CN1208087C

CN1208087C - 可用于采用蛋白激酶Raf和Ras调节血管生成的方法和组合物

Info

Publication number: CN1208087C
Application number: CNB008140952A
Authority: CN
Inventors: J·霍德; B·埃利塞里; D·A·彻雷斯
Original assignee: Scripps Research Institute
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1999-08-13
Filing date: 2000-08-11
Publication date: 2005-06-29
Anticipated expiration: 2020-08-11
Also published as: HK1050856A1; BR0013228A; KR20020032553A; WO2001012210A1; MXPA02001553A; AU6763300A; KR100805098B1; HUP0300923A2; US20060040853A1; PL364928A1; CZ2002449A3; NO20020718D0; HUP0300923A3; WO2001012210A9; CA2380966A1; AU781877B2; KR100759241B1; JP2003507337A; NO20020718L; EP1210099A4

Abstract

本发明描述了用Raf和/或Ras蛋白、修饰的Raf或Ras蛋白和编码所述蛋白的核酸调节组织血管生成的方法。具体地说，本发明描述了用无活性的Raf和/或Ras蛋白或编码所述蛋白的核酸抑制血管生成的方法、或用活性Raf和/或Ras蛋白或编码所述蛋白的核酸增强血管生成的方法。本发明也描述了应用基因传递系统提供编码所述Raf或Ras蛋白的核酸或其修饰形式。

Description

可用于采用蛋白激酶Raf和Ras调节血管生成的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求于2000年7月5日申请的美国临时专利申请顺序号60/215,951和于1999年8月13日申请的美国临时专利申请顺序号60/148,924的优先权。

技术领域

本发明总的来讲涉及医药领域，具体地说涉及用蛋白激酶Raf或Ras、Raf或Ras的变异体、采用调节Raf或Ras的试剂以及采用编码所述激酶、变异体或试剂的核酸调节组织血管生成的方法和组合物。

背景

血管生成是一个涉及新血管生长到组织中的组织血管形成过程，也称为新血管形成。该过程由内皮细胞和平滑肌细胞浸润介导。据信该过程以下述三种方式中的任一种进行：血管可以从现有的血管出芽、可以从前体细胞出现血管的从头发育(血管发生)或现有的小血管的直径可以增大。Blood等， Bioch.Biophys.Acta，1032：89-118(1990)。

血管生成是新生儿生长的一个重要过程，但在伤口愈合和包括组织炎症、关节炎、肿瘤生长、糖尿病性视网膜病、特征为视网膜新血管形成的黄斑变性等病症在内的各种各样临床疾病的发病机理方面也是重要的。与血管生成有关的这些临床表现被称为血管生成性疾病。Folkman等， Science，235：442-447(1987)。血管生成在成体组织或成熟组织中一般不存在，虽然它在伤口愈合和黄体生长周期中确实发生。参见例如Moses等， Science，248：1408-1410(1990)。

已经提出：对血管生成的抑制可能是限制肿瘤生长的一种有用的疗法。已经建议通过以下方式进行对血管生成的抑制：(1)抑制“血管生成分子”例如bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)的释放，(2)中和血管生成分子，例如通过应用抗bFGF抗体，(3)应用玻连蛋白受体α_vβ₃的抑制剂，和(4)抑制内皮细胞对血管生成刺激的应答。这后一种策略已经受到注意，Folkman等， Cancer Biology，3：89-96(1992)已经描述了一些内皮细胞应答的抑制剂，包括胶原酶抑制剂、基底膜更新(turnover)抑制剂、血管生成性类固醇、真菌来源的血管生成抑制剂、血小板因子4、血小板反应蛋白、关节炎药物例如D-青霉胺和金硫丁酸盐(goldthiomalate)、维生素D₃类似物、α-干扰素和可以用来抑制血管生成的类似抑制剂。关于建议的其它血管生成抑制剂，参见Blood等， Bioch. Biophys Acta.，1032：89-118(1990)，Moses等， Science，248：1408-1410(1990)，Ingber等， Lab.Invest.，59：44-51(1988)和美国专利第5,092,885、5,112,946、5,192,744、5,202,352、5,753,230和5,766,591号。然而，在前述参考文献中没有一种血管生成抑制剂涉及Raf蛋白。

为了发生血管生成，内皮细胞必须首先降解，并且类似于肿瘤细胞在侵入和转移形成期间所用的方式使血管基底膜交联。

先前已经报道了血管生成依赖于血管整联蛋白和胞外基质蛋白之间的相互作用。Brooks等， Science，264：569-571(1994)。此外，报道了生血管血管细胞的程序性细胞死亡(细胞凋亡)由所述相互作用起始，这可以用血管整联蛋白α_vβ₃的某些拮抗剂来抑制。Brooks等， Cell，79：1157-1164(1994)。新近，已经报道了可以用α_vβ₅的拮抗剂抑制基质金属蛋白酶-2(MMP-2)与玻连蛋白受体(α_vβ₅)的结合，由此抑制所述蛋白酶的酶功能。Brooks等， Cell，85：683-693(1996)。

发明概要

本发明设计了在血管生成依赖于蛋白激酶Raf(在本文也通称为Raf)活性的组织中对血管生成的调节。

设计了用于在与病症相关的组织中调节血管生成的组合物和方法。将包含血管生成调节量的Raf蛋白的组合物给予待治疗对血管生成的调节有反应的病症的组织。提供所述Raf蛋白的组合物可以含有纯化蛋白、生物活性蛋白片段、重组产生的Raf蛋白或蛋白片段或融合蛋白、或用于表达Raf蛋白的基因/核酸表达载体。

在Raf蛋白被失活或被抑制的情况下，所述调节是对血管生成的抑制。在Raf蛋白有活性或被活化的情况下，所述调节是对血管生成的增强。

待治疗组织可以是需要调节血管生成的任何组织。关于血管生成的抑制，治疗正发生有害的新血管形成的患病组织是有用的。示例性的组织包括炎症组织、实体瘤、转移组织、经历再狭窄的组织等之类的组织。

对于增强，治疗具有底氧组织例如中风、心肌梗塞后或与慢性溃疡有关的组织的患者、具有因糖尿病或其它病症而有异常(即循环差)的局部缺血肢体的患者的组织是有用的。也可以治疗具有不愈合的慢性伤口并且因此可以从血管细胞增殖和新血管形成增加而受益的患者。

特别优选应用含本文所述的修饰氨基酸序列的Raf蛋白。本文描述了包括Raf融合蛋白例如Raf-caax在内的几种特别有用的经修饰的Raf蛋白以及编码所述蛋白表达的核酸构建体，这些在本发明的范围内。

本发明也包括适用于抑制哺乳动物靶组织中血管生成的药用组合物，所述药用组合物包括含有一种核酸的病毒性或非病毒性基因转移载体和一种药学上可接受的载体或赋形剂，所述核酸具有一种编码Raf蛋白的核酸区段，并且所述Raf蛋白在密码子375具有除赖氨酸以外的任何氨基酸残基。一个特别优选的实施方案利用名为Raf K375M并且在下文实施例中描述的Raf蛋白。另一种无活性的Raf构建体是编码缺失羧基末端部分的Raf蛋白的核酸。一个优选实施方案利用名为Rafl-305的Raf蛋白，这是一种无活性的Raf蛋白。

也设计了适用于刺激哺乳动物靶组织中血管生成的药用组合物，所述药用组合物包括含有一种核酸的病毒性或非病毒性基因转移载体和一种其药学上可接受的载体或赋形剂，所述核酸具有编码具激酶活性的Raf蛋白的区段。一种优选的核酸编码一种抑制性Raf融合蛋白，该蛋白是Raf-caax。另一种抑制性Raf构建体含有编码缺失了Raf蛋白氨基末端部分的Raf蛋白的核酸。一个优选实施方案利用名为Raf306-648的Raf蛋白，该蛋白在下文实施例中描述。

本发明还设计了用小GTP酶Ras(本文也通称为Ras)因其在给Raf发送信号的作用(如本文所述)而调节组织中的血管生成。也设计了利用Ras和Raf调节的组合来调节组织中的血管生成。这种联合调节可以采用给予一次蛋白或编码调节蛋白的核酸的联合制剂、或者以血管生成调节量分开给予各个剂量的形式。

设计了用于在与病症相关组织中调节血管生成的组合物和方法，其中所述调节针对通过Ras蛋白的Raf介导的血管生成途径。将包含血管生成调节量的Ras蛋白的组合物给予要治疗对血管生成调节有反应的病症的组织。提供Ras蛋白的组合物可以含有纯化蛋白、生物活性Ras蛋白片段、重组产生的Ras蛋白或蛋白片段或融合蛋白或用于表达Ras蛋白的基因/核酸表达载体。

在Ras蛋白被失活或被抑制的情况下，所述调节是对血管生成的抑制。在Ras蛋白有活性或被活化的情况下，所述调节是对血管生成的增强。设计了以类似于Raf家族蛋白的方式使用的用于显性失活Ras蛋白(例如S17N Ras或V12C40 Ras)的药用组合物和方法。在本发明的再一方面，设计了用法与Raf家族蛋白相当的用于显性活性Ras蛋白(例如G12V Ras或V12S35 Ras)的药用组合物和方法。

还设计了调节与病症相关组织中血管生成的方法，所述方法包括给予血管生成调节量的药用组合物，所述药用组合物包含一种Raf蛋白或能够表达Raf蛋白的核苷酸序列和一种Ras蛋白或能够表达Ras蛋白的核苷酸序列。在这类方法中，在所需调节是抑制血管生成的情况下，所述Raf或Ras蛋白中的至少一种或两种无活性。在所需调节是刺激血管生成的情况下，所述Raf或Ras蛋白中的至少一种或两种有活性。

附图简述

在构成本说明书一部分的附图中：

图1A-1D说明：亲嗜性(ecotrophically)包装的反转录病毒仅感染鼠类细胞。用编码b-半乳糖苷酶(b-Gal)基因的反转录病毒构建体转染亲嗜性包装细胞，24小时后收集上清液。将含有所述病毒的上清液置于鼠源成纤维细胞(图1A)、鼠源内皮细胞(图1B)、人上皮腺癌细胞(图1C)或人黑素瘤细胞(图1D)上达24小时。用标准方法显现b-半乳糖苷酶活性。

图2说明：Raf K375M在小鼠内皮细胞系中的在先感染阻止了bFGF诱导的Raf活性的增加。用编码缺陷型Raf激酶基因的反转录病毒构建体转染亲嗜性包装细胞，24小时后收集上清液。将含有病毒的上清液置于小鼠内皮细胞上达24小时。然后用bFGF处理细胞达5分钟，然后进行裂解。根据经免疫沉淀的Raf激酶将具有放射性标记的³²P的MEK底物磷酸化的能力，对Raf激酶活性进行定量。反应混合物通过SDS PAGE进行分级分离，并且用光密度扫描术定量。

图3A-3B说明：突变的无活性Raf K375M在鼠皮下血管生成模型中阻断bFGF诱导的血管生成。通过在小鼠胁腹皮下注射250μl冰冷的含400ng/ml bFGF、有或无表达Raf K375M的反转录病毒表达包装细胞的生长因子减少的matrigel，诱导血管生成。5天后，经尾静脉注射内皮特异性FITC缀合的Bandeiriea Simplifica B5凝集素，让其循环并清除30分钟。然后通过取出、提取和分析血管生成组织的荧光含量，对血管生成进行定量(图3A)。通过光学断层证实新血管形成(图3B)。

图4A-4B说明：突变的活性Raf在鼠皮下血管生成模型中刺激血管生成。通过在小鼠胁腹皮下注射250μl冰冷的含有表达GFP对照或氨基末端缺失的Raf激酶(Raf306-648)的反转录病毒表达包装细胞的生长因子减少的matrigel，诱导血管生成。5天后，通过取出、提取和分析血管生成组织的荧光含量，对血管生成进行定量(图4A)。通过切片和用Mason’s trichrome染色，证实新血管形成(图4B)。

图5A-5D说明：用反转录病毒将Raf K375M激酶传递至肿瘤，以内皮特异性方式诱导细胞凋亡。将人类肿瘤皮下注射到无胸腺wehi(nu/nu)小鼠的胁腹，让其移植。当肿瘤达到100mm³时，给小鼠肿瘤内注射含10⁶pfu亲嗜性包装的Raf K375M的培养上清液。48小时后收获肿瘤，将其切片并进行免疫组织化学。根据vWF表达，鉴定内皮细胞(图5A)；而用Flag标志标记来指示被Raf K375M激酶基因感染的细胞(图5B)。观察到这些标记中的每种与指示凋亡细胞的TUNEL标记一起共定位(图5C和5D)。

图6A-6B说明：内皮传递Raf K375M激酶基因抑制肿瘤的生长并且刺激肿瘤消退。将人类肿瘤皮下注射到无胸腺wehi(nu/nu)小鼠的胁腹，让其生长至100mm³。此时，在邻近肿瘤的部位注射一次表达RafK375M激酶的包装细胞，或者开始一系列的病毒上清液的肿瘤内注射。这种策略导致肿瘤快速消退，注射对照GFP基因则没有观察到这一现象(图6A)。这种消退发生快速，并且在整个实验期间保持(图6B)。

图7描述编码人c-Raf的cDNA序列，这是缺失内含子的完整编码序列。所述序列可通过GenBank登记号X03484(GI＝35841，HSRAFR)获得(SEQ ID NO.：1)。

图8描述了图7所示核酸序列中所述编码序列的所编码翻译的人c-Raf的氨基酸残基序列(SEQ ID NO.：2)。

图9说明：血管生成依赖于Ras-Raf-MEK-ERK途径的激活。通过Ras拆除(pulldown)分析测定，在暴露于bFGF的鸡尿囊绒膜(CAM)裂解液中评价Ras活性。得自10日龄鸡胚的CAM以用或者PBS或者30ng bFGF饱和的滤纸局部刺激。5分钟后，切取CAM组织，在裂解缓冲液中匀浆，然后根据其被编码Raf的Ras结合结构域的GST融合肽沉淀的能力，测定Ras活性。因为仅活性Ras结合Raf，所以产生由与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)缀合的Raf的Ras结合结构域组成的重组蛋白。进而将GST与sepharose珠缀合，使得可以从组织裂解液中沉淀活性Ras。

