CN1918295A

CN1918295A - 增强抗体活性的方法

Info

Publication number: CN1918295A
Application number: CNA2004800415998A
Authority: CN
Inventors: 大友俊彦; 薮田尚弘; 角田浩行; 土屋政幸
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-12-12
Filing date: 2004-12-10
Publication date: 2007-02-21
Also published as: EP1710308A4; WO2005056798A1; TW200530266A; KR20060130605A; JP4634305B2; JPWO2005056798A1; AU2004296336A1; CA2548950A1; US20080009038A1; AU2004296336B2; TWI347950B; EP1710308A1

Abstract

制备并纯化抗人Mpl抗体，进而使用基因工程方法制备了抗人Mpl抗体的单链抗体。该抗体显示出高激动剂活性。这表示，通过以接头结合两个或两个以上的重链可变区和两个或两个以上的轻链可变区形成单链多肽，可以增强抗体的活性。

Description

增强抗体活性的方法

技术领域

本发明涉及增强抗体活性的方法。

背景技术

由于抗体在血中的稳定性高而抗原性低，因此作为药物受到人们关注。一般认为，这些抗体中，识别受体等在细胞表面表达的蛋白质，并能够在细胞中引起特异性反应的激动剂抗体作为药物是有用的。现已报道了几种激动剂抗体，如针对红细胞生成素受体的激动剂抗体(参照专利文献1)，针对血小板生成素受体的激动剂抗体和针对CD47的激动剂抗体(参照专利文献1和2)等。

分别以各种测试法测定这些激动剂抗体的激动剂活性(アゴニスト活性)，然而如果将其活性与天然配体比较的话，这些抗体的活性都很弱。例如，针对属于细胞因子受体家族的血小板生成素受体的激动剂抗体，为了显示其激动剂活性，必须首先使TPO受体二聚体化，并使其保持适当的距离以利于信号传递。然而，由于抗体分子是二价的，因此认为受体的二聚体化没有问题，但其通常是分子量约为150kD的巨大分子，结构的自由度小，因此预计由于难以使之与结合的受体保持适于信号传递的距离，因而无法充分传递活性。

专利文献1：WO02/33072A

专利文献1：WO02/33073A

非专利文献1：Elliott S等人，J.Biol.chem..，1996年，Vol.271(40)，p24691-24697

发明的公开

发明要解决的问题

本发明是鉴于上述状况完成的，其目的在于提供使抗体活性增强的方法。具体而言，旨在通过以接头结合两个或两个以上的重链可变区和两个或两个以上的轻链可变区，形成单链多肽，使抗体活性增强的方法。

用于解决问题的方法

低分子化抗体(minibody)，具体的是，双抗体或sc(Fv)2，其分子量为约60kD，低于完整抗体的二分之一，进而推定其结构上的自由度也比较高，因此认为也能够比配体更为有效地或者与其相同程度地使受体二聚体化，因而认为所述抗体能够显示出高活性。

本发明人制备并纯化了抗人Mpl抗体，进而使用基因工程方法制备了抗人Mpl抗体VB22B的单链抗体。进而，构建抗人Mpl抗体sc(Fv)2表达载体，在CHO-DG44细胞中进行单链抗体的瞬时表达，从培养上清中制备了抗人Mpl单链抗体VB22B sc(Fv)2。并且，作为对照，构建抗人Mpl双抗体表达载体，使用COS7细胞，从其培养上清中制备了VB22B双抗体。在评价各种抗体的TPO样激动剂活性时，确认了单链抗体的激动剂活性高。这表示，通过以接头结合两个或两个以上的重链可变区、及两个或两个以上的轻链可变区形成单链多肽，可以增强抗体的活性。

总之，本发明涉及一种使抗体的活性增强的方法，更为具体地涉及以下内容：

(1)通过以接头结合两个或两个以上的重链可变区和两个或两个以上的轻链可变区，形成单链多肽，使抗体活性增强的方法；

(2)通过以接头结合含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第一多肽，和含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第二多肽，使抗体活性增强的方法；

(3)通过将抗体制成sc(Fv)2，使抗体的活性增强的方法；

(4)根据(1)-(3)任一项记载的方法，所述活性是激动剂活性；

(5)根据(1)-(4)任一项记载的方法，其特征在于所述接头是肽接头；

(6)根据(5)记载的方法，其特征在于所述肽接头的长度为5-30个氨基酸；

(7)根据(6)记载的方法，其特征在于所述肽接头的长度为12-18个氨基酸；

(8)根据(7)记载的方法，其特征在于所述肽接头的长度为15个氨基酸；

(9)通过(1)-(8)任一项记载的方法使其活性增强的抗体；

(10)(9)记载的抗体的制备方法，其包括以下步骤：

(a)制备编码两个或两个以上的抗体重链可变区、两个或两个以上的抗体轻链可变区，和结合各可变区的肽接头的DNA的步骤，

(b)制备含有该DNA的载体的步骤，

(c)将该载体导入宿主细胞的步骤，

(d)培养该宿主细胞的步骤；

(11)根据(10)记载的制备方法，其特征在于所述DNA编码两个重链可变区，两个轻链可变区，和3个肽接头；

(12)根据(11)记载的制备方法，其特征在于所述DNA按重链可变区，肽接头，轻链可变区，肽接头，重链可变区，肽接头，轻链可变区的顺序编码。

附图的简要说明

图1：是表示抗人Mpl抗体(H链和L链)的氨基酸序列图。图中所示VB140(H链)的氨基酸序列表示于序列号19，VB45B(H链)的氨基酸序列表示于序列号20，VB22B(H链)的氨基酸序列表示于序列号21，VB16(H链)的氨基酸序列表示于序列号22，TA136(H链)的氨基酸序列表示于序列号23。此外，VB140(L链)的氨基酸序列表示于序列号24，VB45B(L链)的氨基酸序列表示于序列号25，VB22B(L链)的氨基酸序列表示于序列号26，VB16(L链)的氨基酸序列表示于序列号27，TA136(L链)的氨基酸序列表示于序列号28。

图2：是表示单链抗体sc(Fv)2制备过程的图。

图3：是表示使用BaF3-人Mpl评价VB22B抗体的激动剂活性的结果的图。

图4：是表示使用BaF3-猴Mpl评价VB22B抗体的激动剂活性的结果的图。

图5：是表示使用BaF3-人Mpl评价VB16抗体的激动剂活性的结果的图。

图6：是表示使用BaF3-人Mpl评价VB140抗体的激动剂活性的结果的图。

图7：是表示使用BaF3-人Mpl评价VB45B抗体的激动剂活性的结果的图。

图8：是表示使用BaF3-人Mpl评价TA136抗体的激动剂活性的结果的图。

用于实施发明的最佳方式

本发明提供了一种通过以接头结合两个或两个以上的重链可变区和两个或两个以上的轻链可变区，形成单链多肽，由此使抗体的活性增强的方法。

根据本发明的方法，活性得以增强的抗体可以是任意抗体，可以是小鼠抗体，人抗体，大鼠抗体，兔抗体，骆驼抗体等任意动物来源的抗体。进而，例如，所述抗体既可以是嵌合抗体，人源化抗体等包含经取代的氨基酸序列的修饰的抗体，也可以是结合了各种分子的抗体修饰物，抗体片段，经糖链修饰的抗体等任意一种抗体。

并且，由于本发明的抗体活性得以增强的抗体，既可以是全长抗体，也可以是双抗体等低分子化抗体。

作为本发明的单链多肽，可以例举有，例如，将含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第一多肽与含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第二多肽以接头结合起来所形成的单链多肽。

含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第一多肽与含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第二多肽，既可以是相同的多肽，也可以是不同的多肽。当第一多肽与第二多肽不同时，既可以是识别相同抗原或表位的抗体，也可以是识别不同的抗原或表位的双特异性抗体(bispecific antibody)。

作为含有抗体的重链可变区和轻链可变区的多肽的具体例子，可以例举有，例如sc(Fv)(单链Fv)。因此，作为以接头结合的含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第一多肽和含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第二多肽的单链多肽，可以例举有sc(Fv)2。sc(Fv)2是以接头结合两个重链可变区和两个轻链可变区形成单链多肽的抗体(Hudson等人，J Immunol.Methods 1999；231：177-189)。

形成sc(Fv)2时，相结合的两个重链可变区(VH)和两个轻链可变区(VL)的顺序没有特别的限定，无论按何顺序连接均可，例如，可以例举有如下的排列：

[VH]接头-[VL]接头-[VH]接头-[VL]

[VL]接头-[VH]接头-[VH]接头-[VL]

[VH]接头-[VL]接头-[VL]接头-[VH]

[VH]接头-[VH]接头-[VL]接头-[VL]

[VL]接头-[VL]接头-[VH]接头-[VH]

[VL]接头-[VH]接头-[VL]接头-[VH]。

在本发明中，优选具有[VH]接头-[VL]接头-[VH]接头-[VL]排列的sc(Fv)2。

重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列可以被取代，缺失，添加和/或插入。进而，所述抗体既可以发生部分缺失，也可以添加其它的多肽，只要当重链可变区和轻链可变区会合时具备抗原结合活性即可。并且，可变区也可以嵌合化或人源化。

可以在通过本发明的方法使抗体活性增强后再进行氨基酸的取代，缺失，添加和/或插入，和人源化，嵌合化等氨基酸序列的改变，同时，也可以在进行氨基酸的改变后通过本发明的方法使抗体活性增强。

嵌合抗体是通过组合不同动物来源的序列制备的抗体，例如为由小鼠抗体的重链、轻链的可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区构成的抗体等。嵌合抗体的制备可以使用公知的方法进行，例如，可以通过将编码抗体V区域的DNA和编码人抗体C区域的DNA相连接，再将其整合到载体中，导入宿主进行生产来制备。

人源化抗体，也称为重构(reshaped)抗体，其是将人以外的哺乳动物，例如小鼠的抗体的互补性决定区域(CDR；complementaritydeterming region)移植到人抗体的互补性决定区域而制备的，其所使用的一般的基因重组方法也是已知的(参见欧洲专利申请公开号EP125023A，WO96/02576A)。

具体而言，使用含有与CDR和FR二者的末端区域相的重叠部分的多个寡核苷酸作为引物，通过PCR法合成连结小鼠抗体的CDR和人抗体的骨架区(framework；FR)的DNA序列，(参照WO98/13388A中记载的方法)。

选择由CDR介导连结的抗体的骨架区以使得互补性决定区域形成良好的抗原结合部位。根据需要，也可以取代抗体可变区中骨架区的氨基酸以使重构人抗体的互补性决定区域形成适宜的抗原结合部位(Sato，K.等人，Cancer Res.(1993)53，851-856)。

嵌合抗体和人源化抗体的C区中，可以使用人抗体，例如在H链中可以使用Cγ1，Cγ2，Cγ3，Cγ4，在L链中可以使用Cκ，Cλ。此外，也可以修饰人抗体的C区以改善抗体或其产物的稳定性。

