CN105505872A - 一种致敏nk细胞的方法及组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种致敏NK细胞的方法及组合物。所述致敏NK细胞的组合物包含实体瘤细胞抗原、CD28单抗、CD137单抗和桔红素。所述致敏NK细胞的方法,包括以下步骤:向NK细胞悬液中加入CD28单抗和实体瘤细胞抗原,在5%CO2、37℃中培养24小时,再加入CD137单抗和桔红素,继续在5%CO2、37℃中培养24小时。通过本发明致敏的NK细胞,对于肿瘤细胞的杀伤活性强,对抗原性较弱的肿瘤同样具有较强的杀伤能力。本发明致敏NK细胞分为两步进行刺激,先加入CD28单抗和实体瘤细胞抗原,以刺激NK细胞的识别功能,后加入CD137单抗和桔红素,再刺激免疫细胞向NK细胞分化。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养领域,尤其涉及一种致敏NK细胞的方法及组合物。
背景技术
NK细胞又叫自然杀伤细胞(naturalkillercell,NK),是机体重要的免疫细胞,不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关,而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生。NK细胞主要分布于外周血中,占PBMC的5~10%。NK细胞的杀伤活性无MHC限制,不依赖抗体,因此称为自然杀伤活性。NK细胞作用于靶细胞后杀伤作用出现早,在体外1小时、体内4小时即可见到杀伤效应。NK细胞的靶细胞主要有某些肿瘤细胞(包括部分细胞系)、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)、寄生虫等,因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染的重要免疫因素。
NK细胞在免疫细胞治疗中发挥了重要作用,但是在某些肿瘤疾病当中,由于肿瘤细胞免疫原性较弱、且能分泌免疫抑制因子促使细胞凋亡或者降低杀伤活性,导致NK细胞杀伤活性较差。现有技术通过加入该类肿瘤细胞抗原以达到刺激NK细胞增殖和增强杀伤活性的目的。这种方法对于血液性肿瘤的疗效不错;但对胃癌和肠癌等抗原性较弱并且存在免疫逃逸的实体瘤,采用胃癌或肠癌细胞抗原刺激的NK细胞对实体肿瘤杀伤效果较差。
发明内容
有鉴于此,有必要针对上述的问题,提供一种致敏NK细胞的方法及组合物。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种致敏NK细胞的组合物,包含实体瘤细胞抗原、CD28单抗、CD137单抗和桔红素。实体瘤细胞抗原可以刺激NK细胞的扩增,还能够使其识别特定种类的肿瘤细胞;CD28单抗可以增强NK细胞对肿瘤抗原的摄取能力,从而提高肿瘤抗原的致敏效果;桔红素可以巩固NK细胞对抗原的识别能力,同时避免NK细胞的自主凋亡;CD137单抗刺激NK细胞成熟和细胞因子的分泌。
优选地,所述致敏NK细胞的组合物各组分的浓度如下:
优选地,所述致敏NK细胞的组合物各组分的浓度如下:
优选地,所述致敏NK细胞的组合物中各组分的浓度如下:
一种致敏NK细胞的方法,包括以下步骤:
向NK细胞悬液中加入CD28单抗和实体瘤细胞抗原,在5%CO2、37℃中培养24小时,再加入CD137单抗和桔红素,继续在5%CO2、37℃中培养24小时。本发明致敏NK细胞的方法,先加入CD28单抗和实体瘤细胞抗原,以刺激NK细胞的识别功能,后加入CD137单抗和桔红素,再刺激免疫细胞向NK细胞分化,分为两步进行刺激,效率较高。
优选地,所述实体瘤细胞抗原通过以下方法制备:用5ml生理盐水重悬1×106个实体瘤细胞,加入冻存管中,放到液氮中冷冻,待细胞悬液完全凝结后取出,室温解冻至完全融化,重复冷冻解冻过程至细胞完全裂解,最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀,所得上清即为实体瘤细胞抗原。
