ES2566335T3 - Método de activación de linfocitos citolíticos naturales mediante preparaciones de células tumorales in vitro - Google Patents
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Abstract
Un método de activación de un linfocito citolítico natural (NK) humano, que comprende la etapa de poner en contacto el linfocito NK in vitro con una preparación de células tumorales activadoras (PCTA), que comprende células tumorales humanas intactas, o una preparación de membrana de células tumorales humanas.
Description
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DESCRIPCION
Metodo de activacion de linfocitos citollticos naturales mediante preparaciones de celulas tumorales in vitro Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo de activacion de un linfocito citolltico natural (NK, Natural Killer, en ingles). En particular, se refiere a un metodo de activacion de un linfocito NK tal que tiene la capacidad de efectuar la lisis de una celula cancerosa resistente a NK.
Antecedentes de la invencion
En la actualidad, existen diversos tipos de cancer que son incurables. Para otros, la quimioterapia es solo parcialmente eficaz y una proporcion significativa de pacientes experimentan una recidiva despues del tratamiento. Algunas neoplasias hematologicas son tratables mediante trasplante de celulas madre hematopoyeticas (TCMH), pero menos del 30 % de los pacientes que requieren TCMH tienen un donante adecuado y son de la edad requerida.
Los linfocitos citollticos naturales (NK) son un subconjunto de linfocitos de sangre periferica que puede efectuar espontaneamente la lisis de determinadas celulas tumorales. Se ha propuesto la utilizacion de linfocitos NK en la inmunoterapia tumoral adoptiva, existiendo interes en la estimulacion in vitro o ex vivo de los linfocitos NK para aumentar su capacidad de efectuar la lisis de celulas tumorales.
El descubrimiento de la interleucina-2 (IL-2) y su papel en la activacion de linfocitos NK en la decada de los 80 dio lugar a un considerable interes en el uso de linfocitos NK activados por linfocinas (LAK, por sus siglas en ingles) en la inmunoterapia tumoral. Los resultados de estos ensayos fueron, sin embargo, en gran parte decepcionantes. En un estudio en el que se investigo el efecto de la administracion de linfocitos LAK autologos a los pacientes junto con IL-2, menos del 20 % de los pacientes respondieron (Rosenburg et al (1987) N. Engl. J. Med. 316: 889-897). En estudios que utilizan administraciones diarias de IL-2 a los pacientes con cancer junto con quimioterapia y TCH autologo, se demostro que, aunque IL-2 aumento significativamente el numero de linfocitos NK circulantes in vivo, estas celulas no son extremadamente citotoxicas de acuerdo con los resultados obtenidos en un ensayo in vitro (Miller et al (1997) Biol. Blood Marrow Transplant. 3: 34-44).
Actualmente se sabe que los linfocitos NK estan controladas por senales citollticas positivas y negativas. En los ultimos diez anos se han clonado diversas moleculas que median en la inhibicion de los linfocitos NK y sus ligandos son casi exclusivamente moleculas del CMH de clase I. Algunos de estos receptores (“KIR”) son especlficos para determinantes compartidos por determinados alelos de la clase I y cada KIR es expresado por un subconjunto de linfocitos NK. Por lo tanto, en el repertorio NK, algunos linfocitos NK reconocen, y son bloqueados por, alelos especlficos de clase I. Los linfocitos NK tienen una vision limitada de polimorfismo de clase I, pero las celulas pueden ser responsables de alorreacciones cuando las celulas diana incompatibles no expresan los alelos de clase I que bloquean cada linfocito NK en el repertorio (la hipotesis de “perdida de lo propio”). Por lo tanto las celulas diana alogenicas que carecen de al menos uno de los grupos de alelos de clase I expresados por las celulas del donante no encontrara el ligando de la clase inhibidora I en un subconjunto de linfocitos NK del donante y se activara su via lltica.
Asl, se ha sugerido que los linfocitos NK autologos pueden ser suprimidos por la respuesta fisiologica que resulta del reconocimiento por los linfocitos NK de las moleculas del CMH “propias”. Tambien se ha sugerido que cuanto mayor es el grado de falta de incompatibilidad en KIR con el CMH del tumor (es decir, ligando KIR) mayor sera la destruccion del tumor (Ruggeri et al (2002), Science 295:2097-2100). En vista de las limitaciones de la terapia con linfocitos NK autologas (se cree que debido a la falta de compatibilidad en el receptor inhibidor de los linfocitos NK con las celulas tumorales autologas), se ha sugerido el uso de infusiones de linfocitos NK alogenicos como una alternativa (Miller et al (2005) Blood en prensa, pero pre-publicado en Internet el 4 de enero de 2005).
Miller et al (2005, como el anterior) administro linfocitos NK haploidenticos alogenicos activados con IL-2 a pacientes con melanoma metastasico, carcinoma de celulas renales metastasico, enfermedad de Hodgkin resistente o LMA de pronostico desfavorable. Es importante destacar que sus resultados demuestran que los linfocitos NK pueden persistir y expandirse in vivo. Las celulas indujeron la remision hematologica completa en cinco de los 19 pacientes con LMA de pronostico desfavorable, pero sin actividad frente a otros tumores. En el grupo que logro la remision, los pacientes se estratificaron en aquellos con alorreactividad de hospedador frente a injerto usando la estrategia de no compatibilidad en el ligando KIR. Los resultados mostraron que la remision era mucho mas probable en aquellos pacientes con incompatibilidad en el ligando KIR.
El documento US-6.849.452 se refiere a un proceso de activacion de linfocitos NK mediante su puesta en contacto con celulas dendrlticas.
Los linfocitos NK no especlficamente activados pueden, por tanto, tener una aplicacion frente a un subconjunto de tumores, pero las celulas del donante deben ser alogenicas, siendo mucho mas probable que sean eficaces si son
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HLA incompatibles. Una desventaja asociada con el uso de linfocitos NK incompatibles dirigidos a celulas hematopoyeticas normales es que pueden dirigirse y rechazar las celulas hematopoyeticas normales (por ej., del hospedador) (Yu et al (1996) Immunity 4:67-76).
Hay as! una necesidad de una inmunoterapia alternativa para el cancer que sea eficaz contra los tumores “resistentes a NK”, pero que ahorre celulas normales hematopoyeticas.
Sumario de la invencion
El dogma actual es que los linfocitos NK son estimulados por la celula diana que en ultima instancia lisa y que los tumores “resistentes a NK” no se lisan porque no pueden provocar este estlmulo.
Contrariamente al pensamiento actual, los presentes inventores han demostrado que el “acontecimiento de estimulacion” puede ser separado temporalmente del “acontecimiento lltico”. Tambien han demostrado que algunas celulas tumorales, o preparaciones de membrana de las mismas, son capaces de estimular los linfocitos NK de tal manera que estas pueden proceder a lisar una celula diana que es resistente a la lisis por un linfocito NK no estimulado equivalente.
La presente invencion proporciona un metodo para activar un linfocito NK humano, que comprende la etapa de poner en contacto el linfocito NK in vitro con una preparacion de celulas tumorales activadoras (PCTA), la cual comprende celulas tumorales humanas intactas o una preparacion de membrana de celula tumoral humana.
El linfocito NK se activa para efectuar la lisis de una celula diana. Por ejemplo, el linfocito NK puede activarse de tal manera que pueda efectuar la lisis de una celula previamente resistente a la lisis por linfocitos NK. Por consiguiente, el metodo de la presente invencion se puede usar para proporcionar linfocitos NK utiles en el tratamiento de una serie de tumores malignos “resistentes a NK”, muchos de los cuales son incurables en la actualidad (tales como el mieloma y la leucemia linfocltica cronica (LLC)).
El hecho de que el “acontecimiento de estimulacion” pueda ser separado del “acontecimiento lltico” tiene la ventaja de que el linfocito NK se puede estimular in vitro, pero una vez estimulado conserva la capacidad de lisar una celula diana hasta que se encuentre con la celula diana cuando se introduce o retorna al sujeto.
Esta forma de activacion da lugar a linfocitos NK que pueden efectuar la lisis de multiples tipos de tumores que se considera que son resistentes a la destruccion por linfocitos NK. Por otra parte los linfocitos NK activados son eficaces con independencia del grado de compatibilidad HLA entre los linfocitos NK y las celulas tumorales. Esto abre la posibilidad de usar linfocitos NK de donantes alogenicos autologos o HLA compatibles. El uso de celulas autologas o HLA compatibles tiene la ventaja de que es menos probable que se produzca el rechazo de las celulas del donante o del hospedador (por ejemplo celulas hematopoyeticas normales del hospedador).
Ademas, dado que el metodo de la invencion no se basa en la activacion mediada por IL-2, evita los efectos adversos in vivo asociados a la respuesta de IL-2 (Miller et al (2005) como antes).
En el metodo de la invencion, la PCTA puede ser una preparacion de, o comprender celulas tumorales intactas. Las celulas pueden ser irradiadas o fijarse.
Alternativamente, la PCTA puede ser o comprender una preparacion de membrana celular. El uso de membranas celulares es ventajosa, ya que evita muchos problemas de seguridad asociados con el uso de celulas tumorales.
La PCTA puede comprender celulas tumorales o preparaciones de las mismas con capacidad de activacion de NK, tales como las celulas de leucemia mieloide CTV-1 y/o una preparacion de membrana de las mismas.