一般而言，嵌合抗体是由人以外的哺乳动物来源的抗体的可变区和来源于人抗体的恒定区构成的。另一方面，人源化抗体是由人以外的哺乳动物来源的抗体的互补性决定区域和人抗体来源的骨架区和C区构成的。

并且，在制备嵌合抗体或人源化抗体后，也可以进而用其它氨基酸取代可变区(例如FR)和恒定区中的氨基酸等。抗体的可变区的序列，可以使用已经公知的抗体的可变区的序列，此外也可以通过使用任意抗原按照本领域公知的方法制备抗体，获得并使用该抗体的序列。使用抗原，按照通常的免疫方法免疫小鼠等免疫动物，按照常规的细胞融合法使获得的免疫细胞与公知的母细胞融合，通过常规的筛选法，筛选出产生单克隆抗体的细胞(杂交瘤)。抗原的制备可以按照公知的方法进行。杂交瘤的制备可以按照例如Milstein等人的方法(Kohler，G.and Milstein.C.，Methods Enzymol.(1981)73：3-46)等进行。抗原的免疫原性低时，可以使之与白蛋白等具有免疫原性的大分子结合，进行免疫。然后，可以使用逆转录酶由杂交瘤的mRNA合成抗体的可变区(V区域)的cDNA，通过公知的方法解读所得cDNA的序列。

此外，制备人抗体的方法也是众所周知的。例如，可以在体外致敏淋巴细胞，使致敏的淋巴细胞与人来源的具有能力的骨髓瘤细胞融合，制备期望的具有结合活性的人抗体(参照特公平1-59878号公报)。进而，也可以对具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物施以抗原，制备抗体产生细胞，无限增殖化，进而从中制备针对抗原的人抗体(参照国际专利申请公开号WO94/25585号公报，WO93/12227号公报，WO92/03918号公报，WO94/02602号公报)。

在本发明中，结合重链可变区和轻链可变区的接头，可以使用通过基因工程导入制备的任意肽接头，或者合成化合物接头(例如，Protein Engineering，9(3)，299-305，1996中公开的接头)。

肽接头的长度没有特别的限制，本领域技术人员可以根据需要适当进行选择，但通常是1-100个氨基酸，优选5-30个氨基酸，尤为优选12-18个氨基酸(例如，15个氨基酸)。

作为肽接头的氨基酸序列，例如，可以例举有如下序列。

可以例举有

Ser

Gly·Ser

Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly

Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Ser

Ser·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly·Gly

(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)n

(Ser·Gly·Gly·Gly·Gly)n

[n是1或1以上的整数]等。

合成化合物接头(化学交联剂)，是通常用于肽交联的交联剂，例如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、辛二酸二琥珀酰亚胺基酯(DSS)、辛二酸二(磺基琥珀酰亚胺基)酯(BS3)、二硫代二(丙酸琥珀酰亚胺基酯)(DSP)、二硫代二(丙酸磺基琥珀酰亚胺基酯)(DTSSP)、乙二醇二(琥珀酸琥珀酰亚胺基酯)(EGS)、乙二醇二(琥珀酸磺基琥珀酰亚胺基酯)(sulfo-EGS)、酒石酸二琥珀酰亚胺基酯(DST)、酒石酸二磺基琥珀酰亚胺基酯(sulfo-DST)、二[2-(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(BSOCOES)、二[2-(磺基琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(sulfo-BSOCOES)等，这些交联剂是市售的。

此外，本发明还提供了通过上述方法增强了活性的抗体。

此外，本发明提供了抗体的制备方法，其包括以下(a)-(d)的步骤：

(a)制备编码两个或两个以上的抗体重链可变区、两个或两个以上的抗体轻链可变区，以及连接各可变区的肽接头的DNA的步骤，

(b)制备含有该DNA的载体的步骤，

(c)将该载体导入宿主细胞的步骤，

(d)培养该宿主细胞的步骤。

在该方法中，首先制备编码两个或两个以上的抗体重链可变区、两个或两个以上的抗体轻链可变区以及连接各可变区的肽接头的DNA。作为这种DNA，可以例举有例如编码两个重链可变区(VH)，两个轻链可变区(VL)，和3个肽接头的DNA，优选可以例举为sc(Fv)2。

所结合的2个VH和2个VL的顺序没有特别的限制，无论按何顺序排列均可，例如，可以例举有如下的排列：

[VH]接头-[VL]接头-[VH]接头-[VL]

[VL]接头-[VH]接头-[VH]接头-[VL]

[VH]接头-[VL]接头-[VL]接头-[VH]

[VH]接头-[VH]接头-[VL]接头-[VL]

[VL]接头-[VL]接头-[VH]接头-[VH]

[VL]接头-[VH]接头-[VL]接头-[VH]。

在本发明中，优选[VH]接头-[VL]接头-[VH]接头-[VL]的排列。

重链可变区或轻链可变区的氨基酸序列可以被取代，缺失，添加和/或插入。进而，所述抗体可以发生部分缺失，只要当重链可变区和轻链可变区会合时具有抗原结合活性即可。并且，可变区也可以被嵌合化或人源化。

在本发明中，接着制备含有上述DNA的载体。

作为载体，例如，在以大肠杆菌作为宿主时，只要载体具有用于在大肠杆菌中扩增的[ori]，以使载体在大肠杆菌(例如，JM109，DH5α，HB101，XL1Blue)等中大量扩增大量制备，进而具有被转化的大肠杆菌的选择基因(例如，可以通过某些药剂(氨苄青霉素，四环素，卡那霉素和氯霉素)判别的药物抗性基因)即可，没有特别的限制。作为载体的实例，可以例举有M13系列载体，pUC系列载体，pBR322，pBluescript，pCR-Script等。此外，在以cDNA的亚克隆和切除为目的时，除了上述载体之外，可以例举有，例如pGEM-T，pDIRECT，pT7等。

作为本发明的载体，表达载体是特别有用的。作为表达载体，例如，以在大肠杆菌中表达为目的时，载体具有用以在大肠杆菌中扩增的上述特征是不可缺少的，除此之外，在以JM109，DH5α，HB101，XL1Blue等大肠杆菌作为宿主时，具有能在大肠杆菌中有效表达的启动子，例如lacZ启动子(Ward等人，Nature(1989)341，544-546；FASEB.J(1992)6，2422-2427)，araB启动子(Better等人，Science(1988)240，1041-1043)，或者T7启动子等是不可缺少的。作为这种载体，除了上述载体之外，还可以例举有pGEX-5X-1(Pharmacia公司制)，“QIAexpress system”(QIAGEN公司制)，pEGFP或者pET(此时，宿主优选表达T7RNA聚合酶的BL21)等。

此外，在载体中可以含有用于分泌多肽的信号序列。作为用于蛋白质分泌的信号序列，为使其在大肠杆菌的周质中产生，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.等人，J.Bacterial.(1987)169，4379)，可以使用例如氯化钙法，电穿孔法等将载体导入宿主细胞。

大肠杆菌之外，例如，作为本发明的载体，可以例举有哺乳动物来源的表达载体(例如，pcDNA3(Invitrogen公司制)，pEGF-BOS(NucleicAcids.Res.1990，18(17)，p5322)，pEF，pCDM8)，昆虫细胞来源的表达载体(例如“Bac-to-Bac杆状病毒表达系统”(GIBCO-BRL公司制)，pBacPAK8)，植物来源的表达载体(例如pMH1，pMH2)，动物病毒来源的表达载体(例如pHSV，pMV，pAdexlcw)，逆转录病毒来源的表达载体(例如，pZIPneo)，酵母来源的表达载体(例如，“Pichia Expression Kit”(Invitrogen公司制)pNV11，SP-Q01)，枯草杆菌来源的表达载体(例如，pPL608，pKTH50)。

以在CHO细胞，COS细胞，NIH3T3细胞等动物细胞中表达为目的时，具备使基因在细胞内表达所需的启动子，例如SV40启动子(Mulligan.等人，Nature(1979)277，108)，MMTV-LTR启动子，EF1α启动子(Mizushima等人Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)，CMV启动子等是不可缺少的，如果具有用于选择经转化细胞的基因(例如，可以通过药物(新霉素，G418等)判别的药物抗性基因)就更为优选。例如，可以例举有pMAM，pDR2，pBK-RSV，pBK-CMV，pOPRSV，pOP13等。

进而，以使基因稳定表达并且使细胞内的基因的拷贝数扩增为目的时，可以例举有在缺少核酸合成途径的CHO细胞中导入具有与之相互补的DHFR基因的载体(例如pCHOI等)，通过氨甲喋呤(MTX)进行扩增的方法，此外，在以基因的瞬间表达为目的时，还可以例举有，使用在染色体上具有表达SV40T抗原的基因的COS细胞，用具有SV40的复制起始位点的载体(pcD等)转化的方法。作为复制起始位点，还可以使用来源于多瘤病毒，腺病毒，牛乳头状瘤病毒(BPV)等的复制起始位点。进而，为了扩增宿主细胞系中的基因拷贝数，表达载体可以含有氨基糖苷转移酶(APH)基因，胸苷激酶(TK)基因，大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因，二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为表达标记。

在本发明中，接着，将该载体导入宿主细胞。作为导入载体的宿主细胞，没有特别的限制，例如可以使用大肠杆菌和各种动物细胞等。可以使用宿主细胞作为，例如，本发明的用于制备和表达包含两个或两个以上的抗体重链可变区和两个或两个以上的抗体轻链可变区、以及连接各可变区的肽接头的多肽的生产系统。用于制备多肽的生产系统有体外和体内两种生产系统。作为体外的生产系统，可以例举有使用真核细胞的生产系统和使用原核细胞的生产系统。

使用真核细胞时，例如，可以使用动物细胞，植物细胞，真菌细胞作为宿主。作为动物细胞，已知有例如CHO(J.Exp.Med(1995)，108，945)、COS、3T3、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、HeLa、Vero之类的哺乳类细胞，例如爪蟾卵母细胞(Velle，等人，Nature(1981)291，358-340)之类的两栖类细胞，或例如Sf9，Sf21，Tn5之类的昆虫细胞。本发明中，最好使用CHO-DG44，CHO-DXB11，COS7细胞，BHK。在动物细胞中，以大量表达为目的时，特别优选CHO细胞。可以通过例如磷酸钙法，DEAE葡聚糖法，使用阳离子脂质体DOTAP(Boehringer-Mannheim)的方法，电穿孔法，脂质转染法等方法将载体导入宿主细胞。

作为植物细胞，已知例如烟草(Nicotiana Tabacum)来源的细胞为蛋白质生产系统，也可以进行愈伤组织培养。作为真菌细胞，已知有例如酵母(saccharomyces)属等酵母，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，粟酒裂殖酵母(Saccharomyces pombe)包括曲霉属(Aspergillus)的丝状真菌，例如黑曲霉(Aspergillus niger)。