图10描述了野生型人Ras(wt H-Ras)的cDNA编码结构域核苷酸序列(SEQ ID NO.：3)。c-Ha-Rasl原癌基因的完整编码序列可通过GenBank(GI＝190890，HUMRASH)获得(SEQ ID NO.：5)。

图11描述了图10所示野生型人Ras(wt H-Ras)的cDNA核苷酸序列编码的氨基酸残基序列(SEQ ID NO.：4)。

图12说明：用突变的无效Ras感染阻断了CAM中生长因子诱导的血管生成。将15μl高滴度编码突变的无效Ras即S17N Ras(于第17位Asn取代Ser的野生型H-Ras)的鸡肉瘤反转录病毒RCAS(A)局部加样至CAM上的滤纸上，其中所述CAM如图9所述用bFGF刺激。72小时后，通过对血管分支点计数，评价血管生成。

图13A和13B分别以示意图和图描绘了用选择性激活Ras-Raf-MEK-ERK途径的突变Ras构建体Ras V12S35感染，诱导了血管生成；而选择性激活PI3K途径的突变构建体Ras V12C40不诱导血管生成。将15μl高滴度的编码Raf-MEK-ERK激活Ras构建体Ras V12S35或PI3激酶激活Ras构建体Ras V12C40的RCAS(A)病毒如图12所述局部加样至滤纸上并且评价结果。

图14描述了编码融合蛋白Raf-caax的核苷酸序列(SEQ ID NO.：6)，其中编码人Raf(wt H-Raf)羧基末端的核苷酸序列与编码K-Ras膜定位结构域的一段20个氨基酸残基序列的核苷酸序列融合。

图15描述了Raf-caax的氨基酸残基序列(SEQ ID NO.：7)，Raf-caax为由图14所述的融合核苷酸序列产生的融合蛋白。

图16A-16E和图16F分别以照片和图说明：MEK抑制剂PD98059阻断由或者突变的活性Ras或者Raf诱导的血管生成。将编码激活Ras构建体Ras V12(也称为G12V)和激活Raf构建体Raf-caax的病毒如图12所述局部加样至滤纸上。24小时后，将1毫微摩尔MEK抑制剂PD98059加入到滤纸上。然后如图12所述评估CAM。绘图的数据是20个胚胎的平均值±SE。

图17A-17F和图17G分别以照片和图说明：不由Ras诱导而由Raf诱导的血管生成难以通过整联蛋白封闭加以抑制。用突变的活性Ras和Raf两种构建体感染，诱导显著的血管生成，但仅Ras诱导的血管生成被α_vβ₃整联蛋白封闭性抗体抑制。得自10日龄鸡胚的CAM如图9和图2所述用以或者PBS(对照)、bFGF、RCAS(A)反转录病毒构建体G12V-Ras或Raf-caax饱和的滤纸刺激。24小时后，经静脉内传递一种抗整联蛋白α_vβ₃的单克隆抗体LM609，72小时后通过血管分支点分析评价血管生成。代表性CAM示于所述图中。数据是20个胚胎的平均值±SE。

图18A-18D和18E分别以照片和图说明：用突变的无效粘着斑激酶FRNK共感染CAM，阻断了Ras诱导的血管生成，但不阻断Raf诱导的血管生成。将编码Ras V12或Raf-caax的RCAS(A)病毒如图12中所述与编码FAK相关无效激酶(FRNK)的RCAS(B)一起局部加样到CAM滤纸上。数据是20个胚胎的平均值±SE。

图19A和图19B-19G分别以图和照片说明：在鼠皮下血管生成模型中，FRNK阻断bFGF和Ras诱导的血管生成，但不阻断Raf诱导的血管生成。通过在小鼠胁腹皮下注射250μl冰冷的含有或者400ng/mlbFGF或者表达所述基因的莫洛尼反转录病毒表达包装细胞的生长因子减少的matrigel，诱导血管生成。将FRNK反转录病毒作为用vsv.g外壳蛋白包装的高滴度病毒加入matrigel中。5天后，经尾静脉注射内皮特异性FITC缀合的Bandeiriea Simplifica B5凝集素，并让其循环。然后，通过取出、提取和分析血管生成组织的荧光含量，对血管生成进行定量。

图20A和20B说明：用突变的无效粘着斑激酶FRNK共感染CAM，阻断了Ras诱导的对Raf的活化。CAM如图18所述进行处理，只是在24小时后切取血管生成组织，将其溶解，进行Raf免疫沉淀，然后根据其将激酶失效的MEK磷酸化的能力，评价Raf活性。图20A显示了在所述结果之上的每种组合下分析免疫沉淀的活性Raf蛋白与总Raf蛋白。图20B图绘了在那些条件下活性Raf测定的结果。

发明详述

A. 定义

氨基酸残基：在化学消化(水解)一种多肽的肽键时形成的氨基酸。本文所述的氨基酸残基优选为“L”异构体形式。然而，可以用“D”异构体形式的残基取代任何L-氨基酸残基，只要所述多肽保留所需的功能特性即可。NH₂是指存在于多肽氨基末端的游离氨基。COOH是指存在于多肽羧基末端的游离羧基。与标准多肽命名法(描述于 J.Biol. Chem.，243：3552-59(1969)并且根据37 CFR§1.822(b)(2)采用)保持一致。

应该注意到，在本文中所有氨基酸残基序列均由结构式表示，其左右方向是常规的氨基末端至羧基末端的方向。此外，应该注意到，氨基酸残基序列的开始或结束之处的虚线表示与具有一个或多个氨基酸残基的另一序列结合的肽键。

多肽：是指相互之间通过相连氨基酸残基的α-氨基和羧基之间的肽键连接的氨基酸残基的线性序列。

肽：本文所用的是指一个氨基酸残基与另一氨基酸残基如多肽中一样连接的不多于约50个氨基酸残基的线性序列。

环肽：是指具有一个杂原子环结构的化合物，所述环结构包括与典型肽中一样的几个酰胺键。所述环肽可以是“头尾”环化的线性多肽，其中线性肽的n末端已经与所述线性肽的末端羧酸形成一个酰胺键，或它可以含有一个环结构，在所述环结构中所述聚合物是homodetic或heterodetic，并且包含酰胺键和/或闭合所述环的其它键合，所述其它键合例如二硫桥、硫酯、硫代酰胺、胍基等键合。

蛋白质：是指一个氨基酸残基与另一氨基酸残基如多肽中一样连接的多于50个氨基酸残基的线性序列。

融合蛋白：是指含有至少两种不同通过典型肽键有效连接的(“融合的”)多肽结构域的多肽，其中所述两个结构域对应于在自然界中没有发现融合的肽。

合成肽：是指通过肽键连接在一起的化学产生的氨基酸残基链，不包括天然存在的蛋白质及其片段。

B. 一般考虑

本发明总的来讲涉及这样一种发现：血管生成由蛋白激酶Raf蛋白介导，并且可以通过提供或者活性或者无活性Raf蛋白来分别增强或抑制血管生成，调节血管生成。本发明也涉及这样一种发现：Ras蛋白可以影响Raf，并且因此调节血管生成。

这一发现是重要的，因为血管生成即形成新血管在多种疾病过程中起作用。另一方面，在与病症相关的组织需要血管生成以进行组织生长的情况下，理想的是抑制血管生成，由此抑制患病组织的生长。在受损伤组织需要血管生成以进行组织生长和愈合的情况下，最好增强或促进血管生成，由此促进组织愈合和生长。

在新血管的生长是与患病组织相关的病理学原因或结果时，抑制血管生成将减少所述疾病的有害效应。通过抑制血管生成，人们可以干涉所述疾病，缓解症状，在某些情况下治愈所述疾病。

与将从抑制性调节血管生成中受益的疾病和新血管形成相关的组织的实例，包括癌症、类风湿性关节炎、眼病例如糖尿病性视网膜病、炎症、再狭窄等。在需要新血管生长以支持有害组织生长的情况下，抑制血管生成减少对所述组织的血液供应，由此基于血液供应的需求而导致组织块的减小。特别优选的实例包括肿瘤生长，其中新血管形成是一种持续的需求，以便肿瘤生长的厚度超过数毫米以及建立实体瘤转移瘤。

在新血管的生长引起组织愈合的情况下，增强血管生成有助于愈合。实例包括治疗肢体局部缺血的患者，在局部缺血的肢体中由于糖尿病或其它病症而有异常，即循环差。也考虑了具有不愈合的长期伤口并且因此可以从血管细胞增殖和新血管形成增加中获益的患者。

本发明的方法部分是有效的，因为所述疗法对于血管生成具有高度的选择性，而对于其它生物学过程无效。

如先前所述，血管生成包括涉及组织新血管形成的多个过程，包括“出芽”、血管发生或血管增大，所有这些血管生成过程都受单独的Raf蛋白或受Raf蛋白与Ras蛋白的影响。除创伤愈合、黄体形成和胚胎发生以外，据信大多数血管生成过程与疾病过程相关，因此应用本治疗方法对于所述疾病具有选择性，并且没有有害的副作用。

C. Raf蛋白

用于本发明中的一种蛋白激酶Raf蛋白可以根据计划的用途而不同。术语“Raf蛋白”或“Raf”用来统称各种形式的活性形式或无活性形式的蛋白激酶Raf蛋白。

“活性Raf蛋白”是指增强、刺激、激活、诱导或增加血管生成的多种形式的Raf蛋白中的任一种。测量血管生成增强的测定如本文所述，但不能解释为是限制性的。如果与在所述测定系统中不加入Raf的对照水平相比，血管生成水平至少高10％、优选高25％、更优选高50％，则认为蛋白是活性的。用于测量增强的优选测定是实施例中所述的体外Raf激酶，其中MEK底物用³²P磷酸化。在实施例中描述了示例性活性Raf蛋白。

“无活性Raf蛋白”是指抑制、减少、阻碍或限制血管生成的多种形式的Raf蛋白中的任一种。本文描述了测量血管生成抑制的测定，但不能解释为是限制性的。如果与在所述测定系统中不加入外源Raf的对照水平相比，血管生成水平至少降低10％、优选降低25％、更优选降低50％，则认为蛋白是无活性的。用于测量抑制的优选测定是实施例中所述的体外Raf激酶，其中MEK底物用³²P磷酸化。在实施例中描述了示例性无活性Raf蛋白。

可用于本发明的Raf蛋白可以用多种方法中的任一种产生，所述方法包括从包括组织在内的天然来源中进行分离、通过重组DNA表达产生和纯化等。也可以通过将基因治疗系统导入目的组织中，然后在所述组织中表达kaf蛋白，“原位”提供所述蛋白。

可以用本领域已知的多种方法制备编码Raf蛋白的基因，本发明不能解释为在该方面是限制性的。例如，众所周知Raf的自然史包括来自哺乳动物、鸟类、病毒等物种的多种同系物，并且可以用cDNA克隆法，从表达所述蛋白的任何组织中容易地克隆所述基因。用于本发明的一种优选Raf是细胞蛋白，例如名为c-Raf的哺乳动物或鸟类同系物。特别优选人c-Raf。本发明的再一种优选的Raf蛋白是Raf融合蛋白，所述融合蛋白具有组成型活性，但不依赖于Ras介导的激活。这样一种Raf蛋白可以是融合蛋白。一种优选的不依赖Ras的Raf蛋白是Raf-caax，它是野生型Raf与K-Ras膜定位结构域的羧基末端融合蛋白，如实施例中进一步描述的。

D. Ras蛋白

用于本发明的Ras家族GTP酶可以根据计划的用途而不同。术语“Ras蛋白”或“Ras”在本文中用来统称活性或无活性形式的各种形式的Ras蛋白。

“活性Ras蛋白”是指增强、刺激、激活、诱导或增加血管生成的多种形式的Ras蛋白中的任一种。在本文中描述了测量Ras增强血管生成的测定，但不能解释为是限制性的。如果与在所述测定系统中不加入Ras的对照水平相比，血管生成水平至少高10％、优选高25％、更优选高50％，则认为蛋白是活性的。示例性的活性Ras蛋白是Ras G12V(也称为V12)和Ras V12S35，这两种在实施例中进一步描述。“无活性Ras蛋白”是指抑制、阻碍、延迟或终止血管生成的多种形式的Ras蛋白中的任一种。本文描述了测量血管生成抑制的测定，但不能解释为是限制性的。如果与在所述测定系统中不加入外源Ras的对照水平相比，血管生成水平至少降低10％、优选降低25％、更优选降低50％，则认为蛋白是无活性的。示例性的无活性Ras蛋白包括称为RasS17N(或有时称为N17)和V12C40的无效突变Ras，这两种在实施例中进一步描述。

可用于本发明的Ras蛋白可以用多种方法中的任一种产生，所述方法包括从包括组织在内的天然来源中进行分离、通过重组DNA表达产生和纯化等。也可以通过将基因治疗系统导入目的组织中，然后在所述组织中表达Ras蛋白，“原位”提供所述蛋白。

可以用本领域已知的多种方法制备编码Ras蛋白的基因，本发明不能解释为在该方面是限制性的。例如，众所周知Ras的自然史包括来自哺乳动物、鸟类、病毒等物种的多种同系物，并且可以用cDNA克隆法，从表达所述蛋白的任何组织中容易地克隆所述基因。

根据本说明书的内容可以了解到：集合形式的Ras蛋白可以用于与本文对于Raf蛋白所述相同的各种实施方案中，因此，关于使用Ras蛋白的细节不再重复。例如，Ras可以以活性形式或无活性形式存在，以用于调节血管生成，或者可以通过应用载体传递系统经核酸表达所述Ras蛋白产物、以及在各种药用(治疗)组合物和用于实施本发明的制品中提供。也设计了用基于Ras的试剂替代所列举的基于Raf试剂的血管生成的调节方法。

