAAA-3’(SEQ ID NO:144)
下游引物：5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’(SEQ ID NO:145)
探针：5’-TTCAGTTGAGCAAGCTGA-3’(SEQ ID NO:146)。该探针的5’端带有FAM；3’端带有MGB。
2.总RNA抽提
运用柱提取法，对病人血浆进行总RNA提取，具体步骤如下：
a)使用2.0mL离心管，取0.2mL血浆样本加入0.3mL的结合液和0.3mL的裂解液(请注意查看是否加入β-巯基乙醇)，涡旋混匀15s；
b)放在60℃的电热恒温鼓风干燥箱中孵育10min；
c)孵育结束后取出，并加入0.75mL的无水乙醇，涡旋混匀15s；
d)1250rpm离心1min，小心去上清，但要保证碳化硅不被丢弃；
e)加入0.3mL裂解液(请注意查看是否加入β-巯基乙醇)，涡旋混匀15s；
f)重复步骤3.2；
g)孵育结束后取出，并加入0.3mL的无水乙醇，涡旋混匀15s；
h)取650μL上述混合液加入至RNA纯化柱中，14000rpm离心1min，弃废液；
i)重复3.8直至混合液完全转移至RNA纯化柱中；
j)加入400μL清洗液，14000rpm离心1min，弃废液；
k)重复3.10两次；
l)14000rpm离心3min，弃收集管；
m)将RNA纯化柱放入1.5mL EP管中，加入30μL洗脱液，2000rpm离心2min，随后14000rpm离心3min，将RNA纯化柱取出，得到RNA洗脱液。
3.样本RNA逆转录反应
各取5μL抽提好的样本RNA，阳性对照RNA，阴性对照加入逆转录的缓冲液5μL，震荡混匀后，备用。随后加入10μL逆转录酶混合液。逆转录反应体系如表60所示。
表60
逆转录反应体系
其中，逆转录过程中的条件如下：16℃-30min，42℃-30min，85℃-5min。
4.样本cDNA荧光定量PCR检测
逆转录得到的cDNA片段，在独立的反应孔中分别对hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p、hsa-miR-16、Cel-miR-39进行荧光定量PCR检测，并用Applied Biosystems 7500Real-Time PCRSystem软件分析结果。
其中，每个反应孔中荧光定量PCR检测体系如表61所示。
表61 荧光定量PCR检测体系
荧光定量PCR的循环次数为45，具体的，在95℃预变性4分钟，95℃变性15秒，60℃复性30秒。
荧光定量PCR结果，阳性对照的扩增曲线呈典型的S型曲线，且Ct值均小于40，认为是阳性扩增曲线；而阴性对照的扩增曲线不呈S型，Ct值大于40，认为是阴性扩增曲线。
将早期肝癌特异性分子标记的Ct值和内参和外参的Ct值相减，得到的差值(ΔCt)作为后续ROC曲线分析的协变量。
5.样本通过逻辑模型联合分析用于判断肝癌发生的可行性
将独立反应孔中的hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p与hsa-miR-16、Cel-miR-39的Ct值相减，得到的差值作为协变量，用于ROC曲线分析，较优但不仅限于利用下述logistic regression方程及临界值判断肝癌发生的可行性进行判定。
所述逻辑回归计算公式为：P＝eK/(1+eK)。
上式中，P为综合指数，其范围为0<P<1；e为自然常数；K＝(0.15501)+(0.01785)hsa-miR-33B-3p+(-0.02857)hsa-miR-92B-3p+(-0.01955)miR-205-5p+(0.03704)miR-374C-5p+(0.04277)miR-4516-3p+(0.04277)miR-6803-3p。模型中的P值的cutoff值介于0～1之间，较优为0.3～0.5之间。待测样本经模型分析后若P值高于cutoff值，则认为是极早期肝癌高危患者。
实施例22:制备一种基于miRNA检测的肝癌检测试剂盒
本实施例中，以实施例21中设计的检测试剂，制备包含如下组分或组件的试剂盒：RNA提取试剂、针对每一待测miRNAs及内参的逆转录试剂、针对每一待测miRNAs及内外参的PCR扩增上游引物及下游引物、无RNA酶的纯水、阴性质控品、阳性质控品。
1)RNA提取试剂：本实施例中使用的是柱提取法试剂(Norgen公司，加拿大)；
2)逆转录引物、正向引物、反向引物、寡核苷酸探针，及阳性对照，委托英潍捷基贸易有限公司合成；
3)逆转录酶M-MLV、逆转录反应体系、核酸扩增酶及定量PCR反应体系购自赛默飞公司。
4)、阴性质控品为灭菌生理盐水，阳性质控品为各1×106拷贝数的hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p、hsa-miR-16、Cel-miR-39寡核苷酸
上述每一种试剂置于独立的试剂瓶或管中，将这些试剂瓶或管有效分隔，集中包装于包装盒中。
实施例23:miRNA样本验证试剂盒应用于早期肝癌检测的特异性和灵敏度
为了进一步验证实施例21制备的试剂盒应用于无症状高风险个体的群体的极早期肝癌鉴定的特异性、敏感性，获取100个受试者的血浆样本(验证集，其中60例慢性乙肝患者，40例极早期肝癌患者)，验证上述miRNA组合(hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p)应用于早期肝癌检测的特异性和敏感性。以并行检测AFP的结果作为对比。预测概率被用来建立受试者工作特征曲线(见图36)。miRNA多靶标联合诊断模型性能与AFP单标记检测性能对比结果如表62所示。