使用原核细胞时，有使用细菌细胞的生产系统。作为细菌细胞，已知有大肠杆菌(E.coli)，此外还有枯草杆菌，大肠杆菌可以例举有例如JM109，DH5α，HB101等。

在本发明中，接着培养上述宿主细胞。通过在体外培养由目的DNA转化的细胞，可制备抗体。培养可以按照公知的方法进行。例如，作为动物细胞的培养液，可以使用例如DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM。这时，也可以结合使用胎牛血清等血清添加液，也可以无血清培养。培养时的pH优选为约6-8。培养通常在约30-40℃下进行约15-200小时，根据需要进行培养基的更换，通气，搅拌。

另一方面，作为多肽的体内生产的系统，例如可以例举有使用动物的生产系统或使用植物的生产系统。在这些动物或植物中导入目标的DNA，使多肽在动物或植物体内生产，并回收。本发明中所谓“宿主”，包括这些动物，植物。

使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的生产系统。作为哺乳类动物，可以使用例如山羊，猪，绵羊，小鼠，牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。此外，使用哺乳类动物时，可以使用转基因动物。

例如，将目的DNA制备成与编码像山羊β酪蛋白等在乳汁中固有产生的蛋白质的基因的融合基因。接着，在山羊的胚胎中注射含有这种融合基因的DNA片段，将该胚胎移植到雌性山羊体内。从由接受胚胎的山羊产生的转基因山羊或其后代产生的乳汁中获得目的蛋白质。为了增加含有来自转基因山羊的蛋白质的乳汁的产量，可以在转基因山羊中使用适当的激素(Ebert，K.M.等人，Bio/Technology(1994)12，699-702)。

此外，作为昆虫，可以使用例如蚕。使用蚕时，通过使插入有编码目的蛋白质的DNA的杆状病毒感染蚕，可以从该蚕体液中获得目的抗体(Susumu，M等人，Nature(1985)315，592-594)。

进而，使用植物时，可以使用例如烟草。使用烟草时，在例如pMON530等植物表达载体中插入编码目的抗体的DNA，将该载体导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等细菌中。使这种细菌感染烟草，例如烟草(Nicotiana tabacum)，可以从该烟草的叶中获得所期望的抗体(Julian K.-C.Ma等人，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。

由此制备的本发明的抗体，可以从宿主细胞内或细胞外(培养基等)分离出来，纯化成基本上纯且均一的抗体。抗体的分离纯化，使用通常的蛋白质的纯化中使用的分离纯化方法就可以了，没有任何限定。例如对以下方法适当选择并进行组合，就可以分离纯化出抗体：层析，过滤，超滤，盐析，溶剂沉淀，溶剂抽提，蒸馏，免疫沉淀，SDS-聚丙烯酰胺电泳，等电点电泳，透析，再结晶等。

作为层析，可以例举有，例如亲合层析，离子交换层析，疏水性层析，凝胶过滤，反相层析，吸附层析等(Strategies for ProteinPurification and Characterization：A Laboratory Course Manual.EdDaniel R.Marshak等人，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1996)。这些层析可以使用例如HPLC、FPLC等液相层析进行。作为亲合层析中使用的柱，可以例举有蛋白A柱，蛋白G柱。例如，作为使用蛋白A的柱，可以例举有HyperD，POROS，SepharoseF.F.(Pharmacia)等。

并且，在纯化蛋白质前或纯化后，通过使适当的蛋白质修饰酶作用，也可以任意添加修饰，部分地除去肽。作为蛋白质修饰酶，可以使用例如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，赖氨酰基内肽酶(lysylendopeptidase)，蛋白激酶，糖苷酶等。

本发明中增强的抗体的活性，可以是结合活性，中和活性，细胞毒性活性，激动剂活性，拮抗活性，酶活性等任意活性，没有特别的限定，优选给生物体，组织，细胞，蛋白质，DNA，RNA等带来量变和/或质变的影响的活性，尤为优选的是激动剂活性。

所谓激动剂活性，是指通过抗体与受体等抗原结合，在细胞内传递信号的同时，诱导某些生理活性变化的活性。作为生理活性，可以例举有，例如增殖活性，生存活性，分化活性，转录活性，膜运输活性，结合活性，蛋白质分解活性，磷酸化/脱磷酸化活性，氧化还原活性，转移活性，核酸分解活性，脱水活性，细胞死亡诱导活性，细胞凋亡活性等，但不仅限于此。

本发明中的抗原没有特别的限定，可以是任意抗原。作为抗原的实例，可以例举有例如受体，癌抗原，MHC抗原，分化抗原等。

作为受体的实例，可以例举有，例如属于造血因子受体家族，细胞素受体家族，酪氨酸激酶型受体家族，丝氨酸/苏氨酸激酶型受体家族，TNF受体家族，G蛋白质共轭型受体家族，GPI锚定型受体家族，酪氨酸磷酸酶型受体家族，粘着因子家族，激素受体家族等受体家族的受体。关于属于这些受体家族的受体及它们的特征的大多数文献，可以例举有，例如Cooke BA.，King RJB.，van der Molen HJ.ed.NewComprehensive Biochemistry Vol.18B″Hormones and their ActionsPart II″pp.1-46(1988)Elsevier Science Publishers BV.，New York，USA；Patthy L.(1990)Cell，61：13-14；Ullrich A.，等人.(1990)Cell，61：203-212；Massagul J.(1992)Cell，69：1067-1070；MiyajimaA.，等人(1992)Annu.Rev.Immunol.，10：295-331；TagaT.and Kishimoto T.(1992)FASEB J.，7：3387-3396；Fantl WI.，等人(1993)Annu.Rev.Biochem.，62：453-481；Smith CA.，等人(1994)Cell，76：959-962；Flower DR.(1999)Biochim.Biophys.Acta，1422：207-234；宫坂昌之主编.，细胞技术别册，手册系列《粘着因子手册》(1994)(秀润社，东京，日本)等。

作为属于上述受体家族的具体的受体，可以例举有，例如人或小鼠红细胞生成素(EPO)受体，人或小鼠粒细胞集落刺激因子(G-CSF)受体，人或小鼠血小板生成素(TPO)受体，人或小鼠胰岛素受体，人或小鼠Flt-3配体受体，人或小鼠血小板来源的生长因子(PDGF)受体，人或小鼠干扰素(IFN)-α、β受体，人或小鼠瘦蛋白leptin受体，人或小鼠生长激素(GH)受体，人或小鼠白介素(IL)-10受体，人或小鼠胰岛素样生长因子(IGF)-I受体，人或小鼠白血病抑制因子(LIF)受体，人或小鼠睫状神经营养因子(CNTF)受体等(hEPOR：Simon，S.等人(1990)Blood76，31-35.；mEPOR：D′Andrea，AD等人(1989)Cell 57，277-285；hG-CSFR：Fukunaga，R.等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.87，8702-8706；mG-CSFR：Fukunaga，R.等人(1990)Cell 61，341-350；hTPOR：Vigon，I.等人(1992)89，5640-5644；mTPOR：Skoda，RC.等人(1993)12，2645-2653；hInsR：Ullrich，A.等人(1985)Nature 313，756-761；hFlt-3：Small，D.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.91，459-463；hPDGFR：Gronwald，RGK.等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.85，3435-3439；hIFNα/βR：Uze，G等人(1990)Cell 60，225-234；和Novick，D.等人(1994)Cell 77，391-400)。

癌抗原是伴随细胞的恶化表达的抗原，也称之为肿瘤特异性抗原。并且，在细胞癌变时，细胞表面和蛋白质分子上出现的异常的糖链也成为癌抗原，其被特别称为癌糖链抗原。作为癌抗原的实例，可以举例为例如CA19-9，CA15-3，唾液酸SSEA-1(SLX)等。

MHC抗原中，可分为MHC I类和MHC II类抗原两类，MHC I类抗原中，包括HLA-A，-B，-C，-E，-F，-G，-H，MHC II类抗原包括HLA-DR，-DQ，-DP。

分化抗原包括

CD1，CD2，CD3，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8，CD10，CD11a，CD11b，CD11c，CD13，CD14，CD15s，CD16，CD18，CD19，CD20，CD21，CD23，CD25，CD28，CD29，CD30，CD32，CD33，CD34，CD35，CD38，CD40，CD41a，CD41b，CD42a，CD42b，CD43，CD44，CD45，CD45RO，CD48，CD49a，CD49b，CD49c，CD49d，CD49e，CD49f，CD51，CD54，CD55，CD56，CD57，CD58，CD61，CD62E，CD62L，CD62P，CD64，CD69，CD71，CD73，CD95，CD102，CD106，CD122，CD126，CDw130等。

作为用于测定活性变化的检测指标，可以使用任意指标，只要可以测定量变和/或质变即可。例如，可以使用无细胞系(cell free assay)的指标，细胞系(cell-based assay)的指标，组织系的指标，生物体系统的指标。

作为无细胞系的指标，可以使用酶反应，以及蛋白质，DNA，RNA的量变和/或质变。作为酶反应，可以使用例如，氨基酸转移反应，糖转移反应，脱水反应，脱氢反应，底物切断反应等。此外，还可以使用蛋白质的磷酸化，脱磷酸化，二聚体化，多聚体化，分解，解离等，DNA，RNA的扩增，切断，延伸。例如，可以使用存在于信号传递途径的下游的蛋白质的磷酸化作为检测指标。

作为细胞系的指标，可以使用细胞表型的变化，例如产生物质的量变和/或质变，增殖活性的变化，细胞数的变化，形态的变化，特性的变化等。作为产生物质，可以使用分泌蛋白质，表面抗原，细胞内蛋白质，mRNA等。作为形态的变化，可以使用突起的形成和/或突起的数目的变化，扁平度的变化，伸长度/纵横比的变化，细胞大小的变化，内部结构的变化，作为细胞团的不均一性/均一性，细胞密度的变化等。这些形态的变化可以在显微镜下观察来确认。作为特性的变化，可以使用基质依赖性，细胞因子依赖应答性，激素依赖性，药物抗性，细胞运动性，细胞趋化活性，搏动活性，细胞内物质的变化等。作为细胞运动性，有细胞浸润活性，细胞趋化活性。此外，作为细胞内物质的变化，可以使用例如酶活性，mRNA量，Ca²⁺和cAMP等细胞内信息传递物质质量，细胞内蛋白质的量等。此外，当使用细胞膜受体时，可以使用由受体刺激诱导的细胞的增殖活性的变化作为指标。

作为组织系的指标，可以使用根据所使用的组织的功能变化作为检测指标。作为生物体系统的指标，可以使用组织重量变化，血液系统变化，例如血细胞数的变化，蛋白质量，酶活性，电解质量的变化，或者循环系统的变化，例如血压，心跳数的变化等。

