KR20040098048A - 4-1ｂｂ 및/또는 ｃｄ40의 생체내 격발을 통한 항종양ｃｔｌ 면역성 유발 - Google Patents
4-1ｂｂ 및/또는 ｃｄ40의 생체내 격발을 통한 항종양ｃｔｌ 면역성 유발 Download PDFInfo
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Abstract
아고니스트 항CD40 항체 또는 그의 단편, 및/또는 아고니스트 항4-1BB 항체 또는 그의 단편을 포함하는 종양 또는 감염성 질환의 치료용 조성물 및 치료방법이 제공된다. 아고니스트 항체 분자는 Fab, (Fab')2및 Fv와 같은 단편들을 포함한다. 본 발명의 방법과 조성물은 클래스 1 MHC 또는 클래스 II MHC-제한 T 세포 에피토프를 갖거나 코딩하는 폴리펩타이드 또는 핵산 서열을 추가로 포함할 수도 있다.
Description
많은 종양이 우리의 면역계의 감시를 빠져나간다. 암환자의 경우 종양 세포를 제거하는 면역계의 특이적인 메카니즘에 정량적 및/또는 정성적으로 명백한 결함이 있다. 이러한 메카니즘들 중 하나는 바이러스에 감염된 세포 또는 암세포로 형질변환되는 세포를 인식하여 사멸시킬 수 있는 세포독성 T 세포(CTL)에 의해 제공된다. 이전에는 수상돌기 세포(DC: dendritic cells)가 T-헬퍼 세포를 자극하고 그에 따라 CTL의 활성화에 도움을 주는 것으로 추정되었었다. 본 발명자들은 T-헬퍼 세포가 CTL에 직접적으로 헬퍼 시그널을 제공(IL2를 분비함으로써)한다기 보다, T-헬퍼 세포 부재하에서 CTL을 활성화시킬 수 있는 아직 특징화되지 않은 세포 표면 및/또는 가용성 분자를 유도하는 DC에 시그널을 제공한다는 것을 입증하였다. T-헬퍼 세포가 DC에 제공한 이 시그널은 CD40L-CD40 상호작용에 의해 매개된다. 이 새로운 발견은 암 면역학에 독자적인 기회를 제공해주었다.
면역계는 자가유래 세포가 암세포로 형질전환되거나 바이러스에 의해 감염될 경우 자가유래 세포를 사멸시킬 수 있다. 잠재적으로 위험한 이러한 메카니즘은 확실하고 엄격하게 통제되어야만 한다. 면역계의 CTL은 불활성 전구체처럼 순환한다. 활성화 되기 위해서, 전구체 T-킬러 세포는 프로페셔널 APC 상에 MHC 클래스 I 분자로서 제시되는 그의 특이적인 항원 펩타이드를 인식해야만 한다. 그러나, 이러한 T 세포를 프라이밍시키기 위해서는 APC 역시 공동자극 표면 분자 B7.1와 7.2 및 림포카인 IL-12와 같은 다른 물질들에 의해 제공되는 바와 같이적절한 공동자극적 개념으로 항원을 제공할 필요가 있다.
최근까지도 CTL를 완벽하게 활성화시키기 위해서는, 동일한 APC 상의 동일한 항원을 인식하는 T-헬퍼 세포가 필요한 것으로 믿어져왔다. 특이적인 T-헬퍼 세포는 CTL의 활성화에 필요한 IL-2와 같은 시토카인을 공급해 줄 것이다. Guerder 및 Matzinger (J. Exp. Med.176:553(1992))는 그러나, CTL 활성화의 "라이센싱" 모델을 제안했다. 이 모델에서는 T-헬퍼 세포가 프로페셔날 APC 상에서 그의 항원을 인식할 때, 활성화 시그널을 APC에 전달하고 그 결과 T-헬퍼 세포의 존재를 필요로 하지 않고도 CTL을 후속적으로 활성화시킬 수 있을 것으로 제안되었다. 아주 최근에야 비로소, 이 라이센싱 모델의 분자수준의 메카니즘이 밝혀졌다. Schoenberger 등 (Nature393:480(1998))은, 라이센싱 모델에서 CD40L-CD40 경로의 역할을 설명해냈다. CD40-CD40L 결합 통한 T-헬퍼 세포와 DCD 사이의 상호작용은 DC를 활성화시킴으로써, DC로 하여금 본래의(naive) CTL을 효과적으로 프라아밍시킬 수 있는 것이다.
DC는 우리몸의 조직을 순환하고 이러한 방식으로 항원을 수집, 가공 및 제시할 수 있다. 항원 수집 후, 이들은 항원을 T 세포에 제시하는 장소인 드레이닝 림프절로 이동한다. DC가 최적으로 작동하기 위해서는 활성화될 필요가 있다는 것은 잘 알려진 사실이다. 휴지기의 DC는 MHC와 공동자극 분자를 아주 보통 수준으로만 발현하고 T 세포의 불량한 자극제이다. DC는 염증성 시토카인과 세균 생성물에 의해 활성화될 수 있고, 이로 인해 MHC와 공동자극 분자들이 업조절(upregulation) 된다. DC가 완전히 성숙한 DC로 활성화되어 MHC 분자, 공동자극 분자 및 IL-12와 같은 림포카인을 최적 수준으로 발현하기 위해서는 CD40 수용체를 통한 이들 세포의 부가적인 격발(trigerring)이 필요하다. 결론적으로, T-헬퍼 세포 상호반응시 CD40L-CD40 상호작용과 항원 흡수 부위에서의 염증성 시토카인과의 결합은 CTL 활성화를 위한 DC의 라이센스를 최적화해주는 것이다.
많은 종양들이 특이적인 CTL 메카니즘에 의한 면역 감시체계를 벗어난다. DC가 비염증성 조건 하에서 종양 항원을 모은다면 활성화되는 T- 헬퍼 세포의 숫자는 충분한 CTL을 활성화시켜 적절한 항종양 응답을 유발하는데는 너무 부족할 것이다. 이러한 개념은 연구자들로 하여금 CTL 활성을 직접 촉진하는 IL-2 및 IL-12와 같은 시토카인을 투여하거나 GM-CSF에 의해 트랜스펙션된 종양 세포를 투여함으로써 항원 제시를 부스트시킴으로써 면역계를 보조하도록 하였다. 이러한 전략은 들쑥날쑥한 그러나 고무적인 결과를 낳았다.
세포성 면역과 체액성 면역을 비롯한 방어적인 항종양 응답을 발생 및/또는 향상시키기 위한 방법을 찾을 필요가 여전히 존재한다는 것은 분명하다. CD40 활성화 경로는 일차적인 체액성 및 세포성 면역 응답 발생을 위한 주요한 면역조절 경로인 것으로 밝혀졌다. 상술한 바와 같이 DC 상의 CD40 경로는 항종양 CTL 응답의 유발에 책임이 있다. 이에 더해, 대식세포에서의 CD40 경로의 활성화는 강력한 종양사멸 활성을 촉진시킨다.
CD40L+Th 세포에 의하거나 또는 아고니스트 항CD40 Ab(T 세포 보조가 충분치 못할 경우)에 의한 CD40-격발의 가장 주요한 효과는 DC의 성숙으로서, 이로 인해, 이들 세포는 나이브 CTL의 프라이밍에 필요한 공동자극적 시그널 측면에서 항원을 제시하는 능력을 부여받게 된다 (5). CD80과 CD86 (이들 두가지 모두 성숙한 DC에서 고도로 발현됨)에 의해 T 세포상의 CD28 수용체에 전달된 공동자극 시그널은 가장 집중적으로 탐구되어왔다 ((6, 7)에서 검토됨). 비록 이 시그널이 T 세포 활성화에 요긴한 역할을 하지만, 부가적인 상당수의 공동자극 경로 역시 이 방법에 관여한다. 이들 중 하나가 4-1BB/4-1BB 수용체-리간드쌍이다. 4-1BB는 TNF-수용체(TNFR) 패밀리의 멤버로서 활성화된 CD8+및 CD4+T 세포상에서 발현된다 (8, 9). 그의 자연적인 리간드인 4-1BBL은 B 세포, 대식세포 및 DC상에서 발현된다 (10-12). 생체내 연구에 따르면 T 세포를 아고니스트 항4-1BB Ab로 자극하면 TCR-유발 증식과 T 세포에 의한 시토카인 생산이 증가하는 것으로 나타났다. 비록 CD4+Th 세포와 CD8+CTL 세포 두가지 모두 이 방식으로 공동 자극될 수 있지만, CD8+T 세포가 CD4+Th보다 4-1BB 격발에 보다 더 잘 반응했다 (8, 13). 따라서, 생체외에서 4-1BB 공동자극을 차단하자 APC-매개성 T 세포 활성화를 억제하고(14, 15), 4-1BB-결핍 마우스는 바이러스 감염에 대한 CTL 면역성의 발현 능력이 감소된 것으로 나타났다 (16-18). 반대로, 아고니스트 항4-1BB Ab를 마우스에게 투여하자 이식 대 숙주 질병 마우스 모델에서 CTL 생산이 증폭된 것으로 나타났고 (13), 종양-산생 마우스에 있어서 약한 면역원성 종양의 거부도 야기되었다 (19).
발명의 요약
본 발명은 약제학적 조성물에서 단독으로 사용되거나 또는 종양 항원 또는 감염성 제제의 항원을 비롯한 CTL-활성화 펩타이드와 함께 사용될 수 있는 4-1BB 결합 분자 뿐만 아니라 CD40 결합 분자에 관한 것이다. 이러한 조성물은 펩타이드 종양 백신의 항종양 효과를 증진시키거나, 또는 CTLs의 활성화에 유용함으로 해서, 활성화된 CTLs이 종양 세포 또는 감염된 세포에 대해 대응할 수 있도록 해준다. CD40 및/또는 4-1BB 결합 분자에는 항체 분자, 그의 상동체(homologues), 유사체(analogues) 및 변형되거나 유도된 형태가 포함되며, 예를 들어 CD40 또는 4-1BB에 결합하여 CTL 응답을 활성화시키는 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 펩티도미메틱스 및 유기 화합물과 같은 소형 분자들 뿐만 아니라, Fab, (Fab')2및 Fv와 같은 면역글로불린 단편을 들 수 있다. CTL-활성화 펩타이드에는 서열 SGPSNTPPEI (SEQ ID NO:2)를 갖는 아데노바이러스-유래된 E1A 펩타이드, 및 서열 RAHYNIVTF (SEQ IDNO: 3)을 갖는, 인간의 파필로마바이러스 타잎 16으로부터 유도된 HPV 16 E7 펩타이드가 포함된다.
