JP2002516344A - チロシンキナーゼSrcを使用する血管形成の変調に有効な方法及び組成物 - Google Patents
チロシンキナーゼSrcを使用する血管形成の変調に有効な方法及び組成物Info
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Abstract
Description
キナーゼSrc、Srcの変異体及びそれらをコードする核酸を使用して組織の
血管形成を変調する方法及び組成物に関する。
含む組織血管分布のプロセスであり、血管新生とも呼ばれる。このプロセスには
内皮細胞及び平滑筋細胞の浸潤が介在する。このプロセスは以下の3つの行程、
即ち、先在する血管から血管が萌芽し得る行程、前駆細胞から血管のde no
vo発生が生じる行程(脈管形成、バスキュロゲネシス)、または、既存の小血
管の内径が拡張し得る行程、のいずれかによって進行すると考えられている。B
loodら,Bioch.Biophys.Acta,1032:89−118
(1990)。
いても、組織炎症、関節炎、腫瘍増殖、糖尿病性網膜症、網膜の血管新生による
黄斑変性などの状態のような多様な臨床疾患の病理発生においても重要である。
血管形成に関連するこれらの臨床徴候を血管形成性疾患と呼ぶ。Folkman
ら,Science,235:442−447(1987)。一般に成人の組織
または成熟組織には血管形成が存在しないが、創傷の治癒中及び黄体成長サイク
ル中には血管形成が生じる。例えばMosesら,Science,248:1
408−1410(1990)参照。
れた。(1)bFGF(塩基性線維芽細胞増殖因子)のような“血管新生分子”
の放出の阻害、(2)抗βbFGF抗体の使用などによる血管新生分子の中和、
(3)ビトロネクチン受容体αvβ3のインヒビターの使用、及び、(4)血管
形成刺激に対する内皮細胞応答の阻害、によって血管形成を阻害することが提案
された。この最後の戦略が注目され、Folkmanら,Cancer Bio
logy,3:89−96(1992)は、コラゲナーゼインヒビター、基底膜
代謝回転インヒビター、血管静止ステロイド、菌類由来の血管形成インヒビター
、血小板第4因子、トロンボスポンジン、D−ペニシラミン及び金チオマレート
のような関節炎薬、ビタミンD3類似体、アルファ−インターフェロンなどのよ
うな血管形成の阻害に使用できる複数の内皮細胞応答インヒビターを記載してい
る。その他の提案された血管形成インヒビターに関しては、Bloodら,Bi
och.Biophys.Acta,1032:89−118(1990)、M
osesら,Science,248:1408−1410(1990)、In
gberら,Lab.Invest.,59:44−51(1988)及び米国
特許第5,092,885号、第5,112,946号、第5,192,744
号、第5,202,352号、第5,753,230号及び第5,766,59
1号を参照するとよい。上記の参考文献に記載された血管形成インヒビターはい
ずれもSrcタンパク質を含有していない。
と同様の方法で最初に内皮細胞が血管基底膜を分解しこの膜を貫通しなければな
らない。
依存するという説は従来から報告されていた。Brooksら,Science
,264:569−571(1994)。更に、血管形成性血管細胞のプログラ
ムされた細胞死(アポトーシス)がこの相互作用によって開始されること、及び
、この相互作用は血管インテグリンαvβ3のある種のアンタゴニストによって
阻害されることが報告された。Brooksら,Cell,79:1157−1
164(1994)。より最近には、ビトロネクチン受容体(αvβ5)に対す
るマトリックスメタロプロテイナーゼ−2(MMP−2)の結合をαvβ5アン
タゴニストを使用して阻害し、これによって該プロテイナーゼの酵素機能を阻害
できることが報告された。Brooksら、Cell,85:683−693(
1996)。
本文中ではチロシンキナーゼSrcを総称的にSrcと呼ぶ。
いる。血管形成の変調に応答する疾患状態に対しては、血管形成を変調し得る量
のSrcタンパク質を含む組成物を治療すべき組織に投与する。Srcタンパク
質を供給する組成物は、精製されたタンパク質、生物学的に活性のタンパク質フ
ラグメント、組換え産生されたSrcタンパク質もしくはタンパク質フラグメン
トまたはその融合タンパク質、または、Srcタンパク質を発現する遺伝子/核
酸発現ベクターを含有し得る。
の阻害である。Srcタンパク質が活性であるかまたは活性化される場合、変調
は血管形成の増進である。
阻害は、有害な血管新生が生じている疾患組織の治療に有効である。代表的な組
織は、炎症を生じた組織、固形腫瘍、転移部、再発狭窄症の危険がある組織など
である。
た四肢虚血のある患者の治療に有効である。また、癒合しない慢性創傷があり従
って血管細胞の増殖及び血管新生の亢進によって有利な効果が与えられる患者の
治療に有効である。
好ましい。幾つかの特に有効な修飾Srcタンパク質及びその発現を本文中に開
示する。
クターと医薬として許容される担体または賦形剤とから成り、上記核酸がsrc
タンパク質をコードする核酸セグメントを有しており、該srcタンパク質がコ
ドン527にチロシン、セリンまたはトレオニン以外の任意のアミン酸残基を有
することを特徴とする、ターゲット哺乳類組織中の血管形成を促進する医薬組成
物を包含する。
クターと医薬として許容される担体または賦形剤とから成り、上記核酸がキナー
ゼ活性をもたないsrcタンパク質をコードする核酸セグメントを有しているこ
とを特徴とする、ターゲット哺乳類組織中の血管形成を阻害する医薬組成物を提
供する。
って最初に記載されたイントロンの欠失した完全コーディング配列を表すニワト
リc−SrcのcDNA配列である。この配列はGenBankから登録番号J
00844で入手できる。該配列は1759ヌクレオチドを含み、タンパク質コ
ーディング部分はそれぞれ112位で開始し、1713位で終結する。
ミノ酸残基配列である。
.,USA,88:10411−10415(1991)によって最初に記載さ
れたヒトc−SrcのcDNA配列である。この配列はGenBankから登録
番号X59932 X71157で入手できる。該配列は2187ヌクレオチド
を含み、タンパク質コーディング部分はそれぞれ134位で開始し、1486位
で終結する。
酸残基配列である。
の活性化を示す。図の上部は、bFGF及びVEGFによる内因性c−Srcの in vitro キナーゼアッセイの結果を活性化倍率と共に示す。図の下部は
、均等なSrc及びIgGの含量に対してローディングコントロールとして抗−
Src抗体でプローブしたキナーゼアッセイブロットを示す。
するレトロウイルス介在c−Src A遺伝子発現の効果を示す。9日齡のニワ
トリCAMをRCAS−Src A(活性突然変異c−Src)またはコントロ
ールRCAS−GFP(緑色系蛍光タンパク質;蛍光性指示タンパク質)レトロ
ウイルスまたはバッファに72時間接触させた。図6Aは血管形成レベルの定量
を示し、図6Bは立体顕微鏡で撮影した各処理サンプルの代表的顕微鏡写真(4
×)に対応する。
イルス発現を示す。図7Aは、VEGFもしくはPMAに30分間接触させたか
またはc−Src Aレトロウイルスを48時間感染させた10日齡のニワトリ
CAMの組織抽出物を示す。NTは処理せずを表す。Srcを均等量の全タンパ
ク質抽出物から免疫沈降させ、FAK−GST融合タンパク質を基質として用い
てin vitro免疫複合体キナーゼアッセイで処理し、電気泳動させ、ニト
ロセルロースフィルターに転移させた。上記の全組織溶解物のアリコートの内因
性ERKリン酸化を抗−ホスホ−ERK抗体でイムノブロッティングすることに
よって測定した。図7Bは、擬似RCASまたはSRC Aを含有するRCAS
を感染させた10日齡のCAMを示す。2日後、CAMを摘出し、OCT中で凍
結保存し、4μmで切開した。切片を抗リン酸化ERK抗体(New Engl
and Biolabs)で免疫染色し、洗浄し、ヤギ抗−ウサギFITC−コ
ンジュゲート第二抗体で検出した。冷却したCCDカメラ(Princeton
Inst.)で蛍光像を撮影した。
る選択要求を示す。9日齡のニワトリCAMをRCAS−Src 251または
コントロールRCAS−GFPレトロウイルスまたはバッファに20時間接触さ
せ、次いでbFGFまたはVEGFの存在下または非存在下で更に72時間イン
キュベートした。図8Aは、上述のように定量した血管形成レベルを示し、図8
Bは、立体顕微鏡で撮影した代表的顕微鏡写真(6×)を示す。図8Cは、トラ
ンスフェクト細胞中のSrc 251の発現を確認するために抗−Src抗体で
プローブしたブロットを擬似処理に比較して示す。
バリーの結果を示す。図9Aは、Bio Radレーザー共焦点走査型顕微鏡で
光学セクショニング(bar=500μm)によって検出した腫瘍血管(矢印)
中でGFPだけを発現するRCAS−GFP(RCAS−緑色系蛍光タンパク質
)に感染させたヒト髄芽細胞腫フラグメントを示す顕微鏡写真である。図9Bは
、レトロウイルスの局所塗布によって処理し、3日間または6日間増殖させた後
、切除し、湿潤重量を計量した腫瘍から得られたデータを示す。データは2つの
重複サンプルの腫瘍重量の平均変化(初期腫瘍重量50mgからの変化)±SE
Mとして表される。図9Cは、胚から外科的に摘出された髄芽細胞腫の顕微鏡写
真(bar=350μm)を表す。下段パネルは各腫瘍の脈管構造を詳細に示す
各腫瘍の高倍率写真である(bar=350μm)。矢印はRCAS−Src2
51−処理腫瘍中の血管破壊を示す。
図である。
解)するときに形成されるアミノ酸。本文中に記載のアミノ酸残基は好ましくは
“L”異性体の形態である。しかしながら、ポリペプチドが所望の機能的特性を
維持している限り、任意のL−アミノ酸残基を“D”異性体形態で置換できる。
NH2はポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を意味する。COO
Hは標準ポリペプチド命名法(J.Biol.Chem.,243:3552−
59(1969)に記載され37 CFR §1.822(b)(2)に採用さ
れた命名法)に従ってポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ
基を意味する。
端に向かう慣用の方向で示される式によって表されることに注目されたい。更に
、アミノ酸残基配列の起点または終点のダッシュ記号は1つまたは複数のアミノ
酸残基の別の配列に対するペプチド結合を示す。
カルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに結合されたアミノ酸残基の直
鎖状配列を意味する。
の約50個以下のアミノ酸残基が互いに結合された直鎖状配列を意味する。
合を含む環構造を有する化合物を意味する。環状ペプチドは、“ヘッド−ツー−
テイル”ホモデチック環状ペプチドでもよく、または、ジスルフィド架橋、ラク
タム架橋、チオエステル、チオアミド、グアニジノ及び同様の結合によって環が
閉鎖されたヘテロデチック環構造を含んでもよい。
数のアミノ酸残基が互いに結合された直鎖状配列を意味する。
連結された(“融合した”)少なくとも2個の異なるポリペプチドドメインを含
むポリペプチドを意味する。この場合、2個のドメインは天然には融合形態で見
出されないペプチドに対応する。
ノ酸残基の化学的に産生された鎖であって天然に産生するタンパク質及びそのフ
ラグメントを含まないものを意味する。
しており、活性または不活性のSrcタンパク質を供給することによって血管形
成がそれぞれ増進または阻害されるように血管形成を変調できるという知見に関
する。
のでこの知見は重要である。疾患状態に関連する組織がその増殖のために血管形
成を必要とする場合、血管形成を阻害しこれによって罹病組織の増殖を阻害する