Los linfocitos NK activados producidos por el metodo de la invencion se pueden usar para tratar el cancer.
El metodo es particularmente adecuado en los casos en que el sujeto no es adecuado para el tratamiento intensivo del cancer.
El cancer puede ser, por ejemplo: leucemia mieloide aguda (LMA), leucemia linfocltica cronica (LLC), linfoma o cancer de mama.
Description de las figuras
La Figura 1 es un grafico de transferencia de puntos de citometrla de flujo que muestra la estrategia de analisis para la medida de la lisis de las celulas diana.
Se establece la Region de analisis 1 (R1) para incluir celulas diana (PKH-26 positivo) (A - celulas diana solo) que excluye linfocitos NK efectores y celulas de LMA estimuladoras pre-marcadas con PKH-26 (B - celulas efectoras + estimulador solo). Esta estrategia de acotamiento (gating) discrimina con eficacia las poblaciones de celulas diana y
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efectoras en la mezcla (C). El acotamiento de las celulas diana dentro de la mezcla (R1) permite la enumeration de las dianas FSCbajo/To-Pro+ “muertas”+ (R2) de las celulas diana vivas To-Pro positivo (D).
La Figura 2A es un grafico que muestra el % de lisis de celulas Raji cuando se utilizan diferentes tipos de celulas como celulas estimuladoras para los linfocitos NK.
La Figura 2B es un grafico que muestra el efecto de la pre-incubacion de los linfocitos NK con celulas CTV-1 sobre el % de lisis de diversos tipos de celulas.
La Figura 3A es un grafico que muestra el % de lisis de celulas Raji cuando se utilizan diferentes tipos de celulas como celulas estimuladoras para los linfocitos NK.
La Figura 3B es un grafico que muestra el efecto de la fijacion y el tratamiento con brefeldina A (BFA) sobre la capacidad de las celulas CTV-1 para activar los linfocitos nK.
La Figura 4A es un grafico que muestra el % de lisis de celulas Raji y celulas Daudi cuando se utilizan diferentes tipos de celulas como celulas estimuladoras para los linfocitos NK.
La Figura 4B es un grafico que muestra el % de lisis de celulas de leucemia primaria cuando se utilizan diferentes tipos de celulas como celulas estimuladoras para los linfocitos NK.
La Figura 4C es un grafico que muestra el % de lisis de blastos leucemicos primarios (LMA y LLC) y una llnea celular de cancer de mama (MCF-7) por linfocitos NK activados.
La Figura 4D es un grafico que muestra el % de lisis de celulas tumorales primarias de pacientes con cancer de mama o cancer de ovario por linfocitos T-aNK de donantes normales alogenicos.
La Figura 5A es un grafico que muestra el efecto de los linfocitos NK estimulados sobre CMSP normales compatibles en KIR (autologas) o incompatibles en KIR (haplo 1 o haplo 2).
La Figura 5B es un grafico que muestra la lisis por linfocitos NK activados de donantes normales en CMSP normales del mismo donante (autologo) y de donantes normales incompatibles en KIR (alogenicas).
La Figura 5C es un grafico que muestra el efecto de los linfocitos NK activados sobre la hematopoyesis in vitro de celulas mononucleares de medula osea de un donante normal.
La Figura 6A es un grafico que compara el efecto del uso de llneas de celulas tumorales activadoras incompatibles en HLA-KIR frente a compatibles en HLA-KIR.
La Figura 6B es un grafico que muestra el % de lisis de las dianas Raji por linfocitos NK activados por celulas CTV-1 compatibles e incompatibles en el ligando KIR.
La Figura 7A es una comparacion de la lisis por linfocitos NK activados-por PCTA y estimuladas por IL-2.
La Figura 7B es un grafico que muestra el % de lisis de blastos leucemicos en diferentes relaciones de E:T.
Las Figuras 7C y 7D son graficos que muestran el efecto de la incompatibilidad en KIR sobre la activation de NK inducida por CTV-1 (C) los linfocitos NK CD56+/CD3- se incubaron durante la noche en medio solo (barras en blanco), con celulas CTV-1 irradiadas (barras sombreadas) o con lisado celular de CTV-1 (barras negras) y fenotipadas para la expresion de los KIR y CD69 (las barras muestran la media +/- de). (D) Los linfocitos NK en reposo de 3 donantes normales son separados por citometrla de flujo en dos poblaciones, las que co-expresan CD158a y CD158e1 y las que carecen de ambas moleculas. Estas son estimulados durante la noche con lisados de celulas CTV-1 y su actividad citolltica se ensaya frente a celulas Raji en un ensayo de 4 horas (las barras muestran la media +/- de).
La Figura 8A es un grafico que muestra la proportion de linfocitos CD69+ dentro de la fraction NK CD56+ de linfocitos NK activados por CTV-1.
La Figura 8B es un grafico que muestra el efecto de la incubation con CTV-1 sobre la expresion de un panel de ligandos por linfocitos NK.
La Figura 9A es una fotografla de microscopla confocal que muestra la formation de conjugados entre los linfocitos NK activados y celulas Raji y la polarization de CD69 en la sinapsis inmunologica.
La Figura 9B es una fotografla de gel que muestra el fraccionamiento por HPLC del sobrenadante de la protelna CD69 humana recombinante doblada de nuevo.
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La Figura 9C es un panel de histogramas que muestran el analisis de citometrla de flujo de celulas Raji marcadas despues del contacto con nano-partlculas recubiertas con fracciones de HPLC del sobrenadante de rCD69.
La Figura 9D es una fotografla de microscopla confocal de celulas Raji marcadas despues del contacto con nanopartlculas recubiertas con una fraccion de HPLC rCD69-positivo.
La Figura 9E es una fotografla de microscopla confocal de linfocitos B normales marcados despues del contacto con nano-partlculas recubiertas con una fraccion de HPLC rCD69-positivo.
La Figura 9F es un grafico que muestra e % de lisis de celulas Raji tras la pre-incubacion con 260 pg-1 mg de las fracciones de HPLC de rCD69 (en ausencia de nano-partlculas).
La Figura 9G es un grafico que muestra el analisis de citometrla de flujo de celulas Raji despues del marcaje con nanopartlculas recubiertas con rCD69 (histograma sombreado) o rCD69 desnaturalizado (histograma abierto).
La Figura 9H es un grafico que muestra el analisis de citometrla de flujo de celulas K562 despues del marcaje con nanopartlculas recubiertas con rCD69 (histograma sombreado) o rCD69 desnaturalizado (histograma en blanco).
La Figura 9I es un grafico que muestra el analisis de citometrla de flujo de linfocitos T normales despues del marcaje con nanopartlculas recubiertas con rCD69 (histograma sombreado) o rCD69 desnaturalizado (histograma en blanco).
La Figura 9J es un grafico que muestra el analisis de citometrla de flujo de linfocitos B normales despues del marcaje con nanopartlculas recubiertas con rCD69 (histograma sombreado) o rCD69 desnaturalizado (histograma en blanco).
La Figura 9K es un grafico que muestra el analisis de citometrla de flujo de linfocitos NK normales despues del marcaje con nanopartlculas recubiertas con rCD69 (histograma sombreado) o rCD69 desnaturalizado (histograma en blanco).
La Figura 9L es un grafico que muestra la intensidad de fluorescencia relativa observada con diferentes llneas celulares.
La Figura 9M es un diagrama que muestra la lisis de celulas Raji mediada por T-aNK en presencia de rCD69 a dos concentraciones.
La Figura 9N es un grafico de comparacion de la lisis de celulas Raji mediada por T-aNK en presencia de rCD69, rCD69 desnaturalizado o BSA.
La Figura 9O es un grafico que muestra el efecto de rCD69 sobre la lisis de K562 por linfocitos NK en reposo o linfocitos T-aNK.
La Figura 10 es un diagrama de puntos que muestra un ejemplo de formacion de membranas celulares de la llnea celular CTV-1.
Description detallada
LINFOCITOS CITOLITICOS NATURALES (NK)
La presente invention se refiere a un metodo de activation de un linfocito NK.
Los linfocitos NK son un subconjunto de linfocitos de sangre periferica definido por la expresion de CD56 o CD16 y la ausencia del receptor de linfocitos T (CD3). Estos reconocen y destruyen llneas celulares transformadas sin sensibilization de una manera no restringida por el CMH.
Los linfocitos NK representan la celula linfoide predominante en la sangre periferica durante muchos meses despues del trasplante alogenico o autologo de celulas madre y tienen un papel primordial en la inmunidad a patogenos durante este perlodo (Reittie et al (1989) Blood 73: 1351-1358; Lowdell et al (1998) Bone Marrow Transplant 21: 679-686). El papel de los linfocitos NK en el injerto, en la enfermedad de injerto contra huesped, en la actividad anti- leucemia y en la infection post-trasplante se revisa en Lowdell (2003) Transfusion Medicine 13: 399-404.
Los linfocitos NK humanos median en la lisis de celulas tumorales y celulas infectadas por virus a traves de la citotoxicidad natural y de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (CCDA).