作为测定这些检测指标的方法，没有特别的限制，可以使用吸光，发光，显色，荧光，放射活性，荧光偏振值，表面细胞质共振信号，时间分解荧光度，质量，吸收光谱，光散射，荧光共振能量转移等。这些测定方法是本领域技术人员公知的，可以根据需要适当选择。

例如，吸收光谱可以使用一般使用的光度计(photometer)和平板读数器等测定，发光可以使用发光计(luminometer)等测定，荧光可以使用荧光计等测定。质量可以采用质量分析计测定。放射活性，可以根据放射线的种类使用γ计数器等测定仪器测定，荧光偏振值可以通过BEACON(宝酒造)测定，表面细胞质共振信号可以通过BIACORE测定，时间分解荧光，荧光共振能量转移等可以通过ARVO等测定。进而，流式细胞仪等也可以被用于测定。这些测定方法，可以以一种测定方法测定两种或两种以上的检测指标，如果简便化，也可以通过同时和/或连续实施两种或两种以上的测定进而测定多个检测指标。例如，可以通时用荧光计测定荧光和荧光共振能量转移。

在本发明中，可以通过本领域技术人员公知的方法进行激动剂活性的测定。例如，可以通过如实施例中记载的以细胞增殖为指标测定激动剂活性的方法判定活性。更为具体而言，在显示激动剂依赖性增殖的细胞中添加测定了激动剂活性的抗体，培养。然后，可以添加像WST-8之类的根据活细胞的数量，在特定的波长处呈现出显色反应的试剂，然后测定吸光度，以所得吸光度为指标测定激动剂活性。

显示出激动剂依赖性增殖的细胞也可以按照本领域公知的方法制备，例如在抗原为传递细胞增殖信号的受体时，可以使用表达该受体的细胞。并且，抗原为不传递细胞增殖信号的受体时，可以制备由传递细胞增殖信号的受体的细胞内区域和不传递细胞增殖信号的细胞外区域构成的嵌合受体，使该嵌合受体在细胞中表达。作为传递细胞增殖信号的受体的实例，可以例举有例如G-CSF受体，mpl，neu，GM-CSF受体，EPO受体，c-kit，FLT-3等。作为表达受体细胞，可以例举有，例如BaF3，NFS60，FDCP-1，FDCP-2，CTLL-2，DA-1，KT-3等。

并且，在本说明书中引用的所有现有技术文献均并入本说明书作为参考。

实施例

下面，基于实施例对本发明进行更详细的说明。

实施例1抗人Mpl抗体的制备

1.1表达Mpl的BaF3细胞系的建立

为了制备TPO依赖性增殖细胞系，建立了表达全长Mpl基因的BaF3细胞系。通过PCR扩增全长人Mpl cDNA(Palacios等，Cell1985；41：727-734)(GenBank#NM_005373)，克隆到去除了pCHOI(Hirata等人，FEBS Letter 1994；356：244-248)的DHFR基因表达部位，插入了HEF-VH-gγ1(Sato等人，Mol Immunol.1994；31：371-381)的新霉素抗性基因表达部位的表达载体pCOS2中，构建出pCOS2-hMplfull。此外，使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech公司制)，从食蟹猴骨髓细胞中提取的总RNA中克隆出食蟹猴Mpl cDNA(序列号1，2由该碱基编码的蛋白质的氨基酸序列序列号2)将所得的食蟹猴cDNA插入pCOS2构建pCOS2-从猴Mplfull。

将制备的各个载体(20μg)与悬浮于PBS中的BaF3细胞(1×10⁷细胞/ml)混合，加入到Gene Pulser比色杯(cuvette)中，用Gene PulserII(Bio-Rad公司制)以0.33kv，950μFD的容量施加脉冲。将通过电穿孔处理导入了基因的BaF3细胞加到含有小鼠白介素3(以下，称为mIL-3，Peprotech公司制)，500μg/ml Geneticin(Invitrogen公司制)，10％FBS(Invitrogen公司制)的RPMI1640培养基(Invitrogen公司制)进行选择，建立表达人Mpl的BaF3细胞系(以下，称为BaF3-人Mpl)和表达猴Mpl的BaF3细胞系(以下，称为BaF3-猴Mpl)。选择后，用含有1ng/mL rhTPO(r&d公司制)，10％FBS的RPMI1640培养基培养，并维持。

1.2表达Mpl的CHO细胞系的建立

为了制备用于通过流式细胞仪评价结合活性的细胞系，建立了表达全长Mpl基因的CHO细胞系。首先，在pCXN2(Niwa等人，Gene1991；108：193-199)的Hind III部位插入pCHOI的DHFR基因表达部位，制备出表达载体pCXND3。以pCOS2-hMplfull，pCOS2-猴Mplfull为模板，将用含有His-tag序列的引物通过PCR扩增的各个Mpl基因克隆到pCXND3中，构建出pCXND3-hMpl-His和pCXND3-monkeyMpl-His。

将制备的各个载体(25μg)与悬浮于PBS中的CHO-DG44细胞(1×10⁷细胞/ml)混合，加入到Gene Pulser比色杯中，用Gene Pulser II(Bio-Rad公司制)以1.5kv，25μFD的容量施加脉冲。将通过电穿孔处理导入了基因的CHO细胞加到含有500μg/ml Geneticin(Invitrogen公司制)，1×HT(Invitrogen公司制)的CHO-S-SFM II培养基(Invitrogen公司制)进行选择，建立表达人Mpl的CHO细胞系(以下，称为CHO-人Mpl)和表达猴Mpl的CHO细胞系(以下，称为CHO-猴Mpl)。

1.3可溶性人Mpl蛋白质的制备

为了制备可溶性人Mpl蛋白质，按以下方式构建利用昆虫细胞Sf9细胞进行分泌、产生的表达系。制备在人Mpl的细胞外区域(Gln26-Trp491)的下游添加了FLAG标记的基因，插入到pBACSurf-1转移质粒(Novagen公司制)的PstI-Sma I部位，制备出pBACSurf1-hMpl-FLAG。接着，用Bac-N-Blue转染试剂盒(Invitrogen)，将4μg的pBACSurf1-hMpl-FLAG导入到Sf9细胞中。培养3天后回收培养上清，通过噬菌斑测定分离重组病毒。在制备病毒原种后，使之感染Sf9细胞，然后回收培养上清。

使用所得培养上清，按以下方式纯化可溶性人Mpl蛋白质。使培养上清吸附于Q Sepharose Fast Flow(Amersham Bioscience公司制)，用50mM磷酸钠缓冲液，0.01％(v/v)Tween20，500mM NaCl(pH7.2)洗脱。使洗脱液吸附于FLAG M2-琼脂糖(SIGMA-ALDRICH公司制)后，用100mM甘氨酸-HCl，0.01％(v/v)Tween20(pH3.5)洗脱。洗脱后，立即用1M Tris-Cl(pH8.0)中和，用PD-10柱(Amersham Bioscience公司制)，以PBS(-)，0.01％(v/v)Tween20进行置换。纯化的可溶性Mpl蛋白质称为shMpl-FLAG。

1.4人Mpl-IgG Fc融合蛋白质的制备

按照Bennett等人的方法(Bennett等人，J.Boil.Chem..1991；266：23060-23067)制备出人Mpl-IgG Fc融合蛋白质基因。编码人Mpl的细胞外区域(Gln26-Trp491)的碱基序列与编码人IgG-γ1的Fc区域(自Asp216的下游区域)的碱基序列连结，在连结部位添加BstE II序列(氨基酸Val-Thr)作为融合接头。信号序列，使用人IgG H链可变区的信号肽19个氨基酸。将所得人Mpl-IgG Fc融合蛋白质基因克隆到pCXND3中，构建出pCXND3-hMpl-Fc。

将制备的各个载体(25μg)与悬浮于PBS中的CHO-DG44细胞(1×10⁷细胞/ml)混合，加入到Gene Pulser比色杯中，用Gene PulserII(Bio-Rad公司制)以1.5kv，25μFD的容量施加脉冲。将通过电穿孔处理导入了基因的CHO细胞加到含有500μg/ml Geneticin，1×HT的CHO-S-SFM II培养基进行选择，建立表达shMpl-Fc的CHO细胞系(CHO-hMpl-Fc)。

使用所得培养上清，按以下方式纯化人Mpl-IgG Fc融合蛋白质。使培养上清吸附于Q Sepharose Fast Flow(Amersham Bioscience公司制)，用50mM磷酸钠缓冲液，0.01％(v/v)Tween20，1M NaCl(pH7.6)洗脱。使洗脱液吸附于HiTrap蛋白G HP柱(Amersham Bioscience公司制)后，用0.1M甘氨酸-HCl，150mM NaCl，0.01％(v/v)Tween20(pH2.7)洗脱。洗脱后，立即用1M Tris-Cl(pH8.0)中和，用PD-10柱(Amersham Bioscience公司制)，以PBS(-)，0.01％(v/v)Tween20进行置换。纯化的可溶性Mpl蛋白质称为hMpl-Fc。

1.5shMpl-FLAG和BaF3-人Mpl的免疫，杂交瘤的选择

使用MRL/MpJUmmCrj-lpr/lpr小鼠(以下，称为MRL/lpr小鼠，由日本Charles River购入)，自8周龄起开始免疫。初次免疫，在100μg/只的shMpl-FLAG中加入弗氏完全佐剂(H37Ra，Beckton Dickinson公司制)，经乳化后皮下给药。追加免疫，向50μg/只的shMpl-FLAG中添加弗氏不完全佐剂(Beckton Dickinson公司制)乳化后皮下给药，对合计进行了6次免疫的3只小鼠，通过尾静脉以50μg/只的shMpl-FLAG给药进行最终免疫。将小鼠骨髓瘤细胞P3-X63Ag8Ul(P3U1；购自ATCC)与小鼠脾细胞混合，通过一边加入polyethylene Gtycol 1500(Roche Diagnostics公司制)一边混合进行细胞融合。第二天起，用HAT培养基进行选择，使用培养上清，以采用固定了shMpl-FLAG或hMpl-Fc的免疫平板的ELISA，以使用BaF3-hMpl的细胞增殖活性作为指标进行筛选。对于阳性克隆，通过有限稀释法单克隆化后，进行扩大培养，回收培养上清。通过该方法，制备产生抗人Mpl抗体的杂交瘤VB22B，VB16，VB140，VB45B。

另一方面，将经BaF3-human Mpl从1周～5个月的间隔在Balb/C小鼠(购自日本Charles River Laboratories)腹腔内以1.0×10⁷细胞对小鼠合计免疫11次的小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞P3U1以同样方式进行融合。次日起用HAT培养基进行选择，使用培养上清，以采用BaF3-hMpl的细胞增殖活性作为指标实施筛选。对于阳性克隆，通过有限稀释法单克隆化后，进行扩大培养，回收培养上清。通过该方法，制备产生抗人Mpl抗体的杂交瘤TA136。