优选地,所述NK细胞通过以下方法制备:用Ficoll分离液法分离单个核细胞,用含20-80ng/ml的IL-2和20-80ng/ml的IL-15的X-VIVO15培养基培养,每3天补液一次,培养至第14天。
优选地,所述实体瘤细胞抗原为胃癌细胞抗原或肠癌细胞抗原。
更优选地,所述实体瘤细胞抗原为MKN45胃癌细胞或HT29结肠癌细胞抗原。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
本发明的方法比较简便,不需要对NK细胞进行基因改造等一系列复杂操作。本发明致敏NK细胞分为两步进行刺激,先加入CD28单抗和实体瘤细胞抗原,以刺激NK细胞的识别功能,后加入CD137单抗和桔红素,再刺激免疫细胞向NK细胞分化,效率更高。通过本发明方法致敏的NK细胞,对抗原性较弱的肿瘤具有较强的杀伤能力。
具体实施方式
为了更好的说明本发明,下面结合具体实施方式做进一步说明。本发明中所用试剂或仪器均可由市场购得,使用的检测方法等都是本领域所熟知的,在此不再赘述。
实施例1
一种致敏NK细胞的方法,包括以下步骤:
S1、NK细胞分离培养
用等体积生理盐水稀释20ml脐血获得稀释液,将稀释液添加至Ficoll分离液上,稀释液与Ficoll分离液的体积比为3:1,700g离心20-30min,升降速降为零;吸取中间白膜层细胞,用生理盐水清洗两遍,进行细胞计数。用X-VIVO15培养基重悬细胞,调整接种密度1×106cells/ml,向细胞悬液中加入IL-2和IL-15,使IL-2和IL-15的浓度均为50ng/ml,放入5%CO2、37℃培养箱中培养到第14天,每3天补加X-VIVO15培养基以及IL-2和IL-15,保持细胞密度在1×106cells/ml,使IL-2和IL-15的浓度保持50ng/ml。
S2、肿瘤抗原制备
用5ml生理盐水重悬1×106个MKN45胃癌细胞(购买自ATCC),加入冻存管中,放到-196℃的液氮中冷冻,待细胞悬液完全凝结后取出,放在室温下解冻,待细胞悬液完全融化后再重复冷冻解冻过程3次(共反复冻融4次),最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀,所得上清即为MKN45胃癌细胞抗原。分光光度法测定肿瘤抗原的蛋白质浓度,用生理盐水调节蛋白浓度到50mg/ml备用。
S3、致敏NK细胞
用50ml含有50ng/mlIL-2和50ng/mlIL-15的X-VIVO15培养基重悬1×108个NK细胞,向细胞悬液中加入CD28单抗和MKN45胃癌细胞抗原,使CD28单抗的浓度为20ng/ml,MKN45胃癌细胞抗原的浓度为10mg/ml,在5%CO2、37℃培养箱中培养24小时;再加入CD137和桔红素,使CD137的浓度为30ng/ml,桔红素的浓度为80μg/ml,继续在5%CO2、37℃培养箱中培养24小时,即可得到致敏的NK细胞。
实施例2
一种致敏NK细胞的方法,包括以下步骤:
S1、NK细胞分离培养
用等体积生理盐水稀释20ml脐血获得稀释液,将稀释液添加至Ficoll分离液上,稀释液与Ficoll分离液的体积比为3:1,700g离心20-30min,升降速降为零;吸取中间白膜层细胞,用生理盐水清洗两遍,进行细胞计数。用X-VIVO15培养基重悬细胞,调整接种密度1×106cells/ml,向细胞悬液中加入IL-2和IL-15,使IL-2和IL-15的浓度均为20ng/ml,放入5%CO2、37℃培养箱中培养到第14天,每3天补加X-VIVO15培养基以及IL-2和IL-15,保持细胞密度在1×106cells/ml,使IL-2和IL-15的浓度保持20ng/ml。
S2、肿瘤抗原制备