Las NK humanas son controlados por senales citollticas positivas y negativas. Las senales negativas (inhibidoras) son transducidas por los receptores que contienen el dominio C-lectina CD94/NKG2A y por algunos receptores de
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tipo inmunoglobulina de los linfocitos NK (KIR). La regulation de la lisis por NK mediante senales inhibidoras se conoce como la hipotesis de “perdida de lo propio”, en la que los alelos HLA de clase I especlficos expresados en la superficie de la celula diana se unen a los receptores inhibidores de los linfocitos NK. La regulacion negativa de las moleculas HLA en las celulas tumorales y en algunas celulas infectadas con virus (por ejemplo, CMV) reduce esta inhibition por debajo de un umbral objetivo y las celulas diana se vuelven susceptibles a la lisis mediada por linfocitos NK.
Los receptores inhibidores se clasifican en dos grupos, los de la superfamilia denominados receptores de tipo inmunoglobulina de los linfocitos NK (KIR) y los de la familia de la lectina, NKG2, que forman dlmeros con CD94 en la superficie celular. Los KIR tienen una estructura extracelular con 2 o 3 dominios y se unen a HLA-A, HLA-B o HLA-C. Los complejos NKG2/CD94 se unen a HLA-E.
Los KIR inhibidores tienen hasta 4 dominios intracelulares que contienen ITIM y los mejor caracterizados son KIR2DL1, KIR2DL2 y KIR2DL3 que se sabe que se unen moleculas de HLA-C. KIR2DL2 y KIR2DL3 a los alelos de HLA-C del grupo 1, mientras que KIR2DL1 se une a los alelos del grupo 2. Ciertas celulas de leucemia/linfoma expresan ambos grupos de alelos HLA-C 1 y 2 y son conocidos por ser resistentes a la lisis mediada por linfocitos NK.
En cuanto a las senales de activation positivas, se cree que la CCDA esta mediada a traves de CD16, habiendose identificado varios receptores activadores responsables de la citotoxicidad natural, entre ellos, CD2, CD38, CD69, NKRP-1, CD40, B7-2, NK-TR, NKp46, NKp30 y NKp44. Ademas, varias moleculas KIR con colas intracitoplasmaticas cortas tambien son estimulantes. Se sabe que estos KIR (KIR2DS1, KIR2DS2 y KIR2DS4) se unen a HLA-C, siendo sus dominios extracelulares identicos a sus KIR inhibidores relacionados. Los KIR activadores carecen de los ITIM y en su lugar se asocian con DAP12 lo que conduce a la activacion de los linfocitos NK. Se desconoce el mecanismo de control de la expresion de los KIR inhibidores frente a los activadores.
Los linfocitos NK preparados mediante el metodo de la presente invention pueden ser linfocitos NK autologos o alogenicos.
Los linfocitos NK “autologos” son celulas obtenidas del paciente. Los linfocitos NK “alogenicos” se obtienen de otro individuo, que tiene un gen no identico en uno o mas loci. Si los linfocitos NK se obtienen de un gemelo identico, estos se denominan “singenicos”.
Los linfocitos NK de un donante pueden ser compatibles o incompatibles en HLA-KIR. Los presentes inventores han demostrado que el grado de compatibilidad entre los linfocitos NK y las celulas tumorales diana no tiene importancia.
PREPARACION DE CELULAS TUMORALES ACTIVADORASS (PCTA)
El termino “activacion” se usa como sinonimo del termino “estimulacion” en esta section y en todo el documento.
Los presentes inventores han descubierto que determinadas celulas tumorales tienen la capacidad de estimular los linfocitos NK para aumentar su capacidad para efectuar la lisis de celulas tumorales. Los linfocitos NK estimulados han demostrado ser capaces de efectuar la lisis de celulas tumorales “resistentes a NK” (es decir celulas tumorales resistentes a la lisis por linfocitos NK no estimulados).
Las celulas tumorales capaces de activar los linfocitos NK de esta manera incluyen celulas CTV-1. Esta llnea celular esta comercializada, por ejemplo, en la American Typed Cell Collection (ATCC).
Se espera que otras celulas tumorales tambien tengan la capacidad de activar los linfocitos NK. Con el fin de determinar si una preparation de celulas tumorales es una preparation de celulas tumorales activadoras, se puede usar un metodo que tenga las siguientes etapas:
(i) poner en contacto la preparacion de celulas tumorales con un linfocito NK;
(ii) poner en contacto el linfocito NK de la etapa (i) con una celula diana resistente a la lisis por linfocitos NK no activados;
(iii) determinar si la celula diana se lisa por el linfocito NK de la etapa (i).
Por tanto, es posible para un experto en la materia establecer si una celula tumoral dada tiene la capacidad de actuar como una preparacion de celulas tumorales activadoras y detectar celulas tumorales conocida por esta actividad.
Los presentes inventores han demostrado que la pre-incubacion de linfocitos NK con una PCTA (como blastos de LMA CTV-1) provoca una rapida regulacion positiva de CD69 sobre los linfocitos NK. Tambien han demostrado (usando CD69 marcado) que las celulas tumorales que susceptibles a lisis por linfocitos NK activados, expresan el ligando CD69 (CD69L), mientras que esta expresion esta ausente en celulas que no experimentan lisan (tales como los linfocitos B). La presencia de CD69 recombinante inhibe la capacidad de los linfocitos NK activados para efectuar
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la lisis de las celulas tumorales, supuestamente debido a que bloquea la interaccion con CD69L en las celulas tumorales.
Sin desear estar limitado por la teoria, los presentes inventores creen que en los linfocitos NK estimulados CD69 es la molecula activadora predominante para su actividad citotoxica.
En una realizacion preferida, la PCTA usada en el metodo de la presente invencion provoca la regulacion positiva de la expresion de CD69 del linfocito NK.
Aunque en la actualidad se desconoce la naturaleza del ligando(s) CD69, es posible determinar su expresion en las celulas diana tumorales mediante tecnicas estandar. Por ejemplo, utilizando CD69 marcado con un fluorocromo, es posible determinar la expresion de CD69L mediante tecnicas tales como la citometna de flujo o la microscopia confocal.
Es posible determinar si una preparacion de celulas tumorales es una preparacion de celulas tumorales activadoras, usando un metodo que tiene las siguientes etapas:
(i) poner en contacto la preparacion de celulas tumorales con un linfocito NK;
(ii) determinar si la PCT provoca la regulacion positiva de CD69 en el linfocito NK.
El metodo puede implicar determinar si la PCT comprende o expresa CD69L.
La PCTA puede consistir en o comprender una poblacion de celulas tumorales intactas. Por ejemplo, la preparacion de celulas tumorales activadoras puede ser una linea celular tumoral.
La PCTA puede consistir en o comprender una preparacion de membrana de celulas tumorales humanas. Por ejemplo, una preparacion de membrana celular se puede hacer por tecnicas de fijacion estandar (como el uso de paraformaldehido). La fijacion tiene la ventaja de que la preparacion se estabiliza, tiene una “vida util” mucho mas larga y es mas facil de almacenar. Una preparacion de membrana celular adecuada tambien puede prepararse mediante ciclos repetidos de congelacion-descongelacion, en combination con el tratamiento con ADNasa. Tal preparacion se puede considerar que tiene mayor seguridad, ya que reduce la probabilidad de contamination asociada con priones, etc.
Las celulas estimuladoras pueden irradiarse antes de su uso, por tecnicas estandar.
Las preparaciones de membrana tienen la ventaja respecto a las preparaciones que comprenden celulas tumorales intactas de que evitan el riesgo de transferencia de celulas tumorales potencialmente malignas al paciente.
La PCTA y la preparacion de linfocitos NK pueden realizarse conjuntamente, por ejemplo, mediante co-cultivo (donde se utilizan celulas tumorales intactas). El “tiempo de activation” dependera de la naturaleza de las preparaciones de celulas y las condiciones de contacto, pero comunmente puede ser de 12-24 horas, quizas 20 horas.
Los linfocitos NK activados por el metodo de la invencion pueden ser linfocitos NK autologos y/o alogenicos.
Los linfocitos NK alogenicos pueden ser HLA incompatibles.
Las NK alogenicas se pueden obtener a partir de sangre periferica de un individuo donante. Las celulas mononucleares de sangre periferica alogenicas se pueden recoger mediante tecnicas convencionales (por ejemplo aferesis convencional). Para reducir al minimo la posibilidad de enfermedad injerto contra huesped y la aplasia inmunomediada, las celulas alogenicas pueden estar desprovistas de linfocitos T. Por ejemplo, la preparacion de celulas puede vaciarse de linfocitos T CD3+ usando microesferas conjugadas con anticuerpo monoclonal anti-CD3 humano de raton y un dispositivo de selection celular (tal como el dispositivo de selection de celulas Miltenyi Biotec CliniMACS®).Sin embargo, los linfocitos NK producidos mediante tales procedimientos de “seleccion negativa” por si solos no dan un alto grado de pureza y pueden estar contaminados con linfocitos T y B.
Con el fin de reducir la contaminacion, es posible obtener una preparacion de linfocitos NK por separation inmunomagnetica directa, por ejemplo, en funcion de la expresion de CD56. Para reducir aun mas la contaminacion de linfocitos T, el producto debe estar desprovisto de celulas CD3+ (por ejemplo, utilizando CD3 FITC y esferas anti- FITC).
Antes de la activacion por la preparacion de celulas tumorales activadoras, la preparacion de linfocitos NK puede comprender al menos 80 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 98 % de linfocitos CD56+.
Antes de la activacion por la preparacion de celulas tumorales activadoras, la preparacion de linfocitos NK puede comprender menos de 15 %, menos de 10 %, menos de 5 % o menos de 3 % de linfocitos CD3+.