E. 用于表达Raf或Ras蛋白的重组DNA分子和表达系统

本发明描述了一些具体用于本发明的核苷酸序列。这些限定了编码可用于本发明的Raf或Ras蛋白的核酸序列以及构建用于表达Raf和/或Ras蛋白的各种DNA区段、重组DNA(rDNA)分子和载体。

因此，本发明的DNA分子(区段)可以包含本文进一步描述的编码全结构基因、结构基因的片段和转录单位的序列。

一种优选的DNA区段是编码本文限定的Raf蛋白的核苷酸序列或其生物活性片段。

另一种优选的DNA区段是编码本文限定的Ras蛋白的核苷酸序列或其生物活性片段。所谓生物活性是指所表达的蛋白将具有在细胞中发现的完整蛋白生物活性中的至少某些活性，例如配体结合，或在所述蛋白的活性形式的情况下，具有酶活性。

在实施例中描述优选的c-Raf和h-Ras的氨基酸残基序列和核苷酸序列。

一种优选的DNA区段编码与对应于本文所述Raf或Ras蛋白的氨基酸残基序列或其部分基本上相同、优选基本上由其组成的氨基酸残基序列。在实施例中进一步描述代表性的和优选的DNA区段。

蛋白质或多肽的氨基酸残基序列通过遗传密码与编码所述蛋白的结构基因的脱氧核糖核酸(DNA)序列直接相关。因此，结构基因或DNA区段可以根据其编码的氨基酸残基序列(即蛋白质或多肽)来限定。

遗传密码的一个众所周知的重要特性是其丰余性。也就是说，对于大多数用来构成蛋白质的氨基酸而言，不止一种编码核苷酸三联体(密码子)可以编码或确定一种特定的氨基酸残基。因此，多种不同的核苷酸序列可以编码一种特定的氢基酸残基序列。这样的核苷酸序列由于它们可以导致在所有生物中产生同一氨基酸残基序列，因此在功能上是等同的。有时，可以将嘌呤或嘧啶的甲基化变异体加入给定的核苷酸序列中。然而，这类甲基化决不能影响所述编码关系。

核酸是任何多核苷酸或核酸片段或其类似物，所述多核苷酸无论它是多核糖核苷酸还是多脱氧核糖核苷酸，即无论它是RNA还是DNA。在优选实施方案中，核酸分子是双链体DNA的区段形式，即DNA区段，虽然对于某些分子生物学方法而言，优选单链DNA或RNA。

通过多种方法产生DNA区段，所述方法包括化学合成法和重组方法，优选克隆或聚合酶链式反应(PCR)。利用化学技术，例如Matteucci等的磷酸三酯法( J.Am.Chem.Soc.，103：3185-3191(1981))，或采用自动合成法，可以容易地合成编码Raf或Ras蛋白的全部或仅其部分的DNA区段。另外，用众所周知的方法，例如合成一组限定所述DNA区段的寡核苷酸，然后通过寡核苷酸的杂交和连接构建完整的区段，可以容易地制备较大的DNA区段。可供选择的方法包括用一对用于认为含有编码Raf或Ras蛋白的成员的cDNA文库的寡核苷酸引物，通过PCR分离优选的DNA区段。

当然，通过化学合成，可以简单地通过用合适的碱基取代编码天然氨基酸残基序列的那些碱基，制备任何所需的修饰。这种方法是众所周知的，并且可以容易地用来产生本文所述的各种不同“修饰的”Raf或Ras蛋白。

此外，随后可以对基本上由编码Raf或Ras蛋白的结构基因构成的DNA区段进行修饰，如通过定点诱变或随机诱变进行修饰，以引入任何所需的取代。人们理解，各种等位基因形式的Raf或Ras蛋白和编码Raf或Ras蛋白的基因也适用于本发明。

1. 克隆Raf或Ras基因

可以通过多种生物化学方法，从合适的基因组DNA或信使RNA(mRNA)源中克隆本发明的Raf或Ras基因。可以按照实施例中描述和本领域已知的一般方法，进行这些基因的克隆。

用于克隆适用于本发明方法的Raf或Ras基因的核酸源可以包括来自认为表达这些蛋白的组织的基因组DNA或cDNA文库形式的信使RNA(mRNA)。一种优选的组织是人肺组织，虽然可以使用任何其它合适的组织。

一种优选的克隆方法涉及用标准方法制备cDNA文库，然后用基于本文所述核苷酸序列的成对寡核苷酸引物，通过PCR扩增分离Raf编码核苷酸序列或Ras编码核苷酸序列。或者，可以用基于本文所述核酸序列的杂交探针，通过常规核酸杂交法，从cDNA文库或基因组文库中鉴定并且分离出所需的cDNA克隆。分离和克隆合适的Raf编码核酸或Ras编码核酸的其它方法对于本领域技术人员而言是显而易见的。

2. 表达载体

本发明设计了重组DNA分子(rDNA)，所述重组DNA分子含有编码本文所述的Raf和/或Ras蛋白的DNA区段。通过将一种载体与本发明的Raf或Ras编码DNA区段有效地(符合读框地，可表达地)连接，可以产生一种可表达rDNA。设想了可以构建一种联合表达，其中存在或者有效连接于同一启动子、或者有效连接于不同启动子的Raf编码核酸和Ras编码核酸。因此，一种重组DNA分子是一种杂种DNA分子，所述杂种DNA包含至少两种正常情况下在自然界中不一起存在的核苷酸序列的核酸(即基因和载体)。

与本发明的DNA区段有效连接的载体的选择，正如本领域众所周知的，直接取决于所需的功能特性，例如蛋白质表达和待转化的宿主细胞。本领域中通常考虑的是构建重组DNA分子。本发明设计的一种载体至少能够指导包括在所述载体DNA区段中与所述DNA区段有效连接的结构基因的复制，最好是也指导其表达。

原核表达载体和真核表达载体都是载体构建领域的技术人员所熟悉的，并且描述于Ausebel等，载于： Current Protocols in Molecular Biology，Wiley and Sons，New York(1993)和Sambrook等， Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)。这些参考文献也描述了本文引用的许多通用重组DNA方法。

在一个实施方案中，本发明设计的载体包括一种原核复制子，即有能力在用其所述载体转化的原核宿主细胞(例如细菌宿主细胞)中指导所述重组DNA分子在染色体外自主复制和保持的DNA序列。这类复制子是本领域众所周知的。另外，包括一种原核复制子的那些实施方案也包括一种其表达赋予用其转化的细菌宿主抗药性的基因。典型的细菌抗药性基因是赋予对氨苄青霉素或四环素抗性的那些基因。

包括一个原核复制子的那些载体也可以包括一种能够在用所述载体转化的细菌宿主细胞(例如大肠杆菌)中指导结构基因表达(转录和翻译)的原核启动子。启动子是由DNA序列构成的允许RNA聚合酶结合并发生转录的表达控制元件。根据所需的表达控制和/或效应，启动子或其它这类调节核酸序列可以是诱导型或组成型的。与细菌宿主相容的启动子序列通常在质粒载体中提供，所述载体含有方便的限制位点以供插入本发明的DNA区段。典型的这样的载体质粒是可得自Biorad Laboratories(Richmond，CA)的pUC8、pUC9、pBR322和pBR329、可得自Invitrogen(San Diego，CA)的pRSET以及可得自Pharmacia(Piscataway，N.J.)的pPL和pKK223。

与真核细胞相容的表达载体、最好是与脊椎动物细胞相匹配的那些载体也可以用来构成本发明的重组DNA分子。真核细胞表达载体是本领域众所周知的，可得自一些商业来源。通常，提供含有方便的限制位点以供插入所需DNA区段的这类载体。典型的这类载体是pSVL和pKSV10(Pharmacia)、pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies，Inc.)、pTDT1(ATCC，#31255)、pRc/CMV(Invitrogen，Inc.)、实施例中所述的优选载体等真核表达载体。

在本发明中用于基因表达的特别优选的系统包括基因传递成分，也就是说能够将所述基因传递至目的组织。合适的载体是被工程改造以表达所需蛋白并且具有允许感染预选靶组织特性的“感染性”载体，例如重组DNA病毒载体、腺病毒载体或反转录病毒载体。特别优选本文所述的反转录病毒载体系统。

可以对利用重组病毒或病毒元件来指导表达的哺乳动物细胞系统进行工程改造。例如，当使用腺病毒表达载体时，可以将多肽的编码序列连接于腺病毒转录/翻译控制复合体，例如晚期启动子和三联前导序列。然后可以将这种嵌合基因通过体外或体内重组，插入到腺病毒基因组中。在病毒基因组的非必需区(例如E1或E3区)插入，将产生有活力并且能够在受感染宿主中表达所述多肽的重组病毒(例如参见Logan等， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：3655-3659(1984))。或者，可以使用痘苗病毒7.5K启动子(例如参见Mackett等， Proc.Natl.Acad. Sci.，USA，79：7415-7419(1982)；Mackett等， J.Virol.，49：857-864(1984)；Panicali等， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，79：4927-4931(1982))。特别有价值的是基于牛乳头瘤病毒、有能力作为染色体外元件复制的载体(Sarver等， Mol.Cell.Biol.，1：486(1981))。在该DNA进入靶细胞后不久，所述质粒复制为约100-200个拷贝/细胞。所插入cDNA的转录不需要质粒整合到宿主染色体中，因此产生高水平的表达。可以用这些载体，通过在所述质粒中包括一种选择标记，例如 neo基因，来进行稳定表达。或者，可以对所述反转录病毒基因组进行修饰，以用作能够将所述多肽编码核苷酸序列导入宿主细胞并且指导所述核苷酸序列在宿主细胞中表达的载体(Cone等， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，81：6349-6353(1984))。用诱导型启动子也可以达到高水平表达，所述诱导型启动子包括但不限于金属硫蛋白IIA启动子和热激启动子。

最近，已经研究了在带有人卵巢癌的裸鼠中巨细胞病毒(CMV)启动子对劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子驱动的胸苷激酶(TK)基因治疗的长期存活。发现腺病毒介导的、CMV启动子驱动的单纯疱疹病毒TK基因治疗的细胞杀伤功效比RSV驱动的治疗有效2-10倍(Tong等，Hybridoma 18(1)：93-97(1999))。也已经研究了用于基因治疗应用的、要求低水平表达后接诱导型高水平表达的嵌合启动子的设计(Suzuki等， Human Gene Therapy 7：1883-1893(1996))。

为了长期高产量地产生重组蛋白，优选稳定表达。除使用含有病毒复制起点的表达载体外，可以用受合适表达控制元件(例如启动子和增强子序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点等)控制的cDNA和选择标记转化宿主细胞。如上所述，重组质粒中的选择标记赋予对所述选择的抗性，以及允许细胞将所述质粒稳定地整合到其染色体中，并且生长形成转化灶，进而可以将转化灶克隆并扩增为细胞系。

例如，在导入外源DNA之后，可以让工程细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将其转移到选择培养基上。可以使用多种选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等， Cell，11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska等， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，48：2026(1962))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，Cell，22：817(1980))基因，它们可以分别用于tk^-、hgprt^-或aprt^-细胞。还可以使用赋予抗代谢物抗性的基因作为选择的基础；例如dhfr的基因，它赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，77：3567(1980)；O’Hare等， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，78：1527(1981)；gpt，它赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan等， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，78：2072(1981))；neo，它赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Colberre-Garapin等， J.Mol. Biol.，150：1(1981))；和hygro，它赋予对潮霉素的抗性(Santerre等， Gene，30：147(1984))。最近，已经描述了其它的可选择基因，即trpB，它允许细胞利用吲哚取代色氨酸；hisD，它允许细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman等， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85：804(1988))；和ODC(鸟氨酸脱羧酶)，它赋予对鸟氨酸脱羧酶抑制剂2-(二氟甲基)-DL-鸟氨酸即DFMO的抗性(McConlogue L.，载于：Current Communications inMolecular Biology，Cold Spring Harbor Laboratory编著(1987))。

设想用于人类基因治疗的主要载体起源于反转录病毒(Wilson，Clin.Exp.Immunol.107(增刊1)：31-32(1997)；Bank等， Bioessays18(12)：999-1007(1996)；Robbins等， Pharmacol.Ther.80(1)：35-47(1998))。基因转移和反义治疗的治疗潜力激励了许多载体系统的开发，以用于治疗多种组织(脉管系统，Stephan等， Fundam.Clin. Pharmacol.11(2)：97-110(1997)；Feldman等， Cardiovasc.Res.35(3)：391-404(1997)；Vassalli等， Cardiovasc.Res.35(3)：459-69(1997)；Baek等，Circ.Res.82(3)：295-305(1998)；肾，Lien等， Kidney Int.Suppl.61：S85-8(1997)；肝，Ferry等， Hum Gene Ther.9(14)：1975-81(1998)；肌肉，Marshall等， Curr.Opn.Genet.Dev.8(3)：360-5(1998))。除这些组织外，一种人类基因治疗的重要的靶是癌组织，或者是肿瘤自身，或者是肿瘤相关组织(Runnebaum， Anticancer Res.17(4B)：2887-90(1997)；Spear等， J.Neurovirol.4(2)：133-47(1998))。

以下简述容易适用于本发明方法的病毒基因治疗载体系统的具体实例。最近，Federspiel和Hughes对反转录病毒基因传递进行了综述( Methods in Cell Biol.52：179-214(1998))，具体描述了禽类白血病病毒(ALV)反转录病毒家族(Federspiel等， Proc.Natl.Acad Sci.，USA，93：4931(1996)；Federspiel等， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，91：11241(1994))。包括ALV和鼠类白血病病毒(MLV)在内的反转录病毒载体由Svoboda进一步描述( Gene 206：153-163(1998))。

经修饰的反转录病毒/腺病毒表达系统可以容易地用来实施本发明的方法。例如，Karavanas等， Crit.Rev.In Oncology/Hematology28：7-30(1998)综述了鼠类白血病病毒(MLV)系统。Von Seggern和Nemerow在 Gene Expression Systems(Fernandez和Hoeffler编著，Academic Press，San Diego，CA，第5章，第112-157页(1999))综述了腺病毒表达系统。

