CN115747333A - 一种肿瘤标记物检测试剂盒和检测分析系统及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种肿瘤标记物检测试剂盒和检测分析系统及其应用。本发明鉴定出一个能够作为胃癌诊断分子标志物的环状RNA hsa_circ_0000268，通过对患者血清外泌体中hsa_circ_0000268表达水平的研究，显示该标志物具有较高的灵敏度和特异度，提高了血清标本检测的准确性，能用于区分胃癌患者和健康人，区分I/II期胃癌患者和健康人，以及区分胃癌与胃癌前病变，能实现快速、无创、高灵敏的检测。同时，本发明提供肿瘤标记物检测试剂盒和检测分析系统，利用hsa_circ_0000268进行诊断分析，为胃癌的早期诊断及预后监测提供了新的标志物检测分析方法，为早期筛查和发现胃癌提供了更多的途径。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤分子生物学技术领域。更具体地，涉及一种肿瘤标记物检测试剂盒和检测分析系统及其应用。
背景技术
肿瘤标记物，是指特征性存在于恶性肿瘤细胞或由恶性肿瘤细胞异常产生的物质或者是宿主对于肿瘤的刺激反应而产生的物质，并且能够反映肿瘤的发生、发展，监测肿瘤对于治疗反应的一类物质。肿瘤标记物存在于肿瘤患者的组织，体液以及排泄物之中，能够用免疫学，生物学以及化学的方法来检测到。二十多年来，为了提高对肿瘤的早期检测、鉴别诊断、疗效观察以及预后判断，人们从肿瘤细胞的化学特性、细胞病理、免疫反应和基因表达产物等诸多方面寻找各种特异性强、灵敏度高的肿瘤标志物，并取得了较快的进展。肿瘤标志物的研究对肿瘤的诊断有极其重要的意义，推动了临床实验室的检测水平的提高和发展。
胃癌(gastric carcinoma)属于常见的恶性肿瘤之一，近年来在国内乃至全世界的发病率都比较高。目前针对胃癌的诊断主要是依靠胃镜获取组织进行病理诊断。胃癌病人可以进行纤维胃镜检查，纤维胃镜可以在镜下非常直观地发现胃黏膜病变的部位和范围，最主要的还可以精准获取病变组织来进行病理学检查。病理学检查是诊断胃癌最重要的依据。但胃镜检查是一种有创的检查手段，因此被检者的依从性较差，而胃镜检查结果的准确性依赖于内镜科科医生的经验，目前中国也存在比较大的内镜科医生缺口，且胃镜检测的费用较高，不太适合常规普查。
而对于胃癌患者，临床上可以进行肿瘤标记物的检查，如血清CEA，血清CA50，血清CA72-4，血清CA19-9等。这些肿瘤相关抗原对于肿瘤的诊断有辅助作用，同时还有助于判断肿瘤的预后。但上述临床采用的肿瘤标记物存在灵敏度低的缺点。近年来，通过对血液、粪便或组织样本的检测筛查，还发现了其他肿瘤标志物能够用于癌症的诊断检测，如采用micro RNA或circular RNA用于筛查和预后预测等，如现有技术公开的一个胃癌新型分子标记物hsa_circ_0074362，但其灵敏度才达到36.2％，还有待提高。因此，亟需开发出新的更多的诊断标志物用于胃癌患者的诊断。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种肿瘤标记物检测试剂盒和检测分析系统及其应用。
本发明的目的是提供一种利用环状RNA诊断胃癌的检测分析系统。
本发明另一目的是提供用于检测环状RNA hsa_circ_0000268表达水平的试剂的应用。
本发明再一目的是提供一种环状RNA胃癌诊断试剂盒。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供一种利用环状RNA诊断胃癌的检测分析系统，包括环状RNA hsa_circ_0000268表达量的定量检测模块、数据输入模块、数据分析模块和结果输出模块。定量检测模块通过定量检测样本中hsa_circ_0000268的表达量，并将测得的表达量数值通过数据输入模块传输给数据分析模块；数据分析模块接收表达量数值，并经过单因素逻辑回归模型建模及计算，绘制ROC曲线，判断结果，最后将诊断结果通过结果输出模块输出。