CD40 결합 분자, 4-1BB 결합 분자 및 CTL 활성화 펩타이드는 주사를 비롯한 적절한 수단으로 환자에게 투여되거나, 이러한 분자와 펩타이드를 코딩하는 유전자 구조물을 투여하여 그에 의해 그 분자 및 펩타이드가 생체내(in vivo)또는 생체외(ex vivo)에서 생산되는 것이다. 이러한 유전자 치료법은 해당 기술분야에 잘 알려진 방법에 따라 수행된다. 유전자 구조물의 트랜스펙션 또는 감염이 생체외에서 행해진 후, 감염 또는 트랜스펙션된 세포들은 환자에게 투여되고, 이러한 단계들은 생체내에서 행될 수 있기 때문에 그 분자와 펩타이드가 내래적으로(endogenously) 생산된다. 트랜스펙션이나 감염이 생체외에서 수행될 경우에는 전기영동, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, 마이크로인젝션을 비롯한 통상적인 방법 또는 유전자 구조물을 적절한 리포좀 내로 인코포레이팅시키는 방법에 의할 수 있다. 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 파르보바이러스 벡터를 비롯한 벡터, 또는 플라스미드를 이용하여 유전자 구조물을 인코포레이션시킨 다음 이것을 생체내 또는 생체외에서 발현시키는 것이다.
CTL 프라이밍에 대한 T-세포의 보조는 CD40-CD40리간드(CD40L) 상호작용을 통해 매개되며, CD4+T 세포의 부재시 CTL 프라이밍의 결여는 종양 항원을 비롯한 CTL-활성화 펩타이드의 존재 하에서 골수-유래된 APC의 모노클로날 항체 (mAb)-매개성 CD40 활성화에 의해 복구될 수 있음이 증명되었다. 뿐만 아니라, CD4+T 세포에 의해 발현된 CD40L의 차단은 CTL 면역성을 유발하지 못하게 만든다. 이러한 결함은 생체내 CD40-격발에 의해 극복될 수 있다. CD40의 생체내 격발은 펩타이드-기재의 항종양 백신의 효능을 현저하게 증강시켜줄 수 있거나, 그렇지 않으면 CTL을 활성화시켜 항종양 또는 항감염성 세포반응을 결과시킬 수 있다.
CTL-활성화 펩타이드는 톨레로겐성(tolerogenic)일 수 있다는 것이 알려져 있으며, 이는, 그 펩타이드를 발현하는 세포에 대한 숙주의 반응이 항CD40 부재하에 억제된다는 것을 의미하는 것이다. 그러나, 활성화 항CD40 항체와 결합된 이러한 펩타이드는 톨레라이제이션(tolerization)을 강력한 CTL 활성화로 변환시킨다. 뿐만 아니라, 전술한 바와 같이, CD40-라이게이션은 이미 보호성인 종양 특이적 펩타이드-백신에 종양 산생 마우스에서 치료적 CTL 면역성을 유발할 수 있는 능력을 부여해줄 수 있다.
이러한 발견은 CD40-CD40리간드 쌍이 나이브 말초 CTL를 프라임시킬 것인지 또는 톨레라이즈시킬 것인지를 결정하는 스윗치로서 작용함을 함께 증명해준다. 따라서, 모노클로날 항체 및 기타 자극성 리간드와 같은 CD40 결합제는 CTL-활성화 펩타이드와 효과적으로 복합적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서는 예컨대 아고니스트 항4-1BB 항체를 통한 4-1BB의 격발이 CTL에 강력한 공동자극적 시그널(이 시그널은 항원-특이적 CTL 면역성의 교차-프라이밍에 있어서의 CD4+T 세포 보조에 대한 필요성을 효과적으로 대체시킬 수 있음)을 전달할 수 있는 것으로도 증명되었다. 4-1BB는 달리 톨레로겐성 펩타이드 백신을효과적인 CTL 프라이밍을 할 수 있는 포뮬레이션으로 전환시킬 수 있다. 나이브 CTL의 초기 활성화는 4-1BB 공동 자극 부재하에 일어날 수 있지만 이 시그널은 항원-자극된 CTL의 증가된 생존을 허락한다. 4-1BB 공동자극에 의한 T-헬퍼-독립성 CTL 면역성의 격발은 TCR 및 CD-28 의존성 공동자극의 선행 자극을 필요로 한다. 4-1BB-매개성 생존 시그널은 따라서 나이브 CTL의 CD-28-의존성 공동자극과 항원특이적 TCR 격발의 하류에 위치한다. 따라서, 4-1BB 결합 분자는 그 자체로 또는 CD40 결합 분자 및/또는 CTL-활성화 펩타이드와 결합적으로, 예컨대 항종양 백신의 강도를 증강시키는데 있어서 항원특이적 CTL 응답의 유발, 증폭 및 지속을 위한 의약 제조에 사용될 수 있을 것이다.
본 발명은 아고니스트 항CD40 항체 또는 그의 단편, 및/또는 아고니스트 항4-1BB 항체 또는 그의 단편을 포함하는 종양 또는 감염성 질환의 치료용 조성물 및 치료방법을 제공한다. 본 발명의 조성물은 클래스 1 MHC 또는 클래스 II MHC-제한 T 세포 에피토프를 갖거나 코딩하는 폴리펩타이드 또는 핵산 서열을 추가로 포함할 수도 있다.
도 1: E1B-특이적 CTL의 교차-프라이밍은 CD4
+
T 헬퍼 세포를 필요로 한다
정상적인 마우스(a) 또는 Ad5E1-BALB/c MEC로 면역된 CD4-고갈된 B6 마우스(b)로부터의 비장세포를, 인간의 아데노바이러스로부터 유도되어 서열 VNIRNCCYI(SEQ ID NO:1)을 갖는 E1B192-200펩타이드(직선) 또는 Dd-제한 콘트롤 펩타이드 HPV-16E749-57(점선)이 로딩된 동계(syngeneic) MEC 표적 세포의 용해(lysis)를 위해 다양한 이펙터/표적 비율로 시험하였다. 각각의 선은 마우스 한마리를 나타낸다. 데이터는 유사한 결과에 대해 3회 수행된 한가지 실험을 나타내고 있다.
도 2: CD40 활성화는 CD4
+
T 헬퍼 세포를 대체한다
CD4-고갈 마우스(a,b) 또는 클래스 II-결핍 I-Ab-녹아웃 (KO) (c,d) B6 마우스로부터의 비장세포를, Ad5E1-BALB/c MEC로 면역화시키고 CD40-활성화 항체(Ab)FGK45(a,c)나 또는 이소타잎 콘트롤 항체(b,d)로 처리하였다. 이 비장세포들을 E1B192-200펩타이드(직선)나 또는 HPV-16E749-57콘트롤 펩타이드(점선)이 로딩된 동계(syngeneic) MEC 표적 세포의 E1B-특이적 CTL 활성에 대해 시험하였다. 각각의 선은 마우스 한마리를 나타낸다. 도시된 데이터는 2회의 독립적인 실험결과를 나타낸다. E/T 비율, 이펙터/표적 비율.
도 3: B 세포는 교차-프라이밍의 항CD40-매개성 복구나 교차-프라이밍 APC
로서 필수적인 것은 아니다
Ad5E1-BALB/c MEC로 면역화되어 이소타잎 콘트롤 항체(b)나 또는 CD40-활성화 항체 FGK45(c)를 투여받은 CD4-고갈 B 세포-결핍 B6MT 세포(b,c)나 또는 미반응 마우스(a)로부터 비장세포를 채취하였다. 이 비장세포들을 E1B192-200펩타이드(직선)나 또는 HPV-16E749-57콘트롤 펩타이드(점선)이 로딩된 동계(syngeneic) MEC 표적 세포의 E1B-특이적 CTL 활성에 대해 시험하였다. 각각의 선은 마우스 한마리를 나타낸다. 도시된 데이터는 유사한 결과를 갖는 2회 수행된 하나의 실험을 나타낸다.
도 4: CD40L 차단은 E1B-특이적 CTLs의 교차-프라이밍을 방지한다
Ad5E1-BALB/c MEC로 면역화시키고 CD40L-차단 항체 MR-1(a) 또는 콘트롤 항체(b)로 처리한 B6 마우스 또는 면역화시킨지 24시간 후에 CD40L-차단 항체 MR-1과 CD40-활성화 항체 FGK45(c)를 병합 처리(c)한 마우스로부터 비장세포를 채취하였다. 이 비장세포들을 E1B192-200펩타이드(직선)나 또는 HPV-16E749-57콘트롤 펩타이드(점선)이 로딩된 동계(syngeneic) MEC 표적 세포의 E1B-특이적 CTL 활성에 대해 시험하였다. 각각의 선은 마우스 한마리를 나타낸다. 도시된 데이터는 유사한 결과를 갖는 3회 수행된 하나의 실험을 나타낸다. E/T 비율, 이펙터/표적 비율.
도 5: E1A-펩타이드가 피하주사된 마우스는 더 이상 E1A-특이적 CTL을
마운트하지 못한다
IFA 중 콘트롤-펩타이드(c,d) 또는 E1A-펩타이드(a,b) 20 μg으로 C57BL/6 마우스를 2회(1주일 간격) 피하주사하고, 1일 후 E1A-펩타이드를 대량 발현하는 세포주인 SAMB7(b,d)로 복강경로로 챌린지시켰다. 이 마우스들로부터 유래한 벌크 배양체를 E1A-펩타이드(-■-) 또는 HPV16E7-펩타이드(-○-)로 펄스시킨 표적 세포상에서 E1A-특이적인 세포독성에 대해 시험하였다. 여러가지 이펙터 대 표적 (E/T) 비율에서의 대표적인 벌크 배양체의 특이적 용해결과를 도시하였다. 이 실험을 4회반복하여 필적할만한 결과를 얻었다.
도 6: 톨레라이징 E1A-펩타이드는 IFA 피하주사 후 급속히 전신적으로 분포
된다
미처리 C57BL/6 마우스(-) 또는 IFA 중 E1A- 또는 HPV16E7-펩타이드 100μg으로 16시간 먼저 피하주사된 마우스로부터의 비장 세포들을 E1A-특이적 CTL 클론의 자극자 세포로서 이용하였다. 배경값을 빼지 않고, 자극자 농도에 대한 상이한 이펙터에 대한 [3H]-티미딘 인코포레이션(cpm)+/- S.E.M.을 도시하였다. 실험 결과는 5회의 독립적 실험 결과를 나타내는 것이다.
도 7: CTL-내성(tolerance) 유도는 생체내에서 CD40-격발 후에 CTL-
프라이밍으로 복귀된다
야생형 C57BL/6 마우스(a,b)와 H-2bCD40-/-마우스(c,d)에게 20μg의 E1-A 펩타이드를 IFA 단독(c), 래트 IgG2a 컨트롤 항체와 함께(a), 또는 항CD40 mAb FGK-45(b,d)와 함께 피하주사하였다. 이들 마우스로부터의 벌크 배양체를 E1A-펩타이드(-■-), HPV16E7-펩타이드(-○-) 또는 Ad5E1 형질전환 종양세포(-◆-)로 펄스시킨 표적 세포상의 E1A-특이적 세포독성에 대해 시험하였다. 상이한 E/T 비율에서의 대표적인 벌크 배양체의 특이적 용해를 도시하였다. 이 실험을 각각 18회(B6 마우스) 및 2회(CD40-/-마우스) 반복하자 필적할만한 결과가 얻어졌다. E/T 비율 60에서 E1A-펩타이드를 IFA 단독(좌측) 중에서 또는 항CD40 mAb(우측)와의 배합물 중에서 주사시킨 B6 마우스로부터 유도된 37 벌크 CTL 배양체와 23 배양체 각각의 %특이적 용해를 (e)에 도시하였다. 각 그룹의 평균 플러스 표준편차를 도시하였다(E1A 대 E1A+항CD40: p<0.01, 스튜던트 t-테스트).