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Una composition que comprende linfocitos NK activados por el metodo de la invention tambien puede comprender la totalidad o una parte de la preparation de celulas tumorales activadoras (es decir, celulas tumorales activadoras y/o una preparation de membrana de las mismas) o un producto de las mismas.
La activation mediada por PCTA puede ser la unica activation que reciben los linfocitos NK, o puede haber mas etapas de activation. Los linfocitos NK tambien pueden o no pueden ser especlficamente activados por IL-2 (por ejemplo, mediante la incubation de las celulas en medio suplementado con IL-2). Alternativamente, las celulas pueden ser activadas en ausencia de IL-2, pero la IL-2 se puede utilizar para la expansion ex vivo de las celulas estimuladas.
Una composition que comprende linfocitos NK activados por el metodo de la invention se puede usar para tratar o prevenir el cancer en un sujeto.
La composition se puede administrar al sujeto por cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica, por ejemplo, infusion intravenosa.
La composition puede utilizarse para tratar un sujeto en necesidad de la misma. El procedimiento es de bajo riesgo y especialmente adecuado para los pacientes con cancer para los cuales estan excluidos los tratamientos intensivos para el cancer (por ejemplo, pacientes de edad avanzada). Tambien proporciona una alternativa para los pacientes (con, por ejemplo, linfoma, mieloma o LMA) que carecen de un donante adecuado para el trasplante alogenico de celulas madre.
Antes del tratamiento con la composition, el paciente puede recibir algun tratamiento previo, por ejemplo, terapia citorreductora del tumor y/o inmunosupresion del paciente. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por quimioterapia.
Es posible la obtencion de celulas tumorales primarias de pacientes en el momento del diagnostico y crioconservar estas como suspensiones de celulas individuales viables. Por tanto, es posible ensayar in vitro una composition que comprende linfocitos NK activados frente a blastos del paciente. Esto se podrla hacer antes de embarcarse en un regimen de tratamiento para evaluar la idoneidad del enfoque. La correlation de los resultados del estudio in vitro y la correspondiente respuesta cllnica al tratamiento tambien puede ser investigada.
ENFERMEDAD
Una composition que comprende linfocitos NK activados por el metodo de la presente invention se puede usar para tratar o prevenir una enfermedad o trastorno medico.
La enfermedad puede ser un cancer. Hay alrededor de 200 tipos diferentes de cancer. Existas listas de los tipos de cancer (por ejemplo, vease
http://www.acor.org/types.html o
http://www.cancerresearch uk.org).
http://www.acor.org/types.html o
http://www.cancerresearch uk.org).
Algunos de los tipos de cancer mas comunes incluyen leucemia (aguda y cronica), cancer de vejiga, cancer de hueso (osteosarcoma), cancer intestinal (cancer colorrectal), cancer cerebral, cancer de mama, cancer cervical, cancer de esofago, linfoma de Hodgkin, cancer de rinon, cancer de hlgado, cancer de pulmon, mesotelioma, mieloma multiple, linfoma no Hodgkin, cancer de ovario, cancer pancreatico, cancer de pene, cancer de prostata, cancer de piel (melanoma y no melanoma), carcinoma de tejidos blandos, cancer gastrico, cancer testicular, cancer de tiroides y cancer de endometrio.
La composition puede ser util para tratar cualquier tipo de cancer que sea accesible a los linfocitos NK.
En particular, el cancer puede ser un tumor maligno hematologico, como la leucemia (LMA), la leucemia linfocltica cronica (LLC) y el linfoma.
El mieloma es un cancer incurable y mortal. La actividad NK contra las celulas plasmaticas de mieloma se documenta in vitro y se ha demostrado que la actividad NK mejorada frente a celulas de mieloma autologas esta correlacionada con la respuesta al tratamiento con derivados de la talidomida. Los pacientes con mieloma son generalmente jovenes y en forma suficiente como para someterse a un trasplante autologo de celulas madre hematopoyeticas, pudiendo facilmente someterse a un procedimiento menos invasivo.
El trastorno linfoproliferativo postrasplante (TLPT) es una complication grave y relativamente comun que se produce despues del trasplante de organos solidos y actualmente se esta ensayando la inmunoterapia de linfocitos T, pero con poco exito. La terapia utilizando linfocitos NK activados de acuerdo con la presente invention serla facil y segura en este grupo de pacientes.
Ademas, la composition puede utilizarse para tratar tumores solidos tales como el cancer de mama.
El procedimiento es particularmente adecuado para el tratamiento de tumores “resistentes a NK”. Los linfocitos NK normales, no estimulados con PCTA, pueden efectuar espontaneamente la lisis de algunos tumores humanos, pero
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otros muchos tumores son resistentes a las NK. Por lo tanto, “resistentes a NK” como se usa en el presente documento, indica las celulas tumorales resistentes a la lisis por los linfocitos NK normales, no estimulados por PCTA.
Como se explico anteriormente, la inhibition de la lisis mediada por NK se controla mediante la expresion de moleculas del CMH de clase I especlficas en la superficie de la celula diana, en particular HLA-C. Hay dos grupos distintos de alelos HLA-C con respecto al reconocimiento de los linfocitos NK. Algunos tumores expresan ambos tipos de alelos HLA-C, que se cree que son resistentes a la lisis mediada por linfocitos NK. Las celulas “resistentes a NK” pueden, por tanto, expresar ambos grupos de alelos de clase I. Algunas llneas celulares derivadas de leucemia/linfoma, tales como Raji y Daudi expresan ambos tipos de alelo HLA-C, lo que las convierte en modelos utiles para las celulas tumorales resistentes a NK in vivo.
La invention se describira ahora adicionalmente por medio de ejemplos, que estan destinados a servir para ayudar a una persona con experiencia ordinaria en la tecnica en la realization de la invencion y no se pretende de ninguna manera limiten el alcance de la invencion.
Ejemplos
Ejemplo 1: La pre-incubacion de linfocitos NK con determinadas llneas de celulas aumenta significativamente el grado de lisis de las celulas resistentes a NK.
La pre-incubacion de los linfocitos NK de donantes normales con celulas CTV-1 aumenta de manera muy significativa (p <0,001) el % de lisis de las celulas Raji (Figuras 2A, 3A y 4A). Las celulas CTV-1 son “celulas tumorales activadoras”.
La pre-incubacion con celulas HL-60 (Figura 2A, 3A y 4A) o Raji (Figuras 3A y 4A) o son menos eficaces o ineficaces en la activation de los linfocitos NK para efectuar la lisis de las celulas Raji. La pre-incubacion con CMSP normales incompatibles en HLA-KIR alogenicas no induce la activacion de NK (Figura 4A). En estos experimentos, las celulas tumorales expresan niveles normales de antlgenos CMH de clase I al igual que las llneas de celulas Daudi y Raji. Las celulas Daudi y Raji expresan ambas moleculas HLA-C, que unen KIR de clase 1 y clase 2.
La pre-incubacion con CTV-1 produce un aumento en el grado de lisis de las diversas llneas de celulas tumorales, tales como Raji, Daudi, JOSK y HL-60 (Figura 2B).
Ejemplo 2: Investigation de los requisitos para la activacion de los linfocitos NK
El efecto de la fijacion y brefeldina A (BFA) sobre la activacion de NK por celulas CTV-1 se investiga usando multiples donantes normales. Como se muestra en la Figura 3B, la induction de la activacion de NK requiere el contacto con la llnea celular tumoral aunque no requiere la secretion de una citosina, ya que la fijacion de las celulas tumorales no suprime la respuesta. Los linfocitos NK necesitan la slntesis de una protelna en respuesta a la union de las celulas tumorales, ya que la adicion de brefeldina A durante la pre-incubacion evita la induccion del estado activado.
Ejemplo 3: Investigacion del efecto de la union de KIR
Con el fin de investigar el efecto de la union de KIR durante la fase de estimulacion, el uso de llneas de celulas tumorales estimulantes compatibles e incompatibles en HLA-KIR se compara en cuanto a la estimulacion de los linfocitos NK para efectuar la lisis de celulas Raji. Las llneas de celulas tumorales estimulantes no necesitan ser incompatibles en HLA-KIR con los linfocitos NK del donante aunque parezca que el umbral para la activacion de los linfocitos NK por la llnea de celulas tumorales pueda ser menor en ausencia de union de KIR (Figura 6A).
En otro experimento, los linfocitos NK purificadas de donantes normales se seleccionan en funcion de su tipo HLA-A, HLA-B y HLA-C como ligando compatible o incompatible con celulas CTV-1. Las celulas CTV-1 son homocigotas para el HLA-C tipo 2 y expresan los alelos HLA-Bw4. De este modo, unen KIR2DL1 y KIR3DL1 en los linfocitos NK. Los cocultivos NK:CTV-1 se establecen con linfocitos NK que expresan KIR2DL1, que expresan KIR2DL1 y KIR3DL1 y con celulas que expresan solo KIR2DL2/3, cuyo ligando falta en las celulas estimuladoras CTV-1. Por lo tanto, es posible evaluar la contribution de la “perdida de lo propio” para la etapa de activacion de NK. Los AMLANK (linfocitos NK activados por LMA) son generados por CTV-1 tanto de donantes compatibles como incompatibles en HLA-/KIR y no existe ninguna diferencia significativa en el grado de lisis especlfica aunque los AMLANK de donantes compatibles muestran mayor heterogeneidad (Fig 6B). El grado de lisis es equivalente al obtenido por la activacion no especlfica con IL-2 (Fig 7A).