本发明研究筛选鉴定得到1个环状RNA组成的分子标签hsa_circ_0000268，其cDNA序列如SEQ ID NO：1所示(circBankID为hsa_circZRANB1_005)。研究显示，与健康人血清外泌体和胃癌患者癌旁组织相比，hsa_circ_0000268在胃癌患者血清外泌体和胃癌组织中显著高表达，hsa_circ_0000268具有较高的检测灵敏度和特异度，诊断的灵敏度最高达94％、特异度达88.5％；且hsa_circ_0000268还能用于区分I/II期胃癌患者和健康人，以及进一步区分胃癌患者与胃癌前病变患者。
因此，通过检测患者血清外泌体中的hsa_circ_0000268的表达水平，是能达到诊断患者胃癌的目的，提高了通过胃癌患者血清标本进行诊断的准确性，对早期诊断胃癌患者和尽早进行正确有效的治疗具有重大意义。
进一步地，所述数据分析模块中模型计算公式为：logit P＝-0.7322+2.1635*has_circ_0000268，其中has_circ_0000268为hsa_circ_0000268的表达量数值。
进一步地，所述数据分析模块中，结果的判断标准为：当样本的logit P大于截断值时，样本为阳性；当样本的logit P小于截断值时，样本为阴性。
更进一步地，当检测分析系统是为了诊断胃癌患者或I/II期胃癌患者和健康人时，以0.374作为截断值，结果输出模块输出的阳性为胃癌患者或I/II期胃癌患者，阴性为健康人；当检测分析系统是为了诊断胃癌患者和胃癌前病变患者时，以0.318作为截断值，结果输出模块输出的阳性为胃癌患者，阴性为胃癌前病变患者。
本发明还提供所述分析系统的运行方法，包括以下步骤：(1)采用定量检测模块，获得hsa_circ_0000268表达量数值；(2)将上述步骤(1)所得数值输进数据输入模块；(3)数据分析模块接收到数值后进行运算分析；(4)结果输出模块输出诊断结果。
以下应用也在本发明保护范围内：
用于检测环状RNA hsa_circ_0000268表达水平的试剂在制备胃癌诊断试剂盒的应用。
用于检测环状RNA hsa_circ_0000268表达水平的试剂在制备区分I/II期胃癌患者和健康人产品中的应用。
用于检测环状RNA hsa_circ_0000268表达水平的试剂在制备区分胃癌患者与胃癌前病变患者产品中的应用。
本发明提供一种环状RNA胃癌诊断试剂盒，含用于检测环状RNA hsa_circ_0000268表达水平的试剂。
优选地，所述试剂为检测环状RNA hsa_circ_0000268的引物对，引物对序列为：正向引物：CTGCTACGAAGCGGGACTCT(SEQ ID NO：2)；逆向引物：CAGGCAGGAAGCCACACAAG(SEQ IDNO：3)。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种肿瘤标记物检测试剂盒和检测分析系统用于胃癌诊断分析，环状RNA hsa_circ_0000268作为诊断胃癌的分子标记物，通过对患者血清外泌体中hsa_circ_0000268表达水平的研究，能实现快速、无创地检测并诊断胃癌；且hsa_circ_0000268具有较高的灵敏度和特异度，提高了通过胃癌患者血清标本进行诊断的准确性，还能用于区分I/II期胃癌患者和健康人，以及胃癌患者与胃癌前病变患者。同时，本发明提供的肿瘤标记物检测试剂盒和检测分析系统，利用hsa_circ_0000268进行检测和诊断，同样具有较高的灵敏度、特异度，为早期筛查和发现胃癌提供了更多的途径和方法。
附图说明
图1是胃癌患者和健康人血清外泌体中hsa_circ_0000268的表达量；图中T代表胃癌患者样本，N代表健康人样本。
图2是胃癌患者的胃癌组织和癌旁组织中hsa_circ_0000268的表达量；图中T表示胃癌组织样本，N表示癌旁组织样本。