已经证明了蛋白质表达系统在体内和体外都具有有效的应用。例如，已经描述了通过1型单纯疱疹病毒(HSV)扩增子载体将基因有效地转移至人扁平细胞癌(Carew等，1998， Am.J.Surg.176：404-408)。单纯疱疹病毒已经用于将基因转移至神经系统(Goins等， J.Neurovirol.3(增刊1)：S80-8(1997))。已经在实体瘤上测试了利用HSV-TK的定向自杀载体(Smiley等， Hum.Gene Ther.8(8)：965-77(1997))。1型单纯疱疹病毒载体已经用于对结肠癌细胞的癌症基因治疗(Yoon等， Ann.Surg.228(3)：366-74(1998))。已经开发出杂种载体来延长转染时间，包括用于治疗肝细胞的HSV/AAV(腺伴随病毒)杂种(Fraefel等， Mol.Med.3(12)：813-825(1997))。

痘苗病毒因其基因组大，已经被开发了用于人类基因治疗(Peplinski等， Surg.Oncol.Clin.N.Am.7(3)：575-88(1998))。已经描述了用作肿瘤定向基因治疗载体、表达嘌呤核苷焦磷酸化酶的缺乏胸苷激酶的痘苗病毒(Puhlman等， Human Gene Therapy 10：649-657(1999))。

已经描述了用于人类基因治疗的腺伴随病毒2(AAV)；然而，AAV需要辅助病毒(例如腺病毒或疱疹病毒)以在哺乳动物细胞中进行最佳复制和包装(Snoeck等， Exp.Nephrol.5(6)：514-20(1997)；Rabinowitz等，Curr.Opn.Biotechnol.9(5)：470-5(1998))。然而，已经描述了感染性重组AAV的体外包装，使得该系统更有前途(Ding等， Gene Therapy4：1167-1172(1997))。已经表明，AAV介导的亲嗜性反转录病毒受体cDNA的转移，允许对建成的人细胞和人原代细胞进行亲嗜性反转录病毒转导(Qing等， J.Virology 71(7)：5663-5667(1997))。已经证明了使用表达人野生型p53的AAV载体的癌症基因治疗(Qazilbash等， Gene Therapy 4：675-682(1997))。也已经表明用AAV载体将基因转移到血管细胞中(Maeda等，Cardiovascular Res.35：514-521(1997))。已经证明AAV是用于肝定向基因治疗的合适载体(Xiao等， J.Virol.72(12)：10222-6(1998))。已经证明AAV载体可用于脑组织和中枢神经系统的基因治疗(Chamberlin等， Brain Res.793(1-2)：169-75(1998)；During等， Gene Therapy 5(6)：820-7(1998))。也已经在肺的基因治疗和转移至人囊性纤维化上皮细胞方面将AAV载体与腺病毒载体(AdV)进行了比较(Teramoto等， J.Virol.72(11)：8904-12(1998))。

嵌合的AdV/反转录病毒基因治疗载体系统加入可有用量的每种病毒，以产生通过中间产生反转录病毒生产细胞而变成功能整合型的非整合型AdV(Feng等， Nat.Biotechnology 15(9)：866-70(1997)；Bilbao等， FASEB J 11(8)：624-34(1997))。这种强有力的新一代基因治疗载体已经用于定向癌症基因治疗(Bilbao等， Adv.Exp.Med.Biol.451：365-74(1998))。注射一次表达p53的AdV，抑制人前列腺(prostrate)癌细胞的皮下肿瘤结节的生长(Asgari等， Int.J.Cancer 71(3)：377-82(1997))。已经描述了在晚期非小细胞肺癌患者体内AdV介导的野生型p53的基因转移(Schuler等， Human Gene Therapy 9：2075-2082(1998))。这同一种癌一直是AdV载体介导的p53基因取代疗法的对象(Roth等， Semin. Oncol.25(3增刊8)：33-7(1998))。AdV介导的p53的基因转移，在体内抑制内皮细胞分化和血管生成(Riccioni等， Gene Ther.5(6)：747-54(1998))。也已经描述了作为转移性黑素瘤免疫治疗的腺病毒介导的黑素瘤抗原gp75的表达(Hirschowitz等， Gene Therapy 5：975-983(1998))。AdV促进亲嗜性反转录病毒感染人细胞，并且提高反转录病毒感染的效率(Scott-Taylor等， Gene Ther.5(5)：621-9(1998))。AdV载体已经用于将基因转移至血管平滑肌细胞(Li等， Chin.Med.J.(Engl)110(12)：950-4(1997))、扁平细胞癌细胞(Goebel等， Otolarynol Head Neck Surg 119(4)：331-6(1998))、食管癌细胞(Senmaru等， Int J.Cancer78(3)：366-71(1998))、肾小球系膜细胞(Nahman等， J.Investig.Med.46(5)：204-9(1998))、神经胶质细胞(Chen等， Cancer Res.58(16)：3504-7(1998))和动物关节(Ikeda等， J.Rheumatol.25(9)：1666-73(1998))。新近，证明了基于导管的AcV载体介导的心包基因转移(March等， Clin. Cardiol.22(1增刊1)：I23-9(1999))。对具有合适控制遗传元件的AdV系统的操作，可供用于AdV介导的体内可调节的靶基因表达(Burcin等， PNAS(USA)96(2)：355-60(1999))。

已经开发了用于人类基因治疗应用的甲病毒属载体以及适合用适用于新培斯病毒和西门利启森林甲病毒衍生载体的表达盒转化的包装细胞系(Polo等， Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，96：4598-4603(1999))。也已经开发了基于非细胞病性黄病毒复制子RNA的系统(Vamavski等，Virology 255(2)：366-75(1999))。含有自杀HSV-TK基因的新培斯病毒载体已经用于细胞特异性靶向肿瘤细胞(Iijima等， Int.J.Cancer80(1)：110-8(1998))。

基于人泡沫病毒(HFV)的反转录病毒载体也显示出作为基因治疗载体的前景(Trowbridge等， Human Gene Therapy 9：2517-2525(1998))。已经设计了用于自杀基因治疗的泡沫病毒载体(Nestler等， Gene Ther.4(11)：1270-7(1997))。重组鼠类巨细胞病毒和启动子系统也已经用作高水平表达的载体(Manning等， J.Virol.Meth.73(1)：31-9(1998)；Tong等， Hybridoma 18(1)：93-7(1998))。

通过构建基于仙台病毒的载体，已经使得基因传递到非分裂细胞中变为可行(Nakanishi等， J.Controlled Release 54(1)：61-8(1998))。

在使得能够转化非分裂体细胞的其它工作中，已经探查出慢病毒属载体。已经描述了用基于复制缺陷型人免疫缺陷病毒(HIV)的载体进行的囊性纤维化基因治疗。(Goldman等， Human Gene Therapy 8：2261-2268(1997))。也已经表明通过慢病毒属载体传递到肝和肌肉中的基因持续表达(Kafri等， Nat.Genet.17(3)：314-7(1997))。然而，安全的考虑是主要的，并且改进载体的开发正在快速进行(Kim等， J.Virol.72(2)：994-1004(1998))。HIV LTR和Tat的检查，给出用于开发载体的有关基因组组构的重要信息(Sadaie等， J.Med.Virol.54(2)：118-28(1998))。因此，现在更好地了解了基于HIV的有效载体的遗传需求(Gasmi等， J.Virol.73(3)：1828-34(1999))。已经描述了自动失活载体或条件包装细胞系(例如Zuffery等， J.Virol.72(12)：9873-80(1998)；Miyoshi等， J.Virol.72(10)：8150-7(1998)；Dull等， J.Virol.72(11)：8463-71(1998)；和Kaul等， Virology 249(1)：167-74(1998))。已经表明HIV载体有效地转导人淋巴细胞和CD34+细胞(Douglas等， Hum.Gene Ther.10(6)：935-45(1999)；Miyoshi等， Science 283(5402)：682-6(1999))。已经描述了猫免疫缺陷病毒(FIV)慢病毒载体有效地转导人非分裂细胞，这便于将利用基于HIV的载体相关的安全忧虑减至最小(Poeschla等，Nature Medicine 4(3)：354-357(1998))。已经表明了FIV载体生产性感染人血单核细胞(Johnston等， J.Virol.73(3)：2491-8(1999))。

虽然许多病毒载体难以处理，并且所插入DNA的容量有限，但这些限制和缺点已经得到解决。例如，除简化的病毒包装细胞系外，还开发了衍生自人疱疹病毒-1型单纯疱疹病毒(HSV-1)和EB病毒(EBV)的小病毒载体，以简化病毒载体遗传物质的操作和病毒载体的产生(Wang等， J.Virology 70(12)：8422-8430(1996))。先前已经表明衔接质粒(adaptor plasmid)简化了将外源DNA在不依赖辅助病毒的反转录病毒中的插入( J.Virology 61(10)：3004-3012(1987))。

病毒载体并不是唯一有效的基因治疗工具，因为也已经描述了几种非病毒载体。已经表明基于应用表皮生长因子/DNA多复合体(polyplex)(EGF/DNA)的定向非病毒基因传递载体导致有效且特异性的基因传递(Cristiano， Anticancer Res.18：3241-3246(1998))。已经证明了采用阳离子脂质体对脉管系统和CNS的基因治疗(Yang等， J. Neurotrauma 14(5)：281-97(1997))。也已经用阳离子脂质体完成了胰腺炎的瞬时基因治疗(Denham等， Ann.Surg.227(6)：812-20(1998))。已经表明基于脱乙酰壳多糖的载体/DNA复合体用于基因传递是有效的(Erbacher等， Pharm.Res.15(9)：1332-9(1998))。已经描述了一种基于terplex系统的非病毒DNA传递载体(Kim等，53(1-3)：175-82(1998))。也已经用以脂质体复合物包被的病毒颗粒完成基因转移(Hirai等，Biochem.Biophys.Res.Commun.241(1)：112-8(1997))。

已经证明了通过直接肿瘤注射编码胸苷激酶基因的非病毒T7载体的癌症基因治疗(Chen等， Human Gene Therapy 9：729-736(1998))。质粒DNA的制备对于直接注射基因转移是重要的(Horn等， Hum.Gene Ther.6(5)：656-73(1995))。已经将经修饰的质粒载体具体用于直接注射(Hartikka等， Hum.Gene Ther.7(10)：1205-17(1996))。

因此，本领域已知各种各样的基因转移/基因治疗载体和构建体。容易对这些载体加以改变以用于本发明方法。通过用重组DNA/分子生物学技术进行适当操作，以将有效连接的Raf或Ras编码核酸区段(或者活性的或者无活性的)插入选定表达/传递载体中，可以产生许多用于实施本发明的等同载体。

F. 调节血管生成的方法

一方面，本发明提供一种方法，用于调节病程或病症相关组织中的血管生成、并且因此影响依赖于血管生成的组织中的事件。一般而言，所述方法包括将血管生成调节量的一种组合物给予与病程或病症相关或受其损害的组织，所述组合物包含一种Raf蛋白或表达活性或无活性Raf的核酸载体。

再一种方法包括将血管生成调节量的一种组合物给予与病程或病症相关的组织，所述组合物包含一种Ras蛋白或表达活性或无活性Ras的核酸载体。另一个方法方面包括将血管生成调节量的一种组合物给予与病程或疾病相关的组织，所述组合物包含一种Raf和Ras蛋白或一种或多种表达活性或无活性Raf和Ras的核酸载体。

在病症下，多种组织或由已构成的组织组成的器官中的任一种可以支持血管生成，包括皮肤、肌肉、肠、结缔组织、脑组织、神经细胞、关节、骨和在血管生成刺激下血管可以侵入的类似组织。

在许多实施方案中，待按照本发明治疗的患者是人类患者，虽然本发明对于所有哺乳动物都是有效的。在该方面，“患者”是人类患者以及兽医学患者、需要治疗与涉及血管生成的疾病相关的组织的任一种哺乳动物物种(特别是农业和家畜哺乳动物物种)的哺乳动物。

因此，本发明具体化的方法包括将治疗有效量的一种生理上可耐受的组合物给予患者，所述组合物包含一种Raf和/或Ras蛋白或表达Raf和/或Ras蛋白的核酸载体。

给予Raf或Ras蛋白的剂量范围取决于所述蛋白的形式和所述蛋白的效力，如本文选一步描述的，并且是大到足以产生所需效应的量，其中血管生成和血管生成介导的疾病症状得到缓解。所述剂量不应该大到引起不利副作用，例如粘滞性过高综合征、肺水肿、充血性心力衰竭等。一般而言，剂量将随患者的年龄、病症、性别和疾病严重程度而改变，可以由本领域技术人员确定。所述剂量也可以由各位医师在任何并发症的情况下进行调整。

治疗有效量是Raf或Ras蛋白或编码(活性或无活性)Raf或Ras蛋白的核酸足以产生对所治疗组织中血管生成可测量的调节的量，即血管生成调节量。对血管生成的调节可以通过本文所述的CAM测定、检查肿瘤组织或通过本领域技术人员已知的其它方法在体外测定或监测。

可以通过注射或在一定时间内逐渐输注，经胃肠外给予所述Raf或Ras蛋白或表达这类蛋白的核酸载体。虽然在体内通常可以通过系统给药来进入待治疗组织，并且因此最常通过静脉给予治疗组合物来治疗，但在有可能靶组织含有所述靶分子的情况下，也考虑了其它组织和传递方法。因此，本发明的组合物可以经静脉内、腹膜内、肌内、皮下、腔内、经皮给予，并且如有需要可以通过蠕动工具传递。

含有Raf或Ras蛋白或表达所述Raf或Ras蛋白的核酸载体的治疗组合物可以按常规静脉内给予，例如通过注射一个单位剂量给予。术语“单位剂量”当用于本发明的治疗组合物时，是指物理上分离的对于所述受治疗者而言适合作为单位剂量的单位，每个单位含有结合所需生理可接受的稀释剂(即载体)或溶媒、计算产生所需治疗效应的预定量的有效物质。