1.6抗人Mpl抗体的的分析

通过利用用山羊抗小鼠IgG(γ)(ZYMED公司制)和碱性磷酸酶-山羊抗小鼠IgG(γ)(ZYMED公司制)的小鼠IgG夹心酶联免疫分析(sandwich ELISA)，以同种型抗体等市售抗体作为标准，采用GraphPadPrism(GraphPad Software；USA)制作标准曲线，进行抗体浓度的换算。

通过使用同种型特异性第二抗体的抗原依赖性ELISA确定抗体的同种型。用包被缓冲液(0.1mM NaHCO₃，(pH9.6)，0.02％(w/v)NaN₃)将hMpl-Fc稀释成1μg/mL，然后加入到ELISA平板中。4℃下反应过夜，进行包被。用稀释缓冲液(50mM Tris-HCl(pH8.1)，1mM MgCl₂，150mM NaCl，0.05％(v/v)Tween 20，0.02％(w/v)NaN₃，1％(w/v)BSA)进行封闭处理。然后加入杂交瘤的培养上清，室温下放置1小时。用Rinse缓冲液(0.05％(v/v)Tween 20，PBS)洗涤后，加入经碱性磷酸酶标记的同种型特异性第二抗体，室温下放置1小时。使用以底物缓冲液(50mM NaHCO₃(pH9.8)，10mM MgCl₂)将SIGMA104(SIGMA-ALDRICH公司制)稀释成1mg/mL的稀释液进行显色，以Benchmark Plus(Bio-Rad)测定405nm的吸光度。

通过ELISA评价对shMpl-FLAG和hMPL-Fc的结合活性。以1μg/mL的纯化的shMpl-FLAG和hMPL-Fc包被，用稀释缓冲液进行封闭处理。然后加入杂交瘤的培养上清，室温下放置1小时后，加入经碱性磷酸酶标记的抗小鼠IgG抗体(Zymed)，以上述方法同样的方式进行显色。室温下1小时显色后测定405nm的吸光度，使用GraphPad Prism计算EC₅₀值。

回收CHO-human Mpl或CHO-猴Mpl，以l×10⁶细胞/mL的终浓度悬浮于FACS缓冲液(1％ FBS/PBS)中。以100μl/孔的终浓度等分注入到Multiscreen(Millipore)中，通过离心操作除去培养上清。加入稀释成5μg/mL的培养上清，使之在冰上反应30分钟。用FACS缓冲液洗涤1次，添加经FITC标记的抗小鼠IgG抗体(Beckman Coulter公司制)，使之在冰上反应30分钟。反应后，以500rpm离心1分钟，除去上清，悬浮于400μL FACS缓冲液中，使用EPICS ELITE ESP(BeckmanCoulter)进行流式细胞术进行分析。在前向角散射(forward scatter)及侧向角散射(side scatter)的柱状图为活细胞团设门。

使用显示出TPO依赖性增殖的BaF3-人Mpl或BaF3-猴Mpl评价抗体的激动剂活性。将各个细胞分别以4×10⁵细胞/mL的终浓度悬浮于含有10％胎牛血清(Invitrogen)的RPMI 1640(Invitrogen)中，以60μl/孔的终浓度等分注入96孔板中。以不同浓度制备的rhTPO(R&D)和杂交瘤培养上清，在各孔中加入40μl，37℃，5％ CO₂条件下培养24小时。以10μl/孔的终浓度添加Cell Count Reagent SF(nacalai Tesque公司制)，培养2小时后，用Benchmark Plus测定450nm(以655nm作为对照)的吸光度，使用GraphPad Prism计算EC₅₀值。

通过以上所示分析，制备与人Mp1结合的抗体VB 22B，VB 16，VB140，VB45B和TA 136。

1.7抗人Mp1抗体的纯化

使用杂交瘤的上清，按以下方式纯化抗人Mp1抗体。使培养上清吸附于HiTrap蛋白G HP柱(Amersham Bioscience公司制)后，用0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7)洗脱。洗脱后，立即用1M Tris-Cl(pH9.0)中和，用PBS透析一天，缓冲液进行置换。

实施例2抗人Mp1单链抗体的制备

下面，显示抗人Mp1抗体VB22B的单链抗体制备例。

2.1抗人Mp1抗体可变区的克隆

使用从产生抗人Mp1抗体的杂交瘤中提取的总RNA，通过RT-PCR法扩增。使用RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN)从1×10⁷细胞的杂交瘤中提取总RNA。

使用1μg总RNA，采用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)，使用与小鼠IgG2b恒定区序列互补的合成寡核苷酸MHC-IgG2b(序列号3)或与小鼠κ链恒定区碱基序列互补的合成寡核苷酸kappa(序列号4)，扩增5’端基因片段。使逆转录反应在42℃下反应1小时30分钟。

下面，显示PCR反应溶液(50μL)的组成。

10×Advantage 2 PCR Buffer 5μL

10×Universal Primer A Mix 5μL

dNTPs(dATP，dGTP，dCTP，和dTTP) 0.2mM

Advantage 2 Polymerase Mix 1μL

(以上的成分均由CLONTECH公司制造)

逆转录反应产物 2.5μL

合成寡核苷酸，MHC-IgG2b或kappa 10pmol

并且反应条件如下：

94℃/30秒；

94℃/5秒、72℃/3分钟，5个循环；

94℃/5秒、70℃/10秒、72℃/3分钟，5个循环；

94℃/5秒，68℃/10秒、72℃/3分钟，25个循环；

最后将反应产物在72℃下加热7分钟。

用QlAquick Gel提取试剂盒(QIAGEN公司制)，从琼脂糖凝胶纯化PCR产物后，克隆到pGEM-T Easy Vector(Promega公司制)中。进而，用ABI 3700 DNA分析仪(Perkin Elmer公司制)测定其碱基序列。克隆的VB22B H链可变区(以下，表示为VB22B-VH)的碱基序列表示于序列号5中，由该碱基序列编码的蛋白质的氨基酸序列表示于序列号6中，L链可变区(以下称为VB22B-VL)的碱基序列表示于序列号7中，该碱基序列编码的蛋白质的氨基酸序列表示于序列号8中。且VB22B，VB16，VB140，VB45B，TA136的氨基酸序列如图1所示。

2.2抗人Mp1抗体双抗体表达载体的制备

使用PCR法分别扩增在编码VB22B-VH的基因的3’端和编码VB22B-VL的基因的5’端添加了编码由(Gly₄Ser₁)构成的接头的碱基序列的基因，通过连结构建编码包含5个氨基酸的接头序列的VB22B单链Fv(下面，表示为VB22B双抗体)的基因。

将VB22B-VH的正向引物70·115HF(序列号9)设计成具有EcoRI位点，将VB22B-VH的反向引物33·115HR(序列号10)设计成与编码VB22B-VH的C末端的DNA杂交，并且具有编码由(Gly₄Ser₁)构成的接头的碱基序列以及与编码VB22B-VL的N末端的DNA杂交的碱基序列。将VB22B-VL的正向引物33·115LF(序列号11)设计成具有编码VB22B-VL的N末端的碱基序列、编码由(Gly₄Ser₁)构成的接头的碱基序列，以及编码VB22B-VH的C末端的碱基序列。将VB22B-VL的反向引物33·115LR(序列号12)设计成与编码VB22B-VL的C末端的DNA杂交，且具有编码FLAG(Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys/序列号13)标记的碱基序列以及NotI位点。

在第一轮PCR中，按以下方式合成含有VB22B-VH和接头序列，以及VB22B-VL和接头序列的两种PCR反应物。

下面，显示PCR反应溶液(50μL)的组成。

5μL的10×PCR缓冲液

0.4mM的dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)

2.5单位的DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq

(以上的成分均由宝酒造公司制造)

10ng含有VB22B-VH或VB22B-VL基因的pGEM-T Easy载体

10pmol的合成寡核苷酸70·115HF和33·115HR，或33·115LF和33·115LR

并且反应条件如下：

以94℃，30秒；

94℃/15秒、72℃/2分钟，5个循环；

94℃/15秒、70℃/2分钟，5个循环；

94℃/15秒、68℃/2分钟，28个循环；

最后将反应产物在72℃下加热5分钟。

用QlAquick Gel提取试剂盒(QIAGEN)，从琼脂糖凝胶纯化约400bp的PCR产物后，按以下方式使用各个PCR产物的一部分进行第二轮PCR。

下面，显示PCR反应溶液(50μL)的组成。

5μL的10×PCR缓冲液

0.4mM的dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)

2.5单位的DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq

(以上的成分均由宝酒造公司制造)

1μL的第一轮PCR产物(两种)

10pmol的合成寡核苷酸70·115HF和33·115HR

并且反应条件如下：

94℃/30秒；

94℃/15秒、72℃/2分钟，5个循环；

94℃/15秒、70℃/2分钟，5个循环；

94℃/15秒、68℃/2分钟，28个循环；

最后将反应产物在72℃下加热5分钟。

用QlAquick Gel提取试剂盒(QIAGEN)，从琼脂糖凝胶纯化约800bp的PCR产物后，用限制性酶EcoRI(宝酒造公司制造)和限制性酶NotI(宝酒造公司制造)消化后，用QlAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，克隆到pCXND3中，制备出pCXND3-VB22B db.

2.3抗人Mp1抗体sc(Fv)2表达载体的制备

为了制备表达含有来源于VB22B的两个H链可变区和2个L链可变区的修饰抗体[sc(FV)2]的质粒，用前述pCXND3-VB22B db按以下方式通过PCR法进行修饰。sc(Fv)2基因的构建过程表示于图2中。

首先，用PCR法分别扩增在编码VB22B-VH的基因的3’端以及编码VB22B-VL的基因的5’端添加了编码15个氨基酸构成的(Gly₄Ser)₃的碱基序列的基因，然后通过连结进行构建。在该构建过程中，重新设计3种引物。将VB22B-VH的正向引物VB22B-fpvu(引物A；序列号14)设计成具有EcoRI位点，将PvuII位点取代为VB22B db的Gln22和Leu23。将VB22B-VH的反向引物sc-rL15(引物B；序列号15)设计成与编码VB22B-VH的C末端的DNA杂交，并且具有编码由(Gly₄Ser)₃构成的接头的碱基序列、以及与编码VB22B-VL的N末端的DNA杂交的碱基序列。将VB22B-VL的正向引物sc-fL15(引物C；序列号16)设计成具有编码VB22B-VL的N末端的碱基序列和编码由(Gly₄Ser)₃构成的接头的碱基序列、以及编码VB22B-VH的C末端的碱基序列。

在第一轮PCR中，按以下方式合成含有VB22B-VH和接头序列以及VB22B-VL和接头序列的两种PCR反应物。

下面，显示PCR反应溶液(50μL)的组成。

5μL的10×PCR Buffer

0.4mM的dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)

2.5 单位的DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq

(以上的成分均由宝酒造公司制造)

10ng的pCXND3-VB22B db

10pmol的合成寡核苷酸VB22B-fpvu，sc-rL15或sc-fL15和33·115LR(引物D)