のが望ましい。傷害された組織がその増殖及び治癒のために血管形成を必要とす
る場合、血管形成を増進または促進しこれによって組織の治癒及び増殖を促進す
るのが望ましい。
ったりする場合、血管形成の阻害によって疾患の有害な効果を抑制し得る。血管
形成を阻害することによって、疾患に介入し、症状を軽減し、いくつかの場合に
は疾患の治療に成功し得る。
生関連組織の例としては、リューマチ様関節炎、糖尿病性網膜症、炎症性疾患、
再発狭窄症などがある。有害組織の増殖を助長するために新しい血管の増殖が必
要な場合、血管形成の阻害によって組織への血液供給が減少し、これは、血液供
給要求に基づく組織集団の縮小に寄与する。この例としては、腫瘍が数ミリメー
トル以上の厚さに増殖するため及び固形腫瘍の転移が成立するために血管新生が
絶えず要求されるような腫瘍の増殖がある。
支援する。この例は、糖尿病またはその他の状態が原因で四肢の循環不良に陥っ
た四肢虚血患者の治療である。また、癒合しない慢性創傷があり従って血管細胞
の増殖及び血管新生の亢進から有利な効果を得る患者も治療対象として考えるこ
とができる。
であり他の生物学的プロセスには選択性でないという理由に基づく。
うな組織の血管新生が関与する多様なプロセスを含む。これらの血管形成プロセ
スはすべてSrcタンパク質によって行われる。
スは疾患プロセスに関連すると考えられる。従って、本発明の治療方法は疾患選
択性であり、有害な副作用を有していない C.Srcタンパク質 本発明で使用するチロシンキナーゼSrcタンパク質は所期用途に応じて種々
のものを利用できる。「Srcタンパク質」又は「Src」なる用語は本明細書
に記載する活性又は不活性形態の各種チロシンキナーゼSrcタンパク質を意味
する。
意のものを意味する。本明細書には血管形成の促進を測定するアッセイを記載す
るが、これに限定するものではない。血管形成レベルがSrcをアッセイ系に加
えない対照レベルよりも少なくとも10%、好ましくは25%、より好ましくは
50%高い場合にタンパク質は活性であるとみなす。促進を測定するアッセイと
しては、実施例に記載するようにRCASウイルスベクターを使用し、分岐点を
数えることにより血管形成指数を計算するCAMアッセイが好ましい。好ましい
活性Srcタンパク質はチロシンキナーゼ活性も示す。活性Srcタンパク質の
例については実施例に記載するが、例えばSrc−Aである。
任意のものを意味する。本明細書には血管形成の阻害を測定するアッセイを記載
するが、これに限定するものではない。血管形成レベルが外因性Srcをアッセ
イ系に加えない対照レベルよりも少なくとも10%、好ましくは25%、より好
ましくは50%低い場合にタンパク質は不活性であるとみなす。阻害を測定する
アッセイとしては、実施例に記載するようにRCASウイルスベクターを使用し
、分岐点を数えることにより血管形成指数を計算するCAMアッセイが好ましい
。好ましい不活性Srcタンパク質はチロシンキナーゼ活性の低下も示す。不活
性Srcタンパク質の例については実施例に記載するが、例えばSrc−251
である。
発現と精製による生産等の各種方法の任意の方法で生産することができる。Sr
cタンパク質は遺伝子治療系を目的組織に導入した後、同タンパク質をこの組織
で発現させることにより「in situ」提供することもできる。
製することができ、本発明はこの点で限定するものではない。例えば、Srcの
自然史は哺乳動物、トリ、ウイルス等の種からの種々の相同体を含むことが周知
であり、その遺伝子はタンパク質を発現する任意組織からcDNAクローニング
法を使用して容易にクローニングできる。本発明で使用するのに好ましいSrc
は哺乳動物又はトリ相同体等の細胞性タンパク質c−Srcである。ヒトc−S
rcが特に好ましい。
れらの配列は本発明で有用なSrcタンパク質をコードする配列と、Srcタン
パク質を発現させるために構築した種々のDNAセグメント、組換えDNA(r
DNA)分子及びベクターを含む。
伝子、構造遺伝子のフラグメント及び転写単位をコードする配列を含むことがで
きる。
ードするヌクレオチド配列又は生物学的に活性なそのフラグメントである。
する。
アミノ酸残基配列又はその部分に実質的に同一であり、好ましくはこのような配
列又は部分から主に構成されるアミノ酸残基配列をコードする。代表例な好まし
いDNAセグメントは実施例に詳述する。
パク質をコードする構造遺伝子のデオキシリボ核酸(DNA)配列に直接相関す
る。従って、構造遺伝子又はDNAセグメントはこの構造遺伝子又はDNAセグ
メントがコードするアミノ酸残基配列即ちタンパク質又はポリペプチドにより表
すことができる。
めに使用されるアミノ酸の大半は2種以上のコーディングヌクレオチドトリプレ
ット(コドン)が特定アミノ酸残基をコード又は指定できる。従って、多数の異
なるヌクレオチド配列が特定アミノ酸残基配列をコードする場合がある。このよ
うなヌクレオチド配列は全生物で同一アミノ酸残基配列を生じ得るので機能的に
等価であるとみなされる。場合により、所与ヌクレオチド配列にプリン又はピリ
ミジンのメチル化変異体が含まれる場合もある。しかし、このようなメチル化は
いずれにせよコーディング関係には影響しない。
、即ちRNAであるかDNAであるかを問わず任意ポリヌクレオチドもしくは核
酸フラグメント又はその類似体である。好ましい態様では、核酸分子は2本鎖D
NAのセグメント即ちDNAセグメントの形態であるが、分子生物学法によって
は1本鎖DNA又はRNAが好ましい場合もある。
製されるが、クローニング又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により作製する
ことが好ましい。Srcタンパク質の部分をコードするDNAセグメントは化学
的方法(例えばMatteucciら,J.Am.Chem.Soc.,103
:3185−3191,1981のホスホトリエステル法)や自動合成法を使用
して容易に合成することができる。また、DNAセグメントを規定する1群のオ
リゴヌクレオチドの合成後にオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションとラ
イゲーションにより完全セグメントを構築するなどの周知方法により、もっと大
きいDNAセグメントを容易に作製することができる。別法として、Srcタン
パク質をコードするメンバーを含むと考えられるcDNAライブラリーで使用さ
れるオリゴヌクレオチドブライマー対を使用してPCRにより好ましいDNAセ
グメントを単離することもできる。
基を適当な塩基に置換することにより任意の所望修飾を加えることができる。こ
の方法は周知であり、本明細書に記載する種々多様の「修飾」Srcタンパク質
の生産に容易に適用することができる。
グメントを部位特異的又はランダム突然変異誘発等により後期修飾し、所望の任
意置換を導入することができる。
から種々の生化学的方法によりクローニングすることができる。これらの遺伝子
のクローニングは当技術分野で公知の通り、実施例に記載する一般法により実施
することができる。
酸源としては、これらのタンパク質を発現すると考えられる組織からのcDNA
ライブラリー形態のゲノムDNA又はメッセンジャーRNA(mRNA)が挙げ
られる。好ましい組織はヒト肺組織であるが、任意の他の適当な組織も使用でき
る。
製し、本明細書に記載するヌクレオチド配列に基づくオリゴヌクレオチドプライ
マー対を使用してPCR増幅によりSrcをコードするヌクレオチド配列を単離
する。あるいは、本明細書に記載する核酸配列に基づくハイブリダイゼーション
プローブを使用して慣用核酸ハイブリダイゼーション法によりcDNA又はゲノ
ムライブラリーから所望cDNAクローンを同定及び単離することもできる。S
rcをコードする適当な核酸を単離及びクローニングする他の方法は当業者に自
明である。
DNA)は本明細書に記載するように作製することができる。特に、DNAセグ
メントをコードするSrcにベクターを作動的に(インフレーム、発現可能に)
連結することにより、発現可能なrDNAを作製することができる。従って、組
換えDNA分子は自然界に通常は同時に存在しないヌクレオチド配列の少なくと
も2種の核酸を含むハイブリッドDNA分子である。
通り、所望の機能的性質(例えばタンパク質発現)と形質転換しようとする宿主
細胞に直接依存する。本発明の実施時に使用するのに適したベクターはこのベク
ターを作動的に連結するDNAセグメントに含まれる構造遺伝子を少なくとも複
製し、好ましくは発現させることも可能である。
Ausebelら,Current Protocols in Molecu
lar Biology,Wiley and Sons,New York(
1993)や、Sambrookら,Molecular Cloning:A
Laboratory Manual,Cold Spring Harbo
r Laboratory,(1989)に記載されている。これらの文献は本
明細書中に引用する一般組換えDNA法の多くも記載している。
子で形質転換した原核宿主細胞(例えば細菌宿主細胞)においてこの組換えDN
A分子を染色体外に自律複製及び維持することが可能なDNA配列を含む。この
ようなレプリコンは当技術分野で周知である。更に、原核レプリコンを含む態様
は、その発現により形質転換細菌宿主に薬物耐性を付与する遺伝子も含む。典型
的な細菌薬物耐性遺伝子はアンピシリン又はトラサイクリン耐性を付与する遺伝
子である。
えば大腸菌)においてこの構造遺伝子の発現(転写及び翻訳)を誘導することが
可能な原核プロモーターも含むことができる。プロモーターはRNAポリメラー
ゼの結合と転写を可能にするDNA配列により形成される発現制御エレメントで
ある。本発明のDNAセグメントを挿入するのに好都合な制限部位を含むプラス
ミドベクターは、一般に細菌宿主に適合可能なプロモーター配列を含む。このよ
うなベクタープラスミドの典型例はBiorad Laboratories(
Richmond,CA)から市販されているpUC8、pUC9、pBR32
2及びpBR329、Invitrogen(San Diego,CA)から
市販されているpRSET、並びにPharmacia(Piscataway
,N.J.)から市販されているpPL及びpKK223である。
現ベクターを使用しても本発明の組換えDNA分子を形成することができる。真
核細胞発現ベクターは当技術分野で周知であり、数種の業者から市販されている
。一般に、このようなベクターとしては所望DNAセグメントの挿入に好都合な
制限部位を含むものが提供される。このようなベクターの典型例はpSVL及び
pKSV−10(Pharmacia)、pBPV−1/pML2d(Inte
rnational Biotechnologies,Inc.)、pTDT
1(ATCC#31255)、pRc/CMV(Invitrogen,Inc
.)、実施例に記載する好適ベクター、並びに同種の真核発現ベクターである。
的組織に送達することが可能な成分を含む。利用可能なベクターは所望タンパク
質を発現し、予め選択されたターゲット組織に感染させる特徴をもつように構築
した「感染性」ベクター(例えば組換えDNAウイルス、アデノウイルス又はレ
トロウイルスベクター)である。本明細書に記載する複製コンピテントトリ肉腫
ウイルス(RCAS)が特に好ましい。
胞系を構築することができる。例えば、アデノウイルス発現ベクターを使用する
場合には、ポリペプチドのコーディング配列をアデノウイルス転写/翻訳制御複
合体(例えば後期プロモーターと3部分リーダー配列)に連結する。その後、こ
のキメラ遺伝子をin vitro又はin vivo組換えによりアデノウイ
ルスゲノムに挿入する。ウイルスゲノムの非必須領域(例えばE1又はE3領域
)に挿入すると、感染宿主でポリペプチドを発現することが可能な生存可能な組