在一个优选实施方案中，所述有效物质以一个剂量静脉内给予。可以通过直接注射或利用解剖学上分离的区室、隔离靶器官系统的微循环、在循环系统中再灌注、或基于导管的暂时闭合与患病组织相关的脉管系统的靶区域，完成局部给药。

所述组合物以与所述剂型匹配的方式、以治疗有效量给予。给药量和给药时间取决于待治疗的受治疗者、受治疗者系统利用所述有效成分的能力和所需的治疗效应的程度。需要给予的有效成分的精确量取决于医师的判断，并且对于每个个体都是特殊的。然而，本文公开了系统给药的合适剂量范围，所述剂量范围取决于给药途径。合适给药方案也是可变的，但通常为一次最初给药，然后以一小时或数小时的间隔，通过随后注射或其它给药法重复给药。或者，设计了足以维持血液内体内治疗特定范围内浓度的连续静脉输注。

1. 血管生成的抑制

有各种各样的疾病，重要的是抑制血管生成，这些疾病称为血管生成性疾病，包括但不限于炎症，例如免疫性和非免疫性炎症、慢性关节风湿病和银屑病；与血管不适当或不合时机侵入相关的疾病，例如糖尿病性视网膜病、新血管性青光眼、再狭窄、动脉粥样硬化斑和骨质疏松中的毛细管增生；以及癌症相关疾病，例如实体瘤、实体瘤转移瘤、血管纤维瘤、晶状体后纤维组织形成、血管瘤、Kaposi肉瘤等需要新血管形成以支持肿瘤生长的癌症。

因此，在与病症相关的组织中抑制血管生成的方法缓解所述疾病的症状，并且根据所述疾病，可以导致疾病的治愈。在一个实施方案中，本发明设计了抑制病症相关组织中血管生成自身。组织中血管生成的程度以及因此用本发明方法达到的抑制程度可以通过多种方法评估。

因此，在一个实施方案中，待治疗组织是炎症组织，而待抑制的血管生成是其中炎症组织有新血管形成的炎症组织的血管生成。这种具体方法包括抑制例如慢性关节风湿病患者体内关节组织、免疫性或非免疫性炎症组织、银屑病组织等中的血管生成。

在另一实施方案中，待治疗的组织是视网膜病患者的视网膜组织，所述视网膜病例如糖尿病性视网膜病、黄斑变性或新血管性青光眼，而待抑制的血管生成是其中视网膜组织有新血管形成的视网膜组织的血管生成。

在又一实施方案中，待治疗组织是实体瘤、转移瘤、皮肤癌、乳腺癌、血管瘤或血管纤维瘤等癌症患者的肿瘤组织，而待抑制的血管生成是其中肿瘤组织有新血管形成的肿瘤组织的血管生成。可用本发明方法治疗的典型的实体瘤组织包括肺、胰腺、乳房、结肠、喉、卵巢等组织。由于新血管形成在肿瘤生长中起重要作用，故此抑制肿瘤组织的血管生成是一个特别优选的实施方案。在肿瘤组织没有新血管形成的情况下，肿瘤组织没有获得所需的营养、生长缓慢、停止进一步生长、消退，并且最终变为坏死，导致杀死所述肿瘤。

换句话说，本发明提供一种通过按照本发明方法抑制肿瘤血管生成来抑制肿瘤新血管形成的方法。同样，本发明提供一种通过实施抑制血管生成的方法而抑制肿瘤生长的方法。

所述方法对于转移瘤的形成也特别有效，因为(1)它们的形成需要原发性肿瘤的血管形成，使得转移性癌细胞可以离开原发性肿瘤，并且(2)它们在第二位点的建立需要新血管形成以支持转移瘤的生长。

在再一实施方案中，本发明设计了结合其它疗法(例如针对实体瘤和用于控制转移瘤建立的常规化学疗法)实施所述方法。通常在化疗期间或之后给予血管生成抑制剂，虽然最好在化疗方案之后抑制血管生成，在化疗之后时常肿瘤组织将对毒性攻击作出反应，通过诱导血管生成以通过为肿瘤组织提供血液供应和营养而恢复。另外，最好在已经除去实体瘤作为预防转移的措施的手术后，实施所述血管生成抑制方法。

因为本发明方法适用于抑制肿瘤的新血管形成，所以所述方法也适用于抑制肿瘤组织的生长、抑制肿瘤转移的形成以及已建立肿瘤的消退。

再狭窄是一个平滑肌细胞(SMC)迁移并增生到经皮经腔冠状血管成形术部位的组织中的过程，妨碍了血管成形术的成功。再狭窄期间平滑肌细胞的迁移和增生可以被认为是一个血管生成过程，这可以用本发明方法抑制。因此，本发明也设计了通过按照本发明方法在血管成形术手术后抑制患者体内的血管生成，来抑制再狭窄。关于再狭窄的抑制，因为冠状血管壁有再狭窄的危险，通常在血管成形术手术后通常从约2天至约28天、更通常在手术后约前14天给予失活的酪氨酸激酶。

用于抑制病症相关组织中血管生成以及因此用于也实施治疗血管生成相关疾病的方法的本发明方法，包括使发生血管生成或有发生血管生成危险的组织与治疗有效量的一种组合物接触，所述组合物包含一种失活的Raf蛋白或表达所述蛋白的载体。早在首次接触所述治疗组合物之后7天，发生血管生成的抑制和肿瘤消退。最好再次暴露于或延长暴露于无活性Raf或Ras蛋白7天至6周，最好暴露约14天至28天。在所述调节效应较早可检测到的情况下，较短的暴露时间可能是有效的，然而最好给药后暴露至少12小时。

2. 血管生成的增强

在理想的是促进或增强血管生成的情况下，给予所述组织活性Raf或Ras蛋白是有效的。给药途径和给药时间与上文关于抑制所述的方法相当。

G. 治疗组合物

本发明设计了可用于实施本文所述治疗方法的治疗组合物。本发明的治疗组合物含有一种生理上可耐受的载体与溶于或分散于所述载体中作为有效成分的一种Raf或Ras蛋白或本文所述的能够表达Raf或Ras蛋白的载体。在一个优选实施方案中，所述治疗组合物当给予哺乳动物或人类患者用于治疗目的时，没有免疫原性。

本文所述的术语“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”及其语法上的变体，当它们是指组合物、载体、稀释剂和试剂时，可互换使用，代表能够给予哺乳动物或给予哺乳动物时不产生不希望有的生理效应(例如恶心、眩晕、反胃等)的物质。

其中含有溶解或分散的有效成分的药理学组合物的制备是本领域众所周知的，根据制剂不必受限制。通常，这类组合物被制备为注射剂，或者为液体溶液或者为液体悬浮液；然而也可以制备适用于溶液或悬浮液、在使用之前溶于液体中的固体形式。也可以将所述制剂乳化或以脂质体组合物存在。

有效成分可以与药学上可接受的并且与所述有效成分相容的、适用于本文所述治疗方法的量的赋形剂混合。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，如有需要，所述组合物可以含有少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等增强有效成分效力的物质。

本发明的治疗组合物可以包括其中组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与例如盐酸或磷酸的无机酸或诸如乙酸、酒石酸、扁桃酸等之类的有机酸形成的酸加成盐(与所述多肽的游离氨基形成的)。与游离羧基形成的盐也可以从例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁的无机碱以及诸如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等之类的有机碱衍生。

生理上可耐受的载体是本领域众所周知的。典型的液体载体是除所述有效成分和水之外不含其它物质的无菌水溶液，或含有例如生理pH值的磷酸钠的缓冲液、生理盐水或前两者，例如磷酸缓冲盐溶液。再者，水性载体可以含有不止一种的缓冲盐以及诸如氯化钠和氯化钾的盐、葡萄糖、聚乙二醇和其它溶质。

液体组合物除含有水和不含水外，也可以含有液相。典型的这类额外的液相是甘油、植物油例如棉子油以及水-油乳液。

一种治疗组合物含有血管生成调节量的一种本发明Raf或Ras蛋白、或足够的重组DNA表达载体以表达有效量的Raf或Ras蛋白，通常将其配制含有总治疗组合物重量的至少0.1％(重量)的Raf或Ras蛋白。重量百分比是Raf蛋白与总组合物重量之比。因此，例如，0.1％(重量)是每100克总组合物0.1克Raf或Ras蛋白。对于DNA表达载体而言，给予量取决于所述表达载体的特性、待治疗的组织等考虑。合适的给予量可以根据预期的载体量、或所表达蛋白量来测量。

H. 制品

本发明也设计了作为贴有标签的容器以提供本发明Raf或Ras蛋白的制品。一种制品包括包装材料和一种包含在所述包装材料中的药剂。

所述制品中的所述药剂是如本文所述、根据所公开的指示适用于提供Raf或Ras蛋白并且配制为药学上可接受的形式的任何本发明组合物。因此，所述组合物可以包含Raf和/或Ras蛋白或能够表达Raf和/或Ras蛋白的DNA分子。所述制品含有足以用于治疗本文所述病症的量、或者单位剂量或者为多剂量的药剂。

包装材料包括一个标签，所述标签指示其中所含药剂的用法，例如用于治疗通过抑制或增强血管生成而有所帮助的病症等本文公开的病症。标签还可以包括使用说明和相关的信息，如销售所需的信息。包装材料可以包括用于贮存所述药剂的容器。

本文所用的术语包装材料，是指例如玻璃、塑料、纸、箔等能够将药剂保持在固定装置中的材料。因此，例如包装材料可以是塑料瓶或玻璃瓶、层压包装等用来包含药用组合物(包括所述药剂)的容器。

在优选实施方案中，所述包装材料包括一个标签，所述标签是描述制品内容物和其中所含药剂用法的明确表述。

实施例

以下实施例涉及本发明，是说明性的，当然不应该解释为具体限制本发明。此外，在本领域技术人员技术范围内的现在已知或以后发展的本发明的这类变化，被认为属于此后要求保护的本发明范围内。

1. c-Raf表达构建体的制备

为了制备可用于通过本发明方法调节血管生成的表达构建体，对c-Raf cDNA进行操作，并将其插入表达构建体/载体中。

编码野生型(即内源的)人c-Raf的cDNA序列描述于图7所示的核酸序列(SEQ ID NO.：1，核苷酸130...2076)中，所编码翻译的所述Raf蛋白的氨基酸残基序列示于图8(SEQ ID NO.：2)中。

本发明描述了调节血管生成的两类c-Raf功能。如前所述，一类含有增加血管生成并因此被认为是活性蛋白的Raf分子。本发明显示了诱导血管生成的野生型Raf连同各种突变。

在该方面就其诱导血管生长并因此在体内增强肿瘤重量的能力而论有功能的野生型c-Raf的一个优选突变体，是其中仅表达Raf的氨基酸残基306-648(Raf306-648)的Raf突变构建体。该构建体缺乏整个调节激酶结构域，因此被称为组成型活性的Raf蛋白。

也已经表明Raf中的突变对血管生成具有相反的调节效应，抑制血管生成，而不是刺激血管生成。这类突变被称为无活性Raf突变。具有赋予这种抑制活性的突变的蛋白，也被称为显性失活Raf蛋白，因为它们抑制新血管形成，包括由于Raf内源活性以及由于生长因子刺激引起的Raf活性增强所致的新血管形成。因此，本发明的野生型c-Raf的某些突变体就其阻止血管生长和例如因此在体内降低肿瘤重量的能力而论，也可以用作显性失活蛋白。

一种示例性的抑制性Raf构建体是其中赖氨酸氨基酸残基375被突变为任何其它氨基酸、优选突变为甲硫氨酸的Raf突变体(即RafK375M)。激酶结构域中的这种点突变阻止ATP结合，也阻断与血管细胞和肿瘤细胞信号和增生相关的依赖激酶的Raf功能。另一种抑制性Raf突变体可以包含截短的Raf蛋白形式的氨基酸残基1-305(即Raf1-305)，它缺乏激酶结构域。

就点突变而论，产生所需抑制活性或刺激活性的任何突变都可考虑用于本发明。也考虑了将所需Raf蛋白(其突变体或片段)与已表达氨基酸标记、抗原表位、荧光蛋白或其它这类蛋白质或肽组合的融合蛋白构建体。只要所述Raf蛋白的所需调节效应完整即可。

为了在cDNA中产生所需的c-Raf突变，利用本领域技术人员熟悉的标准定点诱变法。也设计了具有限制位点以有助于随后克隆步骤、设计加入所需突变的PCR引物。根据已知的鸡、人等Raf同系物的cDNA序列，通过PCR扩增技术从所述核酸构建体缺失Raf编码核酸序列的完整区段，随后形成新的构建体。

具体地说，以几种方式修饰图7所示的野生型Raf cDNA序列，以构建Raf突变体，以证明本发明的原理。将这些突变体插入本文所述的反转录病毒表达系统中。

第一种突变Raf名为Raf K375M，是在野生型人Raf中构建的，其中第375位氨基酸残基的赖氨酸被甲硫氨酸取代。Raf K375M是一种本文所述的“无活性”Raf蛋白。

第二种突变Raf名为Raf 306-648，是在野生型人Raf中构建的，其中缺失氨基末端部分，留下截短的羧基末端残基306-648。Raf 306-648是一种本文所述的“活性”Raf蛋白。

第三种突变Raf名为Raf 1-305，是在野生型人Raf中构建的，其中缺失羧基末端部分，留下截短的氨基末端残基1-305。Raf 1-305是一种本文所述的“无活性”Raf蛋白。

一种替代的用于表达本发明Raf或Ras蛋白的表达载体也包括美国专利第4,797,368号、第5,173,414号、第5,436,146号、第5,589,377号和第5,670,488号中所述的腺病毒载体。可供选择的传递Raf或Ras调节蛋白的方法包括用美国专利第5,675,954号中所述的非病毒载体系统传递Raf或Ras cDNA、以及如美国专利第5,589,466号中所述将所述cDNA本身作为裸露DNA传递。本发明构建体的传递也不限于局部应用病毒载体，也可通过静脉注射病毒载体制剂，以系统传递到血管床中，或可以将其皮下、组织内注射等。作为实例，这些载体也可通过局部注射肿瘤，被定向到新血管形成增强的部位。