도 8: 펩타이드와 생체내 CD40 격발과의 병합 치료에 의한 HPV16E6
및 E7 형질전환 세포의 치료
25.000 HPV16 형질전환된 동계 세포 (TC-1)로 마우스를 피하주사하였다. C57BL/6 마우스를 미처리로 방치하던가(-○-), 6일 후 IVA 중의 100μg의 HPV16 E7-펩타이드로 복강주사 하던가 (-□-), 항CD40 mAb FGK-34와 복합적으로 IFA 중에서 100μg의 HPV16E7-펩타이드로 복강주사 (-■-)하던가 또는 항CD40 mAb FGK-45와 복합적으로 IFA 중에서 콘트롤 펩타이드로 복강주사 (-●-)하였다. (a)에 종양 산생 마우스의 백분율을 여러가지 치료그룹 (n=10)에 대해 측정하여 나타내었다. HPV16-펩타이드 플러스 항CD40 mAb으로 처리된 그룹과 다른 세가지 그룹간의 차이는 통계적으로 유의적이었다 (p<0.01) (Log-Rank 테스트). 생존 동물의 백분율을 (b)에 도시하였다(E7-펩타이드 치료 그룹 대 E7-펩타이드 플러스 항CD40-처리 그룹: p = 0.002, Log-Rank 테스트).
도 9: 4-1BB를 통한 생체내 격발은 T 세포 보조 부재하에서 Ad5-특이적
CTL의 프라이밍을 복구한다
CD4+T 세포가 고갈되지 않거나(a) 고갈된 (b,c,d) B6 마우스를 콘트롤 Ab(b), 항CD40 Ab(c) 또는 항4-1BB Ab(d)의 전신 투여와 함께 복합적으로 107TAP k.o. Ad5E1MEC 피하주사에 의해 백신접종하였다. 별도의 실험에서 정상적인 B6 마우스에게 IFA 중 20μg의 E1A 펩타이드를 콘트롤 Ab(e), 항CD40(f) 또는 항4-1BB Ab(g)의 전신 투여와 함께 복합적으로 접종하였다. 면역화 마우스용 비장세포를 생체외에서 6일 동안 재자극시킨 다음 E1B-펩타이드(판넬 a-d) 또는 E1A-펩타이드(판넬 e-g) (■), HPV16E7-펩타이드(□) 또는 Ad5E1MEC(회색○)가 로딩된 표적 세포상에서의 항원-특이적 세포독성에 대해 시험하였다. 펩타이드 백신 및 종양 세포에 의한 Ad5-특이적 CTL의 프라이밍에 미치는 4-1BB Ab의 자극 효과를 3가지 별도 실험에서 각각 재생 관찰하였다.
도 10: 항4-1BB Ab의 전신 투여는 생체내에서 DC 활성화를 유도하지 않는다
a: 100μg의 콘트롤 Ab(흐린 회색 히스토그램), 항CD40 Ab(짙은 회색, 좌측 판넬) 또는 항4-1BB Ab(짙은 회색, 우측 판넬)로 B6 마우스를 2회 주사하였다. 3일 후 비장 세포를 분리하여 항CD11c 및 항CD86으로 염색하였다. 비장에서 CD11c+세포 상의 CD86 발현도를 도시하였다. b: B6 골수를 분리해서 생체외에서 GM-CSF-함유 배지에서 7일간 배양하였다. 제7일에, 10μg/ml PolyI:C를 첨가함으로써 세포들을 활성화시키거나 또는 미처리한채 방치하였다. 48시간 후 세포들을 4-1BB 발현(흑색선) 또는 콘트롤 Ab(색칠된 흐린 회색)으로 염색하였다. PolyI:C-처리된 BMDC의 활성화는 CD86 발현을 측정함으로써 확인하였다(도시하지 않음).
도 11: 4-1BB를 통한 공동자극은 항원-의존성이며 항원-특이적 T 세포의
생존을 증가시키는 결과를 낳는다
a: 생체외에서 CFSE가 표지된 Ad5E1A-특이적 TCR 트랜스제닉 CD8+T 세포 5x 106개를 B6 마우스에게 주사하였다. 3일 후 이 마우스들에게 E1A 펩타이드 백신과 Ab를 도면에 도시된 바와 같이 복합 투여하였다. 펩타이드 백신화는 IFA 중 1회의 20μg 투여량을 피하주사한 반면, Ab의 100ug 투여량을 펩타이드 백신화 후 3일 연속해서 복강주사하였다. 펩타이드를 주사한지 3일째에, 비장 세포를 분리하여 CD8+/CFSE+T 세포의 존재여부를 FACS에 의해 분석하였다. 히스토그램은 CD8+T 세포의 CFSE 강도를 보여준다. b: B6 Thy1.1 마우스에게 B6Thy 1.2 기원의 5 x 106개의 E1A-펩타이드 특이적인 TCR 트랜스제닉 CD8+T 세포를 주사하였다. 3일 후에 이들 마우스에게 E1A 펩타이드 백신과 Ab를 도면에 도시된 바와 같이 복합 투여하였다 (투여량과 투여시기는 상기한 바와 같음). 펩타이드 백신을 주사한지 11후에, 혈액 샘플을 채취해서 CD8+/Thy1.2+T 세포(E1A-펩타이드 특이적인 TCR 트랜스제닉 기원의)의 존재여부를 검사하였다.
도 12: 4-1BBL은 활성화된 DC 상에서 업조절된다. B6 골수를 분리해서 GM
-CSF-함유 배지에서 7일간 생체배양한다
제7일에 세포들을 미처리 방치하거나(a) 10μg/ml Poly I:C로 활성화시키거나(b) 또는 2μg/ml 쥐의 CD40L-트라이머(c)로 활성화시켰다. 48시간 후, 세포들을 콘트롤 Ab(흑색선)이나 또는 항4-1BBL Ab(색칠된 회색선)와 복합적으로 CD11ㅊ 에 대해 염색하였다. 히스토그램은 CD11c+세포 파퓰레이션을 나타낸다.
도 13: CD18과 4-1BB는 두가지 모두 종양-특이적 CTL의 교차 프라이밍에
기여한다
도면에 도시된 바와 같이, B6 마우스를 미처리 방치하거나 차단 항4-1BBL Ab, 이소타잎 콘트롤 Ab 및/또는 CTLA4-Ig와 복합적으로 107Ad5E1-형질전환된 종양 세포로 피하주사에 의해 면역화시켰다. 면역화한지 10일 후에 비장 세포를 분리해서 5일간 생체외에서 재자극시켰다. E1B-코딩된 CTL 에피토프 1μg/ml로 밤새 자극한 후 항CD8 항체와 항INFγ Ab를 이용한 이중 염색에 의해 항원-특이적인 CTL의 존재여부에 대해 벌크 배양체를 시험하였다. 도시된 데이터는 3회의 독립적인 실험의 평균값이다. 에러 막대는 S.E.M.값을 나타낸다.
도 14: CD28 시그널링을 통한 공동자극은 항4-1BB Ab 처리 효능의
선결요건이다
CD4+세포가 고갈되지 않거나(a) 고갈된(b-d) B6 마우스를 콘트롤 Ab(b), 항4-1BB Ab(c) 또는 CTLA4-1Ib와 배합된 항4-1BB(d)와 복합적으로 107Ad5E1MEC로 피하주사하여 백신화시켰다. 백신처리한지 10일 후 비장세포들을 수확해서 7일간 생체내에서 재자극시켰다. E1B-펩타이드(■), HPV16E7-펩타이드(□) 또는 Ad5E1-형질전환된 종양세포(회색○)가 로딩된 표적 세포에 대한 E1B-특이적 세포독성에 대해 벌크 배양체를 시험하였다. (e) 이펙터 대 표적 비율 60:1로 E1B-펩타이드 로딩된 표적 세포에 대한 이들 벌크 배양체의 평균 용해도를 도시하였다. 에러 막대는 6마리의 마우스에 대해 2회의 독립적인 실험으로부터 얻어진 S.E.M. 값이다.
도 15: CD28 공동자극은 TCR-격발된 T 세포상에 미치는 4-1BB 발현
유도를 촉진한다
플레이트-결합된 항CD3 Ab 및/또는 플레이트-결합된 항CD28 Ab (5μg/ml)의 표시량 존재 하에서 B6 비장 세포를 배양하였다. 24시간 후 4-1BB의 발현여부에 대해 CD8+T 세포를 분석하였다.
도 16: 4-1BB 시그널화는 E1A-특이적인 CTL의 생체내 유도에 있어서 CD40
시그널과 상승적으로 작용한다
100 마이크로그램의 항CD40 Ab FGK-45, 항4-1BB Ab 3H3, 또는 이들 둘의 배합물을 PBS 중에서 복강주사하고 E1A-펩타이드를 피하주사함으로써 C57BL/6 마우스를 백신화시켰다. 10일 후에 비장 세포를 분리해서 CD8-APC 및 Db-E1A 테트라머로 염색함으로써 E1A-특이적 CTL의 존재여부를 분석하였다. 비장 중의 CD8+T 세포의 절대적인 숫자(상부 판넬)과 이 CD8+파퓰레이션에서의 E1A-특이적 CTL의 백분율 (하부 판넬)을 도시하였다.
도 17: 생체내에서의 CD40-라이게이션은 수립된 종양의 제거를 초래한다
마우스에게 Ad5E1A-발현 종양 세포들을 주사하였다. 쉽게 알 수 있을 정도로 마우스의 종양이 커졌을 때, 마우스를 미처리 방치하거나 (색칠된 원) CD40-활성화 항체로 정맥주사하였다(빈원). 종양 크기가 1 cm3를 초과하면 불필요한 고통을 피하기 위해서 마우스를 희생시켰다.