El fenotipo KIR de los linfocitos NK de sangre periferica no esta completamente restringido por el HLA del individuo y es comun para los linfocitos NK carecer de KIR adecuados para el propio CMH e incluso para expresar los KIR especlficos de los alelos HLA ausentes del individuo. En otro experimento, los linfocitos NK de donantes normales se co-incuban durante la noche con CTV-1 y se fenotipan para la expresion de KIR y de CD69. Es facilmente
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evidente que la activacion de NK inducida por CTV-1 no se limita a linfocitos NK incompatibles en KIR, ya que las celulas que expresan CD158a y CD158e1 muestran niveles equivalentes de activacion a los linfocitos NK de los mismos donantes que carecen de CD158a o CD158e1 pero expresan CD158b, cuyo ligando esta ausente de CTV-1 (Figura 7C). Para investigar con mas precision el papel de KIR en la activacion mediada por CTV-1 y en la lisis de Raji, los linfocitos NK se fenotipifican y se seleccionan en cuanto a su compatibilidad en KIR con el HLA de las celulas estimuladoras CTV-1 mediante la seleccion de poblaciones celulares por citometrla de flujo. Las subpoblaciones de linfocitos NK seleccionados por citometrla de flujo se incuban directamente con celulas CTV-1 o se incuban durante la noche, de modo que el anticuerpo anti-KIR se libera del linfocito NK y no puede bloquear la interaccion entre KIR:HLA. En ambos casos los linfocitos NK que expresan CD158a y CD158e1 muestran lisis equivalente de celulas Raji en comparacion con NK CD158a/e1 positivo de los mismos donantes (Figura 7D).
Ejemplo 4: Lisis de las leucemias primarias
Ademas de su capacidad para efectuar la lisis de llneas celulares tumorales resistentes a NK, tambien se muestra que los linfocitos NK activados por CTV-1 tienen una mayor capacidad para efectuar la lisis de las celulas de leucemia primaria, en comparacion con los linfocitos nK pre-incubados con celulas de LMA o celulas Raji compatibles en HLA-KIR (Figura 4B y C).
Los linfocitos AMLANK de donantes alogenicos pueden efectuar la lisis de celulas de LMA primaria de todos los tipos FAB (Fig 4C). Estas celulas tambien efectuan la lisis de las celulas de LLC primarias en una relacion de celula efectora (E):celula diana (T, en ingles target) de 1:1, aunque el nivel de destruccion es bajo. Era notable que la llnea celular de cancer de mama relativamente resistente a NK, MCF-7, es extremadamente susceptible a los linfocitos AMLANK (Ejemplo 5) al igual que las celulas tumorales primarias aisladas de tejido resecado de pacientes con cancer de mama y cancer de ovario (Figura 4D).
La falta de necesidad de compatibilidad en HLA se confirmo en un estudio de dos donantes con HLA identico y sus respectivos hermanos con leucemia. Los linfocitos AMLANK del donante hermano con HLA identico para el paciente 0100 lisan efectivamente los blastos de LMC crioconservados obtenidos del paciente en el momento de la presentacion de la enfermedad. Esta lisis era evidente a una relacion E:T de 1:1 y se incremento al aumentar las relaciones E:T. Por el contrario, los linfocitos NK del mismo donante no pudieron efectuar la lisis de los blastos de LMC incluso con la relacion mas alta E:T de 10:1. Lo mismo se observo con el uso de linfocitos AMLANK de un donante hermano con HLA identico para el paciente 0359 que se presento con LMA M2 y del cual se habla crioconservado blastos en el momento de la presentacion.
Ejemplo 5: Lisis de las llneas celulares CaBr
La llnea celular de cancer de mama MCF-7 fue extremadamente susceptible a la lisis por AMLANK en una relacion E:T de 5:1 despues de un perlodo de incubacion de cuatro horas (Figura 4C).
Ejemplo 6: Investigacion del efecto sobre las celulas hematopoyeticas normales
La estimulacion de los linfocitos NK de donantes normales haplo-compatibles con las dos llneas de celulas tumorales no inicia respuestas llticas a CMSP normales compatibles en KIR (autologas) o incompatibles en KIR (haplo 1 o haplo 2) (Figura 5A).
Para investigar la especificidad frente al tumor de los linfocitos AMLANK alogenicos, se alslan los linfocitos NK de donantes normales y, o bien se activan con celulas CTV-1 durante la noche o se mantienen los medios. A continuacion, estos linfocitos AMLANK se comparan con los linfocitos NK compatibles con respecto a la lisis de CMSP autologas y alogenicas normales. Ni los linfocitos NK ni los AMLANK lisan CMSP autologas ni tampoco lisan CMSP de donantes normales compatibles en HLA-C (Figura 5B). Para determinar la probabilidad de supresion de la medula osea por linfocitos AMLANK, se establecen ensayos de formacion de colonias hematopoyeticas con medula osea de 5 donantes normales y se anaden AMLANK de donantes incompatibles en HLA-C en proporciones crecientes. CFU-GM, BFU-E y CFU-GEMM no se ven afectados por la co-incubacion con AMLANK HLA-compatibles (Fig 5C).
Ejemplo 7: Investigacion de la lisis por linfocitos AMLANK
La comparacion de los linfocitos AMLANK con NK en reposo y con linfocitos NK estimulados con IL-2 (linfocitos NK activados por linfocina - LAK) de los mismos donantes muestra una lisis equivalente de Raji (Figura 7A).
En comparacion con los linfocitos NK en reposo a una alta relacion de E:T (10:1), los linfocitos AMLANK pueden provocar una lisis detectable de los blastos leucemicos en el momento de la presentacion, incluso en una relacion 1:1 (Figura 7B). La llnea discontinua (en la Figura 7B) representa el grado de lisis especlfica de los blastos de LMA que se han descrito anteriormente como asociados con la remision continua en pacientes con LMA despues de la quimioterapia (Lowdell et al (2002) Br. J. Haematol.117: 821-7).
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Ejemplo 8: Investigacion de la importancia de CD69
La co-incubacion de linfocitos NK de donantes normales con un numero igual de celulas CTV-1 irradiadas induce la expresion rapida y sostenida de CD69 en los linfocitos NK (Figura 8A). Los linfocitos NK purificados se mezclan con un numero equivalente de celulas CTV-1 irradiadas que han sido marcadas con PKH-26. Se extraen allcuotas en los puntos temporales indicados y se marcan con anti-CD56 FITC y anti-CD69 APC, se lavan y se analizan por citometrla de flujo. Las celulas CTV-1 se excluyen del analisis en funcion de la dispersion frontal de la luz (FSC) y la expresion de pKH-26 y los linfocitos NK se incluyen positivamente en funcion de la expresion de FSC y CD56. Se presentan los resultados de 10 donantes normales y se expresan como la proporcion de celulas CD69+ dentro de la fraccion CD56+ NK.
Cuando los linfocitos NK de donantes normales (n = 10) se incuban con o sin CTV-1 irradiados durante la noche, las comparaciones por pares emparejados de la expresion de una variedad de ligandos activadores e inhibidores candidatos mediante citometrla de flujo muestra que existe un aumento significativo en la expresion de CD69 (p <0,001) pero no un incremento en cualquiera de los otros ligandos estimuladores estudiados (Figura 8B). La expresion de CD16 se reduce. La regulation positiva de CD69 es bloqueada en presencia de brefeldina A (datos no mostrados).
Los linfocitos AMLANK co-incubados con celulas Raji en una relation E:T de 1:1 muestra la formation de conjugado a los 60 min por microscopla confocal y la polarization de CD69 en la sinapsis inmunologica: La Fig. 9A muestra un unico linfocito AMLANK de un donante sano conjugado con una unica celula Raji. El conjugado se marca con anti- CD69 FITC y Dapi como la mancha nuclear. Se genera CD69 humano recombinante como se ha descrito y el sobrenadante con la protelna replegada se fracciona por HPLC. Las fracciones F2 y F3 contienen rCD69 monomerico cuando se evaluo mediante transferencia Western en condiciones reductoras. La fraccion 4 contiene concentraciones considerablemente mas altas de rCD69 que son detectables como un monomero en presencia de DTT y tanto como un monomero como un dlmero en condiciones no reductoras (Fig 9B). rCD69 esta ausente de la cepa bacteriana parental (carril P) y de todas las demas fracciones de HPLC ensayadas (datos no presentados). El analisis de citometrla de flujo de celulas Raji marcadas muestra la union positiva solamente con nano-partlculas recubiertas con fracciones de HPLC que contienen rCD69 (histogramas sombreados en la Figura 9C). Esta union es confirmada por microscopla confocal (D) y citometrla de flujo (G). En comparacion con la llnea de linfocitos B malignos, los linfocitos B normales no se unen a las esferas (E). La expresion CD69L tambien esta ausente de las celulas K562 sensibles a NK (Fig 9H), linfocitos T normales (Fig 9I), linfocitos B normales (Fig 9J) y linfocitos NK normales (Fig 9K) de todos los donantes sanos (n = 3). La expresion de CD69L tambien se detecto en otras llneas celulares susceptibles a lisis mediada por T-ANK incluyendo celulas Daudi, celulas Jurkat, celulas MCF-7 y celulas ARH77 (tabla 1).