也设计了体外表达的蛋白，以在表达和纯化选定的Raf或Ras蛋白后通过可用于传递蛋白质或多肽的方法传递。一种这样的方法包括脂质体传递系统，例如美国专利第4,356,167号、第5,580,575号、第5,542,935号和第5,643,599号中所述的脂质体传递系统。用于本发明Raf或Ras蛋白表达和/或传递的其它载体和蛋白质传递系统是本领域技术人员众所周知的。

2. 人肿瘤模型

为了证实本发明的效力，将人肿瘤细胞皮下移植到无胸腺小鼠的胁腹，让其生长至约100mm³。在这种异种移植模型中，移植物周围组织中的鼠内皮细胞对正常的血管生成信号应答，形成生长到生长中的人肿瘤中的脉管系统，所述肿瘤变为形成血管。因此，鼠内皮细胞形成微血管，而肿瘤组织本身包含人细胞。

3. 反转录病毒传递载体感染小鼠谱系细胞、而不感染人肿瘤细胞

用Clonetech的反转录病毒表达载体系统，构建含有本文所述Raf构建体的亲嗜性反转录病毒。为了证明感染性反转录病毒的组织特异性，如图1的图例中所述，用亲嗜性包装细胞包装表达b-半乳糖苷酶的反转录病毒表达载体构建体。

在体外培养小鼠3T3小鼠内皮细胞、人表皮腺癌LS174细胞和人黑素瘤M21细胞，将每种细胞暴露于所述亲嗜性包装的反转录病毒。仅所述鼠细胞表达可检测的b-半乳糖苷酶，表明在该表达系统中仅鼠细胞被亲嗜性包装的反转录病毒感染。

4. 无活性Raf激酶在体外破坏Raf激酶活性

为了证明无活性Raf激酶的细胞效应，使用采用bFGF诱导的小鼠内皮细胞的体外模型。当小鼠内皮细胞首先被如图2图例中所述的表达无活性Raf K375M激酶构建体的反转录病毒构建体感染时，通过给予小鼠内皮细胞bFGF对Raf活性的正常诱导被阻断。图2中的数据表明，当细胞首先被表达无活性Raf激酶的载体感染时，Raf激酶活性的量大大降低。

5. 无活性Raf激酶在体内破坏血管生成

用一种血管生成的体内鼠皮下模型，研究无活性Raf激酶的效应。为此，如图3图例中所述，通过注射或者有或者无表达反转录病毒细胞的bFGF，在小鼠体内诱导血管生成，所述反转录病毒产生无活性Raf K375M激酶蛋白。如图3所示，无活性Raf激酶的存在，大大降低了血管生成指数。

6. 活性Raf激酶在体内诱导血管生成

用所述血管生成的鼠皮下模型，研究活性Raf激酶的效应。为此，如图4图例中所述，通过注射表达反转录病毒细胞，诱导血管生成，所述反转录病毒产生活性Raf 306-648激酶。如图4所示，突变的活性Raf激酶在体内诱导血管生成。

7. 无活性Raf激酶诱导细胞凋亡

采用上述小鼠异种移植模型，研究无活性Raf的体内效应。为此，如图5图例中所述，通过注射1.5×10⁶人腺癌LS174细胞，建立该模型。在建立约100mm³的肿瘤块后，将表达无活性Raf K375M激酶的反转录病毒注射到肿瘤块中，48小时后在肿瘤块切片上进行免疫组织化学。图5(Flag标志)所示的结果表明，所述反转录病毒感染是内皮特异性的，通过vWF染色进一步表明，内皮细胞与所述反转录病毒感染共定位。所述染色数据的并合表明，内皮细胞、病毒感染和细胞凋亡的发生共定位，表明无活性Raf蛋白的病毒传递是内皮特异性的，并且无活性Raf诱导细胞凋亡。

8. 无活性Raf激酶诱导肿瘤消退

采用上述小鼠异种移植模型，研究无活性Raf对肿瘤消退的体内效应。为此，如图6图例中所述建立模型，无活性Raf K375M激酶如上所示作为病毒上清液或表达病毒的细胞提供。观察到已建立的肿瘤在导入无活性Raf激酶后快速消退。

9. 血管生成依赖于Ras-Raf-MEK-ERK途径的激活

为了测定生长因子受体和整联蛋白受体连接之间的相互作用以及对参与调节血管生成的促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)/胞外信号调节激酶(ERK)级联活化的激活，进行以下实施例9-11中的研究。如Aplin等， Pharmacol.Rev.，50：197-263(1998)综述，许多实验室已经研究了整联蛋白介导的细胞粘着对MAPK级联的激活。等级ERK级联起始于具有促分裂原受体和生长因子受体的细胞膜上，它募集小三磷酸鸟苷(GTP酶)Ras，然后后者通过与一种蛋白激酶Raf结合并将其募集到细胞膜而激活Raf，在细胞膜上Ras以另一未确定的机制被活化。然后，活化的Raf将MEK(MAPK/ERK激酶)磷酸化并活化。然后，ERK将ERK1和ERK2磷酸化和活化，ERK1和ERK2然后转移至细胞核，反式激活转录因子，以通过改变的基因表达实现生长、分化或有丝分裂。(参见Tibbles等， Cell Mol.Life Sci.，55：1230-1254(1999))。

Ras在由生长因子和/或整联蛋白信号介导的Raf活化中的上游调节是当前研究的对象，但对于信号机制仍未有全面的了解。(参见Stewart等， J.Biol.Chem.，275：8854-8862(2000)；Howe等， J.Biol.Chem.，273：27268-27274(1998))。然而并且更为重要的是，在本发明之前，尚未描述过Ras-Raf-MEK-ERK级联通过细胞膜受体信号的激活导致对血管生成的调节。

A. 通过暴露于bFGF诱导Ras

因此，为了首先评价血管生成是否依赖于Ras-Raf-ME-ERK途径，在暴露于bFGF的鸡尿囊绒膜(CAM)裂解液中，通过Ras拆除(pulldown)测定，测量Ras活性。

可以在正常胚胎血管生成导致成熟血管形成之后，在CAM上诱导血管生成。如Leibovich等， Nature，329：630(1987)和Ausprunk等， Am. J.Pathol.，79：597(1975)所述，已经表明，对特定细胞因子或肿瘤片段应答，诱导血管生成。由鸡胚制备CAM，用于随后血管生成的诱导及其抑制。10日龄鸡胚得自McIntyre Poultry(Lakeside，CA)，将其于37℃、60％湿度孵育。在鸡蛋末端，直接在气囊之上，用小手工钻(craft drill)(Dremel，Division of Emerson Electric Co.，Racine WI)开一个穿过蛋壳的小孔。在鸡蛋长边在通过照蛋箱透照鸡蛋先前确定的无胚胎血管区中钻第二个孔。在第一个孔上加负压，导致CAM(尿囊绒膜)离开壳膜，在CAM上产生一个假气囊。借助小型砂轮(Dremel)，在脱落的CAM上透过蛋壳切一个1.0厘米(cm)×1.0cm的方形窗。所述小窗允许直接触及下面的CAM。

然后在血管生成已平息的胚胎发生10天时，使用所得的CAM制备物。因此，将后一制备物用于本发明，以诱导对细胞因子处理或肿瘤接触应答而重新开始的血管生成，必要时如下所述处理。

1) 由生长因子诱导的血管生成

已经表明血管生成由细胞因子或生长因子诱导。通过将用Hank平衡盐溶液(HBSS，GIBCO，Grand Island，NY)或含重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)或血管内皮细胞生长因子(VEGF)(Genzyme，Cambridge，MA)的HBSS饱和的5毫米(mm)×5mm Whatman滤纸(1号Whatman滤纸)置于9日龄或10日龄鸡胚CAM的无血管区上，然后用胶带密封窗口，诱导血管生成。在诱导血管生长时其它生长因子也是有效的。对于通过静脉注射拮抗剂(例如LM609单克隆抗体)评估对血管生成抑制的测定，首先用bFGF或VEGF在成纤维细胞生长培养基中诱导血管生成，然后如实施例10中所述给予抑制剂。72小时后通过光学显微镜监测血管生成。

得自10日龄鸡胚的CAM用以或者PBS或者30纳克(ng)bFGF饱和的滤纸作局部刺激。5分钟后，解剖出CAM组织，在裂解缓冲液中匀浆，然后根据被编码Raf的Ras结合结构域的GST融合肽沉淀的能力，测定Ras活性。因为仅活性Ras结合Raf，所以产生由Raf的Ras结合结构域与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)缀合构成的重组蛋白。进而将GST与sepharose珠缀合，使得能够从组织裂解液中沉淀活性Ras。

结果示于图9，其中在暴露于bFGF的CAM裂解液中，通过Ras拆除测定评价Ras活性。因此，通过在CAM中暴露于bFGF来诱导Ras。如实施例10中所述，进一步评价Ras在CAM中形成血管生成性血管中的作用。

B. Ras是血管生成必需的

然后为了确定血管生成是否依赖于CAM制备物中Ras的活化，如下所述，将CAM暴露于用以表达显性失活Ras突变体S17N Ras的RCAS反转录病毒制剂并结合Ras的bFGF活化。已经表明这种突变体以优于GTP的优先亲合性结合GDP，由此提供通过螯合Ras-GEF抑制内源Ras活化的突变体。因此，在CAM血管生成模型中应用所述突变体，提供了一种评价Ras在血管生成中作用的方法。

通过如先前所述的标准定点诱变方法，用编码天冬酰胺(N)的密码子取代第17位丝氨酸(S)残基的编码三联体，从野生型人Ras(wt H-Ras)序列构建S17N Ras突变体。其它人例如Stewart等( J.Biol.Chem.，275：8854-8862(2000)已经描述了这类突变体。

为了制备显性失活表达构建体的反转录病毒构建体，在wt H-Ras上进行这种诱变，其中编码wt H-Ras的核酸序列示于图10(SEQ IDNO.：3)。图11(SEQ ID NO.：4)描述了由图10所示的野生型人Ras(wtH-Ras)cDNA核苷酸序列编码的氨基酸残基序列。为了在所述wt H-Ras cDNA中产生所需突变以制备S17N Ras以及以下所述的突变体，利用本领域技术人员熟悉的定点诱变方法。也设计了设计用于加入所需突变并且具有限制位点以利于随后克隆步骤的PCR引物。根据已知的鸡、人等Ras同系物的cDNA序列，通过PCR扩增技术从所述核酸构建体可以缺失Ras编码核酸序列的完整区段，随后形成新的构建体。也通过PCR，对通过PCR构建的所有突变构建体测序，以证实克隆的预测DNA序列。

然后将所得的突变Ras序列制备为本文所述的反转录病毒表达载体构建体。一个用于本发明的优选的表达构建体是RCAS(A)构建体。该表达载体基于一系列具有复制能力的、Bryan聚合酶(BP)增强以提高滴度的禽类肉瘤病毒，并且对于正常禽类细胞上表达的A型包膜糖蛋白是特异性的(综述于Methods in Cell Biology，52：179-214(1997)；也参见Hughes等， J.Virol.61：3004-3012(1987)；Fekete和Cepko， Mol. Cellular Biol.13：2604-2613(1993)；Itoh等， Development 122：291-300(1996)；和Stott等， BioTechniques24：660-666(1998))。本文称为RCAS的RCAS(A)的完整序列是本领域技术人员已知的，并且可在数据库中获得。

然后将所制备的5微克(μg)RCAS构建体转染到鸡无限增殖化成纤维细胞系DF-1(Doug Foster的馈赠，U of Minn.)中。该细胞系以及原代鸡胚成纤维细胞能够产生病毒，然而DF-1细胞系产生的滴度较高。从无血清CLM培养基[组成：F-10培养基，补充DMSO、叶酸、谷氨酸和MEM维生素溶液]中的分会合DF-1生产细胞系中收集病毒上清液。通过于4℃以22,000rpm超离心2小时，对35ml病毒上清液进行浓缩。将这些浓缩的病毒沉淀重悬于1/100原始体积的无血清CLM培养基中，分为等分样品并贮存于-80℃。通过连续稀释具有绿色荧光蛋白(GFP)编码核苷酸序列的对照病毒载体(称为RCAS-GFP)、对孵育48-72小时的原代鸡胚成纤维细胞进行感染，评价滴度。在浓度通常超过10⁸I.u/ml后，获得病毒储液的滴度。

对于采用病毒储液的CAM测定，在溶于95％乙醇的3mg/ml醋酸可的松中达30分钟，制备经醋酸可的松浸泡的、直径为6mm的Whatman滤纸。将滤纸在层流罩超净台中干燥，然后每片滤纸浸泡在20μl病毒储液上达10分钟。将这些滤纸敷在10日龄鸡胚的CAM上，然后用玻璃胶带密封，并于37℃孵育18-24小时。然后，将15微升(μl)体积的合适病毒储液中的浓度为5μg/ml或者模拟PBS或者生长因子加至CAM，作为对CAM组织的另一次病毒加强。72小时后，收获CAM，检查血管生成指数的变化，血管生成指数通过对滤纸下CAM所分支点数进行双盲计数来测定。对于激酶测定，将滤纸下的组织收获于RIPA中，用电动研磨机匀浆，并如先前在实施例4所述测定Raf。对于免疫荧光研究，将滤纸下的CAM组织在低温防护剂OCT中冷冻，以4μm切片，在丙酮中固定1分钟，在3％正常山羊血清中孵育1小时，然后如先前所述(Eliceiri等， J.Cell Biol.，140：1255-1263(1998))在第一兔抗体中孵育，在PBS中洗涤，然后用荧光第二抗体检测。

图12所示结果图示了用突变的无效Ras-S17N感染，阻断了CAM中生长因子诱导的血管生成，但对于未暴露于bFGF以诱导血管生成的CAM没有影响。因此，Ras是bFGF诱导的血管生成所必需的。