換えウイルスが得られる(例えばLoganら,Proc.Natl.Acad
.Sci.,USA,81:3655−3659(1984)参照)。あるいは
、ワクシニアウイルス7.5Kプロモーターを使用してもよい(例えばMack
ettら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,79:7415
−7419(1982); Mackettら,J.Virol.,49:85
7−864(1984); Panicaliら,Proc.Natl.Aca
d.Sci.,USA,79:4927−4931(1982)参照)。染色体
外エレメントとして複製する能力をもつウシパピローマウイルスに基づくベクタ
ーが特に有用である(Sarverら,Mol.Cell.Biol.,1:4
86(1981))。このDNAをターゲット細胞に導入した直後に、プラスミ
ドは細胞当たり約100〜200コピーまで複製する。挿入したcDNAを転写
するためにプラスミドを宿主の染色体に組込む必要がないので、高レベルの発現
が得られる。これらのベクターはneo遺伝子等の選択マーカーをプラスミドに
加えることにより安定的発現に使用することができる。あるいは、ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列を宿主細胞に導入し、発現を誘導することが可能
なベクターとして使用できるようにレトロウイルスゲノムを改変してもよい(C
oneら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81:6349
−6353(1984))。非限定的な例としてメタロチオネインIIAプロモ
ーターや熱ショックプロモーター等の誘導プロモーターを使用して高レベル発現
を達成することもできる。
ーターに比較してサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターにより誘導され
るチミジンキナーゼ(TK)遺伝子治療による長期生存が研究されている。アデ
ノウイルスを介してCMVプロモーターにより誘導される単純ヘルペスウイルス
TK遺伝子治療の細胞死滅効力はRSVにより誘導される治療に比較して2〜1
0倍有効であることが判明した(Tongら,1999,Hybridoma
18(1):93−97)。低レベル発現後に高レベル発現の誘導を必要とする
遺伝子治療に用いるキメラプロモーターの設計も報告されている(Suzuki
ら,1996,Human Gene Therapy 7:1883−189
3)。
起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適当な発現調節エレメント(例
えばプロモーター及びエンハンサー配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化
部位等)と選択マーカーにより制御されるcDNAで宿主細胞を形質転換するこ
とができる。上述のように、組換えプラスミドにおける選択マーカーは選択耐性
を付与し、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に組込み、増殖してフォーカ
スを形成し、細胞系にクローニングして拡張できるようにする。
、選択培地に移す。多数の選択系を使用することができ、例えば非限定的な例と
して、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wiglerら,Cell,1
1:223(1977))、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ(Szybalskaら,Proc.Natl.Acad.Sci.
,USA,48:2026(1962))、及びアデニンホスホリボシルトラン
スフェラーゼ(Lowyら,Cell,22:817(1980))遺伝子を夫
々tk−、hgprt−又はaprt−細胞で使用することができる。また、代
謝阻害剤耐性付与遺伝子を選択基準として使用することもでき、例えばメトトレ
キセート耐性を付与するdhfr(Wiglerら,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.,USA,77:3567(1980); O’Hareら,P
roc.Natl.Acad.Sci.,USA,78:1527(1981)
)、ミコフェノール酸耐性を付与するgpt(Mulliganら,Proc.
Natl.Acad.Sci.,USA,78:2072(1981))、アミ
ノグリコシドG−418耐性を付与するneo(Colberre−Garap
inら,J.Mol.Biol.,150:1(1981))、及びハイグロマ
イシン耐性を付与するhygro(Santerreら,Gene,30:14
7(1984))の遺伝子が挙げられる。近年では他の選択遺伝子も記載されて
おり、即ちトリプトファンの代わりにインドールを細胞に利用させるtrpB、
ヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞に利用させるhisD(Hartma
nら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,85:804(19
88))及びオルニチンデカルボキシラーゼインヒビターである2−(ジフルオ
ロメチル)−DL−オルニチン(DFMO)耐性を付与するODC(オルニチン
デカルボキシラーゼ)(McConlogue L.,Current Com
munications in Molecular Biology,Col
d Spring Harbor Laboratory編,(1987))も
記載されている。
Wilson,1997,Clin.Exp.Immunol.107(Sup
.1):31−32; Bankら,1996,Bioessays 18(1
2):999−1007; Robbinsら,1998,Pharmacol
.Ther.80(1):35−47)。遺伝子導入とアンチセンス治療を治療
に利用できる可能性により、種々の組織を治療するために多数のベクター系が開
発されている(血管系、Stephanら,1997,Fundam.Clin
,Pharmacol.11(2):97−110; Feldmanら,19
97,Cardiovasc.Res.35(3):391−404; Vas
salliら,1997,Cardiovasc,Res.35(3):459
−69; Baekら,1998,Circ.Res.82(3):295−3
05; 腎臓、Lienら,1997,Kidney Int.Suppl.6
1:S85−8; 肝臓、Ferryら,1998,Hum Gene The
r.9(14):1975−81; 筋肉、Marshallら,1998,C
urr.Opn.Genet.Dev.8(3)360−5)。これらの組織に
加え、ヒト遺伝子治療の重要なターゲットは腫瘍自体と関連組織を含めた癌であ
る(Runnebaum,1997,Anticancer Res.17(4
B):2887−90; Spearら,1998,J.Neurovirol
.4(2):133−47)。
の具体例を以下に簡単に説明する。レトロウイルス送達は近年、Federsp
ielとHughes(1998,Methods in Cell Biol
.52:179−214)により記載されており、特にトリ白血病ウイルス(A
LV)レトロウイルスファミリーについて記載されている(Federspie
lら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,93:4931(1
996); Federspielら,Proc.Natl.Acad.Sci
.,USA,91:11241(1994))。更に、ALVとマウス白血病ウ
イルス(MLV)を含むレトロウイルスベクターがSvoboda(1998,
Gene 206:153−163)により記載されている。
応させることができる。例えば、マウス白血病ウイルス(MLV)系はKara
vanasら,1998,Crit.Rev.in Oncology/Hem
atology 28:7−30に記載されている。アデノウイルス発現系はV
on SeggernとNemerowによりGene Expression
Systems(Fernadez & Hoeffler編,Academ
ic Press,San Diego,CA,1999,第5章、112〜1
57頁)に記載されている。
きることが実証されている。例えば、1型単純ヘルペスウイルス(HSV)アン
プリコンベクターによりヒト扁平上皮細胞癌に効率的に遺伝子導入できることが
記載されている(Carewら,1998,Am.J.Surg.176:40
4−408)。単純ヘルペスウイルスは神経系への遺伝子導入に使用されている
(Goinsら,1997,J.Neurovirol.3(Sup.1):S
80−8)。HSV−TKを使用したターゲット特定自殺ベクターは実質腫瘍で
試験されている(Smileyら,1997,Hum.Gene Ther.8
(8):965−77)。1型単純ヘルペスウイルスベクターは結腸癌細胞で癌
遺伝子治療に使用されている(Yoonら,1998,Ann.Surg.22
8(3):366−74)。トランスフェクション時間を延ばすためにハイブリ
ッドベクターが開発されており、例えば肝細胞の治療用としてHSV/AAV(
アデノ随伴ウイルス)ハイブリッドが開発されている(Fraefelら,19
97,Mol.Med.3(12):813−825)。
されている(Peplinskiら,1998,Surg.Oncol.Cli
n.N.Am.7(3):575−88)。プリンヌクレオシドピロホスホリラ
ーゼを発現するチミジンキナーゼ欠失ワクシニアウイルスを腫瘍特定遺伝子治療
ベクターとして使用することが記載されている(Puhlmanら,1999,
Human Gene Therapy 10:649−657)。
ているが、AAVは哺乳動物細胞で最適複製及びパッケージングにヘルパーウイ
ルス(例えばアデノウイルス又はヘルペスウイルス)を必要とする(Snoec
kら,1997,Exp.Nephrol.5(6):514−20; Rab
inowitzら,1998,Curr.Opn.Biotechnol.9(
5):470−5)。しかし、感染性組換えAAVのin vitroパッケー
ジングが報告されており、この系は非常に有望になっている(Dingら,19
97,Gene Therapy 4:1167−1172)。同種指向性レト
ロウイルスレセプターcDNAをAAVにより導入すると、樹立一次ヒト細胞の
同種指向性レトロウイルス形質導入を実現できることが報告されている(Qin
gら,1997,J.Virology 71(7):5663−5667)。
ヒト野生型p53を発現するAAVベクターを使用する癌遺伝子治療が実証され
ている(Qazilbashら,1997,Gene Therapy 4:6
75−682)。AAVベクターを使用した血管細胞への遺伝子導入も報告され
ている(Maedaら,1997,Cardiovascular Res.3
5:514−521)。AAVは肝臓特異的遺伝子治療に適したベクターである
ことが実証されている(Xiaoら,1998,J.Virol.72(12)
:10222−6)。AAVベクターを脳組織と中枢神経系の遺伝子治療に使用
することも実証されている(Chamberlinら,1998,Brain
Res.793(1−2):169−75; Duringら,1998,Ge
ne Therapy 5(6):820−7)。更にAAVベクターは肺の遺
伝子治療とヒト嚢胞性線維症上皮細胞への遺伝子導入に関してアデノウイルスベ
クター(AdV)と比較検討されている(Teramotoら,1998,J.