도 18: 생체내 CD40-활성화는 종양-특이적 CTL의 전신적인 확산을 초래한다
마우스에게 Ad5E1A-발현 종양 세포를 주사하였다. 쉽게 알 수 있을 정도로 마우스의 종양이 커졌을 때, 이들을 미처리 방치하거나 항CD40 mAb로 처리하였다. 항CD40을 주사한지 10일 후, 마우스를 희생시켜 혈액, 비장 및 림프절에 대해 FACS-분석을 수행하였다. 30%가 넘는 미처리 마우스(n=23)에서, 종양 드레이닝 림프절만에서(A) E1A-특이적 CTL이 검출된 반면, 이 그룹의 다른 동물에서는 E1A-특이적 CTL이 전혀 관찰되지 않았다 (도시하지 않음). 이와 대조적으로, E1A-특이적 CTL은 항CD40 mAb(n=29; B)로 처리된 종양-산생 마우스에서는 쉽게 검출되었다. C: 혈액 중 총 CD8+ T 세포 풀의 백분율로서 E1A-특이적 CD8+ T 세포의 수를 나타내었다 (평균값 + SEM). 4회의 실험중 대표적인 하나를 도시하였다. *Students's T-테스트: p < 0.01
도 19: E1A-유도된 CTL-에피토프의 존재는 종양-드레이닝 림프절에서만
감지된다
4*106CFSE-표지된 E1A-특이적 트랜스제닉 T-세포를 Ad5E1A-발현 종양을 산생하는 마우스에게 정맥주사하였다. 7일 후에 비장, 종양-드레이닝 림프절 및 비드레이닝 림프절을 채취해서 FACS에 의해 E1A-특이적 CTL의 분할에 대해 분석하였다. 종양-드레이닝 림프절(검은색 부분)과 비장 (회색 부분)으로부터 얻어진 결과를 도시하였다. 이것은 12마리 마우스를 대표한 것이다. 이 결과는 항CD40-처리된 마우스 및 미처리 마우스와 필적하였다.
도 20: 생체내 CD40-격발은 Ad5E1A-특이적 CTL의 종양 침윤
(infiltration)을 초래한다
마우스에게 Ad5E1A-발현 종양 세포들을 주입하였다. 쉽게 알 수 있을 정도로 종양이 커지면 마우스를 미처리 방치하거나 또는 CD40-활성화 항체를 정맥주사하였다. 그로부터 5일 후, 마우스를 희생시키고, FACS-분석법에 의해 E1A-특이적인 CTL의 종양 침윤을 측정하였다. 우상부의 숫자는 CD8+세포의 전체 풀의 TM-양성 세포의 백분율을 나타낸다.
도 21: 국소적인 CD40-활성화는 전신적인 항종양 면역을 일으킨다
마우스의 양 옆구리에 Ad5E1A-발현 종양 세포를 주사하였다. 양 옆구리에 알 수 있을 정도로 종앙이 커진 후 항CD40 또는 콘트롤로서 PBS를 종양 중 하나에 종양내(intra-tumoral)로 주입하였다. A) 처리한지 10일 후에 혈액을 채취해서 Ad5E1A-특이적 CTL의 존재여부를 FACS로 분석하였다. 결과는 전체 CD8-풀의 백분율로서 E1A-특이적 CD8+T 세포의 수를 나타낸다 (평균 + SEM, n=7). *student's T-테스트: p < 0.05; ** student's T-테스트 p > 0.01: 종양내 주사와 정맥 주사한 항CD40 치료사이에는 아무런 유의적인 차이가 없었다. B) 처리된 옆구리에서의 종양산생 마우스의 백분율. p < 0.01 C) 처리되지 않은 옆구리에서의 종양 산생 마우스의 백분율. p = 0.05.
도 22: 생체내 CD40-라이게이션 후 종양을 제거하는데 있어서 CD8
+
T-세포는
필수불가결하지만 CD4
+
T-세포는 그렇지 않다
Ad5E1A-발현 종양 세포를 마우스에게 주사하였다. 종양이 마우스에서 쉽게 인식될 정도로 커졌을 때 처리를 개시하였다. 마우스에게 아무런 처리도 하지 않거나, 항CD40 mAb-처리하거나 또는 항CD40 mAb와 CD8- 또는 CD4- 고갈 Ab를 처리하기도 하였다. 종양 크기가 1cm3을 넘었을 때 불필요한 고통을 피하기 위해 마우스를 희생시켰다.
도 23: Ad5E1A-발현 종양은 CD40을 발현하지 않는다
PE-표지된 항CD40-항체(흑색선) 또는 이소타잎 콘트롤 항체(회색 부분)으로 염색도니 세포를 이용해서 FACS-분석을 수행하였다. LPS-활성화 수지상 돌기 세포를 양성 콘트롤 (점선)로서 이용하였다.
본 발명의 CD40 및 41-BB 결합 분자를 통상적인 제조방법 및 스크리닝 기술에 의해 제조할 수 있다. 래트 및 햄스터의 항마우스 CD40 모노클로날 항체("MAbs")는 각각Nature393:474-77(1998)에 설명된 것으로서 시판되느 ㄴ것이다(Pharmingen, Inc., CA). 후술되는 실험에서 사용된 FGK45로 명명된 항마우스 CD40 mAb는 Rolink. A. 등의Immunity5, 319-330 (1996)에서 설명된 것이다. 아고니스트 항4-1BB 항체는 Hurtado 등(1997) 및 Shurford 등(1997)에 설명된 것이다. 항인간 CD40 MAbs및 항인간 4-1BB MAb는 기술분야에 공지된 기술에 따라 G. Kohler 및 C. Milstein (Nature, 1975:256 495-497)에 설명된 방법으로 제조될 수 있다. MAb는 세포에 발현되거나 인간의 혈장 또는 소변으로부터 정제된 천연 CD40 또는 진핵 세포계 또는 원핵세포계에서 발현되는 4-1BB 또는 재조합 CD40 또는 4-1BB 또는 그의 단편으로 설치류(예컨대 마우스, 래트, 햄스터 및 기니픽)을 면역시킴으로써 발생시킬 수 있다. 면역화에는 다른 동물들, 예컨대 비인간 영장류, 인간의 면역글로불린을 발현하는 트랜스제닉 마우스 및 인간의 B 임파구가 이식된 중증복합면역결핍(SCID: severe combined immunodeficient) 마우스를 이용할 수도 있다. G. Kohler 및 C. Milstein (상기문헌)의 방법에 따라서, 면역화된 동물로부터의 B 임파구를 골수종 세포 (예컨대 Sp2/0 및 NS0)와 융합시킴으로써 상법에 따라 하이브리도마를 만들수 있다. 뿐만 아니라, 파지-디스플레이 시스템에서 인간의 B 임파구로부터 재조합 단일사슬 Fv 또는 Fab 라이브러리를 스크리닝함으로써 항CD40 및 항4-1BB MAb를 만들 수 있다. 4-1BB 또는 CD40에 대한 MAb의 특이성을 효소결합 면역흡수 분석법(ELISA), Western 면역블로팅 또는 기타 면역화학적 기술에 의해 시험하였다. CTL-활성화 펩타이드와 병합된 CTL에 대한 항체의 활성화 활성을 하기 실시예에 설명된 분석법을 이용하여 평가할 수 있다.
인간을 치료하는데 있어서, 항CD40 및/또는 항4-1BB MAb는 키메라, 탈면역화(deimmunised), 인간화 또는 인간 항체로서 바람직하게 이용될 것이다. 이러한 항체는 면역원성을 감소시킬 수 있기 때문에 인간의 항마우스 항체(HAMA) 응답을 회피할 수 있다. 항체는 IgG4, IgG2 또는 항체-의존성 세포성 세포독성 (S.M. Canfield 및 S.L. Morrison,J. Exp. Med., 1991:173:1483-1491) 및 상보적으로 배개된 세포용해(Y.Xu 외,J. Biol. Chem., 1994:269:3468-3474; V.L. Pulito 외,J. Immunol., 1996: 156: 2840-2850)을 개시하지 않는 기타의 유전적으로 돌연변이된 IgG나 IgM인 것이 바람직하다.
키메라 항체는 기술분야에 잘 알려진 재조합 공정에 의해 생산되며 동물 가변 대역과 인간 불변 대역을 갖는다. 인간화된 항체는 키메라 항체에 비해 더 높은 정도로 인간 펩타이드 서열을 갖는다. 인간화된 항체에서는 항원 결합 및 특이성에 책임이 있는 상보성 결정대역(CDR:complementarity determining regions)만이 동물로부터 유래된 것이고 그 동물 항체에 대응하는 아미노산 서열을 가지며 실질적으로 그 분자의 나머지 잔부 대역(몇몇 경우 가변 대역 중 프레임워크 대역의 적은 부분을 제외하고)은 인간을부터 유래한 것으로서 인간 항체의 아미노산 서열에 대응한다. L. Riechmann 외,Nature, 1988: 332:323-327; G. Winter, 미국특허제5,225,539호; C. Queen 외, 미국특허 제5,530,101호 참조.
탈면역 항체(deimmunised antibodies)란 국제특허출원 제PCT/GB98/01473에 설명된 바와 같이 T 및 B 세포 에피토프가 제거된 항체를 말한다. 이들은 생체내 적용시 감소된 면역원성을 갖는다.
인간 항체는 여러가지 방법으로 만들어질 수 있는데, 예컨대 인간 면역글로불린 발현 라이브러리 (Stratagene Corp., La Jolla, California)를 이용함으로써 인간 항체의 단편 (VH, VL, Fv, Fd, Fab, 또는 (Fab')2)을 만든다거나, 이러한 단편을 이용하여 키메라 항체를 제조하는 것과 유사한 기술에 의해 인간 항체 전체를 만들 수 있다. 인간 항체는 또한 인간의 면역글로불린 게놈을 이용하여 느랜스제닉 마우스에서도 제조될 수 있다. 이러한 마우스는 Abgenix, Inc., Fremont, California 및 Medarex, Inc., Annandale, New Jersey로부터 입수가능하다.
헤비 체인과 라이트 체인 Fv 대역이 연결되어 있는 단일 펩타이드 체인 결합 분자도 만들어낼 수 있다. 단일 체인 항체("ScFv") 및 그의 제조방법은 미국특허 제4,946,778호에 설명되어 있다. 또는, Fab를 만들어서 유사한 수단에 의해 발현시킬 수도 있다(M.J. Evans 외,J. Immunol. Meth., 1995;184: 123-138). 전체 및 부분 인간 항체 모두 전체적인 쥐의 Mab에 비해 덜 면역원성이며 단편과 단일 체인 항체 역시 면역원성이 더 낮다. 이러한 모든 유형의 항체들은 따라서 면역성 또는 알레르기성 반응을 덜 일으킬 것이다. 결론적으로, 이들은 전체 동물 항체에 비해 인간에서 생체외 투여될 경우, 특히 반복 투여나 장기간 투여가 필요한 경우 더 적합하다. 이에 더해서, 항체 단편의 크기가 작을수록 조직 생체적합성을 증강시키는데 더 유리한데, 이것은 종양 치료와 같은 급성 질병 치료시 보다 우수한 투여량 축적을 위해 중요할 수 있다.
항CD40 및/또는 항4-1BB mAb 또는 공지의 CTL-활성화 펩타이드의 가변 대역의 분자 구조에 기초해서, 각각 항체나 펩타이드의 결합 대역의 분자 구조를 모방해서 CTL을 활성화시키는 분자들을 생산 및 스크린하기 위해 분자 모델링 및 합리적인 분자 설계를 할 수 있다. 이러한 소형 분자들은 펩타이드, 펩티도미메틱, 올리고뉴클레오타이드 또는 기타 유기 화합물일 수 있다. 모방 분자들은 암 및 감염을 치료하는데 이용가능하다. 또 다른 한편, 화합물의 라이브러리로부터 적절한 분자를 분리하기 위해 이 분야에서 흔히 사용되는 대규모 스크리닝 공정을 이용할 수도 있다.