Tabla 1 - Distribution en el tejido de la expresion de CD69L
- Llnea celular
- Tipo celular Expresion de CD69L
- Celulas T normales
- Negativo
- Linfocitos B normales
- Negativo
- Linfocitos NK normales
- Negativo
- RAJI
- Linfoma de Burkitt Positivo
- Daudi
- Linfoma de Burkitt Positivo
- K562
- Eritroleucemia Negativo
- ARH77
- Mieloma Positivo
- Jurkat
- Linfoma de linfocitos T Positivo
- MCF-7
- Tumor de mama mestastasico Positivo
La pre-incubacion de las celulas Raji con 260 gg-1 mg de las fracciones 2 o 4 (en ausencia de nano-partlculas) inhibe significativamente la lisis por los AMLANK de las celulas Raji en comparacion con la pre-incubacion con la fraccion 1 que no contenla rCD69 (F).
En resumen, los presentes inventores hablan demostrado anteriormente que CD69 se expresaba en los focos de polarizacion de linfocitos NK activados en la sinapsis inmunologica con una celula de LMA autologa (Lowdell et al (2002) como anteriormente) y ahora han confirmado esto en la sinapsis entre linfocitos AMLANK y celulas Raji (Fig 9A).
Sin desear estar limitado por la teorla, estos resultados implican que el ligando CD69 (CD69L) se expresa en las celulas tumorales sensibles a AMLANK. CD69L es actualmente desconocido.
CD69 es crftico para la destruction restringida al tumor por los linfocitos T-ANK
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Para establecer el papel de la interaction CD69:CD69L en la actividad de los T-ANK, se seleccionan los linfocitos TANK CD69+ tras la estimulacion con CTV-1 de las celulas CD69 positivo antes de un ensayo de lisis de RAJI. La fraction CD69+ media el 83,7 % de la actividad de los linfocitos T-ANK no fraccionados mientras que los linfocitos NK CD69- muestran un 5,5 % (Fig 9M). El papel fundamental de CD69 en la activation de los T-ANK se confirma mediante la inhibition de la lisis de celulas RAJI en presencia de rCD69. La pre-incubacion de celulas RAJI con rCD69 reduce significativamente el grado de lisis celular de RAJI casi hasta el nivel de la lisis por linfocitos NK en reposo. Este efecto no se observo cuando las celulas RAJI se pre-incubaban con BSA o rCD69 desnaturalizado con calor (Fig 9N).
Como era de esperar, rCD69 no bloquea la lisis de K562, ya sea por linfocitos NK en reposo o por linfocitos T-ANK (Fig 9O).
La resistencia de las celulas hematopoyeticas normales a la lisis por linfocitos AMLANK, incluso en ausencia del HLA que une el KIR relevante, implicaba que las celulas tumorales expresan un ligando restringido al tumor que es responsable de la lisis por las NK. La falta de generation de AMLANK en presencia de brefeldina A confirmo que la molecula de serialization para la lisis mediada por AMLANK estaba recien sintetizada tras la co-incubacion con las celulas tumorales estimulantes. De las moleculas activadoras de NK conocidas, solo CD69 es regulada positivamente durante la pre-incubacion.
CD69 es una glicoprotelna homodimerica expresada en muchas celulas hematopoyeticas tras la activacion. En los linfocitos NK humanos se ha demostrado que inicia la lisis de celulas tumorales cuando se une (Demanet et al (2004) Blood 103: 3122 a 3130) aunque los datos murinos implican que la union de CD69 es inhibidora de la lisis mediada por NK ya que los ratones con CD69 suprimido muestran una mayor actividad anti-tumoral (Esplugues et al (2003) J. Exp. Med.197:1093-1106) y el bloqueo de los anticuerpos monoclonales de CD69 sobre los linfocitos NK murinos aumenta su actividad lltica (Esplugues et al (2005) 105:4399- 4406). Mediante la production de una molecula CD69 humana dimerica recombinante, los inventores han demostrado que las celulas tumorales expresan el ligando para CD69 que esta ausente de las celulas hematopoyeticas normales. Por otra parte, los experimentos de bloqueo con CD69L confirman que CD69 en linfocitos NK activados es la molecula activadora predominante para la citotoxicidad de AMLANK. Esto viene apoyado por la evidencia de que la conjugation de linfocitos AMLANK:Raji conduce a la activacion de Syk dentro de los linfocitos AMLANK (datos no mostrados), un fenomeno que se sabe que esta asociado con la senalizacion mediada por CD69 (Pisegna et al (2002) 169: 68-74).
Materiales y metodos para los ejemplos 1-8:
Lineas celulares y celulas primarias
Todas las lineas celulares se obtienen de la American Typed Cell Collection (ATCC) y se mantienen en cultivo en suspension continua en “medio completo” (MC) que consiste en RPMI 1640 suplementado con FCS al 10 %, 100 u.i. de penicilina y 100 u.i. de estreptomicina (todo ello suministrado por Gibco, Paisley, Escocia). Se alslan celulas mononucleares de sangre periferica (CMSP) frescas a partir de sangre venosa heparinizada de donantes sanos normales mediante separation por gradiente de densidad discontinua (Lymphoprep, Nycomed, Reino Unido) y se usan en las cuatro horas siguientes a la de flebotomla.
Inmunofenotipado
Para analizar la expresion de antlgenos de superficie celular, se incuban 105 celulas en 100 gl de HBSS con anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromos a la concentration recomendada por el fabricante durante 15 minutos a temperatura ambiente. Despues de lavar las celulas se analizan mediante citometrla de flujo (FACS Calibur con software CellQuest, Becton Dickinson, Reino Unido). Se usan las caracterlsticas de dispersion frontal y lateral de la luz para acotar la poblacion de linfocitos viables antes de la adquisicion de al menos 10 000 celulas de cada muestra. Todos los anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo son adquiridos en BD (Cowley, Reino Unido) o Beckman Coulter (High Wycombe, Reino Unido).
Purificacion de linfocitos NK humanos y celulas diana
Se obtienen muestras de sangre periferica heparinizada frescas se despues de recogido el consentimiento informado de donantes sanos normales, de pacientes con leucemias aguda y cronica en el diagnostico (Tabla 1) y de dos donantes hermanos con CMSP HLA identicas de pacientes seleccionados para el trasplante alogenico de celulas madre y que hablan donado muestras de medula osea en el momento de la presentation de su enfermedad y de los cuales se hablan crioconservado blastos leucemicos en multiples allcuotas.
Las celulas mononucleares (CMSP) se aislaron de sangre venosa mediante separacion en gradiente de densidad discontinua (Lymphoprep, Nycomed, Reino Unido) y se tipificaron en cuanto a los alelos de HLA de clase I A y B mediante tecnicas de resolution baja y HLA-Cw a alta resolution. Las celulas CD56+ CD3- se purifican a partir de las CMSP mediante separacion inmunomagnetica directa con el CD56 Multisort kit (Miltenyi Biotec, Alemania) y
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posterior agotamiento con CD3 FITC y esferas anti-FITC. Todas las celulas seleccionadas se confirman como > 98 % CD56 + y <3 % CD3+ y se volvieron a suspender en MC.
Tabla 2 - Caracteristicas del paciente
- Identificador
- Diagnostico Edad Sexo
- AML0191
- AML M0 31 H
- AML0231
- AML M2 42 H
- AML0258
- AML M4 35 H
- AML0273
- AML M2 22 H
- AML0302
- AML M4eo 28 M
- AML0306
- AML M6 48 H
- AML0314
- AML M3 40 H
- AML0317
- AML M7 24 H
- AML0359
- AML M4 19 H
- CLL727
- CLL728
- CLL729
- CLL730
- CML0100
- Fase cronica 52 M
Activation de linfocitos NK especifica del tumor
Se resuspenden linfocitos NK recien aislados en MC a una concentration de 106/ml y se incuban con un numero igual de celulas tumorales irradiadas (30 Gy) durante 20 horas a 37 °C/CO2 5 %. Las celulas tumorales estimuladoras estan restringidos a las llneas celulares de leucemia mieloide bien caracterizados, U937, HL-60 y CTV-1, que se obtienen del repositorio de DSMZ. Las celulas diana en ensayos de citotoxicidad incluyen la llnea celular RAJI resistente a NK (obtenida del banco de celulas de DSMZ), la llnea celular de cancer de mama MCF-7 (obtenida de la ATCC) y las celulas leucemicas primarias de los pacientes que acuden al Hospital Royal Free. Cada llnea de la leucemia mieloide y las celulas diana se someten a la tipificacion de HLA como se describe anteriormente.
Ensayo de citotoxicidad
Las celulas diana se recuperaron del cultivo o la crioconservacion y se lavaron en HBSS antes de la resuspension en 1,0 ml de diluyente de marcaje PHK-26 a una concentracion de 4 x 106/ml. Se anade una allcuota de 4 gl de PKH-26 a 1,0 ml de diluyente de marcaje y a continuation se anade a la suspension de celulas durante 2 minutos a temperatura ambiente. La reaction de marcaje se detiene mediante la adicion de 1,0 ml de suero de ternera fetal puro durante 1 min. Por ultimo, las celulas marcadas se lavan dos veces en MC y se resuspenden en MC a 106/ml. Se anaden 50.000 celulas diana marcadas con PKH-26 en 100 gl de RPMI 1640 (FCS 10 %) a 400 gl de celulas efectoras y se sedimentan a 200 g durante 1 min.