Virol.72(11):8904−12)。
込型AdVを作製するために有用な量の各ウイルスを含むキメラAdV/レトロ
ウイルス遺伝子治療ベクター系も記載されている(Fengら,1997,Na
t.Biotechnology 15(9):866−70; Bilbao
ら,1997,FASEB J 11(8):624−34)。この強力な新世
代遺伝子治療ベクターはターゲット特定癌遺伝子治療に応用されている(Bil
baoら,1998,Adv.Exp.Med.Biol.451:365−7
4)。p53を発現するAdVを1回注射するだけでヒト前立腺癌細胞の皮下腫
瘍小節の増殖が抑制された(Asgariら,1997,Int.J.Canc
er 71(3):377−82)。進行した非小細胞肺癌をもつ患者にAdV
により野生型p53を遺伝子導入することが記載されている(Schulerら
,1998,Human Gene Therapy 9:2075−2082
)。この癌はAdVベクターによるp53遺伝子置換療法の対象にもなっている
(Rothら,1998,Semin.Oncol.25(3 Suppl 8
):33−7)。AdVによりp53を遺伝子導入すると、内皮細胞分化と血管
形成がin vivo抑制される(Riccioniら,1998,Gene
Ther.5(6):747−54)。転移メラノーマの免疫療法としてメラノ
ーマ抗原gp75をアデノウイルスにより発現させることも記載されている(H
irschowitzら,1998,Gene Therapy 5:975−
983)。AdVはヒト細胞の同種指向性レトロウイルス感染を助長し、レトロ
ウイルス感染効率を増加する(Scott−Taylorら,1998,Gen
e Ther.5(5):621−9)。AdVベクターは血管平滑筋細胞(L
iら,1997,Chin.Med.J.(Engl)110(12):950
−4)、扁平上皮細胞癌細胞(Goebelら,1998,Otolaryno
l Head Neck Surg 119(4):331−6)、食道癌細胞
(Senmaruら,1998,Int J.Cancer 78(3):36
6−71)、メサンギウム細胞(Nahmanら,1998,J.Invest
ig.Med.46(5):204−9)、グリア細胞(Chenら,1998
,Cancer Res.58(16):3504−7)、及び動物関節(Ik
edaら,1998,J.Rheumatol.25(9):1666−73)
への遺伝子導入に使用されている。より最近では、カテーテルを用いたAdVベ
クターによる心膜遺伝子導入が実証されている(Marchら,1999,Cl
in.Cardiol.22(1 Suppl 1):123−9)。適正な制
御遺伝子エレメントをもつAdV系を上手く操作すると、調節可能なin vi
voターゲット遺伝子発現がAdVにより可能になる(Burcinら,199
9,PNAS(USA)96(2):355−60)。
ムリキ森林熱ウイルスに由来するベクターで使用可能な発現カセットで形質転換
するのに適したパッケージング細胞系も開発されている(Poloら,1999
,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,96:4598−460
3)。非細胞変性フラビウイルスレプリコンRNAに基づく系も開発されている
(Varnavskiら,1999,Virology, 255(2):36
6−75)。自殺HSV−TK遺伝子を含むシンドビスウイルスベクターが腫瘍
細胞への細胞特異的ターゲティングに使用されている(Iijimaら,199
8,Int.J.Cancer 80(1):110−8)。
治療ベクターとして期待されている(Trobridgeら,1998,Hum
an Gene Therapy 9:2517−2525)。フォーミーウイ
ルスベクターは自殺遺伝子治療用に設計されている(Nestlerら,199
7,Gene Ther.4(11):1270−7)。組換えマウスサイトメ
ガロウイルス及びプロモーター系も高レベル発現用ベクターとして使用されてい
る(Manningら,1998,J.Virol.Meth.73(1):3
1−9; Tongら,1998,Hybridoma 18(1):93−7
)。
実現可能になった(Nakanishiら,1998,J.Controlle
d Release 54(1):61−8)。
れている。複製欠損ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に基づくベクターを使用し
た嚢胞性線維症の遺伝子治療が記載されている(Goldmanら,1997,
Human Gene Therapy 8:2261−2268)。レンチウ
イルスベクターにより肝臓及び筋肉に送達した遺伝子の持続発現も報告されてい
る(Kafriら,1997,Nat.Genet.17(3):314−7)
。しかし、安全性の問題が大きく、改良ベクターの開発が急速に進んでいる(K
imら,1998,J.Virol.72(2):994−1004)。HIV
LTR及びTatを検討すると、ベクターを開発するためのゲノムの編成に関
する重要な情報が得られる(Sadaieら,1998,J.Med.Viro
l.54(2):118−28)。このため、今日では有効なHIVに基づくベ
クターの遺伝要件が十分に理解されるようになった(Gasmiら,1999,
J.Virol.73(3):1828−34)。自己不活化ベクター又は条件
パッケージング細胞系が記載されている(例えばZufferyら,1998,
J.Virol.72(12):9873−80; Miyoshiら,199
8,J.Virol.72(10):8150−7; Dullら,1998,
J.Virol.72(11):8463−71; 及びKaulら,1998
,Virology 249(1):167−74)。HIVベクターによるヒ
トリンパ球及びCD34+細胞の効率的形質導入が報告されている(Dougl
asら,1999,Hum.Gene Ther.10(6):935−45;
Miyoshiら,1999,Science 283(5402):682
−6)。ネコ免疫不全ウイルス(HIV)レンチウイルスベクターによる非分裂
ヒト細胞の効率的形質導入が記載されており、HIVに基づくベクターの使用に
付随する安全性の問題を最小限にしている(Poeschlaら,1998,N
ature Medicine 4(3):354−357)。FIVベクター
によるヒト血液単核細胞の生産的感染が報告されている(Johnstonら,
1999,J.Virol.73(3):2491−8)。
これらの制限と欠点に対する対策が検討されている。例えば、遺伝子材料の操作
とウイルスベクターの作製を簡略化するために、簡略ウイルスパッケージング細
胞系以外に、ヒトヘルペスウイルス、1型単純ヘルペスウイルス(HSV−1)
及びエプスタイン−バールウイルス(EBV)から誘導されるミニウイルスベク
ターが開発されている(Wangら,1996,J.Virology 70(
12):8422−8430)。アダプタープラスミドはヘルパー非依存性レト
ロウイルスベクターへの外来DNA挿入を簡略化することが既に報告されている
(1987,J.Virology 61(10):3004−3012)。
ーも記載されている。上皮増殖因子/DNA多元系(EGF/DNA)の使用に
基づくターゲット特定非ウイルス遺伝子送達ベクターは効率的且つ特異的な遺伝
子送達を実現することが示されている(Cristiano,1998,Ant
icancer Res.18:3241−3246)。カチオンリポソームを
使用した血管系及びCNSの遺伝子治療が実証されている(Yangら,199
7,J.Neurotrauma 14(5):281−97)。カチオンリポ
ソームを使用した膵炎の一過性遺伝子治療も実施されている(Denhamら,
1998,Ann.Surg.227(6):812−20)。遺伝子送達用と
してキトサンに基づくベクター/DNA複合体も有効であることが示されている
(Erbacherら,1998,Pharm.Res.15(9):1332
−9)。3元系に基づく非ウイルスDNA送達ベクターも記載されている(Ki
mら,1998,53(1−3):175−82)。ウイルス粒子で被覆したリ
ポソーム複合体も遺伝子導入を実施するために使用されている(Hiraiら,
1997,Biochem.Biophys.Res.Commun.241(
1):112−8)。
による癌遺伝子治療も実証されている(Chenら,1998,Human G
ene Therapy 9:729−736)。直接注射遺伝子導入にはプラ
スミドDNAの作製が重要である(Hornら,1995,Hum.Gene
Ther.6(5):656−73)。改変プラスミドベクターが特に直接注射
に応用されている(Hartikkaら,1996,Hum.Gene The
r.7(10):1025−17)。
分野で公知である。これらのベクターは本発明の方法での使用に容易に適応でき
る。組換えDNA/分子生物学技術を使用する適当な操作により作動的に連結し
たSrc(活性又は不活性)を選択発現/送達ベクターに挿入すると、本発明の
実施に利用可能な多数の等価ベクターを作製することができる。
を提供し、したがって血管形成に依存している組織での事象に影響を与える。一
般的に、本方法は疾病仮定または状態に伴う組織に、血管形成調節量のSrcタ
ンパク質または活性化または不活性化Srcを発現する核酸ベクターを投与する
ことを含む。
器官は、皮膚、筋肉、消化管、結合組織、関節、骨および血管が血管形成刺激で
侵入することのできる同様の組織を含む疾患状態において、血管形成を補助でき
る。
その哺乳動物は用語「患者」に含まれることを意図しているが、その多くの実施
様態において本発明によって処置された患者は、望ましくはヒト患者である。こ
の文脈において、哺乳動物は血管形成を含む疾病に関連した組織の処置が好まし
いような任意の哺乳動物種、特に農業および家畜哺乳動物種を含むことが理解さ
れる。
量のSrcタンパク質またはSrcタンパク質を発現するDNAベクターを含む
生理学的に寛容な組成物を投与することを含む。
、タンパク質の形態およびその効力に依存する。この投与量は血管形成および血
管形成によって仲介される疾患症状が改善されるような望ましい効果を生じるの
に十分である。しかしながら投与量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不
全などの副作用を引き起こすほど多くすべきではない。一般的に、投与量は患者
の年齢、状態、性別および患者での疾患の程度によって変化し、当業者によって
容易に決定できる。投与量はまた任意の合併症の事象によって個々の医者によっ
て調整されうる。
パク質をコードする核酸の量であり、治療している組織での血管形成の検出可能
な調節、すなわち血管形成調節量を産出するのに十分である。血管形成の調節は
本明細書で記述したようなCAMアッセイによって、または当業者に周知の他の
方法によって測定しうる。
、または超過時間緩やかな点滴によって非経口的に投与できる。処置する組織は
典型的には全身投与によって体に注入し、したがってほとんど治療組成物の静脈
内投与によって可能であり、他の組織および送達方法がよく熟慮されうる。した
がって、本発明の組成物は静脈、腹腔内、筋肉内、皮下、海綿内、経皮で投与で
き、また蠕動性方法によって送達しうる。
る治療組成物は従来通り、たとえば単位投与量の注射によってのように静脈内に
投与できる。本発明の治療組成物に関して使用される場合の語「単位投与量」は
対象に対する一体的投与量として好ましい独立した単位をさし、それぞれの単位
は、必要な希釈剤、すなわち担体または賦形剤との結合による望ましい治療的効
果を産出するように計算された、所定の量の活性物質を含む。
直接の注射によって、または解剖学的に単離した区画を利用し、標的器官系の微
小循環、循環系の再灌流、または疾患組織に関連した血管系の標的領域の一時的
閉塞に基づいたをカテーテルを単離することにより行いことができる。
る量および時期は処置する対象、活性成分を使用するための対象の系の受容力お
よび望ましい治療的効果の程度に依存する。投与するのに必要な活性成分の正確
な量は担当医者の判断に依存し、それぞれの個人に対して特有である。しかしな
がら、全身投与に対する適切な投与量範囲は本明細書に開示されており、投与経
路に依存する。投与のための好ましい色素も変えることができるが、しかしその
後引き続く注射または他の投与によって1時間以上の間隔での繰り返し投与が続