따라서 한가지 측면에서 본 발명은 4-1BB 수용체를 자극하는 아고니스트 항4-1BB 항체 또는 그의 단편을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는 이 조성물이 CD40 수용체를 자극하는 아고니스트 항CD40 항체나 그의 단편을 함유하는 것이 좋다.
또 다른 측면에서 본 발명은 (a) 4-1BB 수용체를 자극하는 아고니스트 항4-1BB 항체, 또는 그의 단편, (b) CD40 수용체를 자극하는 아고니스트 항CD40 항체 또는 그의 단편, (c) 또는 두가지를 함유하고, 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC-제한 T 세포 에피토프를 갖거나 코딩하는 핵산 서열, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 바이러스 중에서 선택된 1종 이상의 분자를 추가로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
적절한 클래스 I MHC 및/또는 클래스 II MHC-제한 T 세포 에피토프를 선택 및 생산하는 방법은 예컨대 WO07/41440 및 WO02/070006에 설명되어 있다. 바람직하게는 적절한 클래스 I MHC 및/또는 클래스 II MHC-제한 T 세포 에피토프는 펩타이드이다. 바람직하게는 펩타이드가 적어도 8개의 아미노산, 더욱 바람직하게는 적어도 22개의 아미노산을 갖는 것이 좋다. 바람직한 펩타이드는 8-10, 더욱 바람직하게는 22-45개의 아미노산 길이를 갖는다.
또 다른 측면에서 본 발명은 어떤 항원에 대한 전신적인 T 세포 면역성 유발용 의약품을 제조하는데 있어서의 (a) 4-1BB 수용체를 자극하는 아고니스트 항4-1BB 항체, 또는 그의 단편, (b) CD40 수용체를 자극하는 아고니스트 항CD40 항체 또는 그의 단편, (c) 또는 두가지 모두의 용도에 관한 것이다. 이 의약품은 추가로 어떤 항원에 대한 전신적인 T 세포 면역성 유발용 의약품을 제조하는데 있어서 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC-제한 T 세포 에피토프를 갖거나 코딩하는 핵산 서열, 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 또는 바이러스 중에서 선택된 1종 이상의 분자를 추가로 함유할 수 있다. 항원은 바람직하게는 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC-제한 T 세포 에피토프인 것이 좋다. 항원은 종양 또는 종양세포의 항원인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 항원이 종양-특이 항원인 것이 좋다. 다른 한편, 항원은 감염성 제제의 항원일 수 있다. 바람직한 항원은 HPV 항원이고, 더욱 바람직하게는 HPV 항원이 서열 RAHYNIVTF(SEQ ID NO: 3)을 갖는 것이 좋다. 또 다른 측면에서 본 발명은 전신성 T 세포 면역성 유발에 의한 종양이나 감염성 물질의 치료(그에 의해 치료가 종양이나 감염성 물질의 항원에 의한 면역화(예컨대 백신화)를 포함하지 않는)를 위한 의약을 제조하는데 있어서의 CD40 수용체를 자극하는 아고니스트 항CD40 항체 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 분자의 투여량은 생체외 테스트 및 후술하는 분석으로부터의 외삽법 또는 동물 실험이나 인간에 대한 임상 시도에 의해 쉽게 측정가능하다. 비록 어떤 작은 분자는 경구 투여에 적합하기도 하겠지만, 본 발명의 분자는 항체 또는 단백질의 경우에는 주사 투여가 바람직하다. 본 발명의 효능을 입증할 분석법이나 테스트에 관해 이하에 후술한다.
실시예 1: CD40을 통한 시그널링은 CTL 프라이밍에 있어서 CD4
+
헬퍼 T 세포
를 대체할 수 있다
생체내에서 CD8+ CTL 응답의 일차 활성화를 위한 T-세포 보조의 메카니즘을 프로브하기 위한 잘 특징화된 모델계를 사용하였다. 인간의 아데노바이러스 타잎 5 조기 대역 1(Ad5EI-BALB/c MECs)를 발현하는 동종(allogenic) BALB/c(H-2d) 마우스 배아 세포 (MECs: mouse embryo cells)에 의해 면역화된 C57BL/6(주요 조직적합성 복합체(MHC) H-2b) 마우스는 아데노바이러스 EIB 단백질(EIB192-200)의 H-2Db-제한 에피토프에 대해 강력한 CTL 응답을 발생시켰다 (도 1a). Ad5EI-BALC/c MECs에 의해 발현된 동종 H-2dMHC 분자는 H-2b-제한된 숙주 CTLs을 프라임하지 못하기 때문에, E1B-특이적인 CTLs의 발생은 교차-프라이밍, 즉, 숙주 APCs에 의한 항원의 업테이크 및 H-2b-제한된 재제시(re-presentation)를 필요로 함에 분명하다. EIB-특이적 CTLs의 교차-프라이밍은 면역화전의 CD4+ T-헬퍼 (Th) 세포가 고갈된 마우스가 E1B-특이적 CTL 응답을 더 이상 마운트하지 않았기 때문에 엄격하게 헬퍼-의존성이다(도 1b).
CD40을 통한 시그널링이 CTL 프라이밍에 있어서 CD4+헬퍼 T 세포를 대체할 수 있는지를 조사하기 위해, Ad5E1BALB/c MECs를 이용하여 면역화시키기 전에 생체내에서 마우스로부터 CD4+T 세포를 고갈시켰다. 면역화시킨지 하루 후, 마우스에게 활성화 항체인 항마우스 CD40 mAb FGK45 또는 이소타잎-맷치된 콘트롤 항체를 일회 주사하였다. CD4-고갈된 면역화 마우스에게 FGK45를 투여하자 E1B-특이적 CTL 응답은 효과적으로 복구된 반면 (도 2a) 콘트롤 항체에 의한 치료의 경우에는 그렇지 않았다 (도 2b). E1B-특이적인 CTL의 프라이밍은 FGK45 단독으로 처리된 나이브 마우스에서는 감지되지 않았다 (도시하지 않음). FGK45의 효과가 항CD4 항체 처리에 의해 고갈되지 않은 나머지 D4=세포를 통해 매개되는지를 알아보기 위해, 성숙한 기능성 CD4+말초 T 세포가 결여된 B6 I-Ab녹아웃 마우스를 Ad4EI-BALB/c MEC로 면역화시켰다. 이들 마우스에 있어서의 면역화에 대한 응답은, 콘트롤 항체가 투여된 마우스(도 2d)에서가 아니라, E1B-특이적 CTL이 CD40-활성화 항체가 투여된 마우스에서만 감지되었다는 점에서 (도 2c) CD4-고갈된 마우스에서 보여진 것을 반영하는 것이다.
CD4-고갈된 마우스에서의 CTL의 프라이밍에 있어서 항CD40 항체의 필요성이 전염증성 시토카인의 강력한 인듀서인 세균의 리포폴리사카라이드(LPS)에 의해 대체될 수 있는지, 또는 Ad5EI-BALB/c MEC에 의한 면역화에 이은 IL-2 (불완전 프로인트 보조제 중 1 x 105유닛, 피하)의 투여에 의해 대체될 수 있는지도 조사하였다. FGK45로 처리된 CD4-고갈 마우스는 강력한 E1B-특이적 CTL 활성을 나타낸 반면, LPS나 IL-2로 처리된 경우는 감지할만한 CTL 프라이밍을 결과시키지 않았다 ( 도시하지 않음).
B 세포 상의 CD40 라이게이션은 그들의 공동자극 활성을 업조절하는데, 이는, CD40 활성화 항체를 이용한 처리에 의한 CTL 프라이밍의 복구에 있어서 이들이 어떤 역할을 함을 시사하는 것이다. 이 의문점을 해소하기 위해, 성숙한 B 세포가 결핍된 B6□MT 마우스를 동종 Ad5EI-BALB/c MEC로 면역화시켰다. E1B-특이적 CTL의 교차-프라이밍은 성숙한 B 세포를 요구하지 않았다 (도 3a). 그러나, CD4+세포가 고갈되자, B-세포 결핍 마우스는 E1B-특이적 CTL 응답을 일으키지 않았다 (도 3b). FGK45 모노클로날 항체에 의한 CD40을 통한 활성화는 E1B-특이적 CTLs를 프라임하는 CD4-고갈 □MT 마우스의 능력을 완전히 회복시켰다 (도 3c). 따라서, B 세포는이 모델계에서 교차-프라이밍을 위한 APC나 악세서리 세포들을 필요로 하지 않으며 CD4+T 세포 부재시 CTL의 교차 프라이밍을 위한 CD40-매개성 복구를 필요로 하지도 않는다. 이러한 결과는 CD40을 통한 골수 유도성 APC의 활성화가 E1B-특이적 CTL의 교차-프라이밍에 있어서 CD4+T 헬퍼 세포에 대한 요구성을 우회시킬 수 있음을 입증하는 것이다.
실시예 2: CD40L-CD40 경로를 통해 APC와 상호반응하는 CD4
+
헬퍼 T 세포의
능력 차단은 정상적인 마우스에 있어서 항원-특이적인 CTL 응답을 방지한다
CD40L-CD40 상호반응이 CD4+헬퍼 T 세포에 의해 이용되는 생리학적 경로를 나타낸다면, CD40L-CD40 상호반응을 통해 APC와 상호반응하는 CD4+T 세포의 능력을 차단할 경우 정상적인 마우스에서 E1B-특이적 CTL 응답의 프라이밍이 감소될 것으로 예상된다. B6 마우스를 Ad5E1-BALB/c MEC로 면역화시킨 다음 CD40L-차단 항체 MR1 또는 콘트롤 항체로 처리하였다. CD40L의 차단은 콘트롤 항체를 투여받은 마우스에서 보여지는 효과적인 CTL 프라이밍 (도 4b)에 비해 현저하게 감소된 E1B-특이적인 CTL 응답 (도 4a)을 초래하였다. CD40L 차단에 의해 유도된 프라이밍 결핍은 FGK45에 의한 CD40 시그널링에 의해 완전히 복구되었다 (도 4c). 따라서, CD40L 차단에 의해 유도된 CTL-프라이밍의 결핍은 TH세포가 CD40L-매개성 시그널을 수용 하는데 실패해서라기보다는, 그 시그널을 전달하는데 실패한데 그 이유가 있다.