La citotoxicidad se mide en muestras por triplicado usando un ensayo de citotoxicidad de 4 horas a 37 °C. Despues del perlodo de incubation, las celulas se resuspenden en una solution de yoduro de To-Pro-3 (Molecular Probes, Oregon, EE.UU.) en PBS (1 gm) y se analizan por citometrla de flujo. Al menos se adquieren 10 000 celulas diana con la resolution del canal 1024 despues de la acotacion electronica en fluorescencia roja y se determina la proportion media de celulas yoduro de To-Pro positivas de las muestras por triplicado. Se determina la muerte de celulas de fondo de las celulas incubadas en ausencia de celulas efectoras. La citotoxicidad mediada por celulas se expresa como porcentaje de destruction respecto al promedio de muerte celular de fondo de las tres muestras:
Media (% de lisis celular en el ensayo - % lisis espontanea)
En estos experimentos se observa menos del 5 % de lisis espontanea de celulas diana. En algunos experimentos, la estrategia de marcaje se invierte, marcandose las celulas efectoras con PKH-26 y restringiendose el analisis de la lisis celular a la fraction PKH positivo. Esta inversion confirmo que nuestros resultados iniciales no se deben a un artefacto del marcado de la celula.
Ensayo de bloqueo
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Celulas diana RAJI y K562 marcadas con PKH se pre-incuban con rCD69 o reactivo de control (6gg por 105 celulas) a 4 °C durante 30 minutos antes de la puesta en marcha del ensayo de citotoxicidad con T-ANK descrito anteriormente.
Production y purification de CD69 humano dimerico recombinante
El dominio extracelular de CD69 (residuos 65-199) se amplifica a partir del ADNc mediante reaccion en cadena de la polimerasa usando cebadores que introducen sitios de restriccion Xhol y Hindlll y un codon de parada (CD69 Para 5' GCG CCT CGA GCA ATA CAA TTG TCC AGG CCA AT 3'; CD69Rev 5' CGC GAA GCT TAT TAT TTG TAA GGT TTG TTA CA 3'). El producto de PCR se subclona en los sitios de restriccion Xhol-Hindlll del plasmido pET-19b (Novagen) usando tecnicas estandar, para construir pET-19b/69. La secuencia de ADN que codifica la secuencia del aceptor de aminoacidos para la biotina protelna ligasa Bir A de E. coli se anade entre los sitios Ndel y Xhol de pET- 19b/69 con los siguientes cebadores 5' CAT ATG CAT GCG GGC GGC CTG AAT GAA ATT CTG GAT GGC ATG AAA ATG CTG TAT CAT GAA CTC GAG 3' and 5' CTC GAG TTC ATG ATA CAG CAT TTT CAT GCC ATC CAG AAT TTC ATT CAG GCC GCC CGC ATG CAT ATG 3'. La secuencia de ADN se confirma por secuenciacion automatizada usando un secuenciador de ADN ABl Prism 377.
El CD69 humano marcado con His recombinante se expresa en BL21 (DE3)pLysS (Novagen) a 37 °C. Los cultivos se cultivan en lotes de 1 litro de medio 2xTY que contiene 100 gg/ml de ampicilina y 34 gg/ml de cloranfenicol. La expresion de CD69 se induce por adicion de isopropil-D-tiogalactopiranosido (lPTG) 1 mM despues de que el cultivo haya alcanzado una DO600 ~ 0,6. Las celulas se dejan crecer durante otras 4-5 horas y despues se recogen por centrifugacion a 5000 g durante 20 minutos a 4 °C. Los sedimentos celulares se conservan a -80 °C.
Los sedimentos celulares de 250 ml de cultivo se volvieron a suspender en 15 ml de tampon de resuspension (Tris- HCl 20 mM pH 8,0) enfriado con hielo. Las celulas se rompieron por multiples pases a traves de una aguja de calibre 16 antes de la centrifugacion a 12000 g durante 15 minutos a 4 °C. El sedimento se lavo en tampon de aislamiento (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, Triton-X100 2 %, urea 2 M) antes de ser centrifugado de nuevo. Este proceso se repite una vez mas. El sedimento se lava finalmente en tampon de resuspension antes de ser almacenado a -80 °C.
Antes de la purification y replegamiento, el sedimento se resuspende en tampon de solubilization (clorhidrato de guanidina 6 M, Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM) y se pasa a traves de un filtro de 0,45 gm y a continuation se carga en una columna quelante HiTrap cargada con 5 ml de nlquel (GE Life Science, Amersham Reino Unido) pre-equilibrada con tampon de replegamiento (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, urea 6 M urea, imidazol 10 mM). La protelna se repliega mediante la elimination gradual de la urea a traves de un gradiente lineal que va desde 100 % de tampon de replegamiento hasta 100 % de tampon de lavado (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 10 mM). Esto se consigue con 250 ml de tampon a razon de 5 ml/minuto usando un sistema de HPLC (Varian Technologies). Despues del replegamiento, la protelna se eluye con tampon de elucion (Tris-HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 500 mM, imidazol 500 mM).
Se hace un intercambio de tampon de las fracciones en Tris-HCl 10 mM pH 8,0 usando columnas PD10 (GE Life Science, Amersham, Reino Unido) y se incuba con 2,5 gg de enzima BirA (Avidez Denver, EE.UU.) por 10 nmoles de sustrato a 30 °C durante la noche siguiendo las instrucciones del fabricante. El exceso de biotina es retirado y la protelna se concentra mediante lavado con 50 ml de HBSS en tubos de centrlfuga con un valor de corte del PM de 10.000 dalton (Vivascience Reino Unido) y se evalua para determinar el contenido de rCD69 por ELlSA.
Con el fin de ensayar la expresion de CD69L por citometrla de flujo, se conjuga 5 gg de rCD69 biotinilado con esferas fluorescentes amarillas recubiertas con avidina (Spherotech lnc.) por incubation rotatoria a 4 °C durante 40 minutos como se ha descrito previamente (Brown et al (1988) J. Exp. Medicina.188: 2083-2090). Los conjugados de esfera y protelna se sonican brevemente para evitar la agregacion y se incuban con 105 celulas diana en hielo durante 60 minutos. Las celulas unidas se lavan con HBSS. La adquisicion mediante citometrla de flujo se realiza en un maximo de 40 acontecimientos por segundo con el fin de evitar la adquisicion de eventos coincidentes. La union de 5 gg de rCD69 desnaturalizado con calor se utiliza como un control negativo para cada experimento.
Ejemplo 9: Uso de linfocitos NK activados para el tratamiento de pacientes con LMA de pronostico desfavorable
Miller et al (2005) como anteriormente, han descrito recientemente un metodo para la administration de linfocitos NK de donantes sanos HLA haploidenticos a pacientes con LMA recidivada tras la quimioterapia con ciclofosfamida y fludarabina. Estos pacientes mostraron aceptacion del injerto, expansion y persistencia in vivo de los linfocitos NK.
El metodo descrito por Miller esta adaptado para su uso con la presente invention haciendo los siguientes cambios:
(i) los linfocitos NK alogenicos son pre-activados antes de la infusion de acuerdo con la invencion y el uso de un proceso descrito a continuacion; y
(ii) los linfocitos NK seran seleccionados de donantes normales relacionados haploidenticos por separation inmunomagnetica directa (CliniMACs).
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Los productos NK infundidos en el estudio de Miller no eran puros (aproximadamente 40 % de NK) y estaban contaminados con linfocitos T y B. En un caso, un paciente murio de linfoma asociado al VEB derivado de un clon de linfocitos B del producto del donante que se transformo in vivo durante el perlodo linfopenico posterior a la infusion.
Cuando los linfocitos NK se seleccionan de donantes normales relacionados haploidenticos por separacion inmunomagnetica directa (CliniMACs), se consiguen linfocitos CD56+ con una pureza superior al 95 %. El grado de contamination de los linfocitos NKT es dependiente del donante, pero es poco probable que supere la dosis de linfocitos T infundidos en el estudio de Miller. En el caso de una contaminacion con NKT elevada, la dosis infundida de NK puede reducirse para garantizar que la dosis de linfocitos T no sobrepase la cantidad dada por Miller. Los linfocitos NK alorreactivas pueden ser identificados por la expresion de CD69 en una reaction linfocitaria mixta y dichas celulas se fenotipifican para la expresion de KIR pre-y post cultivo antes de la infusion. Los presentes inventores tambien han establecido un modelo de explante de piel para la prediction de la enfermedad de injerto contra huesped. Este ensayo in vitro se puede utilizar para garantizar la calidad de las infusiones de linfocitos NK.
Los blastos leucemicos son crioconservados como celulas viables de pacientes con LMA. Por lo tanto, los productos NK de los donantes se analizan in vitro en cuanto a la actividad lltica contra blastos de LMA de pacientes y los resultados se correlacionan con la respuesta cllnica al tratamiento.
Los pacientes son seleccionados segun los siguientes criterios:
Adulto capaz de ofrecer un consentimiento informado y que tiene un donante HLA haploidentico con leucemia mieloide aguda despues de CR1.
Inelegible para TCMH alogenico de un hermano o de un donante no relacionado HLA compatible. Adecuado para quimioterapia de alta dosis con ciclofosfamida y fludarabina.