く初期投与によって類型化される。あるいは、in vivo治療のために明記
した範囲での血中濃度を保持するのに十分な連続的な静脈内点滴が意図される。
うな疾患には、免疫および非免疫炎症のような炎症障害、慢性関節リウマチ症お
よび乾癬、糖尿病性網膜症のような血管の不適合で不適当な浸潤、血管形成緑内
障、再狭窄、アテローム性動脈硬化症プラークおよび骨粗鬆症での毛細管増殖お
よび固形腫瘍、固形腫瘍転移、血管線維腫、水晶体後線維増殖症、血管腫、カポ
ージ肉腫および腫瘍増殖を補助するために新生血管形成が必要な類似の腫瘍のよ
うな腫瘍関連障害が含まれるが、これらに限定されない。
の症状を改善し、疾患に依存しながら、疾患の治療に貢献できる。1つの実施様
態において、本発明は疾患状態に関連している組織での血管形成それ自身の阻害
を意図している。組織での血管形成の規模およびしたがって本法によって行われ
る阻害の規模は様々な方法によって評価されうる。
ている組織であり、阻害する血管形成は炎症組織の新生血管形成が起こっている
炎症組織血管形成である。この型において、本方法は、慢性関節炎リウマチ症の
患者のような関節炎組織での、免疫または非免液炎症組織での、乾癬組織等での
血管形成の阻害を意図する。
たは血管形成緑内障のような網膜疾患を持つ患者の網膜組織であり、阻害する血
管形成は網膜組織の新血管形成が存在する網膜組織血管形成である。
癌、乳癌、血管種または血管線維腫および類似の癌を持つ患者の腫瘍組織であり
、阻害すべき血管形成は腫瘍組織の新血管形成の存在する腫瘍組織血管形成であ
る。本方法によって処置可能な典型的な固形腫瘍組織には、肺、膵臓、乳、直腸
、喉頭、卵巣および類似の組織が含まれる。腫瘍増殖において重要な役割を新血
管形成が果たしていることから、腫瘍組織血管形成の阻害が特に好ましい。腫瘍
組織の新血管形成がない場合、腫瘍組織は必要な栄養を得られず、増殖が遅くな
り、さらなる増殖が終わり、退行し、最終的には結果として腫瘍の殺傷となる壊
死となる。
腫瘍新血管形成を阻害する方法を提供する。同様に、本発明は血管形成阻害方法
を実施することにより腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。
形成が原発腫瘍の血管形成を必要とすること、および(2)その第2の部位での
確立が転移の増殖を補助するために心血管形成を必要とすることから、転移の形
成に対して特に効果的でもある。
ために行った従来の化学療法のような他の治療との組合せで本方法を実施するこ
とを意図する。腫瘍組織への血液供給および栄養の供給により血管形成の回復を
誘導することで、毒性攻撃へ応答するであろう腫瘍組織において、化学療法の摂
生後に血管形成を阻害することが好ましいが、血管形成抑制剤の投与は典型的に
化学療法の間または後に行う。さらに、転移に対する予防として、固形腫瘍を取
り除いた手術後、血管形成阻害方法を処置することが望ましい。
殖の阻害、腫瘍転移形成の阻害および確立した腫瘍の退行のために適用できる。
への平滑筋細胞(SMC)遊走および増殖の工程である。再狭窄の間のSMCの
遊走および増殖は本方法にて阻害される血管形成の工程と考えることができる。
したがって、本発明はまた、血管形成工程にある患者での本方法による血管形成
を阻害することによる再狭窄の阻害をも意図する。再狭窄の阻害のために、冠状
血管壁が再狭窄の危険性があることから、典型的には約2から約28日間、より
典型的には処理後およそ最初の14日間、不活性チロシンキナーゼが典型的に再
狭窄処理後に投与される。
関連疾患の処置のために方法を実施するための本方法は、血管形成が起こってい
るまたは起こる危険性のある組織を、治療に効果的な量の不活性化Srcタンパ
ク質またはこのタンパク質を発現するベクターを含む組成物と接触させることを
含む。
た。活性化Srcタンパク質への追加的なまたは引き延ばされた曝露は7日間か
ら6週間の間が好ましく、好ましくは約14から28日間である。
の組織への投与が有用である。投与の経路および時期は本明細書以上で阻害につ
いて記述した方法と類似である。
図する。本発明の治療組成物には、活性成分としてその中に溶解または分散され
る本明細書で記述したようなSrcタンパク質またはSrcタンパク質を発現で
きるベクターと共に、生理学的に寛容な担体が含まれる。好ましい実施様態にお
いて、治療組成物は、治療の目的で哺乳動物またはヒト患者に投与したときに免
疫原性ではない。
およびそれらの文法的変化語は、それらが組成物、担体、希釈剤および薬剤を指
す場合、交換可能に使用され、この物質が悪心、めまい、胃逆流などの望ましく
ない生理学的効果の産出なしに、哺乳動物へまたは哺乳動物上に投与できること
を表す。
技術分野で周知であり、処方に基づいて限定する必要なない。典型的にはそのよ
うな組成物は液体溶液または懸濁液いずれかような注射可能なものとして調製し
、しかし、使用前に液体中に溶液または懸濁液として適当である固体形態も調製
できる。調製品は乳化してもよく、またはリポソーム組成物として存在すること
も可能である。
記載の治療的方法での使用に適切な量で混合できる。適切な賦形剤は、たとえば
水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたは類似物およびそ
れらの組合せである。さらに、所望であれば、組成物は少量の加湿剤または乳化
剤、pH緩衝液剤および活性成分の効果を増強する類似物などの補助物質を含ん
でよい。
を含んでよい。医薬的に許容可能な塩には、たとえば塩化水素またはリン酸など
の無機塩または酢酸、酒石酸、マンデル酸などの有機塩で形成される(ポリペプ
チドの遊離アミノ基と形成した)酸付加塩が含まれる。遊離カルボキシ基で形成
された塩はまた、たとえばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムま
たは鉄水酸化物などのような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチル
アミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有
機塩基から由来しうる。
の例は、活性成分および水以外に何の物質も含まないか、または生理学的pH値
、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水のような両方でのリン酸ナトリウムのよう
な緩衝液を含む無菌水性溶液である。またさらに、水性担体は、塩化ナトリウム
および塩化カリウムのような1つ以上の緩衝塩、デキストロース、ポリエチレン
グリコールおよび他の溶液を含みうる。
うな追加的な液相の例は、グリセリン、綿実油のような植物油および水油エマル
ションである。
rcタンパク質を発現するのに十分な組換え体DNA発現ベクターを含み、典型
的には総処置組成物の重量あたり少なくとも0.1重量パーセントのSrcタン
パク質の量を含むように処方される。重量パーセントはSrcタンパク質の総組
成物に対する重量の比である。したがって、たとえば0.1重量パーセントは1
00グラムの総組成物あたり0.1グラムのSrcタンパク質である。DNA発
現ベクターについて、投与された量は発現ベクターの特性、処置される組織およ
び同様の考慮に依存する。
物品を意図する。包装材料を含む製造物品は処置する疾患状態のために好ましい
ラベル付けおよび包装材料内に含まれる医薬剤を含む。
任意の組成物であり、開示された指示に従って本明細書で記述したような薬理学
的に許容可能な形態で処方される。したがって、組成物はSrcタンパク質また
はSrcタンパク質を発現することの可能なDNA分子を含むことができる。製
造物品は単一または複数投与量どちらかで、本明細書で示された状態の処置での
使用に十分な量の医薬剤を含む。
び本明細書で開示された類似の状態を処置するために、その中に含まれる医薬剤
の使用を示唆するラベルを含む。ラベルはさらに使用のための指示および売買に
必要であろうような関連した情報をも含む。包装材料は医薬剤の保存のための容
器を含んでよい。
ールおよび固定化した装置内に医薬剤を保持できる類似物のような材料を指す。
したがって、たとえば包装材料は、医薬剤を含有している薬理学的組成物を含む
ために使用した、プラスチックまたはガラスバイアル、薄板化包皮等の容器であ
り得る。
まれている医薬剤の使用を示している明確な表現であるラベルを含む。
うに解釈されるべきでない。さらに、現在知られており、後に発展する、当業者
の範囲内であるそのような本発明の変形は、本明細書の以下で請求する本発明の
意図の範囲内であることが考えられる。
Src cDNAを操作し、発現構築物/ベクター内に挿入した。
(配列番号2)に示し、コードされるアミノ酸残基配列を図2(配列番号3)に
示す。コードされたタンパク質配列はcDNAヌクレオチド位置112から17
13まで翻訳される。ヒトc−Src cDNA(配列番号4)の核酸配列に相
当する核酸配列およびコードされたアミノ酸残基(配列番号5)配列をそれぞれ
図3および4に示す。ヒトタンパク質配列について、コードする配列は、cDN
Aのヌクレオチド位置134から1486で始まる。
rc構築物をKaplanら,EMBO J.,13:4745−4756(1
994)によって記述されたような部位特異的変異誘発によって調製した。本発
明の方法で使用するための変異c−Srcタンパク質をコードする変異c−Sr
c構築物は、Laplanら,idに記述されている。Kaplanらは本発明
の実施に有用なさまざまな変異c−Src構築物およびコードされたタンパク質
を記述している。たとえば、Kaplanらはその図1で、SrcAおよびSr
c251を含むいくつかのチキンc−src対立遺伝子の産物を描写している。
議したように、1つの部類は血管形成を増加させるSrc分子を含み、したがっ
て活性タンパク質であると考えられる。様々な変異体と共に野生型Srcが本発
明で血管形成を誘導することが示されている。その血管増殖を誘導する、したが
ってインビボでの腫瘍重量を増加させる能力に関してこの文脈で機能する野生型
c−srcの1つの好ましい変異体は、アミノ酸(aa)残基位置527のチロ
シン527をフェニルアラニンに転化する点変異を持つSrcA変異体である。
この部位は通常c−Srcキナーゼによる負の調節の部位であり、キナーゼCS
Kとして呼ばれる。CSKが野生型srcのaa527をリン酸化するとき、こ
のタンパク質は不活性化する。しかしながら、変異体SrcAでは、調節チロシ
ンはフェニルアラニンに変更されており、したがって構造上(すなわち永久的に
)リン酸化による不活性化の対象ではない活性なタンパク質を提供する。
り、血管形成の刺激の代わりにそれを阻害する。そのような変異体は不活性sr
c変異という。この阻害活性を提供する変異を持つタンパク質はまたそれらが新
血管形成を阻害する優勢劣性Srcタンパク質としてよばれ、Srcの内因性活
性からの結果、同様に増殖因子刺激による増強したSrc活性を含む。したがっ
て本発明の野生型c−srcの特定の変異はまた、その血管増殖を阻害し、そし
てたとえばしたがってインビボで腫瘍受領を減少させる能力に関して優性陰性と
して機能できる。
1アミノ酸のみが発現しているSrc251を含む。この構築体は全キナーゼ領
域を欠き、したがって「キナーゼ死(kinase dead)」srcタンパ
ク質とよぶ。第2の構造は、リジンアミノ酸残基295をメチオニンに変異させ
たSrc(K295M)変異である。このキナーゼ領域での点変異はATP結合
を防止し、また血管細胞および腫瘍細胞信号および増殖に関連したキナーゼ依存
性Src機能を阻害する。
ンまたはメチオニンである限り、本発明は、結果として望まし位置でのかわりの
アミノ酸の存在が望ましい活性、血管形成促進調節活性を持つタンパク質となる
であろうことを意図する。
体が本発明での使用のために意図されている。srcタンパク質の望ましい調節
効果がそのままである限りは、望ましいsrcタンパク質(変異体またはその断
片)を発現したアミノ酸タグ、抗原性エピトープ、蛍光タンパク質または他のそ
のようなタンパク質またはペプチド結合をさせている融合タンパク質構築物をも
意図する。
物(配列番号1)である。この発現ベクターはタイターの改善のための増強した
ブライアンポリメラーゼ(BP)をもつ連続した複製応答鳥類肉腫ウイルスを基
にしており、正常鳥類細胞に発現しているA型包皮糖タンパク質に特異的である
(Method in Cell Biology,52:179−214(1
997)で概説されている。またHughesら,1987,J.Virol.