C. 通过Raf-MEK-ERK途径的Ras信号是血管生成的关键调节因素

为了进一步评价Ras在调节血管生成的Raf-MEK-ERK途径中的作用，将另一种H-Ras突变蛋白用于如上所述的CAM制备物中，其结果示于下文和图13中。在该方面，本发明描述了两类可以调节血管生成的Ras功能。正如先前关于Raf蛋白所讨论的，一类含有增加血管生成并因此被认为是活性蛋白的Ras分子。本发明显示了诱导血管生成的野生型Ras连同各种突变。

在该方面就其诱导血管生长并因此在体内增加肿瘤重量的能力而论有功能的野生型H-Ras的一个优选突变体，是Ras G12V，也称为V12，它是在第12位氨基酸(aa)残基具有一个甘氨酸(G)变为缬氨酸(V)的点突变的突变体。该突变体Ras具有组成型活性的。

本发明描述为组成型血管生成激活剂的另一种H-Ras突变蛋白是Ras V12S35，其中第12位的甘氨酸变为缬氨酸(V)，并且第35位的苏氨酸(T)变为丝氨酸(S)，这两个突变产生Ras V12S35。已经表明这种突变的H-Ras蛋白仅选择性地激活Raf-MEK-ERK途径，如图13A所示。

一种血管生成的H-Ras负调节剂是Ras V12C40突变体，其中第12位的甘氨酸与Ras V12S35一样变为缬氨酸(V)，但另一个突变位于第40位，在此酪氨酸残基(Y)变为半胱氨酸(C)，这两个突变因而产生Ras V12C40。已知这种突变的H-Ras选择性地激活P1-3激酶(图13A中所示的P13K)途径，该途径激活Akt和Rac。因此，Ras V12C40在Raf-MEK-ERK途径中没有作用，并且不刺激血管生成，而是抑制血管生成。具有赋予对血管生成抑制活性的突变的蛋白质也称为显性失活Ras蛋白，因为它们抑制新血管形成，包括由于Ras内源活性所致的血管生成以及由于生长因子刺激引起的Ras活性增强所致的血管生成。因此，本发明的某些野生型H-Ras突变体就其阻止血管生长的能力并且例如因此在体内降低肿瘤重量而论，也可以用作显性失活突变体。先前Joneson等， Science，271：810-812(1996)已经描述了所述三种H-Ras构建体和突变蛋白。

关于点突变，考虑了产生所需抑制活性或刺激活性的任何突变都可用于本发明。也考虑了将所需Ras(或如以下实施例中所述的Raf蛋白)(其突变体或片段)与已表达氨基酸标记、抗原表位、荧光蛋白或其它这类蛋白质或肽组合的融合蛋白构建体，只要所述Ras蛋白的所需调节效应完整即可。

为了评估其它Ras突变蛋白在血管生成信号途径激活中的作用，如上所述制备了相应的反转录病毒表达构建体。将15μl编码Raf-MEK-ERK激活Ras构建体Ras V12S35或PI3激酶激活Ras构建体RasV12C40的高滴度RCAS(A)病毒局部应用于10日龄CAM制备物中的滤纸中，如上所述，在信号途径的选择性激活方面评价所述突变Ras蛋白对血管生成的结果。

图13A和13B分别以示意图和图说明，用选择性激活Ras-Raf-MEK-ERK途径的突变Ras构建体Ras V12S35感染，诱导血管生成；而选择性激活PI3K途径的突变构建体Ras V12C40不诱导血管生成。因此，这些结果证实，Ras V12S35蛋白是一种血管生成刺激物，并且Ras介导的对血管生成的激活通过激活Raf-MEK-ERK途径发生，而不是通过H-Ras突变体V12C40所用的P13K途径发生。

D. MEK-ERK途径的MEK组分是Ras或不依赖Ras的Raf 诱导血管生成所需的

为了进一步评价Ras和Raf各自在调节血管生成的Raf-MEK-ERK途径中的作用，在本文所述的CAM制备物中结合一种已知的MEK激活抑制剂PD98059使用一种称为Raf-Caax的Raf突变蛋白，该突变蛋白靶向质膜，已知是组成型的并且在无Ras结合时有酶活性。图14描述了编码融合蛋白Raf-caax的核苷酸序列，其中编码人Raf(wt H-Raf)羧基末端的核苷酸序列与编码K-ras膜定位结构域的20个氨基酸残基序列的核苷酸序列融合(SEQ ID NO.：6)。图15描述了由图14所示的融合核苷酸序列产生的融合蛋白Raf-caax的氨基酸残基序列(SEQ IDNO.：7)。Leevers等， Nature，369：411-414(1994)和Stokoe等， Science，264：1463-1467(1994)已经描述了所述融合蛋白。

关于评价不依赖Ras的Raf诱导的血管生成以及由Raf诱导的血管生成，将MEK抑制剂PD98059如上所述用于CAM制备物中。如实施例9B中所述，将实施例9C所述制备的编码激活Ras构建体RasV12(Ras G12V)的病毒和编码激活Raf构建体Raf-caax的病毒局部应用于滤纸上。24小时后，将1毫微摩尔MEK抑制剂PD98059加入该滤纸上。然后如实施例9B和图12所述评估CAM。绘图的数据是20个胚胎的平均值±SE。

图16A-16E和图16F分别以照片和图说明，MEK抑制剂PD98059阻断由或者突变的活性Ras(图16B)或者Raf(tu 16D)诱导的血管生成(图16C和16E)。因此，Ras和Raf都通过MEK-ERK途径诱导血管生成。绘成图的数据图示了各个处理的CAM的照片的结果。

10. 不由Ras诱导而由Raf诱导的血管生成难以通过整联蛋白封闭来抑制

为了确定整联蛋白信号如何激活导致血管生成的Ras-Raf-MEK-ERK途径，在存在α_vβ₃整联蛋白封闭性抗体的情况下进行用突变的活性Ras和Raf构建体的CAM测定。得自10日龄鸡胚的CAM如图9和12中所述，用以PBS(对照)、bFGF、RCAS(A)反转录病毒构建体G12V-Ras或Raf-caax饱和的滤纸刺激。24小时后静脉内传递抗整联蛋白α_vβ₃的单克隆抗体LM609，72小时后通过血管分支点分析评价血管生成。代表性CAM示于插图中。数据为20个胚胎的平均值±SE。

图17A-17F和图17G分别以照片和图说明：不由Ras诱导而由Raf诱导的血管生成难以通过整联蛋白封闭加以抑制。分别如图17B和17C中所示，用突变的活性Ras和Raf两种构建体感染，都诱导显著的血管生成，但仅Ras诱导的血管生成被α_vβ₃整联蛋白封闭性抗体抑制，如图17E所示。由于用于该测定中的Raf构建体是不依赖Ras的，因此缺乏对Raf诱导的血管生成的整联蛋白抑制表明，整联蛋白信号发生在Raf的Ras介导的激活时或之前。绘成图的数据图示了各个处理的CAM照片的结果。

11. 粘着斑激酶对Ras-Raf-MEK-ERK途径的调节

为了确定生长因子受体激活Ras-Raf-MEK-ERK血管生成途径的作用，如上所述，用或者Ras V12或者Raf-caax已表达蛋白在存在突变的无效粘着斑激酶(称为FRNK)的情况下进行CAM血管生成测定，FRNK是一种无活性粘着斑激酶。

将如上所述制备的编码Ras V12或Raf-caax的RCAS(A)病毒与编码FAK相关的无效激酶(FRNK)的RCAS(B)病毒一起，如实施例9B(图12)所述局部应用于CAM滤纸上。数据是20个胚胎的平均值±SE。

结果示于图18A-18D和18E。图18A-18D以照片说明：用突变的无效粘着斑激酶FRNK共感染CAM，阻断了Ras诱导的血管生成，但不阻断Raf诱导的血管生成，如与未经处理的Ras(图18A)、未经处理的Raf(图18C)和经FRNK处理的Raf(图18D)相比图18B中缺乏血管所示。绘成图的数据图示了各个处理的CAM照片的结果。

在如先前所述制备的鼠皮下血管生成模型中证实了CAM测定中的数据。通过在小鼠胁腹皮下注射250μl冰冷的含有或者400ng/mlbFGF或者表达所述基因的莫洛尼反转录病毒表达包装细胞的生长因子减少的matrigel，诱导血管生成。将FRNK反转录病毒作为用vsv.g外壳蛋白包装的高滴度病毒加入matrigel中。5天后，通过尾静脉注射内皮特异性FITC缀合的Bandeiriea Simplifica B5凝集素并让其循环。然后通过取出、提取和分析血管生成组织的荧光含量，对血管生成进行定量。

图19A和图19B-19G分别以图和照片说明：在鼠皮下血管生成模型中，FRNK阻断bFGF和Ras诱导的血管生成，但不阻断Raf诱导的血管生成。

为了证实激酶激活发生在Ras-Raf-MEK-ERK途径中的水平，用表达突变的无效粘着斑激酶FRNK的反转录病毒或者与Ras G12V或者与Raf-caax共感染CAM。如图18所述处理CAM，只是在24小时后切取血管生成组织，将其溶解，进行Raf免疫沉淀，然后根据其将激酶失效的MEK磷酸化的能力，评价Raf活性。图20A和20B说明：用突变的无效粘着斑激酶FRNK共感染CAM，阻断了Ras诱导的对Raf的活化。图20A显示了在所述结果之上的每种组合下分析免疫沉淀的活性Raf蛋白与总Raf蛋白。图20B图绘了在那些条件下活性Raf测定的结果。因此，FRNK不直接抑制Raf的活性，而是通过Ras抑制对Raf的活化。

12. 讨论

上述研究表明，Raf激酶对于体内血管生成是必不可少的并且足以满足体内血管生成。此外，将突变的无活性Raf激酶靶向生长中的血管，诱导了局部内皮细胞凋亡。同一靶向也抑制导致抑制已存在的人肿瘤以及甚至使其消退的血管生成。

编码突变的无活性形式Raf激酶(Raf K375M)的基因的反转录病毒传递，证明在体内对肿瘤血管生成有相当大的影响。重要的是，所用的反转录病毒载体特异性地感染鼠谱系的增殖细胞。因此，仅感染人肿瘤异种移植物的血管区室(图1和图4)。发现传递无活性RafK375M激酶抑制体外生长因子诱导的Raf激酶活性，并且阻断体内生长因子诱导的血管生成(图2和图3)。相反，反转录病毒传递突变的活性形式Raf激酶(Raf 306-648)，足以诱导体内血管生成(图4)。此外，将表达无活性Raf激酶的病毒传递至小鼠体内的肿瘤，发现以内皮特异性方式诱导细胞凋亡(图5)。最后，用人肿瘤接种、然后用表达无活性Raf的病毒治疗的动物，经历了在整个实验期间保持的快速肿瘤消退(图6)。因此，Raf激酶既足以满足血管生成，又是血管生成必不可少的，靶向该激酶可以抑制血管生成并且消除依赖血管生成的疾病。

由于实施例9-11所述、图9、12、13和16-20中所示的上述在小鼠和鸡中的血管生成测定的结果，本发明以Raf-caax、Ras G12V Ras和Ras V12S35提供了血管生成激活蛋白，以Ras S17N和Ras V12C40提供了血管生成抑制蛋白。此外，所述研究提供了了解Ras-Raf-MEK-ERK途径中Ras介导的Raf激活的基础，确定Ras是Raf激活所必需的，而整联蛋白介导的信号是在Raf激活时或在此之前相互作用，而不是在Raf激活下游相互作用。

虽然前述说明书足以使本领域技术人员能够实施本发明，但根据前述描述，除本文所示和所描述之外的本发明的各种修改对于本领域技术人员将变得显而易见，这些修改属于所附权利要求书的范围之内。

CPCH0260385P 说明书序列表

<110>斯克里普斯研究学院(THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE)

HOOD，John

ELICEIRI，Brian

CHERESH，David

<120>可用于采用酪氨酸激酶Raf和Ras调节血管生成的方法和组合物

<130>TSRI 710.2

<140>

<141>

<150>US 60/148,924

<151>1999-08-13

<150>US 60/215,951

<151>2000-07-05

<160>7

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>2977

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(130)..(2073)

<400>1

ccgaatgtga ccgcctcccg ctccctcacc cgccgcgggg aggaggagcg ggcgagaagc 60

tgccgccgaa cgacaggacg ttggggcggc ctggctccct caggtttaag aattgtttaa 120

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Met Glu His Ile Gln Gly Ala Trp Lys Thr Ile Ser Asn Gly

1 5 10

ttt gga ttc aaa gat gcc gtg ttt gat ggc tcc agc tgc atc tct cct 219

Phe Gly Phe Lys Asp Ala Val Phe Asp Gly Ser Ser Cys Ile Ser Pro

15 20 25 30

aca ata gtt cag cag ttt ggc tat cag cgc cgg gca tca gat gat ggc 267

Thr Ile Val Gln Gln Phe Gly Tyr Gln Arg Arg Ala Ser Asp Asp Gly

35 40 45

aaa ctc aca gat cct tct aag aca agc aac act atc cgt gtt ttc ttg 315

Lys Leu Thr Asp Pro Ser Lys Thr Ser Asn Thr Ile Arg Val Phe Leu

50 55 60

ccg aac aag caa aga aca gtg gtc aat gtg cga aat gga atg agc ttg 363

Pro Asn Lys Gln Arg Thr Val Val Asn Val Arg Asn Gly Met Ser Leu

65 70 75

cat gac tgc ctt atg aaa gca ctc aag gtg agg ggc ctg caa cca gag 411

His Asp Cys Leu Met Lys Ala Leu Lys Val Arg Gly Leu Gln Pro Glu

80 85 90

tgc tgt gca gtg ttc aga ctt ctc cac gaa cac aaa ggt aaa aaa gca 459

Cys Cys Ala Val Phe Arg Leu Leu His Glu His Lys Gly Lys Lys Ala

95 100 105 110

cgc tta gat tgg aat act gat gct gcg tct ttg att gga gaa gaa ctt 507

Arg Leu Asp Trp Asn Thr Asp Ala Ala Ser Leu Ile Gly Glu Glu Leu

115 120 125

caa gta gat ttc ctg gat cat gtt ccc ctc aca aca cac aac ttt gct 555

Gln Val Asp Phe Leu Asp His Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Ala