Los pacientes reciben 60 mg/m2 de ciclofosfamida y 25 mg/m2 de fludarabina al dla por infusion i.v. durante 5 dlas consecutivos. En el quinto dla, el donante consentidor se somete a una sola aferesis para obtener 2-3x1010 celulas mononucleares. Los linfocitos NK son aislados por selection inmunomagnetica usando microesferas anti-CD56 (Miltenyi Biotec) y el dispositivo CliniMACs y se incuban durante la noche con el mismo numero de celulas de leucemia mieloide CTV-1 irradiadas para proporcionar un estlmulo especlfico del tumor.
Despues de la incubation durante la noche las celulas se lavan mediante centrifugation y se enumeran los linfocitos NK viables. Se preparan dosis de 5x106 NK/kg para los primeros 5 pacientes, 1x107/kg para los proximos cinco pacientes y 2x107/kg para el ultimo grupo de cinco pacientes. Se conservan allcuotas de los linfocitos NK de donantes para la prueba como se ha descrito anteriormente. Los pacientes reciben sus linfocitos NK de donantes en forma de una sola infusion i.v. en el dla 6. Estos son controlados para detectar la enfermedad injerto contra huesped y se realizan estudio cllnicos de quimerismo de celulas especlficas diariamente durante los 7 primeros dlas, cada semana durante los siguientes tres meses y posteriormente cada mes hasta los 12 meses.
Ejemplo 10: Calendario de production de linfocitos NK activados por el tumor (T-aNK) cllnicas
(i) Protocolo para la generation ex vivo de linfocitos T-ANK
Se seleccionan donantes relacionados, sanos, normales de acuerdo con los mismos criterios que para los donantes de celulas madre hematopoyeticas. De acuerdo con el consentimiento informado, los donantes son examinados para detectar marcadores de enfermedades infecciosas de acuerdo con las normas JACIE y se les realiza una exploration medica para determinar su idoneidad para someterse a aferesis. Cada donante es, ademas, evaluado de forma independiente por el responsable del procedimiento de la aferesis.
Los donantes consentidores se someten a una sola aferesis de dos horas para cosechar 25x109 celulas mononucleares en anti-coagulante ACD. La bolsa de recogida de aferesis se etiqueta con el nombre del donante, numero de historia cllnica del donante, fecha de nacimiento del donante, nombre del destinatario, numero de historia cllnica del destinatario, fecha y hora de la aferesis y el volumen del producto. Los productos de la aferesis son recogidos de la unidad por un miembro del personal de LCT y se transporta directamente en un recipiente aprobado para el LCT.
Tras la aceptacion por LCT, los productos de la aferesis se incluyen en la base de datos de productos LCT y se les asigna un numero de producto unico. La base de datos reproduce todos los detalles sobre la bolsa de producto y registra, ademas, la fecha de nacimiento del receptor, la masa corporal del receptor y el numero de ensayo unico asignado al paciente al ingreso en el ensayo y el consentimiento.
Usando el PNT de rutina, los productos de la aferesis se reducen a una fraction de celulas mononucleares puras mediante separacion por gradiente de densidad. Se extrae una muestra de 1 ml para obtener un recuento de celulas mononucleares y una enumeration de linfocitos CD56+ por citometrla de flujo. El volumen de la fraccion de celulas mononucleares requerida para proporcionar 2x107 de NK/kg de masa corporal del paciente se recupera en una bolsa esteril de 250 ml, se lava mediante centrifugacion y se resuspende a 5x106/ml en medio RPMI 1640, suplementado
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ii) Preparacion de membranas celulares de la llnea celular CTV-1
Celulas CTV-1 (suministradas directamente del banco de tejidos DSMZ, Braunschweig, Alemania - se adjunta registro del banco de celulas maestro) se mantienen en crecimiento exponencial continuo a una concentracion de 0,5-1x106/ml en medio RPMI 1640/FCS al 10 %, en un sistema de cultivo cerrado (Lifecell bags, Baxter Healthcare) en el Paul O'Gorman Laboratory of Cellular Therapeutics, RFUCMS (Banco de Tejidos Acreditado por la MHRA 0029/00/00/0-03). Los registros de produccion se mantienen para todos los lotes que incluyen los numeros de lote de todos los reactivos y los materiales desechables utilizados y las iniciales de todo el personal que lleva a cabo los procedimientos individuales y las fechas de esos procedimientos. Los numeros de serie de todos los equipos utilizados en el proceso de produccion tambien se registran.
Para preparar las membranas celulares, se transfieren allcuotas de 8 ml por procedimiento cerrado en bolsas de 10 ml Cryocyte esteriles (Baxter Healthcare) y se colocan en un congelador a -80 °C durante 15 minutos. Las celulas se descongelan rapidamente en un bano de agua a 37 °C y se devuelven al congelador a -80 °C congelador durante otros 15 minutos. Las celulas se descongelan rapidamente de nuevo en el bano de agua. Se anaden 40 pl de Pulmozyme (1.000 U/ml de solucion madre) a cada bolsa de cultivo que se incuba a 37 °C durante 30 minutos.
Despues del lavado por centrifugacion a 2.500xg durante 10 minutos para eliminar la ADNAsa, las preparaciones de membrana se resuspenden en 4 ml de solucion salina esteril (grado de infusion) y se tratan en autoclave a 121 °C durante 5 minutos. Despues de enfriar a 21 °C las bolsas se colocan en un bano de sonicacion durante 25 segundos para romper los agregados que se puedan formar durante el tratamiento en autoclave.
La formacion de las membranas celulares se controla tomando muestras en las distintas etapas del procedimiento y comparandolas con la dispersion frontal de la luz (FSC) y la dispersion lateral de la luz (SSC) a un angulo de 90 ° de celulas CTV-1 enteras mediante citometrla de flujo. En la Figura 10 se muestra un ejemplo.
La esterilidad de las preparaciones de membrana se analiza por lotes siguiendo un PNT de rutina y se almacenan a una concentracion de protelna total de 5 mg/ml en solucion salina esteril (para inyeccion) a -80 °C en un congelador controlado con la etiqueta: “Preparacion de membrana de CTV-1 - calidad cllnica. Conservar a una temperatura inferior a -40 °C” junto con el numero de lote, la fecha de fabricacion y la fecha de caducidad (6 meses a partir de la fecha de fabricacion).
(iii) Activacion de NK del donante con preparaciones de membrana de CTV-1
Las bolsas de cultivo LifeCell que contienen celulas mononucleares del donantes seleccionadas a 5x106/ml se complementan con preparacion de membrana de CTV-1 descongelada a una concentracion final de 5 mg por 107 linfocitos NK del donante. Se cultivan celulas mononucleares suficientes para proporcionar una dosis de celulas maxima de 107 NK/kg de masa corporal del paciente. Los cultivos celulares se mantienen durante un mlnimo de 16 horas y un maximo de 26 horas a 37 °C/CO2 5 % en una incubadora controlada con filtro Hepa en LCT.
Despues de la incubacion durante la noche, las celulas mononucleares se recuperan por centrifugacion, se resuspenden en tampon de marcado (detalles) y se incuban con microesferas anti-CD56 de calidad cllnica (Miltenyi Biotec GmbH) durante 45 min a 21 °C. Los linfocitos NK CD56+ se alslan por seleccion inmunomagnetica mediante CliniMACs (Miltenyi Biotec GmbH). La fraccion NK+ se recupera de la columna despues de un lavado extensivo (Cell Enrichment Procedure v3.02, Miltenyi Biotec, GmbH) para eliminar los linfocitos CD56+ y la preparacion de membrana de CTV1 residual. Los linfocitos CD56+ se recuperan y se suspenden en RPMI1640 a 108/ml. Las celulas se crioconservan siguiendo el PNT de rutina en una sola allcuota a la dosis requerida. Antes de la crioconservacion se extraen allcuotas para las pruebas de garantla de la calidad:
Numero de celulas
Pureza de las celulas CD56 + (superior al 75 %)
Contaminacion de linfocitos T CD3+/CD56- (por debajo de 105/kg de masa corporal del paciente) Cultivo bacteriano anaerobio/aerobio (“negativo” antes de la liberacion del producto) Actividad TaNK detectable frente a la llnea celular Raji resistente a NK en un ensayo de citotoxicidad de cuatro hora (determinada por un aumento> 25 % en la lisis de Raji en comparacion con linfocitos NK compatibles del mismo donante).
Claims (2)
- REIVINDICACIONES1. Un metodo de activacion de un linfocito citolltico natural (NK) humano, que comprende la etapa de poner en contacto el linfocito NK in vitro con una preparacion de celulas tumorales activadoras (PCTA), que comprende5 celulas tumorales humanas intactas, o una preparacion de membrana de celulas tumorales humanas.
- 2. Un metodo de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que la PCTA comprende celulas de leucemia mieloide CTV-1 o una preparacion de membrana de las mismas.10 3. Un metodo de acuerdo con cualquier reivindicacion anterior, en el que durante la activacion, la expresion de CD69esta regulada positivamente en el linfocito NK.
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|---|---|---|---|---|
| ATE323756T1 (de) * | 1997-04-30 | 2006-05-15 | Hans Klingemann | Natürliche killerzelllinien und verfahren zu ihrer verwendung |
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| US7435596B2 (en) * | 2004-11-04 | 2008-10-14 | St. Jude Children's Research Hospital, Inc. | Modified cell line and method for expansion of NK cell |
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