61:3004−3012; Fekete & Cepko,1993.Mo
l.Cellular Biol.13(4):2604−2613: Ito
hら,1996,Development 122:291−300; Sto
ttら,1998.Bio Techniques 24:660−666も参
照のこと)。RCASBP(A)の完全な配列(配列番号1)を付属した配列表
に記し、構築物の制限酵素マップを図10に描写し、本明細書ではRCASとよ
ぶ。
にてPam Schwartzberg博士によってサブクローン化された。簡
単に記すと、その発現のためのsrc cDNA配列のクローン化を、NotI
−BstBI−NotI制限酵素部位を含んでいるリンカーをSrc251の5
’末端の固有NotI部位に挿入して行った。Srcは3’末端に固有のCla
I部位を持つ。BstBIおよびClaIでのSrc251の消化によりBst
BI−ClaI断片を生成し、ついでRCASBP(A)上のClaI部位に連
結した。BstBI突出部はClaIで再切断しないClaI突出部との連結を
可能にする。本発明の実施での使用に適切なsrc構築物は、Src251を含
むRCASベクターをNotIおよびClaIでまず消化することで上記ベクタ
ー内で容易に入手し(DAM+バックグラウンド中)、同様に消化したSrc
cDNAの挿入を可能にする。したがって、Src251を含むこの最初のRC
ASBP(A)構築物をさらに、上でおよびKaplanら,(1994,Th
e EMBO J.13(20):4745−4756)に記述されたようなす
べての他のSrc構築物を、Src251構築物を介して生成したNotI−C
laI断片によってRCASBP(A)内にサブクローン化するのに使用した。
cDNA内に望ましいc−src変異体を産出するために、当業者によく知られ
ている標準部位特異的変異誘発手法を使用した。望ましい変異を挿入するように
設計したPCRプライマーをまたひき続クローニング工程を容易にするために制
限部位も設計した。核酸配列をコードするSrcの全セグメントを、チキン、ヒ
トおよびSrcの同様な類似物の公知のcDNA配列に基づいたPCR増幅技術
および引き続く新規構築物の形成を介して核酸構築物より検出した。
PCRプライマーはまたインフレーム配列についてコードする。このプライマー
の使用により9E10−mycエピトープタグを続くSrc構築物のカルボキシ
ル末端へ加えた。
トープタグを含むベクター構築物を生成した。VDMEQKLIAEEDLN(
配列番号6)。2つの別々のPCRをそれぞれの構築物で実施し、同様の結果を
得た。PCRによって構築したすべての変異体構築物をまたPCRによって配列
決定し、クローンの予期したDNA配列を確認した。本発明の発現系での使用の
ための野生型および変異Src cDNAはまた、ヒトと同様鳥類のsrcおよ
び様々なキナーゼ死および活性化変異形を販売しているUpstate Bio
tech Laboratories,Lake Placid,NYより入手
した。
米国特許第4,797,368号、第5,173,414号、第5,436,1
46号、第5,589,377号および第5,670,488号で記載されたよ
うなアデノウイルスベクターを含む。Src調節タンパク質の送達の他の方法に
は、米国特許第5,675,954号に記載のような非ウイルスベクター系での
Src cDNAの送達および米国特許第5,589,466号に記載のような
裸のままのDNAとしてのcDNAそれ自身の送達が含まれる。本発明の構築物
の送達はまた、以下CAMアッセイ系で記述したようなウイルスベクターの局所
投与に限定されない。たとえば、ウイルスベクター調製品はまた、血管床内への
全身送達のために静脈床内に注射される。これらのベクターはまたたとえば例と
して腫瘍の局所注入による新血管形成の増加部位へ目標を定めうる。
有効な方法で選択されたSrcタンパクの発現と精製に続いて送達することが意
図されている。そのような方法の1つは、米国特許第4,356,167号、第
5,580,575号、第5,542,935号、第5,643,599号に記
述されているようなリポソ−ム送達系を含む。その他のベクターやタンパク質送
達系は本発明のSrcタンパクの発現および/または送達で用いるために当業者
に周知である。
ヨコ漿膜(CAM)に誘導されうる。血管形成はLeibovichら,Nat
ure,329:630(1987)およびAusprunkら,Am.J.P
athol.,79:597(1975)で記述されているように、特異的なサ
イトカインあるいは腫瘍断片への応答として誘導されることが示されている。C
AMをヒヨコの胎児から、その後の血管形成と、その阻害のために調製した。1
0日齢のヒヨコ胎児をMclntyre Poultry(Lakeside、
CA)から得、37℃、湿度60%でインキュベートした。小型クラフトドリル
(Dremel、Division of Emerso Electric
Co.Racine WI)を用いて、卵の端の気嚢の上をまっすぐに殻を通し
て小さな穴をあけた。二番目の穴を、あらかじめ卵をろうそくの灯に照らして調
べた胎児の血管のない領域で卵の広い側面上にあけた。元の穴に負の圧力をかけ
、CAM(漿膜)を殻膜から引き離し、CAMのまわりに偽性の気嚢を生み出し
た。小型モデル摩擦輪(Dremel)を用いて、滴下したCAMのまわりの殻
を通って1.0cm×1.0cm四方の窓を切り取った。この小さな窓は下にあ
るCAMに直接接触させておいた。
用いられたモデルに関連するCAMに付加的な処理をせずに、胚形成の6日目、
活性新血管形成で標識された段階であるいは血管形成が静まる胚形成の10日目
で用いた。後者の調製品をしたがって本発明で、以下に述べるようにサイトカイ
ン処理あるいは腫瘍接触への応答で回復血管形成の誘導のために用いた。
る。
ution、HBSS、GIBCO、Grand Island、NY)、ある
いは2μg/mの組換え体塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)あるいは血管
内皮細胞増殖因子(VEGF)(Genzyme、Cambridge、MA)
を含むHBSSで飽和した5mm×5mm Whatmanフィルターディスク
(Whatman Filter paper NO.1)を血管を避け、窓を
テープで貼り付けた領域で、9日または10日どちらかのヒヨコ胎児のCAM上
に置くことにより、血管形成を誘発した。他濃度の増殖因子もまた、血管増殖の
誘導に効果的である。アンタゴニストの静脈注射による血管形成阻害の起こる場
所のアッセイのために、最初に繊維芽細胞成長増殖培地中1−2μg/mlのb
FGFあるいはVEGFで血管形成を誘発した。72時間後に血管形成を光学顕
微鏡で監視した。
調製品は先に述べたような6日目ヒヨコ胎児である。発生のこの段階では、血管
は新たな増殖をうけ、本発明のSrcタンパク質による血管形成の調節を評価す
るのに有用な系を提供する。CAM系は、アッセイを胎児の9日目あるいは10
日目よりもむしろ6日目で行うということをのぞいて、上で述べたように調製し
た。
、10日齢ヒヨコCAM調製品で行った。実施例1で記述したように準備した5
μgのRCAS構成物をヒヨコ不滅化繊維芽細胞株DF−1(Minn.のDo
ug Fosterよりいただいた)にトランスフェクトした。この細胞株は初
期ヒヨコ胎児繊維芽細胞と同様ウイルス産出能を持つが、DF−1細胞株はより
高い力価を産出した。血清を含まないCLM培地(構成物:DMSOを含むF−
10培地塩基、葉酸、グルタミン酸、MEMビタミン溶液)中、サブコンフレン
トのDF−1産出細胞株からウイルス性の上清を回収した。35mlのウイルス
性上清を、4℃、22.000rpm、2時間の超遠心分離で濃縮した。これら
の濃縮したウイルス性沈殿物を、血清を含まないCLM培地でもとの量の1/1
00に希釈し、分割し、−80℃で保存した。RCAS−GFPと呼ばれる、緑
色蛍光タンパク質(GFP)をコードしているヌクレオチド配列を持つ対照ウイ
ルスベクターの段階希釈物を、48から72時間保温した初期ヒヨコ胎児繊維芽
細胞に感染させることにより力価を評価した。以下の濃度を定常的に得られたウ
イルスストックの力価は108l.u./mlを超えた。ウイルスストックを用
いたCAMアッセイのために、95%エタノール中30分間、3mg/mlコル
チゾンアセテートを浸した直径6mmのコルチゾン浸漬Whatmanフィルタ
ーディスクを用意した。ディスクを層流フードで乾燥し、次いでディスクごと2
0μlのウイルスストックに10分間浸漬した。これらのディスクを9日目ある
いは10日目のヒヨコ胎児のCAMに接触させ、セロファンテープで貼り付け、
37℃で18−24時間インキュベートした。ついでモックPBSまたは増殖因
子のどちらかを5μg/mlの濃度で、CAM組織に対するウイルスの付加的な
増加としての適当なウイルスストック20μl中のCAMに加えた。72時間後
、CAMを回収し、ディスクの下にあるCAM中の分岐点の数の両盲目計測によ
り決定された血管形成性指標の変化を試験した。キナーゼアッセイのために、デ
ィスクに下の組織をRIPA中に回収し、電動摩砕機で均質化し、全タンパク質
の等価量から免疫沈降し、FAK−GST融合タンパク質を基質として用いたイ
ンビトロキナーゼアッセイにかけた。免疫蛍光研究のために、ディスクの下にあ
るCAM組織をOCT中に凍結し、低温保存的に、4μmに切断し、1分間アセ
トンで固定し、通常の3%ヤギ血清中で1時間保温し、次いで、先に記述された
ように(Eliceiriら,J.Cell Biol.,140:1255−
1263(1998))一次ウサギ抗リン酸化ERK抗体中でインキュベートし
、PBSで洗浄し、蛍光二次抗体で検出した。
以下のアッセイを行った。2時間bFGFまたはVEGF(2μg/ml)に暴
露した10日齢ヒヨコCMA組織抽出物を溶解させた。内因性Srcを等量の総
タンパク質より免疫沈降し、基質としてGST融合タンパク質を用いたインビト
ロ免疫複合キナーゼアッセイにかけ、電気泳動し、ニトロセルロースに移した。
表示である未処理(モック)サンプルと比較して、bFGFまたはVEGFどち
らかでのゲルの密度の増加における証拠である図5に示した。bFGFおよびV
EGF両方がCAMに存在する内因性Src活性の約2倍の増加に帰着した。上
記キナーゼアッセイブロットをまた、同等のSrcおよびIgG含量に対するロ
ーディング対照として抗Src抗体でプローブ化した。
発現の影響 以下のアッセイをCMA調製品での血管形成における変異Srcタンパク質の