表62
miRNA多靶标联合诊断模型性能与AFP单标记检测性能对比
| 灵敏度 | 特异性 | 约登指数 | |
| miRNA联检 | 82.5％ | 88.3％ | 0.705 |
| AFP单标记 | 62.5％ | 85.0％ | 0.475 |
实施例24:miRNA检测试剂盒的临床应用
对于医院随访的慢性HBsAg-阳性患者，收集患者的血清，如实施例21的方法抽提RNA逆转录，以上述miRNA组合(hsa-miR-33B-3p、hsa-miR-92B-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-374C-5p、hsa-miR-4516-3p和hsa-miR-6803-3p)作为标志物，以hsa-miR-16和Cel-miR-39作为内外参，以实施例21设计的引物和探针进行定量PCR检测。cutoff值设为0.438。如实施例21对样本进行模型分析，如果测得的cutoff值高于0.438，则认为是极早期肝癌高危患者，建议后续进行积极随访检查和治疗。
在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
尽管在本申请中已经将权利要求阐述为特征的特定组合，但应该理解的是，本公开的范围还包括本文明确或隐含地公开的任何新颖特征或任何新颖特征组合或其任何概括，无论它是否涉及与任何权利要求中目前要求保护的相同的发明，并且无论它是否减轻了与本发明相同的技术问题中的任何一个或全部问题。申请人在此提供通知，在本申请或由此衍生的任何进一步申请的审查期间，新的权利要求可以被制定为这样的特征和/或特征的组合。
尽管已经示出和描述了一些实施例，但是本领域技术人员应该理解，在不脱离本发明的原理的情况下可以对这些实施例进行改变，本发明的范围在权利要求中限定。
本领域技术人员会理解，在不脱离本发明的全部范围和精神的情况下，可对本申请描述的部件、方法、步骤、结构、运动、配合进行修改(添加和/或去除)，本发明的范围和精神涵盖这样的修改以及其任何和全部等同物。
序列(SEQ ID NO)列表：
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本申请涉及如下方面的技术方案：
1.一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含选自基因核酸甲基化检测试剂、蛋白检测试剂、和/或miRNA检测试剂的一种或多种试剂。
2.根据项1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含基因核酸甲基化检测试剂、蛋白检测试剂、和miRNA检测试剂。
3.根据项1或2所述的试剂盒，其特征在于，包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含选自CDKL2、USP44、ZNF783和F12的一个，两个，三个，或全部四个基因。
4.根据项1或2所述的试剂盒，其特征在于，包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含选自CDKL2、USP44、和ZNF783的一个或多个基因。
5.根据项1或2所述的试剂盒，其特征在于，包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含选自CDKL2、USP44、和ZNF783的至少两个基因。
6.根据项1或2所述的试剂盒，其特征在于，包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含CDKL2、USP44、和ZNF783三个基因。
7.根据项1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，用B2M基因作为核酸甲基化的内参，并选取不含GpG位点的B2M片段作为目的序列。
8.根据项3-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述CDKL2基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:1序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
9.根据项8所述的试剂盒，其特征在于，所述CDKL2基因甲基化检测试剂包含选自SEQID NO:57-59的正向引物，选自SEQ ID NO:60-62的反向引物，和选自SEQ ID NO:
63-65的探针。
10.根据项3-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述USP44基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:2序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
11根据项10所述的试剂盒，其特征在于，所述USP44基因甲基化检测试剂包含选自SEQID NO:71-73的正向引物，选自SEQ ID NO:74-76的反向引物，和选自SEQ ID NO:
77-79的探针。
12.根据项3-11任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述ZNF783基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:3序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
