ES2802994T3 - Anticuerpo completamente humano contra CD137 humano y uso del mismo - Google Patents

Anticuerpo completamente humano contra CD137 humano y uso del mismo Download PDF

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Abstract

Anticuerpo que se une específicamente a CD137 o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en el que: dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.5, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.6 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.7; y dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.10, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.11 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.12; o dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.22; o dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.29 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.22; o dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.32, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.22; o dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.35 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.22; o dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.38; o dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.41; o dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.35 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.41.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpo completamente humano contra CD137 humano y uso del mismo
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un anticuerpo humano completo. Específicamente, la presente invención se refiere a un anticuerpo completamente humano contra CD137 humano y al uso del mismo.
Antecedentes de la invención
CD137 (también conocido como 4-1BB, TNFRSF9) es un miembro de la superfamilia de receptores de factor de necrosis tumoral, que pertenece a la proteína transmembrana tipo I. El CD137 humano, que es una proteína que comprende 255 aminoácidos (Uniport: Q07011) de 30 KD, se expresa habitualmente en la membrana celular en forma de un homodímero de 55 KD y tendrá tripolización bajo la inducción del ligando para iniciar la conducción de señales celulares. CD137L es un miembro de la superfamilia de receptores de factor de necrosis tumoral, que pertenece a la proteína transmembrana tipo II.
Los resultados actuales de investigación mostraron que CD137L se expresa principalmente en APC activadas, tales como células dendríticas (CD), macrófagos y células B (Pollok, K.E. et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 367-74); mientras que CD137 puede inducirse a expresar después de que las células T reciban las señales específicas de antígeno (Kwon, B.S. et al., 1989, PNAS 86:1963-67).
La función de CD137 en células T se ha comprobado bien. En presencia de una determinada cantidad de anticuerpos frente a CD3, la activación de señales de CD137 puede inducir la proliferación de células T y la síntesis de citocinas (principalmente IFN-y), e inhibe la apoptosis de células T activadas, prolongando de ese modo la vida de las células T (d . Laderach et al., 2002, Int.mmunol., 14(10): 1155-67; Croft et al., 2009, Nat Rev Immunol 19:271-285). Un resultado de investigación mostró que el AcM agonista de CD137 puede potenciar la capacidad de destrucción de linfocitos T en muchos modelos tumorales de ratón, conduciendo a un efecto antitumoral (Melero, I. et al., 1997, Nat. Med., 3:682-85). Mientras tanto, la administración de combinación de un método de tratamiento del cáncer aprobado y un AcM agonista de CD137 había logrado un resultado emocionante. El resultado de la investigación de SHI et al. (Shi. W. et al., 2006, Anticancer Res., 26:3445-53) mostró que la administración de combinación de agonista de CD137 (agonista) y radioterapia puede inhibir significativamente el crecimiento de tumores grandes.
Por tanto, basándose en el efecto de CD137 en la inmunoterapia tumoral, es necesario un anticuerpo completamente humano contra CD137 humano con un efecto activo para tratar y prevenir enfermedades humanas tales como cáncer, tumores, enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunitarias.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CD137 o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en el que:
dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.5, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.6 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.7; y
dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.10, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.11 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.12;
o
dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
dicha región variable de la cadena ligera comprende un CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.22;
o
dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.29 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.22;
o
dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.32, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.22;
o
dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.35 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.22;
o
dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.38;
o
dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.41;
o
dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.35 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.41.
En un aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CD137 o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que:
dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.4; y
dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.9; o
dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.14; y
dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.19; o
dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.28; y
dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.19; o
dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.31; y
dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.19; o
dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.14; y
dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.34; o
dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.14; y
dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.37; o
dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.14; y
dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.40; o
dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.14; y
dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.43. En aún otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a CD137 o una porción de unión a antígeno del mismo, en el que el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo completo, un anticuerpo biespecífico, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 o Fv. En otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona un anticuerpo de cadena sencilla, que comprende una VH, una VL y un péptido ligador, en el que la VH tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.4, la VL tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.9 y el péptido ligador tiene un secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.1.
En aún otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona un anticuerpo de cadena sencilla, que comprende una VH, una VL y un péptido ligador, en el que la VH tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.14, la VL tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.19 y el péptido ligador tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.1.
En otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona una composición farmacéutica, que comprende:
el anticuerpo monoclonal mencionado anteriormente o una porción de unión a antígeno del mismo; y
un portador farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal mencionado anteriormente o una porción de unión a antígeno del mismo, para su uso en el tratamiento de cáncer.
En aún otro aspecto de la presente invención, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal mencionado anteriormente o una porción de unión a antígeno del mismo, para su uso en el tratamiento de cáncer en combinación con un medicamento adicional o un método adicional para el tratamiento de cáncer. En realizaciones particulares de la presente invención, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal mencionado anteriormente o una porción de unión a antígeno del mismo, para su uso en el tratamiento de tumor en combinación con un medicamento adicional o un método adicional para el tratamiento de cáncer.
La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal mencionado anteriormente o una porción de unión a antígeno del mismo, que puede usarse además en el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunitarias.
En realizaciones particulares de la presente invención, el uso en el tratamiento de tumores en un sujeto comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal mencionado anteriormente o una porción de unión a antígeno del mismo.
En realizaciones particulares de la presente invención, la presente invención proporciona un tratamiento combinado de enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunitarias en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal mencionado anteriormente o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende además administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de medicamentos adicionales para el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunitarias o implementar otros métodos para el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunitarias. En realizaciones particulares de la presente invención, la presente invención proporciona un tratamiento combinado de tumores en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo monoclonal mencionado anteriormente o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende además administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de medicamentos adicionales para el tratamiento de tumores o implementar otros métodos para el tratamiento de tumores.
Otras opciones para tratar cánceres o tumores descritas en la presente invención incluyen radioterapia u otros métodos aprobados para tratar cánceres o tumores.
La presente invención también proporciona un polinucleótido aislado, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para dicho anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo.
Los efectos beneficiosos de la presente invención son los siguientes: según la invención, se obtuvo un anticuerpo capaz de unirse a la proteína CD137 humana a través de una tecnología de presentación en superficie de levadura, que es un anticuerpo humano completo, y la afinidad del anticuerpo se ha potenciado enormemente.
La presente invención se describirá con más detalle con referencia a los dibujos adjuntos. A partir de la siguiente descripción detallada, los aspectos mencionados anteriormente de la invención y otros aspectos de la invención resultarán obvios.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 es un gráfico que muestra los resultados de la unión de scFv anti-hCD137 purificado a células hCD137-EGFP, donde el eje X representa la intensidad de fluorescencia de EGFP y el eje Y representa la intensidad de fluorescencia de anti-hlg-PE.
La figura 2 es un gráfico que muestra los resultados de la unión específica de scFV anti-hCD137 purificado a células hCD137-EGFP, donde el eje X representa la intensidad de fluorescencia de EGFP y el eje Y representa la intensidad de fluorescencia de anti-hlg-PE.
La figura 3 es un gráfico que muestra la detección de la capacidad de unión de scFv anti-CD137 a la proteína hCD137. La figura 4 muestra los resultados de medición de las actividades de los agonistas de scFv C2 y scFv C14.
La figura 5 muestra los resultados de la tinción de levadura por la proteína CD137 después de la maduración por afinidad.
La figura 6 es un gráfico que muestra los resultados del AcM anti-hCD137 C14# purificado que se une específicamente a células hCD137-EGFP, donde el eje X representa la intensidad de fluorescencia de EGFP y el eje Y representa la intensidad de fluorescencia de anti-hlg-PE.
La figura 7 es un gráfico que muestra la capacidad de unión del anticuerpo anti-hCD137 a hCD137.