用5ml生理盐水重悬1×106个MKN45胃癌细胞(购买自ATCC),加入冻存管中,放到-196℃的液氮中冷冻,待细胞悬液完全凝结后取出,放在室温下解冻,待细胞悬液完全融化后再重复冷冻解冻过程3次,最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀,所得上清即为MKN45胃癌细胞抗原。分光光度法测定肿瘤抗原的蛋白质浓度,用生理盐水调节蛋白浓度到50mg/ml备用。
S3、致敏NK细胞:
用50ml含有20ng/mlIL-2和20ng/mlIL-15的X-VIVO15培养基重悬1×108个NK细胞,向细胞悬液中加入CD28单抗和MKN45胃癌细胞抗原,使CD28单抗的浓度为15ng/ml,MKN45胃癌细胞抗原的浓度为5mg/ml,在5%CO2、37℃培养箱中培养24小时;再加入CD137单抗和桔红素,使CD137单抗的浓度为15ng/ml,桔红素的浓度为50μg/ml,继续在5%CO2、37℃培养箱中培养24小时,即可得到致敏的NK细胞。
实施例3
一种致敏NK细胞的方法,包括以下步骤:
S1、NK细胞分离培养
用等体积生理盐水稀释20ml脐血获得稀释液,将稀释液添加至Ficoll分离液上,稀释液与Ficoll分离液的体积比为3:1,700g离心20-30min,升降速降为零;吸取中间白膜层细胞,用生理盐水清洗两遍,进行细胞计数。用X-VIVO15培养基重悬细胞,调整接种密度1×106cells/ml,向细胞悬液中加入IL-2和IL-15,使IL-2和IL-15的浓度均为80ng/ml,放入5%CO2、37℃培养箱中培养到第14天,每3天补加X-VIVO15培养基以及IL-2和IL-15,保持细胞密度在1×106cells/ml,使IL-2和IL-15的浓度保持80ng/ml。
S2、肿瘤抗原制备:
用5ml生理盐水重悬1×106个MKN45胃癌细胞(购买自ATCC),加入冻存管中,放到-196℃的液氮中冷冻,待细胞悬液完全凝结后取出,放在室温下解冻,待细胞悬液完全融化后再重复冷冻解冻过程3次,最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀,所得上清即为MKN45胃癌细胞抗原。分光光度法测定肿瘤抗原的蛋白质浓度,用生理盐水调节蛋白浓度到50mg/ml备用。
S3、致敏NK细胞:
用50ml含有80ng/mlIL-2和80ng/mlIL-15的X-VIVO15培养基重悬1×108个NK细胞,向细胞悬液中加入CD28单抗和MKN45胃癌细胞抗原,使CD28单抗的浓度为40ng/ml,MKN45胃癌细胞抗原的浓度为30mg/ml,在5%CO2、37℃培养箱中培养24小时;再加入CD137单抗和桔红素,使CD137单抗的浓度为50ng/ml,桔红素的浓度为120μg/ml,继续在5%CO2、37℃培养箱中培养24小时,即可得到致敏的NK细胞。
实施例4
一种致敏NK细胞的方法,包括以下步骤:
S1、NK细胞分离培养
用等体积生理盐水稀释20ml脐血获得稀释液,将稀释液添加至Ficoll分离液上,稀释液与Ficoll分离液的体积比为3:1,700g离心20-30min,升降速降为零;吸取中间白膜层细胞,用生理盐水清洗两遍,进行细胞计数。用X-VIVO15培养基重悬细胞,调整接种密度1×106cells/ml,向细胞悬液中加入IL-2和IL-15,使IL-2和IL-15的浓度均为50ng/ml,放入5%CO2、37℃培养箱中培养到第14天,每3天补加X-VIVO15培养基以及IL-2和IL-15,保持细胞密度在1×106cells/ml,使IL-2和IL-15的浓度保持50ng/ml。
S2、肿瘤抗原制备
用5ml生理盐水重悬1×106个HT29结肠癌细胞(购买自ATCC),加入冻存管中,放到-196℃的液氮中冷冻,待细胞悬液完全凝结后取出,放在室温下解冻,待细胞悬液完全融化后再重复冷冻解冻过程3次,最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀,所得上清即为HT29结肠癌细胞抗原。分光光度法测定肿瘤抗原的蛋白质浓度,用生理盐水调节蛋白浓度到50mg/ml备用。