실시예 3: 펩타이드 투여 후의 E1A-특이적인 CTL 미응답성
앞서 설명한 모델계를 이용하였다 (Toes 외,J. Immunol.156:3911 (1996)). IFA 중 Ad5E1A-유도된 CTL 에피토프 SGPSNTPPEI (SEQ ID NO: 2)에 의한 피하 백신화에 의해 마우스에 있어서 Ad5E1A-발현 종양의 과도한 성장을 조절하지 못하게 된 것으로 나타났다. 이것은 E1A/IFA 백신이 E1A-특이적 CTL 면역성의 유도보다는 억압을 유도했음을 가리키는 것이다. 뿐만 아니라, E1A- xmrdlwjrdls ㅊ씨 클론의 TCR α 및 β 체인을 발현하는 T 세포 수용체 (TCR)-트랜스제닉 마우스에게 E1A/IFA 백신을 투여하자, 종양-특이적인 CTL-매개된 면역성이 강력하게 억제되었다. 이러한 실험은 모노클로날 CTL 파퓰레이션에 미치는 펩타이드의 투여 효과를 시험한 것이었다. E1A-펩타이드의 피하 백신화가 폴리클로날 CTL 수준에서 E1A-특이적인 CTL 내성도 유도하였는지를 알아보기 위해, 야생형(wt) C57BL/6 마우스에게 E1A-펩타이드 (도 5a 및 5b) 또는 콘트롤 펩타이드 (도 5c 및 5d)를 주사하였다. 하루 지난 후에, E1A-펩타이드를 그 표면에 고도로 발현시키는 동계 세포주를 이용하여 마우스를 부스트시켰다 (도 5b 및 도 5d). 콘트롤 펩타이드로 프라임된 마우스에게 이 세포주를 주사하여 E1A-특이적 면역성을 유도시킨다 (도 5d). 그러나, E1A-특이적인 CTL 응답을 마운트하는 마우스의 능력은 E1A/IFA 백신 주사 후에 저하되었다 (도 5b). 이러한 데이터는 E1A-펩타이드의 주입이 TCR-트랜스제닉 마우스에 있어 뿐만 아니라 폴리클로날 E1A-특이적인 T 세포 레퍼토리를 발현하는 마우스에 이어서도 E1A-특이적 내성을 유도함을 가리키는 것이다.
E1A/IFA 백신을 피하주사하면 전신적인 CTL 내성이 초래되기 때문에, E1A-펩타이드가 전신적으로 분산되는지 말초적으로 CTL 전구체에 제시되는지를 조사하였다. 이에 따라서, 마우스에게 E1A-펩타이드 또는 IFA 중에 유화시킨 인간 파필로마 바이러스(HPV) 16 E7-유도된 콘트롤 펩타이드를 피하주사하였다. 이 마우스들로부터의 비장 세포를 16시간 후에 분리해서 생체외 E1A-특이적인 CTL 클론에 대한 자극자 세포로서 사용하였다. E1A-펩타이드가 피하 주사된 마우스로부터의 비장세포는 특이적인 증식을 유도한 반면, E7-펩타이드가 피하 주사된 마우스로부터의 비장세포는 그렇지 못했다 (도 6). 뿐만 아니라, 콘트롤 CTL 클론은 E1A-주사된 마우스로부터 유도된 비장 세포상에서 증식하지 않았다 (데이터 미제시). 따라서, 이러한 데이터는 IFA 중에서 피하주사된 E1A-펩타이드가 말초적으로, 특히 그 중에서도 비장세포에 의해 전신적으로 제시됨을 가리키는 것이다.
E1A-펩타이드 백신의 상기한 내성 효과에 비추어 볼 때 생체내 CD40-격발이 CTL의 말초적 내성을 예방하여 CTL 프라이밍을 복구하는데 충분한 것인지에 대한 의문이 있다. 따라서, 생체내 CD40 격발과 복합적인 톨레라이징 펩타이드의 주입이 종양-특이적 CTL 면역성을 초래하는 말초적 CTL 내성의 유도를 방지할 수 있는지를 조사하였다.
실시예 1 및 2에서, 생체내 CD40-격발은 헬퍼-의존성 CTL 응답을 프라이밍하는데 있어서 CD4+T 헬퍼 세포의 필요성을 대체시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. CD4+T 세포-매개성 헬퍼 활성은 말초적인 CTL 내성 유도의 방지에 연루되어 있기 때문에, 본 발명자들은 생체내 CD40-격발이 말초적 E1A-특이적 CTL 톨레라이제이션을 예방하는데 충분한지에 대한 의문을 검토하였다. 이 목적을 위해, 활성화 항-CD40mAb FGK-45와 함께 복합적으로 E1A/IFA 백신을 마우스에게 주사하였다. 이 복합체를 투여받은 마우스들은 강력한 E1A-특이적 CTL 응답을 마운트한 반면 (도 7b 및 7e), E1A/IFA 백신 (도 7) 또는 mAb 단독 (데이터 제시하지 않음)을 투여받은 마우스는 그렇지 못했다. E1A/IFA 백신과 항CD40 mAb의 복합사용은 CD40-결핍 마우스에 있어서 CTL를 유도하지 못했다 (도 7c 및 7d). 또한, E1A/IFA 백신을 이소타잎-맷치된 콘트롤 mAb(도 6a) 또는 IL-2와 함께 공동-주사시키자 E1A/IFA 백신에 의해 유도된 CTL 내성을 CTL 프라이밍으로 변환시키는데 실패하였다 (데이터 미제시). E1A-펩타이드 단독 또는 E1A-펩타이드 플러스 항CD40-백신화 동물에서의 E1A-에피토프에 대한 응답의 범위와 다양성을 도 7e에 도시하였다. 따라서, 전신적인 CD40 활성화는 펩타이드-유도된 말초 CTL 내성을 펩타이드 및 종양-특이적인 CTL 매개된 면역성으로 역전시킬 수 있다.
E1A-특이적인 면역성의 유도는 E1A-펩타이드를 함유하는 PE-컨쥬게이션된 H-2-Db-테트라머 (Db/E1A)로 염색된 백신화된 마우스의 비장 중의 CD8+T 세포의 존재와 밀접하게 관련되어 있다. 백신화 한지 10일 이내에, Db/E1A 테트라머에 의한 CD8+T 세포의 염색은 E1A-펩타이드와 항CD40 mAb가 주사된 마우스에 있어서는 플로우 시메트리에 의해 검출될 수 있었지만, E1A-펩타이드가 단독으로 주사된 마우스에 있어서는 검출되지 않았다 (데이터 미제시). E1A-펩타이드가 주사된 마우스에 있어서, Db/E1A 테트라머로 염색된 CD8+세포의 백분율은 약 3%였다. 강력한 E1A-특이적 면역성을 유도하는 전체 아데노바이러스에 의해 백신화된 마우스에 있어서는, Db/E1A 테트라머-반응성 CD8+비장 세포가 필적할만한 양으로 검출되었담. 이러한 결과는 항CD40 mAb와 복합적으로 E1A/IFA 백신이 투여된 마우스에 있어서 E1A-특이적인 CD8+T 세포의 팽창이 실질적이면서도 바이러스 백신화된 동물에서 발견되는 것에 맞먹는다는 것을 가리키는 것이다.
실시예 4: CD40-격발은 펩타이드-기재 항암 백신의 효능을 강력히 증강
시킨다
비록 상기한 발견은 CD40-격발을 통한 보조 제공이 톨레로겐성 펩타이드-백신 투여 후 CTL-톨레라이제이션을 방지하는데 충분함을 설명해주기는 했지만, 보통은 내성 대신 보호적 면역성을 유도하는 항암 백신의 효능이 CD40을 통한 활성화에 의해 증강될 수 있었는지에 대한 의문은 풀어주지 못한다. 생체내 CD40-격발이 HPV16E7-유도된 펩타이드를 이용한 백신화 결과에 이로운지를 시험하였다. 이 펩타이드에 의한 백신화는 HPV16-형질전환된 종양 세포에 의한 챌린제에 대해 보호적인 CTL-매개 면역성을 유도한다. 뿐만 아니라, 이 펩타이드는 생체외에서 활성화된 DC상에 로딩될 경우 치료적 세팅에 이용가능한데, 이는 이 항종양 응답의 강도가 활성화된 DC에 의해 제시될 경우 증강됨을 시사한다.
CD40-격발과 복합적으로 E7-펩타이드가 투여된 마우스는 E7-펩타이드 만으로 처리된 마우스에 비해 보다 강력한 CTL-응답을 마운트하였는데 (데이터 미제시), 이는, CD40-격발이 HPV16 E7-펩타이드 백신의 효능 역시 증강시킨 다는 것을 가리키는 것으로, 상기한 E1A 펩타이드에 대한 발견을 더 확인시켜주는 것이다. 또한, CD40-음성 HPV16 E6/E7 형질전환된 종양 세포를 피하주사한지 6일 후에 HPV16E7-펩타이드 단독 (색칠되지 않은 네모)으로 처리된 마우스는 종양 성장은 늦출 수 있지만, 실질적으로 대부분의 동물들은 종양에 굴복하였다 (도 8). 그러나, HPV 16E7-펩타이드 백신화가 항CD40 mAb 주사와 복합적으로 사용된 경우, 종양 성장은 현저히 감소되어 마우스 10마리 중 7마리는 종양을 거부한 반면, 콘트롤 펩타이드와 항CD40 mAb가 주사된 동물들은 종양의 과도한 성장을 제어하는데 실패하였다. 이러한 결과는 생체내 CD40-격발과 면역화가 복합될 경우 백신화 스케쥴의 효과가 현저히 증강될 수 있음을 가리키는 것이다. 이러한 데이터는 암환자를 위한 극히 강력하고도 신규한 항종양 백신의 개발의 초석을 제공하는 것이다.
실시예 5: 4-1BB를 통한 생체내 격발은 나이브 CTL을 사멸시킬 수 있는
라이센스를 제공한다
아고니스트 항CD40 항체(Ab)의 투여를 통한 APC의 생체내 CD40 격발은 Ad5-특이적 CTL의 교차-프라이밍에 있어서 CD4+T 헬퍼(Th) 활성에 대한 요구성을 대체시킬 수 있다. 본 발명자들은 Ad4E1-형질전환된 마우스 배아 세포 (Ad5MEC)를 항CD40 또는 항4-1BB Ab와 복합적으로 동계 CD4+Th 세포-고갈된 C57BL/6(B6) 마우스에게 주사하였다. 이들 Ad5E1MEC는 TAP-결핍 마우스로부터 유도된 것이기 때문에 그들 자신의 MHC 관점에서 Ad5E1 코딩된-CTL 에피토프를 제시할 수 없다(20).