La figura 8 es un gráfico que muestra la capacidad de unión del anticuerpo anti-CD137 a CD137 de mono Rhesus.
La figura 9 es un gráfico que muestra los resultados del anticuerpo anti-CD137 y hCD137L que se une competitivamente a hCD137.
La figura 10 muestra la detección de la capacidad del AcM anti-CD137 C14# que estimula a células PBMC o T CD8+ a secretar IFN-y.
La figura 11 muestra los resultados experimentales del AcM anti-CD137 C14# que inhibe significativamente el crecimiento de tumores.
La figura 12 muestra los resultados experimentales del AcM anti-CD137 C14 # que acelera la estabilidad.
La figura 13 es un gráfico que muestra los resultados de la estabilidad térmica del AcM anti-CD137 C14 detectada por el método de DSC.
Descripción de las secuencias
Las secuencias implicadas en la presente invención incluyen secuencias de nucleótidos y secuencias de aminoácidos y se han resumido en una lista de secuencias, adjunta a continuación de la memoria descriptiva, y en paralelo, el inventor ha presentado la lista de secuencias en una forma legible por ordenador.
Descripción detallada de las realizaciones
La presente invención no se limita a los métodos, disoluciones, anticuerpos o líneas celulares específicos descritos en el presente documento porque pueden variar. Además, los términos usados en el presente documento se usan únicamente para el fin de describir realizaciones particulares y no pretenden limitar el alcance de la presente invención.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos y las abreviaturas en el presente documento tienen el mismo significado que comúnmente entiende un experto en la técnica.
A menos que se indique lo contrario, los términos de la presente invención tienen los significados comúnmente usados en la técnica.
El término “anticuerpo” tal como se usa en la presente invención se refiere a cualquier inmunoglobulina o molécula completa que se une a un epítopo específico, así como a una porción de la misma. Los anticuerpos incluyen anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, anticuerpo quimérico, anticuerpo humanizado, anticuerpo de cadena sencilla y fragmentos y/o porciones del anticuerpo completo, siempre que estos fragmentos o porciones conserven las capacidades de unión a antígeno de los anticuerpos parentales. Por ejemplo, en la presente invención, “anticuerpo anti-hCD137” se refiere a un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo de cadena sencilla y fragmentos o porciones de los mismos o variantes funcionales o fragmentos funcionales de los mismos con actividades inmunitarias, que era capaz de unirse específicamente a CD137 humano.
El término “la posición de un anticuerpo” tal como se usa en la presente invención se obtiene según la referencia en el sitio web http://www.bioinf.org.uk/abysis/index.html, que no hace referencia a las posiciones reales de los aminoácidos en la secuencia.
El término “que se une” o “que se une específicamente” tal como se usa en la presente invención se refiere a, con un antígeno silvestre purificado, la unión de un anticuerpo con el epítopo del antígeno en el proceso de determinación in vitro, preferiblemente en el proceso de determinación por resonancia de plasmón (BIAcore, GE-Healthcare, Uppsala, Suecia).
El término “anticuerpo monoclonal humano” tal como se usa en la presente invención se refiere al anticuerpo que presenta una única especificidad de unión con regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de tipo humano.
El documento WO 2006/088447A1 solo menciona anticuerpos murinos frente a CD137 en lugar de anticuerpos completamente humanos. El scFv anti-hCD137 C2 y scFv anti-CD137 C14 se unen a un epítopo diferente de aquel al que se unen los anticuerpos murinos del documento WO 2006/088447A1. Y el documento W o 2006/088447A1 no dice nada de cómo obtener un anticuerpo humano agonista contra CD137 que sea capaz de unirse específicamente a CD137 con alta afinidad.
Cáncer Immunology, Immunotherapy, vol. 61, 2012, 1721-1733 da a conocer un anticuerpo completamente humano frente a CD137 designado PF-05082566.
Ejemplos
Ejemplo 1. Expresión de CD137 humano recombinante y preparación de células EGFP relacionadas
La secuencia de aminoácidos (es decir, desde el residuo 1 hasta el residuo 186 en Q07011) del dominio extracelular de CD137 humano se obtuvo según la secuencia de aminoácidos de CD137 humano en la base de datos de proteínas Uniprot; la secuencia de aminoácidos (es decir, desde el residuo 1 hasta el residuo 186 en F6W5G6) del dominio extracelular de CD137 de mono se obtuvo según la secuencia de aminoácidos (F6W5G6) de CD137 de mono rhesus (RhCD137) en la base de datos de proteínas Uniprot; la secuencia de aminoácidos (es decir, desde el residuo 104 hasta el residuo 330 en P01857) del dominio Fc de IgG1 humana se obtuvo según la secuencia de aminoácidos de región constante (P01857) de inmunoglobulina gamma humana (y)1 (IgG1) en la base de datos de proteínas Uniprot; la secuencia de aminoácidos (es decir, el residuo 98 al residuo 324 en P01868) del dominio Fc de IgG1 de ratón (muFc) se obtuvo según la secuencia de aminoácidos de región constante (P01868) de inmunoglobulina gamma de ratón (y)1 (IgG1) en la base de datos de proteínas Uniprot. Las secuencias de ADN codificante correspondientes se diseñaron usando la herramienta en línea DNAworks (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) para obtener los genes de las proteínas de fusión hCD137-Fc, hCD137-muFc y RhCD137-muFc. La secuencia de aminoácidos (C5MKY7) de proteína fluorescente verde potenciada (EGFP), la secuencia de aminoácidos (Q07011) de CD137 humano, la secuencia de aminoácidos (P20334) de CD137 de ratón, la secuencia de aminoácidos (P41274) de CD137L humano, la secuencia de aminoácidos (P43489) de OX40 humano, la secuencia de aminoácidos (Q9Y5U5) de GITR humano, la secuencia de aminoácidos (P26842) de CD27 humano se obtuvieron según la información de la base de datos de proteínas Uniprot; las secuencias de ADN codificante correspondientes se diseñaron usando la herramienta en línea DNAworks (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) para obtener las secuencias anteriores y los genes de las proteínas de fusión de EGFP, incluyendo los genes de hCD137-EGFP, hCD137L-EGFP, mCD137-EGFP, hOX40-EGFP, hCD27-EGFP y hGITR-EGFP. Sus fragmentos de ADN se obtuvieron por síntesis artificial. Las secuencias génicas sintetizadas se digirieron doblemente con HindIII y EcoRI (Fermentas) respectivamente, y se subclonaron en el vector comercial pcDNA4/myc-Hisa (Invitrogen, V863-20), y la exactitud de los plásmidos construidos se verificó mediante secuenciación. Se obtuvieron los ADN de plásmido recombinantes: pcDNA4-hCD137-hFc, pcDNA4-hCD137-muFc, pcDNA4-RhCD137-muFc, pcDNA4-hOX40-EGFP, pcDNA4-hCD137-EGFP, pcDNA4-mCD137-EGFP, pcDNA4-hCD137L-EGFP, pcDNA4-hCD27-EGFP y pcDNA4-hGITR-EGFP.
Los plásmidos recombinantes de EGFP anteriores se transfectaron en células HEK293 (ATCC, CRL-1573™), y se confirmaron las expresiones de hOX40, hCD137, mCD137 y hCD27 mediante la clasificación de señales activadas por fluorescencia (FACS) a las 48 h después de la transfección.