13.根据项12所述的试剂盒，其特征在于，所述ZNF783基因甲基化检测试剂包含选自SEQID NO:85-87的正向引物，选自SEQ ID NO:88-90的反向引物，和选自SEQ ID NO:
91-93的探针。
14.根据项3-13任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
15.根据项14所述的试剂盒，其特征在于，所述F12基因甲基化检测试剂包含选自SEQ IDNO:100-102的正向引物，选自SEQ ID NO:103-105的反向引物，和选自SEQ ID NO:
106-108的探针。
16.根据项1-15任一项所述的试剂盒，其特征在于，在对甲基化标记基因进行检测之前，将所述核酸进行亚硫酸盐转化。
17.根据项1-16任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸为血浆游离核酸。
18.根据项17所述的试剂盒，其特征在于，所述血浆游离核酸为血浆游离DNA。
19.根据项17或18所述的试剂盒，其特征在于，还包含针对血浆或血清的游离核酸提取试剂；优选地，所述血浆游离核酸提取试剂通过磁珠法提取并纯化血浆游离核酸。
20.根据项1-19任一项所述的试剂盒，其特征在于，每个基因核酸甲基化的检测试剂包含至少一个正向引物，至少一个反向引物，和/或至少一个探针。
21.根据项1-20任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含蛋白检测试剂，所述蛋白包含选自甲胎蛋白(AFP)、异常凝血酶原(DCP)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和生长分化因子-15(GDF-15)的一个、两个，三个，或全部四个蛋白。
22.根据项21所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白包含AFP蛋白或DCP蛋白。
23.根据项21所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白包含AFP和DCP两个蛋白。
24.根据项21-23任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白检测试剂是用于选自ELISA、化学发光、免疫荧光、和流式芯片的一种或多种检测的检测试剂。
25.根据项1-24任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白为血浆或血清样本的蛋白。
26.根据项25所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含针对血浆或血清样本的蛋白提取试剂。
27.根据项1-26任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测miRNA的检测试剂，所述miRNA包含选自hsa-miR-33B-3p，hsa-miR-92B-3p，hsa-miR-205-5p，hsa-miR-374C-5p，hsa-miR-4516-3p，和hsa-miR-6803-3p的一个、两个，三个，四个，五个，或全部六个miRNA。
28.根据项27所述的试剂盒，其特征在于，所述miRNA包含选自hsa-miR-92b-3p、
hsa-miR-374c-5p、和hsa-miR-6803-3p的一个或多个miRNA。
29.根据项27所述的试剂盒，其特征在于，所述miRNA包含选自hsa-miR-92b-3p、
hsa-miR-374c-5p、和hsa-miR-6803-3p的至少两个miRNA。
30.根据项27所述的试剂盒，其特征在于，所述miRNA包含hsa-miR-92b-3p、
hsa-miR-374c-5p、和hsa-miR-6803-3p三个miRNA。
31.根据项1-30任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包含检测内参miRNA的检测试剂，所述内参miRNA是hsa-miR-16-5p。
32.根据项1-31任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包含检测外参miRNA的检测试剂，所述外参miRNA是Cel-miR-39-5p。
33.根据项27-32任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述miRNA检测试剂包含至少一个逆转录引物，至少一个扩增引物，和/或至少一个探针。
34.根据项33所述的试剂盒，其特征在于：
(i)所述检测hsa-miR-33B-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:115所示的逆转录引物、SEQID NO:116和SEQ ID NO:117所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:118所示的探针；
(ii)所述检测hsa-miR-92B-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:119所示的逆转录引物、SEQID NO:120和SEQ ID NO:121所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:122所示的探针；