图3是用hsa_circ_0000268构建的胃癌诊断模型在各队列的ROC曲线及在Training set的最佳截断值；其中，Training set为训练队列，Testing set为测试队列，External validation为外部验证队列，Best cut-off为最佳截断值，AUC为曲线下面积。
图4是用hsa_circ_0000268构建的胃癌诊断模型区分I/II期胃癌患者和健康人的ROC曲线及最佳截断值。
图5是用hsa_circ_0000268构建的胃癌诊断模型区分胃癌患者和胃癌前病变患者的ROC曲线及最佳截断值。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
本发明采用以下试剂盒：血清外泌体抽提试剂盒(货号：C10110-2)、TRIzol、反转录试剂盒(货号：RR037A)、荧光定量PCR的试剂盒(
qPCR Master Mix，货号：A6001)。
实施例1肿瘤标记物circRNA分子的筛选
选取来自中山大学肿瘤防治中心的37例胃癌患者和20例健康人的血清样本，以及20例胃癌患者的肿瘤组织和癌旁组织，使用试剂盒提取外泌体后用TRIzol试剂提取RNA，通过RNA-seq高深度测序方法检测提取的RNA样本中全部RNA的表达情况，鉴定出circRNA。
鉴定在胃癌患者血清外泌体中相比健康人血清外泌体中高表达的circRNA，以及胃癌肿瘤组织比癌旁组织高表达的circRNA，两者的交集得到候选的circRNA再进行下面的验证。
另外，再选取36例胃癌血清和36例健康人血清，以及24例胃癌患者的肿瘤组织和癌旁组织，使用随机引物对提取的血清外泌体RNA和组织RNA进行逆转录，得到cDNA；再采用设计的特异性荧光定量PCR引物，通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法检测样本中候选circRNA的表达情况来进行验证。
其中，荧光定量PCR扩增反应体系为(10μL反应体系)：
qPCR MasterMix，2X 5μL、上游引物和下游引物各0.4μL、无酶水2.2μL、cDNA2μL；扩增反应体系程序为：在PCR仪上于95℃预加热10min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环；在每一个循环中，先于95℃保持15秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度(60℃)，保持1min，使引物与模板充分退火并延伸，完成一个循环，重复循环50次；再在40℃，保持30秒进行冷却；最后，在4℃保存。
经过荧光定量PCR检测，最终筛选得到一个环状RNA hsa_circ_0000268，其cDNA序列如下SEQ ID NO：1所示，hsa_circ_0000268的circBankID为hsa_circZRANB1_005，位于10号染色体上，开始位置126631025，结束位置126631876，其设计的用于检测hsa_circ_0000268的其中一对引物如下，正向引物为SEQ ID NO：2：CTGCTACGAAGCGGGACTCT；逆向引物为SEQ ID NO：3：CAGGCAGGAAGCCACACAAG。
SEQ ID NO：1：CTTCCTGCCTGACACAGCTCACTTCAAGAAGTGCACAATGTCAGAACGTGGAATTAAGTGGGCTTGTGAATATTGTACGTATGAAAACTGGCCATCTGCAATCAAGTGTACTATGTGTCGTGCCCAAAGACCTAGTGGAACAATTATTACAGAAGATCCATTTAAAAGTGGTTCAAGTGATGTTGGTAGAGATTGGGATCCTTCCAGCACCGAAGGAGGAAGTAGTCCTTTGATATGTCCAGACTCTAGTGCAAGACCAAGGGTGAAATCTTCGTATAGCATGGAAAATGCAAATAAGTGGTCATGCCACATGTGTACATATTTGAACTGGCCAAGAGCAATCAGATGTACCCAGTGCTTATCCCAACGTAGGACCAGGAGTCCTACAGAATCTCCTCAGTCCTCAGGATCTGGCTCAAGACCAGTTGCTTTTTCTGTTGATCCTTGTGAGGAATACAATGATAGAAATAAACTGAACACTAGGACACAGCACTGGACTTGCTCTGTTTGCACATATGAAAACTGGGCCAAGGCTAAAAGATGTGTTGTTTGTGATCATCCCAGACCTAATAACATTGAAGCAATAGAATTGGCAGAGACTGAAGAGGCTTCTTCAATAATAAATGAGCAAGACAGAGCTCGATGGAGGGGAAGTTGCAGTAGTGGTAATAGCCAAAGGAGATCACCTCCTGCTACGAAGCGGGACTCTGAAGTGAAAATGGATTTTCAGAGGATTGAATTGGCTGGTGCTGTGGGAAGCAAGGAGGAACTTGAAGTAGACTTTAAAAAACTAAAGCAAATTAAAAACAGGATGAAAAAGACTGATTGGCTCTTCCTCAATGCTTGTGTGG。
实施例2circRNA分子的表达分析
选取来自中山大学肿瘤防治中心的36例胃癌患者血清样本、36例健康人血清样品，分别提取样本血清外泌体RNA后，逆转录RNA进行qPCR检测hsa_circ_0000268的表达量，其中，qPCR反应所用引物如SEQ ID NO：2～3所示，反应体系及反应程序同实施例1。
再取24例胃癌组织与距离肿瘤边缘5cm以上的癌旁组织，通过提取胃癌组织和癌旁组织RNA后，逆转录RNA进行qPCR检测hsa_circ_0000268的表达量，其中，qPCR反应所用引物如SEQ ID NO：2～3所示，反应体系及反应程序同实施例1。
结果如图1所示，胃癌患者血清外泌体中hsa_circ_0000268的表达量比健康人高。而在胃癌组织中hsa_circ_0000268的表达量比癌旁组织高，结果如图2所示。本发明通过筛选、验证发现了一个在胃癌血清外泌体中表达量显著高于健康人的环状RNA hsa_circ_0000268，其在胃癌组织中的表达量也高于癌旁组织，可通过检测血清外泌体中环状RNAhsa_circ_0000268的表达量来对胃癌进行诊断。
实施例3用于胃癌诊断的血清分子标记物hsa_circ_0000268的建模
选取来自中山大学肿瘤防治中心的365例胃癌患者和322例健康人构成训练队列，选取来自中山大学肿瘤防治中心的157例胃癌患者和138例健康人构成测试队列，选取来自中山大学附属第六医院的153例胃癌患者和103例健康人构成外部队列。对这些队列中的样本提取血清外泌体RNA、逆转录后通过RT-qPCR检测has_circ_0000268的表达量，方法步骤同实施例1。
三个队列的表达量生成三个数据集，分别为训练集、测试集和外部验证集。在训练数据集中，采用单因素逻辑回归方法，对has_circ_0000268的表达量进行建模，得到的模型公式为logit P＝-0.7322+2.1635*has_circ_0000268，其中has_circ_0000268为表达量数值。
运用该模型对队列中的样本进行判断时，通过将检测样本的has_circ_0000268表达量值代入上述公式中，得到logit P，若logit P大于截断值，则为胃癌检测阳性；若logitP小于截断值，则为胃癌检测阴性。根据不同截断值时模型的特异度和灵敏度变化绘制训练集、测试集和外部验证集的ROC曲线。
各集合的ROC曲线如图3所示，训练集的ROC曲线下面积为0.846，测试集ROC曲线下面积为0.877，外部验证集ROC曲线下面积为0.72。模型在训练集的最佳截断值(best cut-off)为0.374，此时用模型来诊断样本的灵敏度为76.5％，特异度为88.5％(即76.5％的胃癌患者能被正确诊断出来，85.5％健康人能被正确诊断出来)。
实施例4肿瘤标记物检测试剂盒诊断分析应用