Se transfectaron transitoriamente pcDNA4-hCD137-Fc, pcDNA4-hCD137-muFc y pcDNA4-RhCD137-muFc en células HEK293 para la producción de proteínas. Se diluyeron los plásmidos de expresión recombinantes con un medio FreeStyle293 y se añadió disolución de PEI (polietilenimina) para la transformación; se añadió cada grupo de mezcla de plasmido/PEI a la suspensión celular, respectivamente, y se incubó a 37°C, el 10% de CO2 y 90 rpm; después de 5-6 días, se recogió el sobrenadante de cultivo expresado de manera transitoria y purificó mediante cromatografía de afinidad de proteína A para obtener muestras de proteína hCD137-Fc, hCD137-muFc y RhCD137-muFc para los siguientes ejemplos. Las muestras de proteína obtenidas se sometieron a una detección preliminar por SDS-PAGE, y la banda objetivo puede observarse claramente.
Ejemplo 2. Examen, clonación, expresión e identificación de anticuerpo anti-hCD137 de la biblioteca de presentación en levadura
Se usó la tecnología de presentación en levadura para examinar anticuerpos humanos completos contra CD137 humano. La biblioteca de presentación en levadura de scFv se construyó mediante la clonación de los genes de VH y VL del ADNc de IgM e IgG a partir de PBMC de 150 seres humanos sanos (la secuencia de ligador entre la VH y la VL es el péptido ligador GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 1)), con un volumen de biblioteca de 5x108. Se resucitó el volumen de 10 veces de la biblioteca de levadura para inducir la expresión del anticuerpo en la superficie de la levadura; las levaduras se enriquecieron dos veces con antígenos de hCD137-FC biotinilados 100 nM mediante clasificación con perlas magnéticas, y luego además se enriquecieron dos veces con hCD137 biotinilado por clasificación de flujo. Las levaduras enriquecidas se sembraron en placa y se recogieron monoclones. Después de la amplificación e inducción de expresión, se analizaron las levaduras monoclonales mediante tinción con hCD137 biotinilado o el antígeno de control hOX40, y la levadura con positivo para antígeno/negativo para levadura de control se consideró como levadura positiva.
Los clones de levadura confirmados por FACS se sometieron a PCR de colonias de levaduras y secuenciación. Los cebadores de PCR fueron: secuencia-F: CGTAGAATCGAGACCGAGGAGA (SEQ ID No .2); secuencia-R: CTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGC (SEQ ID NO.3)); los cebadores de secuenciación fueron secuencia-R. Después de la secuenciación, los resultados se compararon y analizaron usando el software BioEdit.
El gen del anticuerpo de cadena sencilla scFv obtenido anteriormente se fusionó con el gen de Fc de IgG1 humana anterior, y luego se digirió doblemente con HindIII y EcoRI (Fermentas) y se clonó en el vector comercial pcDNA4/myc-HisA. La clonación y extracción en una pequeña cantidad del plásmido se llevaron a cabo según la operación convencional de Molecular Cloning. El plásmido extraído se expresó transitoriamente en células HEK 293 y se purificó a través de una columna de proteína A.
Las células hCD137-EGFP se resuspendieron en tampón de PBS-BSA al 0,5%, y se añadieron 2 |ig del anticuerpo de scFv anti-hCD137 purificado anterior, y se estableció el control relevante al mismo tiempo. El control negativo fueron 2 |ig de proteína hlgG1. El anticuerpo secundario era anti-hlg-PE. Después de la tinción, se detectó por citometría de flujo. De esta manera, se identificaron anticuerpos que se unen al antígeno hCD137 en la superficie celular.
Después del examen e identificación, se obtuvieron dos anticuerpos con mejores propiedades: scFv C2y scFv C14. Tal como se muestra en la figura 1, los dos anticuerpos anti-hCD137 fueron capaces de unirse al hCD137 en la superficie celular, mientras que el control negativo no pudo unirse al hCD137 en la superficie celular.
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de scFv C2 es:
EVOLVESGOGLVOPGGSLRLSCAASOFTVSDYYMNWIROAPOKOLEWVSY1SSSASOS
TTYYADSVKGRFTTSRDNANNSLYLfíMDSLRAEDTATYFCARWPAGSGWRWFDPWGOGT
LVTVSS(SEQID NO.4)
Los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.5), CDR2 (SEQ ID NO.6) y CDR3 (SEQ ID NO.7), respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente del mismo es:
GAGGT GC AGCT GGT GGAGT CT GGGGGAGGCTT GGTACAGCCT GGAGGGTCCCT GA GACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTCAGTGACTACTACATGAACTGGATCCGC CAGGCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTTTCATACATTAGTAGTAGTGCTAGTGGTAG TACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGGGACAACGCCA AC AACTC ACT GTAT CT GC ACATGGACAGCCTGAGAGCCGAGG ACACGGCC AT AT ACTT C T GT GCGAGAGT CGTCCCAGCT GGAAGT GGGT GGAGGTGGTTCGACCCCT GGGGCCAGG GTACCCTGGTCACTGTCTCCTCA (SEQ ID NO.8)
La secuencia de aminoácidos de región variable de la cadena ligera de scFv C2 es:
OSVLIOPPSASGSPGOSVTISCTGISSDVGAYDYVSWYOOHPGKVPKLMIYEVSKRPSG VPDRFSGSKSGDTASLTVSGLOAEDEADYYCSSHAGSNNFYVFGTGTKLTVLISEO ID NO.9)
Los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.10), CDR2 (SEQ ID NO.11) y CDR3 (SEQ ID NO.12), respectivamente.
Su secuencia de ácido nucleico correspondiente es:
CAGT CT GTTCT GATT C AGCCTCCCT CCGCGTCCGGGTCTCCT GGAC AGT CAGTC ACC ATCTCCTGCACTGGAATCAGCAGTGACGTTGGTGCTTATGACTATGTCTCCTGGTACCAA CAGCACCCAGGCAAAGT CCCCAAACT CAT GATTTAT GAGGT CAGTAAGCGGCCCT CAG GGGTCCCTGATCGCTTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCGACACGGCCTCCCTGACCGTCTCTG GGCTCC AGGCT G AGG AT GAGGCT GATT ACT ACT GC AGCT CAC AT GCAGGCAGC AACAA TTTTTATGTCTTCGGAACTGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO.13)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de scFv C14 es:
OVOLOOSGPGLVKPSOTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIROSPSRGLEWLGRTY YR SK W YNDYAPSVESRITINPDTSKNOFSLOLSSVTPEDTAVYYCARDPPYVLSTFDIWGOGTMVT VSS (SEQ ID NO.14)
Los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.15), CDR2 (SEQ ID NO.16) y CDR3 (SEQ ID NO.17), respectivamente.
Su secuencia de ácido nucleico correspondiente es:
CAGGT AC AGCT GC AGC AGT C AGGTCCAGG ACT GGT GAAGCCCT CGC AG ACCCT CTC ACT C ACCT GT GCC AT CTCC GGGG ACAGT GTTTCT AGCAACAGT GCT GCTT GGA ACT GGA T CAGGCAGTCCCCAT CG AGGGGCCTT GAGT GGCT GGGAAGGACATACTACAGGTCCAA GT GGT AT AAT GATT AT GCACCAT CT GT GGAAAGT CG AAT AACC AT CAACCCAG AC ACAT CCAAGAACCAGTT CTCCCT GCAGCT GAGCT CT GTGACT CCCGAGGACACGGCT GTGT AC T ACT GT GCAAGAGACCCT CCTTAT GT GCT CAGTACTTTT GAT AT CT GGGGCCAAGGGAC AATGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.18)
La secuencia de aminoácidos de región variable de la cadena ligera de scFv C14 es:
NFM LTOPPSVSESPGKTVTISCTRSSGNIASFYVOW FOORPGSSPTTVIYEDDORPSGVP DRFSGSIDRSSNSASLTISGLTTDDEADYYCOSYDTNNVIFGGGTKLTVL (SEQ ID NO.19)
Los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.20), CDR2 (SEQ ID NO.21) y CDR3 (SEQ ID NO.22), respectivamente.