并且反应条件如下：

94℃/30秒；

94℃/15秒、72℃/2分钟，5个循环；

94℃/15秒、70℃/2分钟，5个循环；

94℃/15秒、68℃/2分钟，28个循环；

最后将反应产物在72℃下加热5分钟。

下面，显示PCR反应溶液(50μL)的组成。

5μL的10×PCR Buffer

0.4mM的dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)

2.5 单位的DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq

(以上的成分均由宝酒造公司制造)

1μL的第一轮PCR产物(两种)

10pmol的合成寡核苷酸70·115HF和33·115HR

并且反应条件如下：

94℃/30秒；

94℃/15秒、72℃/2分钟，5个循环；

94℃/15秒、70℃/2分钟，5个循环；

94℃/15秒、68℃/2分钟，28个循环；

最后将反应产物在72℃下加热5分钟。

用QlAquick Gel提取试剂盒(QIAGEN)，从琼脂糖凝胶纯化约800bp的PCR产物后，用限制性酶EcoRI(宝酒造公司制造)和限制性酶NotI(宝酒造公司制造)消化后，用QlAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，克隆到pBacPAK9(Clontech公司制)中，制备出pBacPAK9-scVB22B。

然后，制备在pBacPAK9-scVB22B的PvuII位点插入的片段。也就是，编码通过由(Gly4Ser)₃构成的接头连结的N末端缺失的VB22B-VH与VB22B-VL的氨基酸的基因，进而通过编码由(Gly4Ser)₃构成的接头的碱基序列与编码VB22B-VH的N末端的基因连结的片段，其两末端具有PvuII识别位点。重新设计2种引物，使用PCR法，制备所述片段。将目的片段的正向引物Fv2-f(引物E；序列号17)设计成在5’末侧端具有PvuII位点，并且具有VB22B-VH 5’端侧序列。将目的片段的反向引物Fv2-r(引物F；序列号18)设计成与编码VB22B-VL的C末端的DNA杂交，并且具有编码由(Gly₄Ser)₃构成的接头的碱基序列以及与编码VB22B-VH的N末端的DNA杂交的碱基序列，并且具有PvuII位点。以pBacPAK9-scVB22B为模板，按以下方式进行PCR。

下面，显示PCR反应溶液(50μL)的组成。

5μL的10×PCR缓冲液

0.4mM的dNTPs(dATP，dGTP，dCTP和dTTP)

2.5单位的DNA聚合酶TaKaRa Ex Taq

(以上的成分均由宝酒造公司制造)

10μg的pBacPAK9-scVB22B

10pmol的合成寡核苷酸Fv2-f，Fv2-r

并且反应条件如下：

94℃/30秒；

94℃/15秒、72℃/2分钟，5个循环；

94℃/15秒、70℃/2分钟，5个循环；

94℃/15秒、68℃/2分钟，28个循环；

最后将反应产物在72℃下加热5分钟。

用QlAquick Gel提取试剂盒(QIAGEN)，从琼脂糖凝胶纯化约800bp的PCR产物后，克隆到pGEM-T Easy Vector(Promega公司制)中。碱基序列的测定后，用限制性酶PvuII(宝酒造公司制造)消化后，回收目的片段。用限制性酶PvuII(宝酒造公司制造)消化pBacPAK9-scVB22B后，连结回收的片段，制备pBacPAK9-VB22B sc(Fv)2。用限制性酶EcoRI(宝酒造公司制造)和限制性酶NotI(宝酒造公司制造)消化所制备的载体后，用QlAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN)纯化，克隆到表达载体pCXND3中，制备出pCXND3-VB22B sc(Fv)2。

2.4使用动物细胞表达抗人Mp1单链抗体

按以下方式使用CHO-DG44细胞制备稳定表达单链抗体的细胞系。通过使用Gene Pulser II(Bio-Rad)的电穿孔法导入基因。将表达载体(25μg)与0.75mL悬浮于PBS中的CHO-DG44细胞(1×10⁷细胞/ml)混合，将混合物置于冰上冷却10分钟，转移到比色杯中后，以1.5ky，25μFD的容量施加脉冲。在室温下10分钟的恢复期后，将经电穿孔处理的细胞添加到含有500μg/ml Geneticin(Invitrogen公司制)的CHO-S-SFMII培养基(Invitrogen公司制)进行选择，建立CHO表达细胞系。由该方法制备稳定表达VB22B sc(Fv)2的细胞系和其培养上清。

按以下方式，利用COS7细胞瞬间表达单链抗体。将表达载体(10μg)与0.75mL悬浮于PBS中的COS7细胞(1×10⁷细胞/ml)混合，将混合物置于冰上冷却10分钟，转移到比色杯中后，以1.5kv，25μFD的容量施加脉冲。在室温下10分钟的恢复期后，将经电穿孔处理的细胞添加到含有10％FBS的DMEM培养基(Invitrogen公司制)中，培养过夜，然后用PBS洗涤后，加入CHO-S-SFM II培养基，培养约3天。由该方法制备用于制备VB22B双抗体的培养上清。

2.5培养上清中的抗人Mpl单链抗体的定量

利用表面细胞质共振测定在COS7细胞或CHO细胞中瞬间表达的抗人Mpl单链抗体在培养上清中的浓度。也就是说，将Sensor Chip CM5(Biacore)设置于BIAcore 2000(Biacore)中，结合抗-FLAG M2单克隆抗体(Sigma-Aldrich)。以5mL/秒的流速灌入合适浓度的试样，通过注入50mM二乙胺分离结合的抗体。注入试样时测定质量变化，使用根据标准样品的质量变化制作的标准曲线计算出浓度。对于双抗体的标准样品，使用dbl2El0(日本专利申请No.2001-27734)，对于sc(Fv)2的标准样品，使用具有相同基因结构的12E10sc(Fv)2。

2.6抗Mpl双抗体和单链抗体的纯化

使表达VB22B双抗体的COS7细胞或CHO细胞的培养上清吸附于经50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，150mM NaCl，0.05％ Tween 20平衡的抗Flag M2亲合凝胶(Sigma-Aldrich)柱上，用100mM甘氨酸-HCl(pH3.5)洗脱。立即用1M Tris-HCl(pH8.0)中和洗脱馏分，然后使用HiLoad 26/60 Superdex 200pg(Amersham Biosciences)柱进行凝胶过滤层析。凝胶过滤层析的缓冲液使用PBS，0.01％ Tween 20。

在与双抗体相同的条件下纯化表达VB22B sc(Fv)2的COS7细胞或CHO细胞的培养上清。此外，在大量制备时，将CHO细胞的培养上清装载到经20mM磷酸缓冲液(pH6.8)平衡的Macro-Prep陶瓷羟基磷灰石I型(Macro-Prep Ceramic Hydroxyapatite Type I)(Bio-Rad)中，用250mM磷酸缓冲液(pH6.8)逐步洗脱VB22B sc(Fv)2。使用超滤膜浓缩洗脱馏分后，使用HiLoad 26/60 Superdex 200pg柱(Amersham Biosciences)进行凝胶过滤层析，分别制备分子量相当于约70kD～40kD的馏分。使该馏分吸附于经50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，150mM NaCl，0.05％Tween 20平衡的抗-Flag M2亲合凝胶柱，用100mM甘氨酸-HCl(pH3.5)洗脱。立即用1M Tris-HCl(pH8.0)中和洗脱馏分，然后使用HiLoad 26/60 Superdex 200pg柱进行凝胶过滤层析。凝胶过滤层析的缓冲液使用20mM醋酸(pH6.0)，150mM NaCl，0.01％ Tween 80。

在各个纯化步骤中，使用SDS-PAGE和采用抗Flag抗体(Sigma-Aldrich公司)的Western blotting确认双抗体和sc(Fv)2。按照Laemli的方法对相对于每个峰的馏分分别进行电泳，用考马斯亮蓝进行染色，结果，在分子量大约29kDa处见到双抗体的单一条带，而在分子量大约55kDa处见到sc(Fv)2的单一条带。

2.7 抗人Mpl单链抗体的TPO样激动剂活性的评价

使用显示出TPO依赖性增殖的BaF3-人Mpl评价TPO样激动剂活性。用含有1％ FBS(胎儿牛血清)的RPMI 1640(Invitrogen)洗涤两次后，以4×10⁵细胞/mL的终浓度悬浮于含有10％胎儿牛血清的RPMI1640中，以60μl/孔的终浓度等分注入96孔板中。任意选择rhTPO(R&D)，COS7培养上清或纯化品的浓度，在各孔中加入40μl，37℃，5％ CO₂条件下培养24小时。以10μl/孔的终浓度添加WST-8试剂(CellCount Reagent SF；Nacalal Tesque公司制)，立刻使用Benchmark Plus测定450nm(以655nm作为对照)的吸光度，培养2小时后，再次测定450nm(以655nm作为对照)的吸光度。根据WST-8试剂基于活细胞数显示出450nm的显色反应，以2小时的吸光度变化作为指标评价TPO样激动剂活性。此外，使用GraphPad Prism计算EC₅₀值。

使用纯化的VB22B双抗体和VB22B sc(Fv)2评价BaF3-人Mpl和BaF3-猴Mpl的TPO样激动剂活性的结果表示于图3，图4中。此外，使VB16，VB140，VB45B，和TA136的单链抗体(双抗体，sc(Fv)2)在COS7细胞中表达，使用培养上清评价BaF3-猴Mpl的TPO样激动剂活性的结果分别表示于图5，图6，图7，图8中。进而，通过这些分析制备的EC₅₀值表示于表1中。

表1

抗体名称	BaF-人Mpl		BaF-猴Mpl
	BaF-人Mpl		BaF-猴Mpl		双抗体	sc(Fv)2	双抗体	sc(Fv)2
	VB22B	61	27	1668	双抗体	sc(Fv)2	双抗体	sc(Fv)2	26
VB16	VB22B	61	27	1668	190	95			26
VB16	VB140	89	38		190	95
VB45B	VB140	89	38	76	30
VB45B	TA136	3076	54	76	30

使用各个抗体的BaF3-人Mpl和BaF3-猴Mpl的激动剂活性(EC₅₀值：pM)

通过这些结果，确认了具有sc(Fv)2结构的单链抗体比双抗体的激动剂活性高。对于激动剂活性重要的是抗原结合部位是2价的，但是抗原结合部位间的距离和角度也被认为是重要的因素(参照WO02/33072和WO02/33073)。由于最适的距离和角度因抗体识别的表位不同而不同，因此认为最适的接头长度取决于各个抗体。但是，据报道，当接头的长度如5-12mer这么短时，形成非共价的双抗体，但是接头的长度更长(12mer或12mer以上)时，不形成双抗体，而形成scFv单体(Hudson等人J Immunol.Methods 1999，231：177-189)。因此，可以推测，即使使用长接头也可以形成2价的抗原结合部位的sc(Fv)2很可能具有高激动剂活性。此外，由于以接头结合的sc(Fv)2的稳定性优于非共价的双抗体，因此具有能够诱导高活性的可能性。