基于上述研究结果显示环状RNA hsa_circ_0000268可用于诊断胃癌患者和健康人，本实施例提供环状RNA检测试剂盒，通过检测样本中环状RNA hsa_circ_0000268的表达水平来诊断胃癌，也能用于区分I/II期胃癌和健康人，本试剂盒中包含用于检测环状RNAhsa_circ_0000268表达水平的试剂和荧光定量PCR所需试剂。
具体地，利用上述试剂盒进行胃癌早期诊断的操作方法为：
S1.选取实施例1中部分胃癌(根据胃癌AJCC第8版pTNM分期确定为I/II期的患者，I、II期的病例数分别为47、171)和全部健康人样本，提取血清外泌体中的RNA，逆转录成cDNA；
S2.利用检测环状RNA hsa_circ_0000268的引物对，其序列依次如SEQ IDNO：2～3所示，对S1的样本cDNA进行荧光定量PCR扩增反应，荧光定量PCR扩增反应体系为(10μL反应体系)：
qPCR Master Mix，2X 5μL、上游引物和下游引物各0.4μL、无酶水2.2μL、cDNA 2μL；扩增反应体系程序为：在PCR仪上于95℃预加热10min，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环；在每一个循环中，先于95℃保持15秒钟使模板变性，然后将温度降到复性温度(60℃)，保持1min，使引物与模板充分退火并延伸，完成一个循环，重复循环50次；再在40℃，保持30秒进行冷却；最后，在4℃保存。
S3.得到样本的hsa_circ_0000268的表达量值，再根据hsa_circ_0000268模型公式：logit P＝-0.7322+2.1635*has_circ_0000268(其中has_circ_0000268为表达量值)，代入hsa_circ_0000268表达量值计算后，绘制ROC曲线，判断结果。
样本I/II期胃癌病人和健康人的ROC曲线及最佳截断值如图4所示，用模型对样本进行判断，ROC曲线下面积为0.875，当选取0.374为cut-off值时，诊断的灵敏度为94.0％，特异度为63.3％(即94.0％的I/II期胃癌患者能被正确诊断出来，63.3％健康人能被正确诊断出来)。表明该试剂盒能通过检测has_circ_0000268区分I/II期胃癌患者和健康人，有助于胃癌的早期诊断。
同样地，基于上述环状RNAhsa_circ_0000268可用于诊断胃癌患者和健康人的基础上，本发明试剂盒能用于进一步区分胃癌患者与胃癌前病变患者，具体方法步骤为：
S1.另外选取胃癌患者和胃癌前病变样本(病例数分别为144和73)，提取样本血清外泌体中的RNA，逆转录成cDNA；(本研究病例中胃癌前病变包括胃溃疡、肠上皮化生、胃息肉、慢性萎缩性胃炎、非典型增生，这些诊断均为美国消化内镜委员会ASGE于2015年发表的《胃镜检查在胃的恶性前和恶性状态管理中的作用》定义的胃癌前病变)
S2.利用上述引物组对S1的样本cDNA进行荧光定量PCR扩增反应，测得hsa_circ_0000268分子的表达量，方法同上。
样本的ROC曲线及最佳截断值如图5所示，用hsa_circ_0000268对样本进行判断，ROC曲线下面积为0.667，hsa_circ_0000268构建的模型在本批样本中的最佳截断值为0.318，用此截断值来对样本进行判断时诊断的灵敏度为78.3％，特异度为64.4％(即78.3％的I/II期胃癌患者能被正确诊断出来，64.4％健康人能被正确诊断出来)。表明has_circ_0000268模型能区分胃癌患者和胃癌前病变患者，有助于胃癌的诊断。
实施例5一种肿瘤标记物诊断胃癌的检测分析系统
本实施例提供一种肿瘤标记物诊断胃癌的检测分析系统，包括环状RNA hsa_circ_0000268表达量的定量检测模块、数据输入模块、数据分析模块和结果输出模块。定量检测模块通过定量检测样本中hsa_circ_0000268的表达量，并将测得的表达量数值通过数据输入模块传输给数据分析模块；数据分析模块接收表达量数值，并经过单因素逻辑回归模型建模及计算，绘制ROC曲线，判断结果，最后将诊断结果通过结果输出模块输出。