影響を査定するために行った。このアッセイのために、9日齢ヒヨコCAMをR
CAS−SrcAまたはRCAS−GFP発現レトロウイルスまたは緩衝液に上
述したプロトコールの後72時間暴露した。
した。代表的な顕微鏡写真(4×)を図6Bに示したようにステレオ顕微鏡でと
った。基準内因性Src活性をおよそ50の血管形成指数とした。一方、チロシ
ンからフェニルアラニンにアミノ酸残喜一527での点変異を持つレトロウイル
スベクター発現RCAS−SrcAで処理したCAMはおよそ90の血管形成指
数の血管形成増強(誘導)となった。Src−A仲介血管形成の増強はまた図6
Bで示した顕微鏡写真であきらかである。
する 増殖因子VEGFおよびPMAと比較したSrcAの、血管MAPキナーゼリ
ン酸化に対する効果も、上記およびここで記載したアッセイ手順に従って評価し
た。VEGFまたはPMA(匹敵する濃度の別のマイトジェン)に30分間曝露
した10日齢のヒヨコCAMの組織抽出物を、SrcA発現レトロウイルスで4
8時間感染させたものと比較した。次いで、Srcを等量の全タンパク質抽出物
から免疫沈降し、基質としてFAK−GST融合タンパク質を使用してインビト
ロ免疫複合体キナーゼアッセイにかけ、電気泳動し、ニトロセルロースに移した
。
内因性Src媒介血管MAPキナーゼリン酸化を示す。VEGFおよびPMAは
両方共、基線の約2倍の増加をもたらした。これに対し、SrcAは非処置サン
プルで見られるものの約5−10倍活性を増強した。
抗体でイムノブロットすることにより、内因性ERKリン酸化についても測定し
た。この評価のために、10日齢のCAMを、偽RCASまたはSRC Aを発
現するRCASで感染させた。2日後、CAMを解剖し、OCTに凍結保存し、
4μmに切片化した。切片を抗リン酸化ERK抗体(New England
Biolabs)で免疫染色し、洗浄し、ヤギ抗ウサギFITCコンジュゲート
二次抗体で検出した。蛍光イメージを冷却CCDカメラ(Princeton
Inst.)で捕獲した。顕微鏡写真により、偽対照と比べてSrcA処置調製
物での免疫蛍光の増強が示される。
のアッセイを実施した。9日齢のヒヨコCAMを、前記したSrc251または
Src K295Mと称されるドミナントネガティブなSrc変異を発現するレ
トロウイルスベクター調製物に曝露した。RCAS−Src251または対照R
CAS−GFPレトロウイルスまたは緩衝液CAMSを20時間処理し、次いで
さらに72時間bFGFまたはVEGFの存在下または非存在下でインキュベー
トした。
、代表的な顕微鏡写真(6×)は、立体顕微鏡で撮影した。図8Cは、抗Src
抗体でプローブしたブロットを示し、偽処置と比較したトランスフェクト細胞で
のSrc251発現を確認する。
VEGF処置CAMSの両方が、偽または非処置CAM調製物で見られるSrc
媒介基線血管形成以上の血管形成を誘導したことを示す。発現されたドミナント
ネガティブな変異体Src251は、VEGF誘導血管形成を基線レベルまで阻
害するのに効果的であったが、bFGF媒介血管形成の阻害には効果的でなかっ
た。図8Bで示した顕微鏡写真は図8Aで示したデータを写真で確認する。従っ
て、レトロウイルス発現Src251は、血管形成がVEGFで誘導される場合
、効果的な血管形成阻害剤である。
を適用することは本発明により考えられる。
瘍組織増殖の退行 増殖因子誘導血管形成に対するSrc修飾因子の効果は、眼の角膜により例示
されるような天然に透明な構造で観察できる。新規血管は、豊富な血液供給のあ
る角膜の縁から、通常血液供給のない角膜中心へと増殖する。bFGFなどの血
管形成刺激物質は、角膜に適用すると、角膜の縁からの新規血管の増殖を誘導す
る。角膜に適用した血管形成アンタゴニストは、角膜の縁からの新規血管の増殖
を阻害する。従って、角膜は、内皮細胞の侵入を通して、角膜の縁から、容易に
見える硬いコラーゲン濃縮角膜組織への血管形成を受ける。ウギ眼モデルアッセ
イはそれ故、眼の角膜に直接化合物を埋め込んだ後の、直接的な血管形成の刺激
および阻害の観察のインビボモデル提供する。
アッセイで誘導され、以下の章で記載する。
.Natl.Acad.Sci.USA、91:4082−4085(1994
)により調製する。個々のペレットは、増殖因子を安定化し、周辺組織へのゆっ
くりとした放出を確かにするスクラルフェート(Carafet、Marion
Merrell Dow Corporation)に別々に結合した650
ngの増殖因子を含む。さらに、前記の所望のSrc発現レトロウイルスを含む
ハイドロンペレットを調製する。ペレットは、その表面に2.5mmの穴を穿孔
した特別に調製したテフロンペグに鋳造する。約12μlの鋳造物質を各ペグに
入れ、一晩無菌フード中で重合する。次いでペレットを紫外線照射により滅菌す
る。次いで、Srcタンパク質の効果を前記のように評価する。
組織増殖のインビボ退行 インビボキメラマウス:ヒトモデルを、SCIDマウスの皮膚の一部をヒト新
生児包皮で置換することにより作成する。インビボキメラマウス:ヒトモデルは
、本質的にYanら、J.Clin.Invest.91:986−996(1
993)に記載のように調製する。簡潔には、2cm2平方領域の皮膚をSCI
Dマウス(6−8週令)から外科的に除去し、ヒト包皮と置換する。マウスを麻
酔し、剪毛により腹側部の各側の5cm2領域から毛を除去する。2つの2cm 2 の環状移植床を、筋膜までの全厚の皮膚を除去することにより調製する。ヒト
新生児包皮から得た同サイズの全厚ヒト皮膚移植片を創傷床に配置し、縫合する
。移植片をバンドエイドで覆い、皮膚に縫合する。ミクロ細孔布巻尺も創傷に適
用する。
TB26;mAb LM609との組織切片の免疫反応性によりαβ3陰性)を
使用して、SCIDマウス上のヒト皮膚移植片上に充実ヒト腫瘍を形成する。5
×106M21−LまたはMDA23.1細胞の単一細胞懸濁液を、ヒト皮膚移
植片に皮内注射する。次いで、マウスを2−4週間観察し、測定可能なヒト腫瘍
を増殖させる。
マウス尾静脈に注射する。2−3週間後、腫瘍を切出し、重量および組織学によ
り分析する。次いで、本発明の発現されたSrcタンパク質の腫瘍に対する効果
を評価する。
インビトロ退行 腫瘍増殖は血管形成に依存する(Folkman、1992;Weidner
ら、1991;Brooksら、1994b)。事実、近年の報告により、腫瘍
増殖はVEGF受容体アンタゴニストの抗血管形成効果に感受性であることが示
唆される(Kimら、1993)。それ故、我々は、キナーゼ欠失Src251
の送達による血管形成の抑制が、VEGFを産生しほとんどbFGFを産生しな
いことが知られる高度に血管形成性の腫瘍である、ヒト髄芽腫(DAOY)の増
殖に影響を及ぼすかどうかを調べた(データは示していない)。
ヒヨコCAMで実施した(Brooksら、1994)。10%ウシ胎児血清を
含むRPMI 1640中で培養した5×106DAOY細胞を洗浄し、10日
齢の胚のCAMに接種し、DAOY腫瘍断片を産生した。7日後、50mgの腫
瘍断片を解剖し、別の10日齢の胚に再度接種し、さらに3または6日間、対照
RCAS−GFPレトロウイルス、RCAS−Src251または偽処置を局所
適用(25μl)してインキュベートした。指針として感染腫瘍の全組織共焦点
イメージングを使用して、我々は、この局所アプローチで、腫瘍断片付近および
その中でRCAS作成物の有意な発現があることを決定できた。腫瘍切除および
秤量を二重盲検様式で実施し、容易に規定できる充実腫瘍塊のみを除去した(B
rooksら、1994)。3または6日後の湿潤腫瘍重量を最初の重量と比較
し、腫瘍重量の比率変化を各群について決定した。
、トリ特異的RCASレトロウイルスの使用によりトリ由来腫瘍脈管構造を選択
的に標的化できる。
をレトロウイルスにより送達すると腫瘍増殖は逆転することを示す結果を示す。
図9Aは、上記したようにヒヨコ胚のCAM上で増殖したヒト髄芽腫を示す。R
CAS−GFPまたはRCAS−Src251を含むレトロウイルスを、50m
g以上の前以て確立された腫瘍に局所適用した。GFPを発現するRCAS−G
FPで感染した髄芽腫腫瘍断片の代表的な顕微鏡写真により、バイオラッドレー
ザー共焦点走査顕微鏡(バー=500μm)を用いた光学切片化により検出した
腫瘍血管での排他的な発現(矢印)が判明する。図9Bは、3または6日間増殖
させ、その後切除し湿潤重量を決定した上記のように処置した腫瘍の結果を示す
。データは、2つの複製物の腫瘍重量の平均変化(50mgの腫瘍開始重量から
)+/−標準誤差として表す。RCAS−Src251は、腫瘍増殖に対する有
意な影響を3日後(*、P<0.002)および6日後(**、P<0.05)
に示した。図9Cは、胚から外科的に除去した髄芽腫腫瘍の代表的な立体顕微鏡
写真をオリンパス立体顕微鏡(バー=350μm)で撮影したことを示す。(下
のパネル)各腫瘍の高倍率顕微鏡写真は詳細に各腫瘍の脈管構造を示す(バー=
350μm)。矢印は、RCAS−Src251処置腫瘍での血管破壊を示す。
より、腫瘍感染血管での選択的ウイルス発現が生じ(図9A)、これは最終的に
6日間以内にこれらの腫瘍の退行をもたらす(図9B)。重要なことに、Src
251を含むウイルスで処置した動物の腫瘍関連血管は重度に破壊し、対照動物
の腫瘍血管と比べて数が少なかった(図9C)。RCAS−GFP感染腫瘍は腫
瘍脈管構造にのみGFP局在を示すという事実は、レトロウイルス送達Src2
51で観察された抗腫瘍効果は抗血管形成特性に起因することを示唆する。
ない。本発明はまた、提出された細胞系により範囲を限定されない。なぜなら提
出された実施形態は本発明の1つの態様の1つの説明として捉えられるからであ
る。機能的に等価のいずれの細胞系も本発明の範囲内にある。物質の提出は、こ
こに含まれる記述が、その最善の形態を含む、本発明の任意の態様の実践を可能
とするに不十分であるという承認にはならず、また、請求の範囲を、それが示す
特定の説明に限定するとは解釈されない。実際、本明細書で示され記載されたも
のに加えて本発明の様々な修飾が、前記から当業者には明らかとなり、添付の請
求の範囲内に該当する。
に記載されたイントロンの欠失した完全コーディング配列を表すニワトリc−S
rcのcDNA配列である。この配列はGenBankから登録番号J0084
4で入手できる。該配列は1759ヌクレオチドを含み、タンパク質コーディン
グ部分はそれぞれ112位で開始し、1713位で終止する。
基配列である。
A,88:10411−10415(1991)によって最初に記載されたヒト