Su secuencia de ácido nucleico correspondiente es:
AATTTT AT GCT GACT CAGCCCCCCT CT GT GTCGGAGT CCCCGGGGAAGACGGTAAC CAT CT CCTGCACCCGC AGCAGTGGGAAC ATT GCC AGCTT CT AT GT GC AGT GGTTT C AAC AGCGCCCGGGCAGTTCCCCCACCACTGTGATCTATGAAGATGACCAAAGACCCTCTGGG GTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGATCGTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATT T CT GGACT G ACGACT G ACGACGAGGCT GACT ACT ACT GT CAGT CTT AT GAT ACCAAC AA T GT CAT ATT CGGCGGAGGGACCAAGCT GACCGT CCTA (SEQ ID N 0.23)
Ejemplo 3. Identificación de características de scFv anti-hCD137
3.1 Identificación de unión específica a hCD137 (FACS):
Células HEK293 que expresan hCD137-EGFP, hOX40-EGFP, hCD27-EGFP y hGITR-EGFP construidos en el ejemplo 1 se resuspendieron en tampón de PBS-BSA al 0,5% y se añadieron proteínas scFv C2 y scFv C14 anti-hCD137, el control negativo fue la proteína hlgG Fc, luego se incubó la mezcla en hielo durante 20 min. Después del lavado, se añadió anticuerpo secundario anti-hlg-PE (eBioscience) y se incubó en hielo durante 20 min. Después del lavado, se resuspendieron las células en 500 i l de tampón de PBS-BSA al 0,5% y se detectaron por citometría de flujo. Tal como se muestra en la figura 2, ambos de scFv C2y scFv C14 anti-hCD137 fueron capaces de unirse a células hCD137-EGFP, pero no pudieron unirse a varias otras células EGFP (hOX40-EGFP-293F, hCD27-EGFP-293F y hGITR-EGFP-293F), mostrando una buena capacidad de especificidad.
3.2 Detección de la capacidad de unión a proteínas hCD137 (ELISA):
Se diluyó hCD137-muFc hasta 2 ig/ml, 100 il/pocillo con tampón de recubrimiento (Na2CO350 mM, NaHCO3 pH 9,6), y luego reposa durante la noche a 4°C. Después del lavado, se bloquearon las placas con BSA-PBS al 3% durante 1 h a 37°C. Se diluyeron los anticuerpos scFv C2 y scFv C14 respectivamente a partir de 2000 ng/ml y se diluyeron 2 veces hasta un total de 11 concentraciones, con el diluyente (BSA-PBS al 1%) como control, y se incubaron a 37°C durante 2 h. Se añadió anticuerpo de cabra anti-hlgG-HRP (conjugado de anticuerpo de cabra anti-hlgG-HRP) y se incubó a 37°C durante 1 h. Se añadió la disolución de desarrollo de sustrato de Tm B de un componente soluble, y se realizó el desarrollo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5-10 min. Se añadió H2SO42 N 50 il/pocillo para terminar la reacción de desarrollo de color. Se leyeron los valores de DO450 nm-650 nm en el lector de microplacas MD SpectraMax Plus 384, y se usó SoftMax Pro v5.4 para el procesamiento de datos y análisis de diagramas, con los resultados mostrados en la figura 3.
3.3 Detección de la capacidad de unión a proteínas hCD137 (proceso de SPR):
La cinética de unión de anticuerpos scFv C2 y scFv C14 anti-hCD137 contra el CD137 humano recombinante se midió mediante el proceso de resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento BIACore X100. El anticuerpo anti-hFc (sin identificación cruzada de Fc de ratón) se conjugó sobre el chip CM5, se diluyó scFv C2 o scFv C14 hasta 5 nM con tampón de ejecución y se capturó como ligando por el anticuerpo sobre el chip. Se diluyó CD137-muFc con tampón de ejecución hasta 1000-31,6 nM, se diluyó dos veces hasta un total de 6 concentraciones. El tiempo de inyección fue de 180 s, el tiempo de disociación fue de 1800 s y el tiempo de regeneración fue de 60 s. El tampón de ejecución fue HBS-EP+, y el tampón de regeneración fue glicina-HCl 10 mM (pH 2,0). La tasa de asociación (Kasodadón) y la tasa de disociación (Kasodadón) se calcularon usando un modelo de unión de Languir uno-a-uno simple (software de evaluación BIACore versión 3.2). La constante de disociación en equilibrio (KD) se calculó como la razón de Kd isociación /Ka sociación.
Las afinidades de unión medidas de los anticuerpos anti-hCD137 se observaron en la tabla 1.
Tabla 1 Detección de la cinética de unión entre anticuerpo anti-hCD137 y hCD137
Figure imgf000010_0001
Ejemplo 4. Determinación de las actividades de los agonistas de scFv C2 y scFv C14 anti-CD137
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de leucocitos concentrados en sangre periférica de donantes sanos mediante la centrifugación en gradiente de densidad usando fluido de separación de linfocitos humanos (Tianjin Hao Yang) y se sembraron en medio completo RPMI. Se recubrieron previamente placas de 96 pocillos con 50 | l de anticuerpo anti-CD3 1 ig/m l durante la noche a 4°C. Se recubrieron grupos experimentales con 50 | l de scFv C2 o scFv C142 ig/m l durante 2 h a 37°C, y mientras tanto, se añadieron scFv C2 o scFv C14 soluble con una concentración final de 2 ig/m l y reticulación (Jackson ImmunoResearch Laboratories: 109-006-008) con una concentración final de 2 ig/m l. El control negativo fue medio completo RPMI. La cantidad de PBMC fue de 2x105/pocillo, las células se cultivaron durante cinco días y luego se tomó el sobrenadante. Tal como se muestra en la figura 4, el nivel de IFN-y en el sobrenadante se detectó mediante el kit de detección por ELISA de IFN-y (ebioscience) y la proliferación de células T se detectó mediante el kit de tinción con BrdU (Roche: 11647229001). Puede observarse que scFv C2 y scFv C14 tienen una buena actividad en la activación de PBMC y la promoción de la proliferación de células T tanto en el modo de administración de recubrimiento como en el modo de administración de reticulación, mientras que la actividad agonista de scFv C14 es ligeramente más fuerte que la de scFv C2.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de leucocitos concentrados en sangre periférica de donantes sanos (4# y 5#) mediante la centrifugación en gradiente de densidad usando fluido de separación de linfocitos humanos (Tianjin Hao Yang) y se sembraron en medio completo RPMI. Se recubrieron previamente placas de 96 pocillos con 50 | l de anticuerpo anti-CD3 1 ig/m l durante la noche a 4°C. Se recubrieron grupos experimentales con 50 i l de scFv C142 ig/m l y reticulación (Jackson ImmunoResearch Laboratories: 109-006-008) con una concentración final de 2 p,g/ml. El control negativo fue medio completo RPMI. La cantidad de PBMC fue de 2x105/pocillo, las células se cultivaron durante cinco días y luego se tomó el sobrenadante. Tal como se muestra en la figura 4, el nivel de IFN-y en el sobrenadante de 5#PBMC (figura 4) y el nivel de IFN-y en el sobrenadante de 4#PBMC (figura 4) se detectaron mediante el kit de detección por ELISA de IFN-y (ebioscience), puede observarse que scFv C14 podía aumentar el nivel del PBMC activados secretando IFN-y.