결과적으로, 이 세팅에서 Ad5E1-특이적 CTL의 프라이밍은 숙주 APC에 의한종양 항원의 교차-제시에 의존한다. CD4+T 세포 결핍 마우스가 E1B-특이적 CTL 응답을 마운트하지 못하므로 Ad5E1B-특이적인 CTL의 유도는 CD4+Th-의존적이다 (도 9b). 이들 CD4-고갈된 동물에서 아고니스트 항CD40Ab의 전신 투여는 E1B-특이적인 교차 프라이밍을 복구시켰다 (도 9c). 흥미롭게도, 아고니스트 항4-1BB Ab의 전신 투여는 CD4+T 세포 보조 부재시 E1B-특이적 CTL의 동등하게 효과적인 프라이밍을 초래하였다 (도 9d). 종양에 대한 항원-특이적인 CTL 면역성을 유도하는 여러가지 방법은 어쥬번트 (IFA)중에서 최소 펩타이드-에피토프를 이용한 백신화를 통한 것이다. 주목할만한 것은, Ad5E1A 및 E1B로부터 유도된 에피토프의 경우, 아고니스트 항CD40 Ab가 공동-투여되지 않는 한, 이러한 펩타이드-기재 백신들이 프라이밍 보다는 CTL 내성을 유도한다는 것이다 (4). 본 발명자들은 따라서, 이 세팅에서 4-1BB를 통한 트리거가 항4-1BB Ab, 항CD40 Ab 또는 콘트롤 항체와 복합적으로 E1A-펩타이드 백신을 B6 마우스에 주사함으로써 CTL 프라이밍을 허용할 수 있는지를 조사하였다. 실제로, 항CD40의 공동-주사 뿐만 아니라, 항4-1BB의 공동-주사 역시 톨레로겐성 펩타이드 백신을 면역원성 배합물로 변환시켰다 (도 1E-G). H-2Dd/E1A 펩타이드 테트라머로 비장세포를 염색함으로써 E1A-특이적인 CTL 면역성을 감시하였을 때에도 유사한 결과가 얻어졌다 (데이터 미제시). 따라서, 4-1BB의 생체내 격발은 펩타이드-특이적 내성 유도를 방지할 수 있으며 그 대신 강력한 E1A-특이적 CTL 응답의 프라이밍을 초래한다. 이와 함께, 이 데이터들은 4-1BB 시그널이 CTL에게사멸 라이센스를 효가적으로 제시함과, 그에 따라, 아고니스트 항CD40 Ab의 투여 또는 Th 세포를 통해 CD40 격발의 필요성을 대체시킬 수 있음을 입증해준다.
실시예 6: 항4-1BB Ab는 DC 활성화를 유도하지 않는다
CD40 및 4-1BB의 발현 패턴에 관한 현상 지식수준에 의하면 항CD40 Ab의 생체내 투여에 의해 제공된 시그널은 APC로 전달되는 반면, 항4-1BB Ab의 그것은 CTL에 직접 전달된다고 주장될 것이다. 항원-특이적인 T 세포를 직접 자극하는 대신 항4-1BB Ab가 항원 산생 DC의 활성화에 의해 간접적인 방식으로 CTL 프라이밍(도 9)에 그의 영향력을 매개할 가능성을 배제하기 위해, 본 발명자들은 항4-1BB 항체의 주사가 생체내에서 DC를 활성화시킬지를 조사하였다. B6 마우스에게 항4-1BB, 항CD40 또는 콘트롤 Ab를 주사하고 이들 마우스의 비장으로부터 분리된 CD11c+DC 상의 CD86(B7.2)의 발현을 분석하였다. 예상과 같이, CD40의 생체내 격발은 CD86의 발현 증강을 초래했는데 이는 DC의 생체내 활성화를 가리키는 것이다. 이와 대조적으로, 생체내 4-1BB 격발 또는 콘트롤 래트 Ab의 투여 후 DC 상의 CD86 발현은 증가되지 않았다 (도 10a). 항4-1BB Ab가 DC 활성화를 유도하지 못한 것은 성숙한 DC건 미숙한 DC건 4-1BB를 검출가능한 수준으로 발현하지 못한다는 사실에 따른 것으로, 이는 DC가 4-1BB 격발에 대해 수용적이지 못함을 가리키는 것이다 (도 10b). 따라서, 항4-1BB 항체는 DC 파퓰레이션에 영향을 미치지는 않는 듯하고, 그보다는 CD8+T 세포의 직접적인 자극을 통해 CTL 프라이밍에 대한 그의 자극 효과를 매개하는 것으로 보인다.
실시예 7: 4-1BB를 통한 공동 자극은 항원-자극 CTL의 생존성 증가를
초래한다
아고니스트 항4-1BB Ab가 Ad5-특이적 CTL의 T 헬퍼 독립성 프라이밍을 어떤 방식으로 허용하는지 조사하기 위해, 본 발명자들은 Ad5E1A-펩타이드 특이적 T 세포 수용체(TCR) 트랜스제닉 마우스로부터 선택적으로 전달된 T 세포 파퓰레이션을 이용하였다 (21). 이들 T 세포의 생체내 추적은 두가지 다른 방식으로 수행하였다. 첫번째 방법은 TCR 트랜스제닉 T 세포를 염료 CFSE로 형광 표지시켜 정상적인 B6 마우스 내로 전달한 다음 이 마우스들을 항4-1BB 처리와 함께 또는 처리 없이 IFA 중 Ad5E1A-펩타이드로 백신처리하는 것이다. 흥미롭게도, 결과적인 데이터는 TCR-트랜스제닉 T 세포의 증식이 항4-1BB Ab와 함께 또는 항4-1BB Ab 없이 E1A-펩타이드를 투여받은 마우스에서 동등하게 격발되었음을 나타내었다 (도 11a). 따라서, 항4-1BB Ab는 초기 활성화 또는 항원-특이적 T 세포의 증식 능력ㅇㄹ 증가시킴으로써 CTL을 프라이밍할 수 없다.
두번째 접근 방법에서 본 발명자들은 B6 Thy1.2로부터 기원하는 Ad5E1A-특이적 TCR 트랜스제닉 T 세포를 B6Thy1.1 콘제닉(congenic) 마우스 내로 전달하였다. 항4-1BB Ab 처리와 함께 또는 처리 없이 이 마우스들을 IFA 중 Ad5E1A-펩타이드로 백신화시켰다. 도 3b는 백신화한지 11일 후, 항4-1BB Ab와 복합적으로 E1A-펩타이드에 의해 백신화된 마우스에서는 TCR-트랜스제닉 기원의 CD8+T 세포의 대규모 팽창이 관찰되었으나, E1A-펩타이드를 투여받지 않거나 항4-1BB Ab만이 투여된 마우스에서는 그렇지 않음을 보여준다. 따라서, E1A-특이적 CTL의 축적은 4-1BB 공동자극적 시그널의 존재를 필요로 하였다. 나아가, 4-1BB를 통한 CD8+CTL 면역성의 자극은 항원-특이적 격발의 존재에 의존하였다. 이와 함께, 도 3의 데이터는 4-1BB 격발이 초기 CTL 활성화에는 필수적이지는 않지만, 항원-자극된 CTL의 생존을 촉진함으로써 이들 CTL의 팽창을 허여한다는 것을 입증해준다.
실시예 8: CTL 프라이밍에 있어서 4-1BBL/4-1BB 상호작용의 관련성
4-1BB의 생체내 격발은 CD40-의존성 DC 활성화 시그널의 부재시 CTL 프라이밍을 가능케하기 때문에 (도 9), 이것은 항4-1BB Ab의 활성화와 복합적으로 비활성화된 DC에 의한 항원 제시가, 효율적인 CTL 프라이밍에 충분함을 시사하는 것이다. 항4-1BB Ab의 공동 투여 필요성 역시 비활성화 DC는 명백히 4-1BB를 통해서 CTL을 자극할 수 없음을 가리키는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 성숙한 DC 및 미숙한 DC 상에서의 이 수용체 4-1BBL에 대한 천연 리간드의 발현에 관해 조사하였다. 활성화되지 않은 DC는 4-1BBL을 저수준으로 발현하는 반면 (도12 a), CD40L-트라이머- 또는 Poly I:C 존재하에서 활성화시 이 분자의 발현은 크게 증가된다 (각각 도 12b 및 12c). 4-1BBL의 이러한 유도는 생체내에서 CD40 격발시에 관찰되었다. 4-1BBL의 발현 증가는 활성화된 DC 상에서의 CD86 수준의 상승과 궤를 같이 한다. 이것은 두가지 공동자극적 시그널 모두가 CTL 면역성을 유도하는데 있어서 의 성숙한 DC의 능력 (미숙한 DC와 반대되게)에 기여함을 시사하는 것이다.
본 발명자들은 CTL 교차-프라이밍에 요구되는 Th-의존성 DC 성숙 시그널이고유하게 유지된 정상적인, CD4+Th 세포 숙달성(proficient) B6 세포에서 종양 세포 면역화 실험을 수행하였다. 각각 블로킹 항4-1BB Ab 또는 CTLA4-Ig를 투여함으로써 CD28 및 4-1BB 시그널의 차단을 수행하였다. 항4-1BBL Ab 및/또는 CTLA4-Ig의 전신 투여와 복합적으로 Ad5E1MEC를 이용하여 B6 마우스를 면역화시켰다. 흥미롭게도 항4-1BBL의 생체내 차단은 종양 세포 백신에 의해 유도된 항원-특이적 CTL의 수를 크게 감소시켰다 (도 13). CD28 공동자극의 차단은 CTL 유도를 완벽히 억제하였기 때문에, CTLA4-Ig와 복합적으로 추가적인 4-1BBL 블로킹은 별도의 다른 효과를 나타내지는 않았다. 이들 분자들간의 상호반응의 차단이, 유지되는 종양-특이적 CTL의 수를 크게 감소시켜주기 때문에 이들 데이터는, 4-1BBL/4-1BB 상호반응이 항원-특이적 CTL의 교차-프라이밍에 있어서 중요함을 가리키는 것이다. 그러나 적절히 활성화된 DC에 의해 제공된 CD28을 통한 공동자극 시그널의 부재하에서는, 4-1BBL에 의해 제공되는 시그널이 CTL 프라이밍을 가능케하지 못하는 것이 명백하며, 그 결과, 항종양 CTL 면역성의 유도는 완전히 실패한다.
실시예 9: 4-1BB 시그널은 CD28 공동자극에 의존한다
생체내 차단 실험은 4-1BB 시그널에 대한 CD28 공동자극의 지배능력을 시사하는 것이다. 따라서, 본 발명자들은 CD28 공동자극 부재하에서, 항4-1BB Ab의 투여가 여전히 사멸 라이센스와 함께 CTL을 제공할지에 대해 조사하였다. B6 마우스의 CD4+T 세포를 고갈시키고 항4-1BB Ab 및/또는 CTLA4-Ig의 투여와 복합적으로 Ad5E1MEC로 면역시켰다. 항4-1BB Ab를 투여받은 마우스들은 강력한 E1B-특이적 CTL응답을 마운트하였지만, CTLA4-1Ig를 부가적으로 투여받은 마우스는 그렇지 못했다 (도 14). 이들 데이터는 CTL 면역성 유발체 미치는 4-1BB 격발의 양성적인 효과가 고유의 CD28 공동자극적 시그널의 존재에 의존함을 시사하는 것이다. 뿐만 아니라, 이들 데이터는 활성화되지 않은 DC에 의해 발현된 CD80/CD86의 기본적인 수준이 CD28을 통해 충분한 공동자극을 제공함으로써 4-1BB 경로를 통해 부가적인 공동자극을 가능케함을 가리키는 것이다.