(iii)所述检测hsa-miR-205-5p的检测试剂包含SEQ ID NO:123所示的逆转录引物、
SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:125所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:126所示的探针；
(iv)所述检测hsa-miR-374C-5p的检测试剂包含SEQ ID NO:127所示的逆转录引物、
SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:130所示的探针；
(v)所述检测hsa-miR-4516-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:131所示的逆转录引物、
SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:134所示的探针；和/或
(vi)所述检测hsa-miR-6803-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:135所示的逆转录引物、
SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:138所示的探针。35.根据项1-34任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述miRNA为血浆或血清样本的miRNA。
36.根据项35所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括针对血浆或血清样本的miRNA提取试剂。
37.根据项1-36任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含针对表13中任一标志物组合的检测试剂。
38.根据项1-36任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含:
(a)针对CDKL2、USP44和ZNF783基因核酸甲基化的检测试剂；
(b)针对hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p和hsa-miR-6803-3p的检测试剂；以及
(c)针对AFP和DCP蛋白的检测试剂。
39.根据项1-36任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含:
(a)针对CDKL2、USP44和ZNF783基因核酸甲基化的检测试剂；
(b)针对hsa-miR-92b-3p和hsa-miR-6803-3p的检测试剂；以及
(c)针对AFP和DCP蛋白的检测试剂。
40.根据项1-36任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含:
(a)针对CDKL2、USP44、ZNF783和F12基因核酸甲基化的检测试剂；
(b)针对hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p和hsa-miR-6803-3p的检测试剂；以及
(c)针对AFP和DCP蛋白的检测试剂。
41.根据项1-40任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述肝癌包括早期肝癌。
42.根据项1-41任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是针对血浆或血清样本。
43.根据项42所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含针对血浆或血清样本处理的试剂。
44.根据项1-43任一项所述的试剂盒在制备肝癌检测的产品的应用。
45.一种生物标记物检测产品在制备肝癌检测的产品的用途，其特征在于，所述产品包含以下三类标记检测的一种或多种：
(i)基因核酸甲基化检测；
(ii)蛋白检测；和/或
(iii)miRNA检测。
46.根据项45所述的用途，其特征在于，所述产品包含以下三类标记检测：
(i)基因核酸甲基化检测；
(ii)蛋白检测；和
(iii)miRNA检测。
47.根据项45或46所述的用途，其特征在于，所述基因包含选自CDKL2、USP44、ZNF783和F12的一个，两个，三个，或全部四个基因。
48.根据项45或46所述的用途，其特征在于，所述基因包含选自CDKL2、USP44、和ZNF783的一个或多个基因。
49.根据项45或46所述的用途，其特征在于，所述基因包含选自CDKL2、USP44、和ZNF783的至少两个基因。
50.根据项45或46所述的用途，其特征在于，所述基因包含CDKL2、USP44、和ZNF783三个基因。
51.根据项45-50任一项所述的用途，其特征在于，用B2M基因作为核酸甲基化的内参，并选取不含GpG位点的B2M片段作为目的序列。
52.根据项47-51任一项所述的用途，其特征在于，所述CDKL2基因甲基化检测所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:1序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
53.根据项52所述的用途，其特征在于，所述CDKL2基因甲基化检测的试剂包含选自SEQID NO:57-59的正向引物，选自SEQ ID NO:60-62的反向引物，和选自SEQ ID NO:
63-65的探针。