工业上利用的可能性

根据本发明，作为全长的抗体，即使在激动剂活性弱或几乎没有活性时，通过低分子化，具体而言通过形成双抗体或sc(Fv)2可以使活性上升。因此，由于以往作为全长抗体的活性弱，因此作为药物等的开发是困难的，但是通过低分子化，作为药物等的开发成为可能。此外，在生产方面，通过比活性上升，也可以减少成本。此外，由于低分子化抗体没有糖链的结合，因此即使在制备重组体时，也可以利用动物细胞，酵母，大肠杆菌等各种表达系统，因而便利性提高。

序列表

<110>CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA

<120>增强抗体活性的方法

<130>C1-A0321P

<150>JP 2003-415760

<151>2003-12-12

<160>28

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1924

<212>DNA

<213>食蟹猴

<220>

<221>CDS

<222>(11)..(1918)

<223>

<400>1

gaattccacc atg ccc tcc tgg gcc ctc ttc atg gtc acc tcc tgc ctc 49

Met Pro Ser Trp Ala Leu Phe Met Val Thr Ser Cys Leu

1 5 10

ctc ctg gcc cct caa aac ctg gcc caa gtc agc agc caa gat gtc tcc 97

Leu Leu Ala Pro Gln Asn Leu Ala Gln Val Ser Ser Gln Asp Val Ser

15 20 25

ttg ctg gcc tcg gac tca gag ccc ctg aag tgt ttc tcc cga aca ttt 145

Leu Leu Ala Ser Asp Ser Glu Pro Leu Lys Cys Phe Ser Arg Thr Phe

30 35 40 45

gag gac ctc act tgc ttc tgg gat gag gaa gag gca gca ccc agt ggg 193

Glu Asp Leu Thr Cys Phe Trp Asp Glu Glu Glu Ala Ala Pro Ser Gly

50 55 60

aca tac cag ctg ctg tat gcc tac ccg ggg gag aag ccc cgt gcc tgc 241

Thr Tyr Gln Leu Leu Tyr Ala Tyr Pro Gly Glu Lys Pro Arg Ala Cys

65 70 75

ccc ctg agt tct cag agc gtg ccc cgc ttt gga acc cga tac gtg tgc 289

Pro Leu Ser Ser Gln Ser Val Pro Arg Phe Gly Thr Arg Tyr Val Cys

80 85 90

cag ttt cca gcc cag gaa gaa gtg cgt ctc ttc tct ccg ctg cac ctc 337

Gln Phe Pro Ala Gln Glu G1u Val Arg Leu Phe Ser Pro Leu His Leu

95 100 105

tgg gtg aag aat gtg ttc cta aac cag act cag att cag cga gtc ctc 385

Trp Val Lys Asn Val Phe Leu Asn Gln Thr Gln Ile Gln Arg Val Leu

110 115 120 125

ttt gtg gac agt gta ggc ctg ccg gct ccc ccc agt atc atc aag gcc 433

Phe Val Asp Ser Val Gly Leu Pro Ala Pro Pro Ser Ile Ile Lys Ala

130 135 140

atg ggt ggg agc cag cca ggg gaa ctt cag atc agc tgg gag gcc cca 481

Met Gly Gly Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gln Ile Ser Trp Glu Ala Pro

145 150 155

gct cca gaa atc agt gat ttc ctg agg tac gaa ctc cgc tat ggc ccc 529

Ala Pro Glu Ile Ser Asp Phe Leu Arg Tyr Glu Leu Arg Tyr Gly Pro

160 165 170

aaa gat ctc aag aac tcc act ggt ccc acg gtc ata cag ttg atc gcc 577

Lys Asp Leu Lys Asn Ser Thr Gly Pro Thr Val Ile Gln Leu Ile Ala

175 180 185

aca gaa acc tgc tgc cct gct ctg cag agg cca cac tca gcc tct gct 625

Thr Glu Thr Cys Cys Pro Ala Leu Gln Arg Pro His Ser Ala Ser Ala

190 195 200 205

ctg gac cag tct cca tgt gct cag ccc aca atg ccc tgg caa gat gga 673

Leu Asp Gln Ser Pro Cys Ala Gln Pro Thr Met Pro Trp Gln Asp Gly

210 215 220

cca aag cag acc tcc cca act aga gaa gct tca gct ctg aca gca gtg 721

Pro Lys Gln Thr Ser Pro Thr Arg Glu Ala Ser Ala Leu Thr Ala Val

225 230 235

ggt gga agc tgc ctc atc tca gga ctc cag cct ggc aac tcc tac tgg 769

Gly Gly Ser Cys Leu Ile Ser Gly Leu Gln Pro Gly Asn Ser Tyr Trp

240 245 250

ctg cag ctg cgc agc gaa cct gat ggg atc tcc ctc ggt ggc tcc tgg 817

Leu Gln Leu Arg Ser Glu Pro Asp Gly Ile Ser Leu Gly Gly Ser Trp

255 260 265

gga tcc tgg tcc ctc cct gtg act gtg gac ctg cct gga gat gca gtg 865

Gly Ser Trp Ser Leu Pro Val Thr Val Asp Leu Pro Gly Asp Ala Val

270 275 280 285

gca att gga ctg caa tgc ttt acc ttg gac ctg aag aat gtt acc tgt 913

Ala Ile Gly Leu Gln Cys Phe Thr Leu Asp Leu Lys Asn Val Thr Cys

290 295 300

caa tgg cag caa gag gac cat gct agt tcc caa ggt ttc ttc tac cac 961

Gln Trp Gln Gln Glu Asp His Ala Ser Ser Gln Gly Phe Phe Tyr His

305 310 315

agc agg gca cgg tgc tgc ccc aga gac agg tac ccc atc tgg gag gac 1009

Ser Arg Ala Arg Cys Cys Pro Arg Asp Arg Tyr Pro Ile Trp Glu Asp

320 325 330

tgt gaa gag gaa gag aaa aca aat cca gga tta cag acc cca cag ttc 1057

Cys Glu Glu Glu Glu Lys Thr Asn Pro Gly Leu Gln Thr Pro Gln Phe

335 340 345

tct cgc tgc cac ttc aag tca cga aat gac agc gtt att cac atc ctt 1105

Ser Arg Cys His Phe Lys Ser Arg Asn Asp Ser Val Ile His Ile Leu

350 355 360 365

gtg gag gtg acc aca gcc ctg ggt gct gtt cac agt tac ctg ggc tcc 1153

Val Glu Val Thr Thr Ala Leu Gly Ala Val His Ser Tyr Leu Gly Ser

370 375 380

cct ttc tgg atc cac cag gct gtg cgc ctc ccc acc cca aac ttg cac 1201

Pro Phe Trp Ile His Gln Ala Val Arg Leu Pro Thr Pro Asn Leu His

385 390 395

tgg agg gag atc tcc agc ggg cat ctg gaa ttg gag tgg cag cac cca 1249

Trp Arg Glu Ile Ser Ser Gly His Leu Glu Leu Glu Trp Gln His Pro

400 405 410

tca tcc tgg gca gcc caa gag acc tgc tat caa ctc cga tac aca gga 1297

Ser Ser Trp Ala Ala Gln Glu Thr Cys Tyr Gln Leu Arg Tyr Thr Gly

415 420 425

gaa ggc cat cag gac tgg aag gtg ctg gag ccg cct ctc ggg gcc cga 1345

Glu Gly His Gln Asp Trp Lys Val Leu Glu Pro Pro Leu Gly Ala Arg

430 435 440 445

gga ggg acc ctg gag ctg cgc ccg cga tct cgc tac cgt tta cag ctg 1393

Gly Gly Thr Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu

450 455 460

cgc gcc agg ctc aat ggc ccc acc tac caa ggt ccc tgg agc tcg tgg 1441

Arg Ala Arg Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly Pro Trp Ser Ser Trp

465 470 475

tcg gac cca gct agg gtg gag acc gcc acc gag acc gcc tgg att tcc 1489

Ser Asp Pro Ala Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala Trp Ile Ser

480 485 490

ttg gtg acc gct ctg ctg cta gtg ctg ggc ctc agc gcc gtc ctg ggc 1537

Leu Val Thr Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly

495 500 505

ctg ctg ctg ctg agg tgg cag ttt cct gca cac tac agg aga ctg agg 1585

Leu Leu Leu Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg

510 515 520 525

cat gcc ctg tgg ccc tca ctt cca gat ctg cac cga gtc cta ggc cag 1633

His Ala Leu Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln

530 535 540

tac ctt agg gac act gca gcc ctg agt ccg ccc aag gcc aca gtc tca 1681

Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser

545 550 555

gat acc tgt gaa gaa gtg gaa ccc agc ctc ctt gaa atc ctc ccc aag 1729

Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys

560 565 570

tcc tca gag agg act cct ttg ccc ctg tgt tcc tcc cag tcc cag atg 1777

Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys Ser Ser Gln Ser Gln Met

575 580 585

gac tac cga aga ttg cag cct tct tgc ctg ggg acc atg ccc ctg tct 1825

Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu Gly Thr Met Pro Leu Ser

590 595 600 605

gtg tgc cca ccc atg gct gag tca ggg tcc tgc tgt acc acc cac att 1873

Val Cys Pro Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser Cys Cys Thr Thr His Ile

610 615 620

gcc aac cat tcc tac cta cca cta agc tat tgg cag cag cct tga 1918

Ala Asn His Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gln Gln Pro

625 630 635

gtcgac 1924

<210>2

<211>635

<212>PRT

<213>食蟹猴

<400>2

Met Pro Ser Trp Ala Leu Phe Met Val Thr Ser Cys Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Pro Gln Asn Leu Ala Gln Val Ser Ser Gln Asp Val Ser Leu Leu Ala