생체외 연구 결과 나이브 T 세포 상에서의 4-1BB 발현은 없고 항CD3뮤 에 의한 가교를 통한 TCR-격발은 4-1BB 표면 발현의 급속히 증가를 초래한다는 것이 입증되었다(8). 본 발명의 데이터가 CD28을 통한 공동자극이 4-1BB 시그널링에 선결요건이라는 결론을 뒷받침하기 때문에, 본 발명자들은 CD28 격발이 나이브 T 세포에 대한 4-1BB의 업조절에 기여하는지를 조사하였다. 따라서, 나이브 비장 세포를 생체외에서 플레이트-결합된 항CD3 Ab로 자극시키고 24시간 후에 4-1BB 발현에 대해 분석하였다(도 16). TCR을 통한 강력한 시그널 (고농도의 항CD3Ab)이 24시간 이내에 4-1BB 발현을 유도하는데 충분하다는 것이 명백하다. 그러나, T 세포를 저농도의 항CD3으로 자극할 경우에는, 4-1BB를 업조절하는 그들의 능력이 크게 소실되었다 (도 16). 이러한 저농도의 항CD3 Ab는 종양 세포 백신에 의해 제공된 종류의 생체내 시그널과 더 많이 닮은 약한 TCR 격발을 제공한다. 중요한 것은 이보다 생리적인 이러한 조건 하에서 CD28 수용체를 통한 공동 자극이 4-1BB 를 높은 수준으로 발현하는 T 세포의 능력을 복구시켰다는 것이다. 이러한 발견은 생체내 CD28 경로의 차단이 4-1BB를 통한 공동자극을 저해한다는 사실과 일치하는 것이다 (도 14및 도 15). 뿐만 아니라, 이들은 항원-자극된 T 세포의 CD28-공동자극이 나이크 T 세포에 미치는 4-1BB 업조절에 있어서 중요한 시그널이고, 그에 따라서 이들 세포를 4-1BB 격발에 민감하게 만든다는 개념을 더욱 강화시켜준다.
실시예 10: 항CD40 및 항4-1BB Ab의 동계적 복합 투여를 통한 종양 세포
또는 펩타이드-기재 백신에 의한 CTL 프라이밍의 실현
항CD40 Ab와 항4-1BB Ab은 유사한 방식으로 E1A 펩타이드에 의한 CTL 프라이밍을 가능케하는 반면, 4-1BB 격발은 CD28-공동자극에 의존했기 때문에, 본 발명자들은 두가지 Ab의 복합이 CTL 면역성을 보다 강력하게 유도할지에 대해 조사하였다. 연구 결과 두가지 Ab 모두와 E1A 펩타이드와의 복합사용은 실제로 CTl 응답의 유도에 대해 강력한 상승적 효과를 일으켰다. 두가지 Ab가 모두 투여된 마우스는 한가지 Ab만 투여된 마우스에 비해, 테트라머-양성 CD8+T 세포의 절대적인 숫자 뿐만 아니라 상대적인 숫자도 적어도 5-10배 더 많았다 (도 17).
실시예 11: 종양-산생 대상자에게 아고니스트 항CD40 Ab를 투여하는 것을
통한 치료적 항종양 면역성의 유발
항CD40 Ab의 주사를 통한 APC의 생체내 활성화가 종양세포-면역화 CD4+T 세포 고갈 마우스에 있어서 종양 특이적인 CTL의 교차-프라이밍을 가능케 하기 때문에, 이 방법은 종양-산생 동물에서 항종양 면역성을 유발하는 것도 촉진시킬 수 있다. 종양-산생 마우스에서 항종양 CTL 응답을 개시하는 것은 적절히 활성화된 APC의 항원 산생 결여에 의해 방해되는 것 같다. 이것은 종양 부위에 대한 불충분한APC 모집(recruitement) 및/또는 종양 항원-로딩된 APC가 활성화되어, 나이브 T 세포와의 조우 - 및 나이브 T 세포의 프라이밍 - 이 발생하는 장소인 드레이닝 림프절에 재분포되지 못한 것에 기인할 수 있다. 특히 염증성 "위험" 시그널의 결여, 종양에 의한 면역조절적 시토카인의 분비 및 종양-특이적 T 세포 보조의 결여는 APC가 항종양 CTL 응답을 교차-프라이밍하지 못하게 하였다.
이러한 정황을 고려해서, 본 발명자들은 Ad5-형질전환된 세포의 종양을 산생(피하)하는 면역경쟁적 B6 마우스에게 항CD40 Ab를 주사하였다. 콘트롤 동물에서는 종양이 점진적으로 성장한 반면, 항CD40 처리된 마우스는 그들의 종양을 거부할 수 있었다 (도 18). 흥미롭게도 콘트롤 동물에서는 드레이닝 림프절 중 E1A-특이적 CTL은 단지 소량으로만 검출된 반면, 항CD40 처리된 마우스는 ㄷ말초 혈액은 물론 드레이닝 림프절과 콜래터럴(co-lateral) 림프절 모두에서 E1A-특이적 CTL의 더 많은 수로 나타난 것이 명백하였다 (도 19 a-c).
중요한 것은, 항원 제시의 국소화가 항CD40 처리된 마우스와 콘트롤 마우스에 있어서, 두 경우 모두 콜래터럴 림프절이 아니라 종양-드레이닝 림프절에서만 검출된다는 점에서 유사하다는 점이다 (도 20). 상기한 바와 같이, 염증성 "위험" 시그널의 결여로 인해 APC는 콘트롤 동물에서 항종양 CTL 응답을 교차-프라임하지 못하는 것 같다. 이와 대조적으로 항CD40 Ab-처리된 마우스의 경우에는 CD40-시그널이 이들 APC로 하여금 Ad5E1A-특이적 CTL 면역성을 효과적으로 프라임시키게 하고, 그 결과 이들 CTL이 드레이닝 림프절을 이탈해서 종양 뿐만 아니라 다른 말초 림프성 기관에 접근할 수 있다. 이러한 후자의 측면은 A5E1A-특이적 CTL이 항CD40Ab-처리된 마우스의 종양에서 주로 검출된다는 사실에 의해서도 확인된다 (도 21). 항CD40 처리가 효과적인 전신적 CTL 면역성을 결과시킨다는 개념은 한쪽 옆구리의 종양 내로 항CD40 Ab를 종양내 주사함에 의한 CD40을 통한 국소적 생체내 격발이 다른쪽 옆구리 상의 미처리 종양도 거부시키는 결과를 초래한다는 사실에 의해서도 더욱 뒷받침된다 (도 22 a-c). 이 실험은 또한 효과적인 항종양 요법이 항CD40 Ab의 전신 투여와 국소 투여의 두가지 투여 후에 달성될 수 있다는 것도 입증한다.
부가적인 두가지 실험은 종양 거부를 초래하는 항CD40 Ab 주입 메카니즘에 대한 그 이상의 고찰을 제공해준다. 먼저, 종양 제거에 있어서 이들 CTL의 역할은 항CD40 Ab를 이용한 항종양 요법이 그들의 CD8+T 세포가 고갈된 마우스에서는 효과적이지 않은 반면, 그들의 CD4+T 세포가 고갈된 마우스에 있어서는 여전히 효과적이라는 사실에 의해 확인되었다 (도 23). 두번째로, 다른 연구진들도 종양 세포의 괴사(apoptosis)를 직접 유발함으로써 CD40-발현 종양의 성장을 저해하는 항 CD40 Ab를 발견했다는 것을 명심해야 한다 (23-25). 중요한 것은, 본 발명의 종양 세포는 CD40 발현을 결여한다는 것이다 (도 24). 따라서, 이 세팅에서 항CD40 Ab의 치료적 효과는 종양사멸성 CTL 응답의 유발을 통해 작용하는 것이다.
실시예 12: 종양-산생 대상자에 대한 항CD40 및 항4-1BB Ab의 상승적 복합
투여를 통한 치료적 항종양 면역성의 유발
본 발명의 데이터는 종양 세포- 및 펩타이드-기재 백신에 대해 CTL 프라이밍을 가능케 하는 것에 더해 아고니스트 항CD40 Ab의 투여 역시, 면역계로 하여금 기존의 종양에 대한 치료적 CTL 면역성을 일으키게 할 수도 있다. 항C40 및 4-1BB Ab는 CTL 면역성을 유사하게 자극할 수 있고, 펩타이드 백신-유발된 응답을 상승적으로 자극하는 작용을 하기 때문에 (상기 내용 참조), 종양 산생 마우스에 있어서 CTL 면역성의 유발에 관한 이러한 강력한 Ab-복합효과의 매우 강력한 치료적 능력이 예상된다.
전술한 설명, 용어, 표현 및 실시예는 어디까지나 예시적인 것으로 본 발명의 내용과 범위가 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명은 공지 구체예와 미지 구체예를 모두 포함해서 전술한 구체예의 모든 동등한 것을 포함한다. 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해서만 한정되며 본 명세서의 다른 부분이나 다른 소스의 언급 내용에 의해서는 한정되지 않는다.
참고문헌:
Claims (13)
- 4-1BB 수용체를 자극하는 아고니스트 항4-1BB 항체, 또는 그의 단편을 포함하는 조성물.
- 제1항에 있어서, CD40 수용체를 자극하는 아고니스트 항CD40 항체 또는 그의 단편을 추가로 포함하는 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC-제한된 T 세포 에피토프를 갖거나 코딩하는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 바이러스 또는 핵산 서열 중에서 선택된 하나 이상의 분자를 추가로 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항4-1BB 항체 또는 그의 단편이 인간의 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 DeimmunisedTM인 조성물.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항CD40 항체 또는 그의 단편이 인간의 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체 또는 DeimmunisedTM인 조성물.
- 항원에 대한 전신적 T 세포 면역성 유발을 위한 의약품을 제조하는데 있어서의, 4-1BB 수용체를 자극하는 아고니스트 항4-1BB 항체 또는 그의 단편의 용도.
- 항원에 대한 전신적 T 세포 면역성 유발을 위한 의약품을 제조하는데 있어서의, CD40 수용체를 자극하는 아고니스트 항CD40 항체 또는 그의 단편의 용도.
- 제6항에 있어서, 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC-제한된 T 세포 에피토프에 대한 전신적 T 세포 면역성 유발을 위한 의약품을 제조하는데 있어서, 항4-1BB 항체 또는 그의 단편이 항CD40 항체 또는 그의 단편과 복합된 용도.
- 제6항 또는 제8항에 있어서, 항원에 대한 전신적 T 세포 면역성 유발을 위한 의약품을 제조하는데 있어서, 항4-1BB 항체 또는 그의 단편, 및/또는 항CD40 항체 또는 그의 단편이 클래스 I MHC 또는 클래스 II MHC-제한된 T 세포 에피토프를 갖거나 코딩하는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 바이러스 또는 핵산 서열 중에서 선택된 하나 이상의 분자와 복합된 용도.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 종양 또는 종양 세포의 항원인 용도.
- 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항원이 감염성 제제의 항원인 용도.
- 제9항 또는 제10항에 있어서, 항원이 HPV 항원인 용도.
- 제11항에 있어서, 항원이 서열 RAHYNIVTF (SEQ ID NO:3)을 갖는 펩타이드인 용도.
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