54.根据项47-53任一项所述的用途，其特征在于，所述USP44基因甲基化检测所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:2序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
55.根据项54所述的用途，其特征在于，所述USP44基因甲基化检测的试剂包含选自SEQID NO:71-73的正向引物，选自SEQ ID NO:74-76的反向引物，和选自SEQ ID NO:
77-79的探针。
56.根据项47-55任一项所述的用途，其特征在于，所述ZNF783基因甲基化检测所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:3序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
57.根据项56所述的用途，其特征在于，所述ZNF783基因甲基化检测的试剂包含选自SEQID NO:85-87的正向引物，选自SEQ ID NO:88-90的反向引物，和选自SEQ ID NO:
91-93的探针。
58.根据项47-57任一项所述的用途，其特征在于，所述F12基因甲基化检测所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:4序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
59.根据项58所述的用途，其特征在于，所述F12基因甲基化检测的试剂包含选自SEQ IDNO:100-102的正向引物，选自SEQ ID NO:103-105的反向引物，和选自SEQ ID NO:
106-108的探针。
60.根据项45-59任一项所述的用途，其特征在于，在对甲基化标记基因进行检测之前，将所述核酸进行亚硫酸盐转化。
61.根据项45-60任一项所述的用途，其特征在于，所述核酸为血浆游离核酸。
62.根据项61所述的用途，其特征在于，所述血浆游离核酸为血浆游离DNA。
63.根据项61或62所述的用途，其特征在于，还包含针对血浆或血清的游离核酸提取步骤；
优选地，所述血浆游离核酸提取步骤通过磁珠法提取并纯化血浆游离核酸。
64.根据项45-63任一项所述的用途，其特征在于，每个基因核酸甲基化的检测使用至少一个正向引物，至少一个反向引物，和/或至少一个探针。
65.根据项45-64任一项所述的用途，其特征在于，所述蛋白包含选自AFP、DCP、MCP-1、和/或GDF-15的一个、两个，三个，或全部四个蛋白。
66.根据项65所述的用途，其特征在于，所述蛋白包含AFP蛋白或DCP蛋白。
67.根据项65所述的用途，其特征在于，所述蛋白包含AFP和DCP两个蛋白。
68.根据项65-67任一项所述的用途，其特征在于，所述蛋白检测是用于选自ELISA、化学发光、免疫荧光、和流式芯片的一种或多种检测方法。
69.根据项45-68任一项所述的用途，其特征在于，所述蛋白为血浆或血清样本的蛋白。
70.根据项69所述的用途，其特征在于，所述用途包含针对血浆或血清样本的蛋白提取步骤。
71.根据项45-70任一项所述的用途，其特征在于，所述miRNA包含选自hsa-miR-33B-3p，hsa-miR-92B-3p，hsa-miR-205-5p，hsa-miR-374C-5p，hsa-miR-4516-3p，和hsa-miR-6803-3p的一个、两个，三个，四个，五个，或全部六个miRNA。
72.根据项71所述的用途，其特征在于，所述miRNA包含选自hsa-miR-92b-3p、
hsa-miR-374c-5p、和hsa-miR-6803-3p的一个或多个miRNA。
73.根据项71所述的用途，其特征在于，所述miRNA包含选自hsa-miR-92b-3p、
hsa-miR-374c-5p、和hsa-miR-6803-3p的至少两个miRNA。
74.根据项71所述的用途，其特征在于，所述miRNA包含hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p、和hsa-miR-6803-3p三个miRNA。
75.根据项45-74任一项所述的用途，其特征在于，还包含检测内参miRNA的检测，所述内参miRNA是hsa-miR-16-5p。
76.根据项45-75任一项所述的用途，其特征在于，还包含检测外参miRNA的检测，所述外参miRNA是Cel-miR-39-5p。
77.根据项71-76任一项所述的用途，其特征在于，所述miRNA检测使用至少一个逆转录引物，至少一个扩增引物，和/或至少一个探针。
78.根据项77所述的用途，其特征在于：
(i)所述检测hsa-miR-33B-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:115所示的逆转录引物、SEQ ID NO:116和SEQ ID NO:117所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:118所示的探针；
(ii)所述检测hsa-miR-92B-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:119所示的逆转录引物、SEQ ID NO:120和SEQ ID NO:121所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:122所示的探针；