定量检测模块中的检测方法为：
S1.选取样本血清，提取外泌体中的RNA，逆转录成cDNA；
S2.利用检测hsa_circ_0000268的引物对，对S1的样本cDNA进行荧光定量PCR扩增反应，获取样本hsa_circ_0000268的表达量。
在分析模块中，模型计算公式为：logit P＝-0.7322+2.1635*has_circ_0000268(其中has_circ_0000268为表达量数值)；在结果输出模块中，结果判断依据为样本logit P计算值大于截断值时，为胃癌检测阳性；样本logit P计算值小于截断值时，为胃癌检测阴性。
当检测分析系统是为了诊断区分胃癌患者和健康人时，以0.374作为截断值，结果输出模块输出的阳性为胃癌患者，阴性为健康人；当检测分析系统是为了诊断区分I/II期胃癌患者和健康人时，仍以0.374作为截断值，结果输出模块输出的阳性为I/II期胃癌患者，阴性为胃癌前病变；当检测分析系统是为了诊断区分胃癌患者和胃癌前病变患者时，以0.318作为截断值，结果输出模块输出的阳性为胃癌，阴性为胃癌前病变。
上述分析系统的运行方法为：
(1)采用定量检测模块，获得得hsa_circ_0000268表达量数值；
(2)将上述步骤(1)所得数值输进数据输入模块；
(3)数据分析模块接收到数值后进行运算分析；
(4)结果输出模块输出诊断结果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种利用环状RNA诊断胃癌的检测分析系统，其特征在于，包括环状RNA hsa_circ_0000268表达量的定量检测模块、数据输入模块、数据分析模块和结果输出模块。
2.根据权利要求1所述分析系统，其特征在于，所述定量检测模块通过定量检测样本中hsa_circ_0000268的表达量，并将测得的表达量数值通过数据输入模块传输给数据分析模块；数据分析模块接收表达量数值，并经过单因素逻辑回归模型建模及计算，绘制ROC曲线，判断结果，最后将诊断结果通过结果输出模块输出。
3.根据权利要求2所述分析系统，其特征在于，所述数据分析模块中模型计算公式为：logit P＝-0.7322+2.1635*has_circ_0000268，其中has_circ_0000268为hsa_circ_0000268的表达量数值。
4.根据权利要求3所述分析系统，其特征在于，所述数据分析模块中，结果的判断标准为：当样本的logit P大于截断值时，样本为阳性；当样本的logit P小于截断值时，样本为阴性。
5.根据权利要求4所述分析系统，其特征在于，当检测分析系统是为了诊断区分胃癌患者或I/II期胃癌患者和健康人时，以0.374作为截断值，结果输出模块输出的阳性为胃癌患者或I/II期胃癌患者，阴性为健康人；当检测分析系统是为了诊断区分胃癌患者和胃癌前病变患者时，以0.318作为截断值，结果输出模块输出的阳性为胃癌患者，阴性为胃癌前病变患者。
6.用于检测环状RNA hsa_circ_0000268表达水平的试剂在制备胃癌诊断试剂盒中的应用。
7.用于检测环状RNA hsa_circ_0000268表达水平的试剂在制备区分I/II期胃癌和健康人的产品中的应用。
8.用于检测环状RNA hsa_circ_0000268表达水平的试剂在制备区分胃癌与胃癌前病变产品中的应用。
9.一种环状RNA胃癌诊断试剂盒，其特征在于，含用于检测环状RNA hsa_circ_0000268表达水平的试剂。
10.根据权利要求9所述试剂盒，其特征在于，所述试剂为检测环状RNA hsa_circ_0000268的引物对，引物对序列为：正向引物：CTGCTACGAAGCGGG ACTCT；逆向引物：CAGGCAGGAAGCCACACAAG。
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