c−SrcのcDNA配列である。この配列はGenBankから登録番号X5
9932 X71157で入手できる。該配列は2187ヌクレオチドを含み、
タンパク質コーディング部分はそれぞれ134位で開始し、1486位で終止す
る。
列である。
を示す。図の上部は、bFGF及びVEGFによる内因性c−Srcのin v
itroキナーゼアッセイの結果を活性化倍率と共に示す。図の下部は、均等な
Src及びIgGの含量に対してローディングコントロールとして抗−Src抗
体でプローブしたキナーゼアッセイブロットを示す。
ロウイルス介在c−Src A遺伝子発現の効果を示す。9日齡のニワトリCA
MをRCAS−Src A(活性の突然変異c−Src)またはコントロールR
CAS−GFP(緑色系蛍光タンパク質;蛍光性指示タンパク質)レトロウイル
スまたはバッファに72時間接触させた。図6Aは血管形成レベルの定量を示し
、図6Bは立体顕微鏡で撮影した各処理サンプルの代表的顕微鏡写真(4×)に
対応する。
ス発現を示す。図7Aは、VEGFもしくはPMAに30分間接触させたかまた
はc−Src Aレトロウイルスを48時間感染させた10日齡のニワトリCA
Mの組織抽出物を示す。NTは処理せずを表す。Srcを均等量の全タンパク質
抽出物から免疫沈降させ、FAK−GST融合タンパク質を基質として用いてi
n vitro免疫複合体キナーゼアッセイで処理し、電気泳動させ、ニトロセ
ルロースフィルターに転移させた。上記の全組織溶解物のアリコートの内因性E
RKリン酸化を抗−ホスホ−ERK抗体でイムノブロッティングすることによっ
て測定した。図7Bは、擬似RCASまたはSRC Aを含有するRCASを感
染させた10日齡のCAMを示す。2日後、CAMを摘出し、OCT中で凍結保
存し、4μmで切開した。切片を抗リン酸化ERK抗体(New Englan
d Biolabs)で免疫染色し、洗浄し、ヤギ抗−ウサギFITC−コンジ
ュゲート第二抗体で検出した。冷却したCCDカメラ(Princeton I
nst.)で蛍光像を撮影した。
件を示す。9日齡のニワトリCAMをRCAS−Src 251またはコントロ
ールRCAS−GFPレトロウイルスまたはバッファに20時間接触させ、次い
でbFGFまたはVEGFの存在下または非存在下で更に72時間インキュベー
トした。図8Aは、上述のように定量した血管形成レベルを示し、図8Bは、立
体顕微鏡で撮影した代表的顕微鏡写真(6×)を示す。図8Cは、トランスフェ
クト細胞中のSrc 251の発現を確認するために抗−Src抗体でプローブ
したブロットを擬似処理に比較して示す。
結果を示す。図9Aは、Bio Radレーザー共焦点走査型顕微鏡で光学セク
ショニング(bar=500μm)によって検出した腫瘍血管(矢印)中でGF
Pだけを発現するRCAS−GFP(RCAS−緑色系蛍光タンパク質)に感染
させたヒト髄芽細胞腫フラグメントを示す顕微鏡写真である。図9Bは、レトロ
ウイルスの局所塗布によって処理し、3日間または6日間増殖させた後、切除し
、湿潤重量を計量した腫瘍から得られたデータを示す。データは2つの重複サン
プルの腫瘍重量の平均変化(初期腫瘍重量50mgからの変化)±SEMとして
表される。図9Cは、胚から外科的に摘出された髄芽細胞腫の顕微鏡写真(ba
r=350μm)を表す。下段パネルは各腫瘍の脈管構造を詳細に示す各腫瘍の
高倍率写真である(bar=350μm)。矢印はRCAS−Src251−処
理腫瘍中の血管破壊を示す。
Claims (38)
- 【請求項1】 パッケージ用材料と前記パッケージ用材料に収容された医薬
組成物とから成り、前記医薬組成物が疾患状態に関連する組織中の血管形成を変
調する能力を有しており、前記パッケージ用材料は、前記医薬組成物が血管形成
の変調によって疾患状態を治療するために使用できることを示すラベルを含んで
おり、前記医薬組成物がSrcタンパク質または該タンパク質を発現し得るヌク
レオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とする製品。 - 【請求項2】 前記Srcタンパク質が活性Srcタンパク質であり、前記
変調が血管形成を増強することを特徴とする請求項1に記載の製品。 - 【請求項3】 前記活性Srcタンパク質がSrc Aであることを特徴と
する請求項2に記載の製品。 - 【請求項4】 前記組織で循環不良が生じていることを特徴とする請求項2
に記載の製品。 - 【請求項5】 前記チロシンキナーゼSrcタンパク質が不活性Srcタン
パク質であり、前記変調が血管形成を阻害することを特徴とする請求項1に記載
の製品。 - 【請求項6】 前記不活性Srcタンパク質がSrc 251またはSrc
K295Mであることを特徴とする請求項5に記載の製品。 - 【請求項7】 前記組織に炎症があり、前記状態が関節炎またはリューマチ
様関節炎であることを特徴とする請求項5に記載の製品。 - 【請求項8】 前記組織が固形腫瘍または固形腫瘍転移であることを特徴と
する請求項5に記載の製品。 - 【請求項9】 前記投与が化学療法と共に行われることを特徴とする請求項
8に記載の製品。 - 【請求項10】 前記組織が網膜組織であり、前記状態が網膜症、糖尿病性
網膜症または黄斑変性であることを特徴とする請求項5に記載の製品。 - 【請求項11】 前記組織が冠状血管形成部位に存在し、前記状態が再発狭
窄症であることを特徴とする請求項5に記載の製品。 - 【請求項12】 前記投与が、静脈内、経皮、滑液嚢内、筋肉内または経口
投与であることを特徴とする請求項1に記載の製品。 - 【請求項13】 前記投与が単一用量の静脈内投与から成ることを特徴とす
る請求項1に記載の製品。 - 【請求項14】 前記医薬組成物が更にリポソームを含むことを特徴とする
請求項1に記載の製品。 - 【請求項15】 前記医薬組成物が前記ヌクレオチド配列を発現させ得るウ
イルス性発現ベクターを含むことを特徴とする請求項1に記載の製品。 - 【請求項16】 前記医薬組成物が前記ヌクレオチド配列を発現させ得る非
ウイルス性発現ベクターを含むことを特徴とする請求項1に記載の製品。 - 【請求項17】 疾患状態に関連する組織中の血管形成を変調するために、
Srcタンパク質または該タンパク質を発現し得るヌクレオチド配列を含む医薬
組成物を前記組織に投与することを特徴とする方法。 - 【請求項18】 前記Srcタンパク質が活性Srcタンパク質であり、前
記変調が血管形成を増強することを特徴とする請求項17に記載の方法。 - 【請求項19】 前記活性Srcタンパク質がSrc Aであることを特徴
とする請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】 前記組織で循環不良が生じていることを特徴とする請求項
18に記載の方法。 - 【請求項21】 前記Srcタンパク質が不活性Srcタンパク質であり、
前記変調が血管形成を阻害することを特徴とする請求項17に記載の方法。 - 【請求項22】 前記不活性Srcタンパク質がSrc 251またはSr
c K295Mであることを特徴とする請求項21に記載の方法。 - 【請求項23】 前記組織に炎症があり、前記状態が関節炎またはリューマ
チ様関節炎であることを特徴とする請求項21に記載の方法。 - 【請求項24】 前記組織が固形腫瘍または固形腫瘍転移であることを特徴
とする請求項21に記載の方法。 - 【請求項25】 前記投与が化学療法と共に行われることを特徴とする請求
項24に記載の方法。 - 【請求項26】 前記組織が網膜組織であり、前記状態が網膜症、糖尿病性
網膜症または黄斑変性であることを特徴とする請求項21に記載の方法。 - 【請求項27】 前記組織が冠状血管形成部位に存在し、前記組織に再発狭
窄症の危険があることを特徴とする請求項21に記載の方法。 - 【請求項28】 前記投与が、静脈内、経皮、滑液嚢内、筋肉内または経口
投与であることを特徴とする請求項17に記載の方法。 - 【請求項29】 前記投与が単一用量の静脈内投与から成ることを特徴とす
る請求項17に記載の方法。 - 【請求項30】 前記医薬組成物が更にリポソームを含むことを特徴とする
請求項17に記載の方法。 - 【請求項31】 前記医薬組成物が前記ヌクレオチド配列を発現させ得るレ
トロウイルス性発現ベクターを含むことを特徴とする請求項17に記載の方法。 - 【請求項32】 前記医薬組成物が前記ヌクレオチド配列を発現させ得る非
ウイルス性発現ベクターを含むことを特徴とする請求項17に記載の方法。 - 【請求項33】 核酸を含むウイルス性遺伝子導入ベクターと医薬として許
容される担体または賦形剤とから成り、前記核酸がsrcタンパク質をコードす
る核酸セグメントを有しており、前記srcタンパク質がコドン527にチロシ
ン、セリンまたはトレオニン以外の任意のアミノ酸残基を有することを特徴とす
るターゲット哺乳類組織中の血管形成を促進する医薬組成物。 - 【請求項34】 核酸を含む非ウイルス性遺伝子導入ベクターと医薬として
許容される担体または賦形剤とから成り、前記核酸がsrcタンパク質をコード
する核酸セグメントを有しており、前記srcタンパク質がコドン527にチロ
シン、セリンまたはトレオニン以外の任意のアミノ酸残基を有することを特徴と
するターゲット哺乳類組織中の血管形成を促進する医薬組成物。 - 【請求項35】 核酸を含むウイルス性遺伝子導入ベクターと医薬として許
容される担体または賦形剤とから成り、前記核酸がキナーゼ活性をもたないsr
cタンパク質をコードする核酸セグメントを有していることを特徴とするターゲ
ット哺乳類組織中の血管形成を阻害する医薬組成物。 - 【請求項36】 核酸を含む非ウイルス性遺伝子導入ベクターと医薬として
許容される担体または賦形剤とから成り、前記核酸がsrcタンパク質をコード
する核酸セグメントを有しており、前記srcタンパク質がキナーゼ活性をもた
ないことを特徴とするターゲット哺乳類組織中の血管形成を阻害する医薬組成物
。 - 【請求項37】 医薬として許容される担体または賦形剤中の治療量のsr
cタンパク質から成り、前記srcタンパク質がコドン527にチロシン、セリ
ンまたはトレオニン以外の任意のアミノ酸残基を有することを特徴とするターゲ
ット哺乳類組織中の血管形成を促進する医薬組成物。 - 【請求項38】 医薬として許容される担体または賦形剤中のsrcタンパ
ク質から成り、前記srcタンパク質がキナーゼ活性をもたないことを特徴とす
るターゲット哺乳類組織中の血管形成を阻害する医薬組成物。
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