Ejemplo 5. Maduración por afinidad in vitro de anticuerpos
5.1 Construcción de la biblioteca de expresión en levadura con afinidad mejorada
La reacción PCR convencional se realizó usando el plásmido pcDNA4-CD137-14-Fc construido en la realización 2 como molde, pcDNA4-F: TCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGC (SEQ ID NO.24) y cMyc-BBXhoI: GCCAGATCTCGAGCTATTACAAGTCTTCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCTAGAATTCCG (SEQ ID NO.25) como cebadores. Los productos de PCR resultantes se digirieron con NheI y BgIII (Fermentas) para construir un plásmido recombinante. A continuación, se obtuvo un producto de PCR de mutación aleatoria de scFv por PCR propensa a errores con referencia al método de Ginger et al. (2006) NatProtocl (2): 755-68. Los cebadores usados fueron ep-F: TAATACGACTCACTATAGGG (SEQ ID NO.26) y ep-R: GGCAGCCCCATAAACACACAGTAT (SEQ ID NO.27). Los productos de PCR resultantes se purificaron mediante el kit de purificación de ADN GeneJet de Fermentas y luego se precipitaron en etanol hasta una concentración mayor de 1 ^g/pJ. Las etapas de funcionamiento restantes se refieren al método de Ginger et al. (2006) Nat Protocl (2): 755-68 para obtener una biblioteca de levaduras con afinidades maduras en virtud de la conversión eléctrica de levaduras y el método de recombinación in vivo.
5.2 Examen de scFv anti-CD137 C14# de levaduras con afinidad mejorada
La biblioteca de levaduras madurada por afinidad obtenida anteriormente se sometió a dos rondas de clasificación de células activadas por fluorescencia con proteína hCD137-Fc 10 nM y 1 nM, y los productos de levadura resultantes se sembraron en placa y se sometieron a identificación monoclonal. Usando el método de tinción con una baja concentración de antígeno, con la levadura silvestre obtenida previamente como control, se identificaron los monoclones de levadura con afinidad mejorada por tinción de flujo, con los resultados de la tinción de levadura mostrados en la figura 5.
Los clones de levaduras confirmados por FACS se sometieron a PCR de colonias de levaduras y secuenciación, el método como anteriormente. Los resultados del análisis de secuencias se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 2 Resultados del análisis de secuencia de monoclones de levadura con afinidad mejorada
Figure imgf000011_0001
Ejemplo 6. Anticuerpo de tipo scFv formateado a anticuerpo de tipo IgG
La secuencia de aminoácidos de la región constante de IgG4 humana se obtuvo basándose en la secuencia de aminoácidos (P01861) de la región constante de la inmunoglobulina gamma humana (y)4 (IgG4) en la base de datos de proteínas Uniprot. La secuencia de ADN codificante correspondiente se diseñó usando la herramienta en línea DNAworks (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) para obtener el gen de la región constante de IgG4 humana. La secuencia de VH de la región variable de la cadena pesada de C14 obtenida a través de examen se sometió a corte y empalme con la secuencia génica de la región constante de IgG4 humana, y se sintetizaron los genes sometidos a corte y empalme, se digirieron doblemente con HindIII y EcoRI (Fermentas) y se subclonaron en el vector pcDNA4/myc-HisA, para obtener pcDNA4-C14HC.
La secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena ligera lambda humana se obtuvo basándose en la secuencia de aminoácidos (A0M8Q6) de la región constante de la inmunoglobulina lambda humana ( X) en la base de datos de proteínas Uniprot. La secuencia de ADN codificante correspondiente se diseñó usando la herramienta en línea DNAworks (http://helixweb.nih.gov/dnaworks/) para obtener el gen de la región constante de la cadena ligera lambda (X) humana. La secuencia de VL de la región variable de la cadena ligera de C14 obtenida a través de examen se sometió a corte y empalme con la secuencia génica de la región constante de la cadena ligera lambda (X) humana, y se sintetizaron los genes sometidos a corte y empalme, se digirieron doblemente con HindIII y EcoRI (Fermentas) y se subclonaron en el vector pcDNA4/myc-HisA, para obtener pcDNA-C14LC.
La extracción de los plásmidos de la cadena ligera y pesada obtenidos anteriormente se realizó usando el kit de extracción de plásmidos (PL14) suministrado por AidLab. Los plásmidos de la cadena ligera y cadena pesada construidos recombinantes se cotransfectaron en células HEK293 para llevar a cabo la expresión de anticuerpos, se cultivaron transitoriamente durante 5-6 días y luego se recogió el sobrenadante de cultivo y se purificó a través de un método de cromatografía de afinidad de proteína A para obtener un anticuerpo anti-hCD137: AcM C14.
El anticuerpo de tipo scFv con afinidad madurada se formateó a un anticuerpo de tipo IgG según el mismo método, y se obtuvo una serie de variantes de AcM 14 # anti-CD137, tal como se muestra en la siguiente tabla.
Figure imgf000012_0001
Sus secuencias se mostraron como a continuación:
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del AcM 14 #H54H57 anti-CD137 es: OVOLOOSGPGLVKPSOTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIROSPSRGLEWLGR T Y Y R S § w y [s d y a [s |s v e s r i t i n p d t s k n o f s l o l s s v t p e d t a v y y c a r d p p y v l s t f d i w g o g t m v t VSS (SEQ ID N 0.28)
Los aminoácidos en el recuadro eran sitios de mutación, los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.15), CDR2 (SEQ ID NO.29) y CDR3 (SEQ ID NO.17), respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente del mismo es:
CAGGTACAGCT GCAGC AGTC AGGTCC AGGACT GGT GAAGCCCTCGC AGACCCTCT C ACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTTTCTAGCAACAGTGCTGCTTGGAACTGGA T C AGGC AGTCCCCATCG AGGGGCCTT GAGT GGCTGGGAAGGACATACTAC AGGTCC AG
|g |t g g t a t ^ g t |g a t t a t g c a |t C aJt CTGT GGAAAGT CGAAT AACC AT C AAC CC AG ACACA TCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAGCTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTA CTACTGTGCAAGAGACCCTCCTTATGTGCTCAGTACTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGA CAATGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO.30)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del AcM 14 #H54H57 anti-CD137 es: NFM LTOPPSVSESPGKTVTISCTRSSGNIASFYVOW FOORPGSSPTTVIYEDDORPSGVP DRFSGSIDRSSNSASLTISGLTTDDEADYYCOSYDTNNVIFGGGTKLTVL (SEQ ID NO.19)
Los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.20), CDR2 (SEQ ID NO.21) y CDR3 (SEQ ID NO.22), respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente del mismo es:
AATTTT AT GCT GACT CAGCCCCCCT CT GT GT CGGAGT CCCCGGGGAAGACGGTAAC CAT CT CCTGCACCCGC AGCAGTGGGAAC ATT GCC AGCTT CT AT GT GC AGT GGTTT C AAC AGCGCCCGGGCAGTTCCCCCACCACTGTGATCTATGAAGATGACCAAAGACCCTCTGGG GTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGATCGTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATT T CT GGACT G ACGACT G ACG ACG AGGCT GACT ACT ACT GT C AGT CTT AT GAT ACCAAC AA T GT CAT ATT CGGCGGAGGGACCAAGCT GACCGT CCTA (SEQ ID N 0.23)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del AcM 14 #H32 anti-CD137 es:
OVOLOOSGPGLVKPSOTLSLTCAISGDSVSS§SA AW N WIROSPSRGLEWLGR TYYRSK W YNDYAPSVESRITINPDTSKNOFSLOLSSVTPEDTAVYYCARDPPYVLSTFDIWGOGTMVT VSS (SEQ ID NO.31)
Los aminoácidos en el recuadro eran sitios de mutación, los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.32), CDR2 (SEQ ID NO.16), CDR3 (SEQ ID NO.17), respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente del mismo es:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTC ACT C ACCT GT GCC AT CTCC GGGG ACAGT GTTTCT AGCIGACIa GT GCT GCTT GG AACT GG A T CAGGCAGTCCCCAT CG AGGGGCCTT GAGT GGCT GGGAAGGACATACTACAGGTCCAA GTGGT AT AATGATT AT GCACCATCT GTGGAAAGTCGAAT AACC ATC AACC C AG AC ACAT CC AAG AACC AGTT CTCCCT GCAGCT G AGCT CT GT GACTCCCGAGGAC ACGGCT GT GT AC T ACT GT GCAAGAGACCCT CCTTAT GT GCT CAGTACTTTT GAT AT CT GGGGCCAAGGGAC AAT GGT C ACC GTCT CCTC A (SEQ ID N 0.33)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del AcM 14 #H32 anti-CD137 es:
NFM LTQPPSVSESPGKTVTISCTRSSGNIASFYVOW FOORPGSSPTTVIYEDDQRPSGVP DRF S GSIDRS SN S ASLTI S GLTT DDE AD Y Y CO S YDTNNVIF GGGTKLT VL (SEQ ID NO.19)
Los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.20), CDR2 (SEQ ID NO.21) y CDR3 (SEQ ID NO.22), respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente del mismo es:
AATTTT AT GCT GACT CAGCCCCCCT CT GT GT CGGAGT CCCCGGGGAAGACGGTAAC CAT CT CCTGCACCCGC AGCAGTGGGAAC ATT GCC AGCTT CT AT GT GC AGT GGTTT C AAC AGCGCCCGGGCAGTTCCCCCACCACTGTGATCTATGAAGATGACCAAAGACCCTCTGGG GT CCCT GATCGGTTCT CT GGCTCCAT CGACAGATCGT CCAACT CT GCCTCCCTC ACC ATT T CT GGACT G ACGACT G ACGACGAGGCT GACT ACT ACT GT C AGT CTT AT GAT ACCAAC AA T GT CAT ATT CGGCGGAGGGACCAAGCT GACCGT CCTA (SEQ ID N 0.23)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del AcM 14 #L50 anti-CD137 es:
OVOLOOSGPGLVKPSOTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIROSPSRGLEWLGRTY YR SK W YNDYAPSVESRITINPDTSKNOFSLOLSSYTPEDTAVYYCARDPPYVLSTFDIWGOGTMVT VSS (SEQ ID NO.14)
Los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.15), CDR2 (SEQ ID NO.16) y CDR3 (SEQ ID NO.17), respectivamente.