20 25 30

Ser Asp Ser Glu Pro Leu Lys Cys Phe Ser Arg Thr Phe Glu Asp Leu

35 40 45

Thr Cys Phe Trp Asp Glu Glu Glu Ala Ala Pro Ser Gly Thr Tyr Gln

50 55 60

Leu Leu Tyr Ala Tyr Pro Gly Glu Lys Pro Arg Ala Cys Pro Leu Ser

65 70 75 80

Ser Gln Ser Val Pro Arg Phe Gly Thr Arg Tyr Val Cys Gln Phe Pro

85 90 95

Ala Gln Glu Glu Val Arg Leu Phe Ser Pro Leu His Leu Trp Val Lys

100 105 110

Asn Val Phe Leu Asn Gln Thr Gln Ile Gln Arg Val Leu Phe Val Asp

115 120 125

Ser Val Gly Leu Pro Ala Pro Pro Ser Ile Ile Lys Ala Met Gly Gly

130 135 140

Ser Gln Pro Gly Glu Leu Gln Ile Ser Trp Glu Ala Pro Ala Pro Glu

145 150 155 160

Ile Ser Asp Phe Leu Arg Tyr Glu Leu Arg Tyr Gly Pro Lys Asp Leu

165 170 175

Lys Asn Ser Thr Gly Pro Thr Val Ile Gln Leu Ile Ala Thr Glu Thr

180 185 190

Cys Cys Pro Ala Leu Gln Arg Pro His Ser Ala Ser Ala Leu Asp Gln

195 200 205

Ser Pro Cys Ala Gln Pro Thr Met Pro Trp Gln Asp Gly Pro Lys Gln

210 215 220

Thr Ser Pro Thr Arg Glu Ala Ser Ala Leu Thr Ala Val Gly Gly Ser

225 230 235 240

Cys Leu Ile Ser Gly Leu Gln Pro Gly Asn Ser Tyr Trp Leu Gln Leu

245 250 255

Arg Ser Glu Pro Asp Gly Ile Ser Leu Gly Gly Ser Trp Gly Ser Trp

260 265 270

Ser Leu Pro Val Thr Val Asp Leu Pro Gly Asp Ala Val Ala Ile Gly

275 280 285

Leu Gln Cys Phe Thr Leu Asp Leu Lys Asn Val Thr Cys Gln Trp Gln

290 295 300

Gln Glu Asp His Ala Ser Ser Gln Gly Phe Phe Tyr His Ser Arg Ala

305 310 315 320

Arg Cys Cys Pro Arg Asp Arg Tyr Pro Ile Trp Glu Asp Cys Glu Glu

325 330 335

Glu Glu Lys Thr Asn Pro Gly Leu Gln Thr Pro Gln Phe Ser Arg Cys

340 345 350

His Phe Lys Ser Arg Asn Asp Ser Val Ile His Ile Leu Val Glu Val

355 360 365

Thr Thr Ala Leu Gly Ala Val His Ser Tyr Leu Gly Ser Pro Phe Trp

370 375 380

Ile His Gln Ala Val Arg Leu Pro Thr Pro Asn Leu His Trp Arg Glu

385 390 395 400

Ile Ser Ser Gly His Leu Glu Leu Glu Trp Gln His Pro Ser Ser Trp

405 410 415

Ala Ala Gln Glu Thr Cys Tyr Gln Leu Arg Tyr Thr Gly Glu Gly His

420 425 430

Gln Asp Trp Lys Val Leu Glu Pro Pro Leu Gly Ala Arg Gly Gly Thr

435 440 445

Leu Glu Leu Arg Pro Arg Ser Arg Tyr Arg Leu Gln Leu Arg Ala Arg

450 455 460

Leu Asn Gly Pro Thr Tyr Gln Gly Pro Trp Ser Ser Trp Ser Asp Pro

465 470 475 480

Ala Arg Val Glu Thr Ala Thr Glu Thr Ala TrpIle Ser Leu Val Thr

485 490 495

Ala Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Ser Ala Val Leu Gly Leu Leu Leu

500 505 510

Leu Arg Trp Gln Phe Pro Ala His Tyr Arg Arg Leu Arg His Ala Leu

515 520 525

Trp Pro Ser Leu Pro Asp Leu His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg

530 535 540

Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys

545 550 555 560

Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu

565 570 575

Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys Ser Ser Gln Ser Gln Met Asp Tyr Arg

580 585 590

Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu Gly Thr Met Pro Leu Ser Val Cys Pro

595 600 605

Pro Met Ala Glu Ser Gly Ser Cys Cys Thr Thr His Ile Ala Asn His

610 615 620

Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Tyr Trp Gln Gln Pro

625 630 635

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的序列

<400>3

caggggccag tggatagact gatg 24

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的序列

<400>4

gctcactgga tggtgggaag atg 23

<210>5

<211>411

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(411)

<223>

<400>5

atg gaa tgg cct ttg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca gga act gca ggt 48

Met Glu Trp Pro Leu Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly

1 5 10 15

gtc cac tcc cag gtt cag ctg cag cag tct gga cct gag ctg gtg aag 96

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

20 25 30

cct ggg gcc tca gtg aag att tcc tgc aag gct tct ggc tat gca ttc 144

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe

35 40 45

act aac tcc tgg atg aac tgg gtg aag cag agg cct gga aag ggt ctt 192

Thr Asn Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

gag tgg att gga cgg att tat cct gga gat gga gaa act atc tac aat 240

Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Asn

65 70 75 80

ggg aaa ttc agg gtc aag gcc aca ctg act gca gac aaa tcc tcc agc 288

Gly Lys Phe Arg Val Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

aca gcc tac atg gat atc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gtc 336

Thr Ala Tyr Met Asp Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

tac ttc tgt gca aga ggc tat gat gat tac tcg ttt gct tac tgg ggc 384

Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Asp Asp Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly

115 120 125

caa ggg act ctg gtc act gtc tct gca 411

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210>6

<211>137

<212>PRT

<213>小鼠

<400>6

Met Glu Trp Pro Leu Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe

35 40 45

Thr Asn Ser Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Asn

65 70 75 80

Gly Lys Phe Arg Val Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Asp Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Tyr Asp Asp Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210>7

<211>396

<212>DNA

<213>小鼠

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(396)

<223>

<400>7

atg agg tgc cta gct gag ttc ctg ggg ctg ctt gtg ttc tgg att cct 48

Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Phe Trp Ile Pro

1 5 10 15

gga gcc att ggg gat att gtg atg act cag gct gca ccc tct ata cct 96

Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro

20 25 30

gtc act cct gga gag tca gta tcc atc tcc tgt agg tct agt aag agt 144

Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser

35 40 45

ctc ctg cat agt aat ggc aac act tac ttg tat tgg ttc ctg cag agg 192

Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg

50 55 60

cca ggc cag tct cct caa ctc ctg ata tat cgg atg tcc aac ctt gcc 240

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala

65 70 75 80

tca gga gtc cca gat agg ttc agt ggc agt ggg tca gga act gct ttc 288

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe

85 90 95

aca ctg aga atc agt aga gtg gag gct gag gat gtg ggt gtt tat tac 336

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

tgt atg caa cat ata gaa tat cct ttt acg ttc gga tcg ggg acc aag 384

Cys Met Gln His Ile Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

115 120 125

ctg gaa ata aaa 396

Leu Glu Ile Lys

130

<210>8

<211>132

<212>PRT

<213>小鼠

<400>8

Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Phe Trp Ile Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro

20 25 30

Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser

35 40 45

Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe

85 90 95

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Met Gln His Ile Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys

130

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>9

tagaattcca ccatggaatg gcctttgatc 30

<210>10

<211>56

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>10

agcctgagtc atcacaatat ccgatccgcc tccacctgca gagacagtga ccagag 56

<210>11

<211>56

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>11

actctggtca ctgtctctgc aggtggaggc ggatcggata ttgtgatgac tcaggc 56

<210>12

<211>60

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>12

attgcggccg cttatcactt atcgtcgtca tccttgtagt cttttatttc cagcttggtc 60

<210>13

<211>8

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的FLAG标记序列

<400>13

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1 5

<210>14

<211>85

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>14

tagaattcca ccatggaatg gcctttgatc tttctcttcc tcctgtcagg aactgcaggt 60

gtccactccc aggttcagct gcagc 85

<210>15

<211>82

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>15

tgagtcatca caatatccga tccgccacca cccgaaccac caccacccga accaccacca 60

cctgcagaga cagtgaccag ag 82

<210>16

<211>82

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>16

tggtcactgt ctctgcaggt ggtggtggtt cgggtggtgg tggttcgggt ggtggcggat 60

cggatattgt gatgactcag gc 82

<210>17

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>17

caggttcagc tgcagcagtc tggac 25

<210>18

<211>81

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>人工合成的引物序列

<400>18

gctgcagctg aacctgcgat ccaccgcctc ccgaaccacc accacccgat ccaccacctc 60

cttttatttc cagcttggtc c 81

<210>19

<211>118

<212>PRT

<213>小鼠

<400>19

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Arg Ala Phe Gly Tyr Ala Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Asn Asn Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210>20

<211>118

<212>PRT

<213>小鼠

<400>20

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Asn Asn Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Asp Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210>21

<211>118

<212>PRT

<213>小鼠

<400>21

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Glu Thr Ile Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Arg Val Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Asp Ile Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Asp Asp Tyr Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210>22

<211>115

<212>PRT

<213>小鼠

<400>22

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Trp Val Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile His Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asn Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Ile Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ser Gly Gly Trp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ala

115

<210>23

<211>116

<212>PRT

<213>小鼠

<400>23

Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp

20 25 30

Tyr Ala Trp Ser Trp Ile Arg Gln Leu Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp

35 40 45

Met Gly Tyr Ile Thr Tyr Ser Gly Tyr Ser Ile Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Ile Ser Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Gly Gly Tyr Asp Asn Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210>24

<211>112

<212>PRT

<213>小鼠

<400>24

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210>25

<211>112

<212>PRT

<213>小鼠

<400>25

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210>26

<211>112

<212>PRT

<213>小鼠

<400>26

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Ile Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Arg Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Ile Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210>27

<211>112

<212>PRT

<213>小鼠

<400>27

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Tyr Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln His

85 90 95

Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210>28

<211>108

<212>PRT

<213>小鼠

<400>28

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

His Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp

35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Met Glu

65 70 75 80

Thr Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

Claims

1.通过接头结合两个或两个以上的重链可变区和两个或两个以上的轻链可变区形成单链多肽，使抗体活性增强的方法。

2.通过接头结合含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第一多肽，与含有抗体的重链可变区和轻链可变区的第二多肽，使抗体活性增强的方法。

3.通过将抗体制成sc(Fv)2，使抗体的活性增强的方法。

4.根据权利要求1-3任一项记载的方法，所述活性是激动剂活性。

5.根据权利要求1-4任一项记载的方法，其特征在于所述接头是肽接头。

6.根据权利要求5记载的方法，其特征在于所述肽接头的长度为5-30个氨基酸。

7.根据权利要求6记载的方法，其特征在于所述肽接头的长度为12-18个氨基酸。

8.根据权利要求7记载的方法，其特征在于所述肽接头的长度为15个氨基酸。

9.通过权利要求1-8任一项记载的方法制备的活性增强的抗体。

10.权利要求9记载的抗体的制备方法，其包括以下步骤：

(a)制备编码两个或两个以上的抗体重链可变区和两个或两个以上的抗体轻链可变区，以及结合各可变区的肽接头的DNA的步骤，

(b)制备含有该DNA的载体的步骤，

(c)将该载体导入宿主细胞的步骤，

(d)培养该宿主细胞的步骤。

11.根据权利要求10记载的制备方法，其特征在于所述DNA编码两个重链可变区，两个轻链可变区，和3个肽接头。

12.根据权利要求11记载的制备方法，其特征在于所述DNA按重链可变区，肽接头，轻链可变区，肽接头，重链可变区，肽接头，轻链可变区的顺序编码。