(iii)所述检测hsa-miR-205-5p的检测试剂包含SEQ ID NO:123所示的逆转录引物、SEQ ID NO:124和SEQ ID NO:125所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:126所示的探针；
(iv)所述检测hsa-miR-374C-5p的检测试剂包含SEQ ID NO:127所示的逆转录引物、SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:129所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:130所示的探针；
(v)所述检测hsa-miR-4516-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:131所示的逆转录引物、SEQ ID NO:132和SEQ ID NO:133所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:134所示的探针；和/或
(vi)所述检测hsa-miR-6803-3p的检测试剂包含SEQ ID NO:135所示的逆转录引物、SEQ ID NO:136和SEQ ID NO:137所示的扩增引物，和/或SEQ ID NO:138所示的探针。
79.根据项45-78任一项所述的用途，其特征在于，所述miRNA为血浆或血清样本的miRNA。
80.根据项79所述的用途，其特征在于，所述用途还包括针对血浆或血清样本的miRNA提取的步骤。
81.根据项45-80任一项所述的用途，其特征在于，所述产品包含针对表13中任一标志物组合的检测。
82.根据项45-80任一项所述的用途，其特征在于，所述产品包含:
(a)针对CDKL2、USP44和ZNF783基因核酸甲基化的检测；
(b)针对hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p和hsa-miR-6803-3p的检测；以及
(c)针对AFP和DCP蛋白的检测。
83.根据项45-80任一项所述的用途，其特征在于，所述产品包含:
(a)针对CDKL2、USP44和ZNF783基因核酸甲基化的检测；
(b)针对hsa-miR-92b-3p和hsa-miR-6803-3p的检测；以及
(c)针对AFP和DCP蛋白的检测。
84.根据项45-80任一项所述的用途，其特征在于，所述产品包含:
(a)针对CDKL2、USP44、ZNF783和F12基因核酸甲基化的检测；
(b)针对hsa-miR-92b-3p、hsa-miR-374c-5p和hsa-miR-6803-3p的检测；以及
(c)针对AFP和DCP蛋白的检测。
85.根据项45-84任一项所述的用途，其特征在于，所述肝癌包括早期肝癌。
86.根据项45-85任一项所述的用途，其特征在于，所述用途是针对血浆或血清样本。
87.根据项86所述的用途，其特征在于，所述用途还包含针对血浆或血清样本的处理步骤。
Claims (10)
1.一种用于肝癌检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含选自基因核酸甲基化检测试剂、蛋白检测试剂、和/或miRNA检测试剂的一种或多种试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含基因核酸甲基化检测试剂、蛋白检测试剂、和miRNA检测试剂。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含选自CDKL2、USP44、ZNF783和F12的一个，两个，三个，或全部四个基因。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含选自CDKL2、USP44、和ZNF783的一个或多个基因。
5.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含选自CDKL2、USP44、和ZNF783的至少两个基因。
6.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，包含基因核酸甲基化检测试剂，所述基因包含CDKL2、USP44、和ZNF783三个基因。
7.根据权利要求1-6任一项所述的试剂盒，其特征在于，用B2M基因作为核酸甲基化的内参，并选取不含GpG位点的B2M片段作为目的序列。
8.根据权利要求3-7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述CDKL2基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:1序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述CDKL2基因甲基化检测试剂包含选自SEQ ID NO:57-59的正向引物，选自SEQ ID NO:60-62的反向引物，和选自SEQ IDNO:63-65的探针。
10.根据权利要求3-9任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述USP44基因甲基化检测试剂所检测的甲基化序列区段包含与SEQ ID NO:2序列有至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，至少99.5％，或100％相同性的序列。
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