Su secuencia de ácido nucleico correspondiente es:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTC ACT C ACCT GT GCC AT CTCC GGGG ACAGT GTTTCT AGCAACAGT GCT GCTT GGA ACT GGA T CAGGCAGTCCCCAT CG AGGGGCCTT GAGT GGCT GGGAAGGACATACTACAGGTCCAA GTGGT AT AATGATT AT GCACCATCT GTGGAAAGTCGAAT AACC ATCAACCCAG AC ACAT CCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGCTGAGCTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTAC T ACT GT GCAAGAGACCCT CCTTAT GT GCT CAGTACTTTT GAT AT CT GGGGCCAAGGGAC AAT GGT CACCGT CTCCT C A (SEQ ID NO.18)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del AcM 14 #L50 anti-CD137 es:
NFMLTOPPSVSESPGKTVTISCTRSSGNIASFYVOW FOORPGSSPTTVIY§D D O R PSGVP DRFSGSIDRSSNSASLTISGLTTDDEADYYCQSYDTNNV1FGGGTKLTVL (SEQ ID N 0.34)
Los aminoácidos en el recuadro eran sitios de mutación, los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.20), CDR2 (SEQ ID NO.35) y CDR3 (SEQ ID NO.22), respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente del mismo es:
AATTTTAT GCT GACT CAGCCCCCCT CT GT GT CGGAGT CCCCGGGGAAGACGGTAAC CATCTCCTGCACCCGCAGCAGTGGGAACATTGCCAGCTTCTATGTGCAGTGGTTTCAAC AGCGCCCGGGCAGTTCCCCCACCACTGTGATCTATGACGATGACCAAAGACCCTCTGG GGTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGATCGTCCAACTCTGCCTCCCTCACCAT TTCT GGACT G ACGACT G ACGACGAGGCT GACT ACT ACT GT C AGT CTT AT GAT ACCAAC A ATGTCATATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID N 0.36)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del AcM 14 #L95 anti-CD137 es: OVOLOOSGPGLVKPSOTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIROSPSRGLEWLGRTY YR SK W YNDYAPSVESRITINPDTSKNOFSLOLSSVTPEDTAVYYCARDPPYVLSTFDIWGOGTMVT VSS (SEQ ID NO.14)
Los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.15), CDR2 (SEQ ID NO.16) y CDR3 (SEQ ID NO.17), respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente del mismo es:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTC ACT C ACCT GT GCC AT CTCC GGGG ACAGT GTTTCT AGCAACAGT GCT GCTT GGA ACT GGA T CAGGCAGTCCCCAT CG AGGGGCCTT GAGT GGCT GGGAAGGACATACTACAGGTCCAA GT GGT AT AAT GATT AT GCACCAT CT GT GGAAAGT CGAAT AACC AT C AACCC AG ACAC AT CC AAG AACC AGTT CTCCCT GCAGCT G AGCT CT GT GACTCCCGAGGAC ACGGCT GT GT AC T ACT GT GCAAGAGACCCT CCTTAT GT GCT CAGTACTTTT GAT AT CT GGGGCCAAGGGAC AATGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.18)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del AcM 14 #L95 anti-CD137 es:
NFM LTQPPSVSESPGKTVTISCTRSSGNIASFYVOW FOORPGSSPTTVIYEDDQRPSGVP DRFSGSIDRSSNSASLTISGLTTDDEADYYCOSYDTN|k |v IFGGGTKLTVL (SEQ ID N 0.37)
Los aminoácidos en el recuadro eran sitios de mutación, los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.20), CDR2 (SEQ ID NO.21) y CDR3 (SEQ ID NO.36), respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente del mismo es:
AATTTTAT GCTGACT CAGCCCCCCT CT GT GTCGGAGT CCCCGGGGAAGACGGTAAC CAT CT CCTGC ACCCGC AGCAGTGGGAAC ATT GCC AGCTT CT AT GT GC AGT GGTTT C AAC AGCGCCCGGGCAGTTCCCCCACCACTGTGATCTATGAAGATGACCAAAGACCCTCTGGG GTCCCTGATCGGTTCTCTGGCTCCATCGACAGATCGTCCAACTCTGCCTCCCTCACCATT T CT GGACT G ACGACT G ACGACGAGGCT G ACT ACT ACT GT C AGT CTT AT GAT ACCAAC AA
[G]GTCATATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO.39)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del AcM 14 #L93L95 anti-CD137 es:
OVOLOOSGPGLVKPSOTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIROSPSRGLEWLGRTY YR SK WYNDYAPSVESRITINPDTSKNOFSLOLSSVTPEDTAVYYCARDPPYVLSTFDIWGOGTMVT VSS (SEQ ID NO.14)
Los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.15), CDR2 (SEQ ID NO.16) y CDR3 (SEQ ID NO.17), respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente del mismo es:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTC ACT C ACCT GT GCC AT CTCC GGGG ACAGT GTTTCT AGCAACAGT GCT GCTT GGA ACT GGA TCAGGCAGTCCCCATCGAGGGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAA GT GGT AT AAT GATT AT GCACCAT CT GT GGAAAGT CGAAT AACC AT CAACCCAG AC ACAT CC AAGAACC AGTT CTCCCT GCAGCT G AGCT CTGT GACTCCCG AGGAC ACGGCT GT GT AC T ACT GT GCAAGAGACCCT CCTTAT GT GCT CAGTACTTTT GAT AT CT GGGGCCAAGGGAC AAT GGT C ACC GTCT CCTC A (SEQ ID NO.18)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del AcM 14 #L93L95 anti-CD137 es:
NFM LTOPPSYSESPGKTYTISCTRSSGNIASFYYOW FOORPGSSPTTYIYEDDORPSGYP DRFSGSIDRSSNSASLTISGLTTDDEADYYCQSYD|n [k ]v IFGGGTKLTVL (SEQ ID NO.40)
Los aminoácidos en el recuadro eran sitios de mutación, los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.20), CDR2 (SEQ ID NO.21) y CDR3 (SEQ ID NO.41), respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente del mismo es:
AATTTTAT GCTGACT CAGCCCCCCT CT GTGT CGGAGT CCCCGGGGAAG ACGGTAAC CATCTCCTGCACCCGCAGCAGTGGGAACATTGCCAGCTTCTATGTGCAGTGGTTTCAAC AGCGCCCGGGCAGTTCCCCCACCACTGTGATCTATGAAGATGACCAAAGACCCTCTGGG GTCCCT GAT CGGTT CT CT GGCTCCATCGACAGAT CGTCCAACT CTGCCTCCCT CACCATT T CT GG ACT G ACGACT G ACG ACG AGGCT G ACT ACT ACT GT C AGT CTT AT GAT AT C AAC AA
[g ]GTCATATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA (SEQ ID NO.42)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del AcM 14 # anti-CD137 nuevo es:
OVOLOOSGPGLVKPSOTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIROSPSRGLEWLGRTY YR SK WYNDYAPSVESRITINPDTSKNOFSLOLSSVTPEDTAVYYCARDPPYVLSTFDIWGOGTMVT VSS (SEQ ID NO.14)