S3、致敏NK细胞:
用50ml含有50ng/mlIL-2和50ng/mlIL-15的X-VIVO15培养基重悬1×108个NK细胞,向细胞悬液中加入CD28单抗和HT29结肠癌细胞抗原,使CD28单抗的浓度为20ng/ml,HT29结肠癌细胞抗原的浓度为10mg/ml,在5%CO2、37℃培养箱中培养24小时;再加入CD137单抗和桔红素,使CD137单抗的浓度为30ng/ml,桔红素的浓度为80μg/ml,继续在5%CO2、37℃培养箱中培养24小时,即可得到致敏的NK细胞。
对比例1
一种致敏NK细胞的方法,包括以下步骤:
S1、NK细胞分离培养
用等体积生理盐水稀释20ml脐血获得稀释液,将稀释液添加至Ficoll分离液上,稀释液与Ficoll分离液的体积比为3:1,700g离心20-30min,升降速降为零;吸取中间白膜层细胞,用生理盐水清洗两遍,进行细胞计数。用X-VIVO15培养基重悬细胞,调整接种密度1×106cells/ml,向细胞悬液中加入IL-2和IL-15,使IL-2和IL-15的浓度均为50ng/ml,放入5%CO2、37℃培养箱中培养到第14天,每3天补加X-VIVO15培养基以及IL-2和IL-15,保持细胞密度在1×106cells/ml,使IL-2和IL-15的浓度保持50ng/ml。
S2、肿瘤抗原制备
用5ml生理盐水重悬1×106个MKN45胃癌细胞(购买自ATCC),加入冻存管中,放到-196℃的液氮中冷冻,待细胞悬液完全凝结后取出,放在室温下解冻,待细胞悬液完全融化后再重复冷冻解冻过程3次,最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀,所得上清即为MKN45胃癌细胞抗原。分光光度法测定肿瘤抗原的蛋白质浓度,用生理盐水调节蛋白浓度到50mg/ml备用。
S3、致敏NK细胞
用50ml含有50ng/mlIL-2和50ng/mlIL-15的X-VIVO15培养基重悬1×108个NK细胞,向细胞悬液中加入MKN45胃癌细胞抗原,使MKN45胃癌细胞抗原的浓度为10mg/ml,在5%CO2、37℃培养箱中培养48,即可得到致敏的NK细胞。
对比例2
一种致敏NK细胞的方法,包括以下步骤:
S1、NK细胞分离培养
用等体积生理盐水稀释20ml脐血获得稀释液,将稀释液添加至Ficoll分离液上,稀释液与Ficoll分离液的体积比为3:1,700g离心20-30min,升降速降为零;吸取中间白膜层细胞,用生理盐水清洗两遍,进行细胞计数。用X-VIVO15培养基重悬细胞,调整接种密度1×106cells/ml,向细胞悬液中加入IL-2和IL-15,使IL-2和IL-15的浓度均为50ng/ml,放入5%CO2、37℃培养箱中培养到第14天,每3天补加X-VIVO15培养基以及IL-2和IL-15,保持细胞密度在1×106cells/ml,使IL-2和IL-15的浓度保持50ng/ml。
S2、肿瘤抗原制备
用5ml生理盐水重悬1×106个HT29结肠癌细胞(购买自ATCC),加入冻存管中,放到-196℃的液氮中冷冻,待细胞悬液完全凝结后取出,放在室温下解冻,待细胞悬液完全融化后再重复冷冻解冻过程3次,最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀,所得上清即为HT29结肠癌细胞抗原。分光光度法测定肿瘤抗原的蛋白质浓度,用生理盐水调节蛋白浓度到50mg/ml备用。
S3、致敏NK细胞
用50ml含有50ng/mlIL-2和50ng/mlIL-15的X-VIVO15培养基重悬1×108个NK细胞,向细胞悬液中加入HT29结肠癌细胞抗原,使HT29结肠癌细胞抗原的浓度为10mg/ml,在5%CO2、37℃培养箱中培养48,即可得到致敏的NK细胞。
效果实施例1
收集各实施例和对比例致敏后的NK细胞,使用Promega的CytoTox非放射性细胞毒性检测试剂盒检测其对癌细胞的杀伤活性(细胞靶效比40:1),结果如表1所示。