Los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.15), CDR2 (SEQ ID NO.16) y CDR3 (SEQ ID NO.17), respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente del mismo es:
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTC ACT C ACCT GT GCC AT CTCC GGGG ACAGT GTTTCT AGCAACAGT GCT GCTT GGA ACT GGA TCAGGCAGTCCCCATCGAGGGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTACAGGTCCAA GT GGT AT AAT GATT AT GCACCAT CT GT GGAAAGT CGAAT AACC AT CAACCCAG AC ACAT CC AAGAACC AGTT CTCCCT GCAGCT G AGCT CT GT GACTCCCGAGGAC ACGGCT GT GT AC T ACT GT GCAAGAGACCCT CCTTAT GT GCT CAGTACTTTT GAT AT CT GGGGCCAAGGGAC AAT GGT C ACC GTCT CCTC A (SEQ ID NO.18)
La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del AcM 14 # anti-CD137 nuevo es:
Figure imgf000017_0001
Los aminoácidos en el recuadro eran sitios de mutación, los aminoácidos correspondientes a las partes subrayadas son CDR1 (SEQ ID NO.20), CDR2 (SEQ ID NO.35) y CDR3 (SEQ ID NO.41), respectivamente.
La secuencia de ácido nucleico correspondiente del mismo es:
Figure imgf000017_0002
AGCGCCCGGGCAGTT CCCCCACCACTGT GAT CT AT GAC GAT GACCAAAGACCCT CT GG
GGT CCCT GAT CGGTT CT CT GGCT CCATCGACAGAT CGTCCAACTCTGCCTCCCT CACCAT
TTCT GG ACT G ACG ACT G ACG ACGAGGCT GACT ACT ACT GT C AGT CTT AT GAT[ATC]AAC[A]
[AG|GTCATATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTA(SEQ ID NO.44)
Ejemplo 7. Identificación de las características del AcM 14 # anti-HCD137 y variantes del mismo
7.1 Identificación de la unión de manera específica a hCD137 (FACS):
Células HEK293 que expresan hCD137-EGFP, hOX40-EGFP, hCD27-EGFP y hGITR-EGFP construidos en el ejemplo 1 se resuspendieron en tampón de PBS-BSA al 0,5% y se añadió proteína de AcM C14 anti-hCD137, el control negativo fue proteína hlgG Fc, luego se incubó la mezcla en hielo durante 20 min. Después del lavado, se añadió un anticuerpo secundario anti-hlg-PE (eBioscience) y se incubó en hielo durante 20 min. Después del lavado, se resuspendieron las células en 500 |il de tampón de PBS-BSA al 0,5% y se detectaron por citometría de flujo. Los resultados se muestran en la figura. Tal como se muestra en figura 6, el AcM C14 anti-hCD137 era capaz de unirse a células hCD137-EGFP, pero no pudo unirse a varias otras células EGFP (hOX40-EGFP-293F, hCD27-EGFP-293F y hGITR-EGFP-293F), mostrando una buena capacidad de especificidad.
7.2 Detección de la capacidad de unión a proteínas hCD137 (ELISA):
Se diluyó hCD137-muFC hasta 2 |ig/ml con tampón de recubrimiento (Na2CO350 mM, NaHCO3 pH 9,6), 100 |il/pocillo, durante la noche a 4°C. Después del lavado, se bloquearon las placas con BSA-PBS al 3% durante 1 h a 37°C. AcM C14 y variantes del mismo se diluyeron respectivamente a partir de 2000 ng/ml y se diluyeron 2 veces hasta un total de 11 concentraciones, con el diluyente (BSA-PBS al 1%) como control, y se incubaron durante 2 h a 37°C. Se añadió anticuerpo de cabra anti-hlgG-HRp (conjugado de anticuerpo de cabra anti-hlgG-HRP) y se incubó durante 1 h a 37°C. Se añadió la disolución de desarrollo de sustrato de TMB de un componente soluble, y se realizó el desarrollo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5-10 min. Se añadió H2SO42 N 50 ^l/pocillo para terminar la reacción de desarrollo de color. Los valores de DO450 nm-650 nm se leyeron en un lector de microplacas MD SpectraMax Plus 384, y se usó SoftMax Pro v5.4 para el procesamiento de datos y análisis de diagramas, con los resultados mostrados en la figura 7.
Tal como se muestra en la figura 7A, la unión del anticuerpo y el antígeno no se vio afectada cuando los sitios H54 y H57 de la cadena pesada se mutaron al mismo tiempo, y mientras tanto, la afinidad entre el anticuerpo y el antígeno no aumentó; tal como se muestra en la figura 7B, la mutación de la cadena ligera podría aumentar la afinidad entre el anticuerpo y el antígeno, especialmente cuando los sitios L93 y L95 se mutaron al mismo tiempo. Puede observarse en la figura 7C que las afinidades del AcM 14 #L93L95 anti-CD137 y AcM 14 # anti-CD137 nuevo con hCD137 eran similares entre sí.
7.3 Detección de la capacidad de unión a proteínas hCD137 (SPR):
La cinética de unión del anticuerpo anti-hCD137 contra el CD137 humano recombinante se midió mediante el proceso de resonancia de plasmón superficial (SPR) usando un instrumento BIACore X100. Se conjugó el anticuerpo anti-hFc (sin identificación cruzada de Fc de ratón) sobre el chip CM5, se diluyó CD137-muFc hasta 5 nM con tampón de ejecución y se capturó como un ligando por el anticuerpo sobre el chip. Se diluyó CD137-muFc con tampón de ejecución hasta 1000-31,6 nM (AcM C14) o 100-3,16 nM (AcM C14 nuevo), diluido dos veces hasta un total de 6 concentraciones. El tiempo de inyección fue de 180 s, el tiempo de disociación fue de 1800 s y el tiempo de regeneración fue de 60 s. El tampón de ejecución era HBS-EP+, y el tampón de regeneración era glicina-HCl 10 mM (pH 2,0). La tasa de asociación (Kasoc¡ac¡ón) y la tasa de disociación (Kd¡soc¡ac¡ón) se calcularon usando un modelo de unión de Languir uno a uno simple (software de evaluación BIACore versión 3.2). La constante de disociación en equilibrio (KD) se calculó como la razón de Kd^odadó^Kâ dadó^ Las afinidades de unión medidas de los anticuerpos anti-hCD137 se observaron en la tabla 3.