表1、细胞杀伤活性结果表
组别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 对比例1 | 对比例2 |
细胞杀伤 | 90.4% | 96.3% | 92.1% | 94.2% | 65.3% | 58.9% |
由表1可知,本发明方法获得的致敏NK细胞对MKN45胃癌细胞的杀伤结果高达90%以上(实施例1-3),而对比例方法获得的致敏NK细胞对MKN45胃癌细胞的细胞杀伤仅为65.3%(对比例1)。本发明方法获得的致敏NK细胞对HT29结肠癌细胞的杀伤结果高达90%以上(实施例4),而对比例方法获得的致敏NK细胞对HT29结肠癌细胞的细胞杀伤仅为58.9%(对比例1)。所以,本发明方法获得的致敏NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力强,杀伤效果更好。
效果实施例2
收集各实施例和对比例致敏后的NK细胞,使用常规方法检测其CD3和CD56的表达情况,结果如表2所示。
表2、流式检测结果表
组别 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 | 对比例1 | 对比例2 |
CD3-CD56+表达率 | 76.7% | 80.2% | 77.0% | 74.3% | 31.5% | 37.6% |
由表2可知,对比例1和对比例2方法致敏的NK细胞的CD3-CD56+表达率较低,仅为31.5-37.6%;本发明方法致敏的NK细胞的CD3-CD56+表达率很高,为74.3-80.2%,约是对比例1和对比例2相应表达率的2倍。所以,本发明方法获得的NK细胞含量多。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种致敏NK细胞的组合物,其特征在于,包含实体瘤细胞抗原、CD28单抗、CD137单抗和桔红素。
2.根据权利要求1所述的致敏NK细胞的组合物,其特征在于,各组分的浓度如下:
3.根据权利要求2所述的致敏NK细胞的组合物,其特征在于,各组分的浓度如下:
4.根据权利要求3所述的致敏NK细胞的组合物,其特征在于,各组分的浓度如下:
5.根据权利要求1所述的致敏NK细胞的组合物,其特征在于,所述实体瘤细胞抗原为胃癌细胞抗原或肠癌细胞抗原。
6.一种致敏NK细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
使用权利要求1-4中任一项所述的致敏NK细胞的组合物致敏NK细胞,向NK细胞悬液中加入CD28单抗和实体瘤细胞抗原,在5%CO2、37℃中培养24小时,再加入CD137单抗和桔红素,继续在5%CO2、37℃中培养24小时。
7.根据权利要求6所述的致敏NK细胞的方法,其特征在于,所述实体瘤细胞抗原通过以下方法制备:用5ml生理盐水重悬1×106个实体瘤细胞,加入冻存管中,放到液氮中冷冻,待细胞悬液完全凝结后取出,室温解冻至完全融化,重复冷冻解冻过程至细胞完全裂解,最后一次解冻所获得的液体离心去除沉淀,所得上清即为实体瘤细胞抗原。
8.根据权利要求6所述的致敏NK细胞的方法,其特征在于,所述NK细胞通过以下方法制备:用Ficoll分离液法分离单个核细胞,用含20-80ng/ml的IL-2和20-80ng/ml的IL-15的X-VIVO15培养基培养,每3天补液一次,培养至第14天。
9.根据权利要求6所述的致敏NK细胞的方法,其特征在于,所述实体瘤细胞抗原为胃癌细胞抗原或肠癌细胞抗原。
10.根据权利要求9所述的致敏NK细胞的方法,其特征在于,所述实体瘤细胞抗原为MKN45胃癌细胞或HT29结肠癌细胞抗原。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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