Tabla 3 Detección de la cinética de unión entre anticuerpo anti-hCD137 y hCD137
Figure imgf000018_0001
7.4 Detección de la capacidad de unión a proteínas CD137 de mono rhesus (ELISA):
Se diluyó RhCD137-muFc hasta 5 ig/ml, 100 il/pocillo, con tampón de recubrimiento (Na2CO350 mM, NaHCO3 pH 9.6), durante la noche a 4°C. Después del lavado, se bloquearon las placas con BSA-PBS al 3% durante 1 h a 37°C. Los anticuerpos AcM 14 # anti-hCD137 nuevos se diluyeron respectivamente a partir de 2000 ng/ml y se diluyeron 3 veces, con el diluyente (BSA-PBS al 1%) como control, y se incubaron durante 2 h a 37°C. Se añadió conjugado de anticuerpo de cabra anti-hlgG-HRP y se incubó durante 1 h a 37°C. Se añadió la disolución de desarrollo de sustrato de TMB de un componente soluble, y se realizó el desarrollo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 5-10 min. Se añadió H2SO42 N 50 il/pocillo para terminar la reacción de desarrollo de color. Se leyeron los valores de DO450 nm-650 nm en el lector de microplacas MD Spectra Max Plus 384, y se usó SoftMax Pro v5.4 para el procesamiento de datos y análisis de diagramas, con los resultados mostrados en la figura 8, en la que puede observarse que el AcM 14 # anti-HCD137 nuevo puede unirse a CD137 de mono rhesus.
7.5 Detección de la unión de proteína CD137 en competición con CD137L (FACS)
Se detectó si el AcM 14 # anti-CD137 nuevo puede bloquear la unión de CD137L y proteína CD137 expresada en la superficie celular. Tomando 5x105 células CD137L-EGFP construidas en el ejemplo 1, al sistema de reacción se le añadieron proteína CD137-muFc 10 ig/m l y anticuerpo AcM C14 # anti-CD137 nuevo 20 ig/m l, que se incubaron en hielo durante 20 min, se lavaron dos veces y luego se añadió anticuerpo secundario anti-mlg-PE a la tinción y se incubó en hielo durante 20 min, se lavó dos veces y luego se almacenaron las células en PBS que contenía BSA al 0,5%, con la adición de CD137-muFc mientras que no se añadieron anticuerpos como control. Se detectó la tinción mediante un citómetro de flujo, con resultados mostrados en la figura 9, donde el eje X representa la intensidad de fluorescencia de EGFP, el eje Y representa la intensidad de fluorescencia de PE. Puede observarse a partir de los resultados que el AcM 14 # anti-CD137 nuevo en este caso no bloqueó la unión entre CD137L y proteína CD137.
Ejemplo 8. Determinación de la actividad del agonista AcM C14 anti-CD137
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de leucocitos concentrados en sangre periférica de donantes sanos mediante la centrifugación en gradiente de densidad usando fluido de separación de linfocitos humanos (Tianjin Hao Yang) y se sembraron en medio completo RPMI. Se recubrieron previamente placas de 96 pocillos con 50 i l de anticuerpo anti-CD3 10 ig/m l y anticuerpo anti-CD28 soluble 0,5 ig /m l durante la noche a 4°C. Se recubrieron grupos experimentales con 50 | l de AcM C14 o scFv C14 2 ig/m l y reticulación (Jackson ImmunoResearch Laboratories: 109-006-008) con una concentración final de 2 ig/m l, el control negativo fue medio completo RPMI. La cantidad de PBMC fue de 2x105/pocillo, las células se cultivaron durante cinco días y luego se tomó el sobrenadante. El nivel de IFN-y en el sobrenadante de PBMC se detectó mediante el kit de detección por ELISA de IFN-y (eBioscience) y los resultados se mostraron en la figura 10A. Puede observarse a partir de los resultados que scFv y AcM 14 # anti-CD137 podían regular por incremento ambos el nivel de IFN-y secretado por PBMC activadas.
Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de leucocitos concentrados en sangre periférica de donantes sanos mediante la centrifugación en gradiente de densidad usando fluido de separación de linfocitos humanos (Tianjin Hao Yang) y se sembraron en medio completo RPMI. Se aislaron células T c D8+ de PBMC usando el kit de separación con perlas magnéticas (Miltenyi Biotec:130-096-533), según el método en la memoria descriptiva. Se pesaron y resuspendieron en medio completo RPMI, con una concentración de 2 millones/ml. Las células T CD8+ aisladas se estimularon con anticuerpo anti-CD3 1 ig/m l y anticuerpo anti-CD28 0,2 ig/m l para activarse. En los grupos experimentales se añadieron scFv C14 o AcM C14 2 ig/m l y reticulación (Jackson ImmunoResearch Laboratories: 109-006-008) con una concentración final de 2 ig/ml, el control negativo fue medio completo RPMI. Las células se cultivaron durante cinco días y luego se tomó el sobrenadante. El nivel de IFN-y en el sobrenadante de células T CD8+ se detectó mediante el kit de detección por ELISA de IFN-y (ebioscience) y los resultados se mostraron en la figura 10B. Puede observarse a partir de los resultados que el scFv y AcM 14 # anti-CD137 podrían aumentar ambos la capacidad de las células T CD8+ que secretan IFN-y.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    Anticuerpo que se une específicamente a CD137 o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de la cadena ligera, en el que:
    dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.5, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.6 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.7; y
    dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.10, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.11 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.12;
    o
    dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
    dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.22;
    o
    dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.29 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
    dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.22;
    o
    dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.32, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
    dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.22;
    o
    dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
    dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.35 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.22;
    o
    dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
    dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.38;
    o
    dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
    dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.21 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.41;
    o
    dicha región variable de la cadena pesada comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.15, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.16 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.17; y
    dicha región variable de la cadena ligera comprende una CDR1 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.20, una CDR2 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.35 y una CDR3 que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.41.
    Anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, en el que:
    dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.4; y
    dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.9;
    o
    dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.14; y
    dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.19;
    o
    dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.28; y
    dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.19;
    o
    dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.31; y
    dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.19;
    o
    dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.14; y
    dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.34;
    o
    dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.14; y
    dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.37;
    o
    dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.14; y
    dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.40;
    o
    dicha cadena pesada comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.14; y
    dicha cadena ligera comprende una región variable que tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.43.
    3. Anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2, en el que dicho anticuerpo o dicha porción de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo completo, un anticuerpo biespecífico, scFv, Fab, Fab', F(ab')2 o Fv.
    4. Anticuerpo de cadena sencilla, que comprende una VH, una VL y un péptido ligador, en el que la VH tiene una secuencia tal como se expone en s Eq ID NO.4, la VL tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.9 y el péptido ligador tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.1.
    5. Anticuerpo de cadena sencilla, que comprende una VH, una VL y un péptido ligador, en el que la VH tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.14, la VL tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.19 y el péptido ligador tiene una secuencia tal como se expone en SEQ ID NO.1.
    6. Composición farmacéutica, que comprende:
    el anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2; y
    un portador farmacéuticamente aceptable.
    7. Anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2, para su uso en el tratamiento de cáncer.
    8. Anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2, para su uso en el tratamiento de cáncer en combinación con un medicamento adicional o un método adicional para el tratamiento de cáncer.
    9. Anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 o 2, para su uso en el tratamiento de tumor en combinación con un medicamento adicional o un método adicional para el tratamiento de tumor.
    10 Polinucleótido aislado, que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
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