130 135 140

cgg aag acg ttc ctg aag ctt gcc ttc tgt gac atc tgt cag aaa ttc 603

Arg Lys Thr Phe Leu Lys Leu Ala Phe Cys Asp Ile Cys Gln Lys Phe

145 150 155

ctg ctc aat gga ttt cga tgt cag act tgt ggc tac aaa ttt cat gag 651

Leu Leu Asn Gly Phe Arg Cys Gln Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Glu

160 165 170

cac tgt agc acc aaa gta cct act atg tgt gtg gac tgg agt aac atc 699

His Cys Ser Thr Lys Val Pro Thr Met Cys Val Asp Trp Ser Asn Ile

175 180 185 190

aga caa ctc tta ttg ttt cca aat tcc act att ggt gat agt gga gtc 747

Arg Gln Leu Leu Leu Phe Pro Asn Ser Thr Ile Gly Asp Ser Gly Val

195 200 205

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Pro Ala Leu Pro Ser Leu Thr Met Arg Arg Met Arg Glu Ser Val Ser

210 215 220

agg atg cct gtt agt tct cag cac aga tat tct aca cct cac gcc ttc 843

Arg Met Pro Val Ser Ser Gln His Arg Tyr Ser Thr Pro His Ala Phe

225 230 235

acc ttt aac acc tcc agt ccc tca tct gaa ggt tcc ctc tcc cag agg 891

Thr Phe Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ser Glu Gly Ser Leu Ser Gln Arg

240 245 250

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Gln Arg Ser Thr Ser Thr Pro Asn Val His Met Val Ser Thr Thr Leu

255 260 265 270

cct gtg gac agc agg atg att gag gat gca att cga agt cac agc gaa 987

Pro Val Asp Ser Arg Met Ile Glu Asp Ala Ile Arg Ser His Ser Glu

275 280 285

tca gcc tca cct tca gcc ctg tcc agt agc ccc aac aat ctg agc cca 1035

Ser Ala Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ser Ser Pro Asn Asn Leu Ser Pro

290 295 300

aca ggc tgg tca cag ccg aaa acc ccc gtg cca gca caa aga gag cgg 1083

Thr Gly Trp Ser Gln Pro Lys Thr Pro Val Pro Ala Gln Arg Glu Arg

305 310 315

gca cca gta tct ggg acc cag gag aaa aac aaa att agg cct cgt gga 1131

Ala Pro Val Ser Gly Thr Gln Glu Lys Asn Lys Ile Arg Pro Arg Gly

320 325 330

cag aga gat tca agc tat tat tgg gaa ata gaa gcc agt gaa gtg atg 1179

Gln Arg Asp Ser Ser Tyr Tyr Trp Glu Ile Glu Ala Ser Glu Val Met

335 340 345 350

ctg tcc act cgg att ggg tca ggc tct ttt gga act gtt tat aag ggt 1227

Leu Ser Thr Arg Ile Gly Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly

355 360 365

aaa tgg cac gga gat gtt gca gta aag atc cta aag gtt gtc gac cca 1275

Lys Trp His Gly Asp Val Ala Val Lys Ile Leu Lys Val Val Asp Pro

370 375 380

acc cca gag caa ttc cag gcc ttc agg aat gag gtg gct gtt ctg cgc 1323

Thr Pro Glu Gln Phe Gln Ala Phe Arg Asn Glu Val Ala Val Lsu Arg

385 390 395

aaa aca cgg cat gtg aac att ctg ctt ttc atg ggg tac atg aca aag 1371

Lys Thr Arg His Val Asn Ile Leu Leu Phe Met Gly Tyr Met Thr Lys

400 405 410

gac aac ctg gca att gtg acc cag tgg tgc gag ggc agc agc ctc tac 1419

Asp Asn Leu Ala Ile Val Thr Gln Trp Cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr

415 420 425 430

aaa cac ctg cat gtc cag gag acc aag ttt cag atg ttc cag cta att 1467

Lys His Leu His Val Gln Glu Thr Lys Phe Gln Met Phe Gln Leu Ile

435 440 445

gac att gcc cgg cag acg gct cag gga atg gac tat ttg cat gca aag 1515

Asp Ile Ala Arg Gln Thr Ala Gln Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys

450 455 460

aac atc atc cat aga gac atg aaa tcc aac aat ata ttt ctc cat gaa 1563

Asn Ile Ile His Arg Asp Met Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu

465 470 475

ggc tta aca gtg aaa att gga gat ttt ggt ttg gca aca gta aag tca 1611

Gly Leu Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Lys Ser

480 485 490

cgc tgg agt ggt tct cag cag gtt gaa caa cct act ggc tct gtc ctc 1659

Arg Trp Ser Gly Ser Gln Gln Val Glu Gln Pro Thr Gly Ser Val Leu

495 500 505 510

tgg atg gcc cca gag gtg atc cga atg cag gat aac aac cca ttc agt 1707

Trp Met Ala Pro Glu Val Ile Arg Met Gln Asp Asn Asn Pro Phe Ser

515 520 525

ttc cag tcg gat gtc tac tcc tat ggc atc gta ttg tat gaa ctg atg 1755

Phe Gln Ser Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Ile Val Leu Tyr Glu Leu Met

530 535 540

acg ggg gag ctt cct tat tct cac atc aac aac cga gat cag atc atc 1803

Thr Gly Glu Leu Pro Tyr Ser His Ile Asn Asn Arg Asp Gln Ile Ile

545 550 555

ttc atg gtg ggc cga gga tat gcc tcc cca gat ctt agt aag cta tat 1851

Phe Met Val Gly Arg Gly Tyr Ala Ser Pro Asp Leu Ser Lys Leu Tyr

560 565 570

aag aac tgc ccc aaa gca atg aag agg ctg gta gct gac tgt gtg aag 1899

Lys Asn Cys Pro Lys Ala Met Lys Arg Leu Val Ala Asp Cys Val Lys

575 580 585 590

aaa gta aag gaa gag agg cct ctt ttt ccc cag atc ctg tct tcc att 1947

Lys Val Lys Glu Glu Arg Pro Leu Phe Pro Gln Ile Leu Ser Ser Ile

595 600 605

gag ctg ctc caa cac tct cta ccg aag atc aac cgg agc gct tcc gag 1995

Glu Leu Leu Gln His Ser Leu Pro Lys Ile Asn Arg Ser Ala Ser Glu

610 615 620

cca tcc ttg cat cgg gca gcc cac act gag gat atc aat gct tgc acg 2043

Pro Ser Leu His Arg Ala Ala His Thr Glu Asp Ile Asn Ala Cys Thr

625 630 635

ctg acc acg tcc ccg agg ctg cct gtc ttc tagttgactt tgcacctgtc 2093

Leu Thr Thr Ser Pro Arg Leu Pro Val Phe

640 645

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agaggcagaa cacatgtttt cagagaagct ctgctaagga ccttctagac tgctcacagg 2213

gccttaactt catgttgcct tcttttctat ccctttgggc cctgggagaa ggaagccatt 2273

tgcagtgctg gtgtgtcctg ctccctcccc acattcccca tgctcaaggc ccagccttct 2333

gtagatgcgc aagtggatgt tgatggtagt acaaaaagca ggggcccagc cccagctgtt 2393

ggctacatga gtatttagag gaagtaaggt agcaggcagt ccagccctga tgtggagaca 2453

catgggattt tggaaatcag cttctggagg aatgcatgtc acaggcggga ctttcttcag 2513

agagtggtgc agcgccagac attttgcaca taaggcacca aacagcccag gactgccgag 2573

actctggccg cccgaaggag cctgctttgg tactatggaa cttttcttag gggacacgtc 2633

ctcctttcac agcttctaag gtgtccagtg cattgggatg gttttccagg caaggcactc 2693

ggccaatccg catctcagcc ctctcaggag cagtcttcca tcatgctgaa ttttgtcttc 2753

caggagctgc ccctatgggg cgggccgcag ggccagcctg tttctctaac aaacaaacaa 2813

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tttcttgatg atttgggttt taattttgtt tttattgcac ctgacaaaat acagttatct 2933

gatggtccct caattatgtt attttaataa aataaattaa attt 2977

<210>2

<211>648

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>2

Met Glu His Ile Gln Gly Ala Trp Lys Thr Ile Ser Asn Gly Phe Gly

1 5 10 15

Phe Lys Asp Ala Val Phe Asp Gly Ser Ser Cys Ile Ser Pro Thr Ile

20 25 30

Val Gln Gln Phe Gly Tyr Gln Arg Arg Ala Ser Asp Asp Gly Lys Leu

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

Cys Leu Met Lys Ala Leu Lys Val Arg Gly Leu Gln Pro Glu Cys Cys

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Asp Phe Leu Asp His Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Ala Arg Lys

130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

Leu Leu Leu Phe Pro Asn Ser Thr Ile Gly Asp Ser Gly Val Pro Ala

195 200 205

Leu Pro Ser Leu Thr Met Arg Arg Met Arg Glu Ser Val Ser Arg Met

210 215 220

Pro Val Ser Ser Gln His Arg Tyr Ser Thr Pro His Ala Phe Thr Phe

225 230 235 240

Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ser Glu Gly Ser Leu Ser Gln Arg Gln Arg

245 250 255

Ser Thr Ser Thr Pro Asn Val His Met Val Ser Thr Thr Leu Pro Val

260 265 270

Asp Ser Arg Met Ile Glu Asp Ala Ile Arg Ser His Ser Glu Ser Ala

275 280 285

Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ser Ser Pro Asn Asn Leu Ser Pro Thr Gly

290 295 300

Trp Ser Gln Pro Lys Thr Pro Val Pro Ala Gln Arg Glu Arg Ala Pro

305 310 315 320

Val Ser Gly Thr Gln Glu Lys Asn Lys Ile Arg Pro Arg Gly Gln Arg

325 330 335

Asp Ser Ser Tyr Tyr Trp Glu Ile Glu Ala Ser Glu Val Met Leu Ser

340 345 350

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355 360 365

His Gly Asp Val Ala Val Lys Ile Leu Lys Val Val Asp Pro Thr Pro

370 375 380

Glu Gln Phe Gln Ala Phe Arg Asn Glu Val Ala Val Leu Arg Lys Thr

385 390 395 400

Arg His Val Asn Ile Leu Leu Phe Met Gly Tyr Met Thr Lys Asp Asn

405 410 415

Leu Ala Ile Val Thr Gln Trp Cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr Lys His

420 425 430

Leu His Val Gln Glu Thr Lys Phe Gln Met Phe Gln Leu Ile Asp Ile

435 440 445

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450 455 460

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530 535 540

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545 550 555 560

Val Gly Arg Gly Tyr Ala Ser Pro Asp Leu Ser Lys Leu Tyr Lys Asn

565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

Leu Gln His Ser Leu Pro Lys Ile Asn Arg Ser Ala Ser Glu Pro Ser

610 615 620

Leu His Arg Ala Ala His Thr Glu Asp Ile Asn Ala Cys Thr Leu Thr

625 630 635 640

Thr Ser Pro Arg Leu Pro Val Phe

645

<210>3

<211>570

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(567)

<400>3

atg acg gaa tat aag ctg gtg gtg gtg ggc gcc ggc ggt gtg ggc aag 48

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

agt gcg ctg acc atc cag ctg atc cag aac cat ttt gtg gac gaa tac 96

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr

20 25 30

gac ccc act ata gag gat tcc tac cgg aag cag gtg gtc att gat ggg 144

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

35 40 45

gag acg tgc ctg ttg gac atc ctg gat acc gcc ggc cag gag gag tac 192

Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr

50 55 60

agc gcc atg cgg gac cag tac atg cgc acc ggg gag ggc ttc ctg tgt 240

Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys

65 70 75 80

gtg ttt gcc atc aac aac acc aag tct ttt gag gac atc cac cag tac 288

Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr

85 90 95

agg gag cag atc aaa cgg gtg aag gac tcg gat gac gtg ccc atg gtg 336

Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val

100 105 110

ctg gtg ggg aac aag tgt gac ctg gct gca cgc act gtg gaa tct cgg 384

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg

115 120 125

cag gct cag gac ctc gcc cga agc tac ggc atc ccc tac atc gag acc 432

Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr

130 135 140

tcg gcc aag acc cgg cag gga gtg gag gat gcc ttc tac acg ttg gtg 480

Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val

145 150 155 160

cgt gag atc cgg cag cac aag ctg cgg aag ctg aac cct cct gat gag 528

Arg Glu Ile Arg Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu

165 170 175

agt ggc ccc ggc tgc atg agc tgc aag tgt gtg ctc tcc tga 570

Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser

180 185

<210>4

<211>189

<212>PRT

<213>Homo sapiens

<400>4

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr

50 55 60

Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys

65 70 75 80

Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His Gln Tyr

85 90 95

Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Asp Asp Val Pro Met Val

100 105 110

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg

115 120 125

Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Tyr Ile Glu Thr

130 135 140

Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val

145 150 155 160

Arg Glu Ile Arg Gln His Lys Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu

165 170 175

Ser Gly Pro Gly Cys Met Ser Cys Lys Cys Val Leu Ser

180 185

<210>5

<211>6453

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>初级转录物

<222>(1664)..(3744)

<220>

<221>内含子

<222>(1775)..(2041)

<220>

<221>内含子

<222>(2221)..(2373)

<220>

<221>内含子

<222>(2534)..(3230)

<400>5

ggatcccagc ctttccccag cccgtagccc cgggacctcc gcggtgggcg gcgccgcgct 60

gccggcgcag ggagggcctc tggtgcaccg gcaccgctga gtcgggttct ctcgccggcc 120

tgttcccggg agagcccggg gccctgctcg gagatgccgc cccgggcccc cagacaccgg 180

ctccctggcc ttcctcgagc aaccccgagc tcggctccgg tctccagcca agcccaaccc 240

cgagaggccg cggccctact ggctccgcct cccgcgttgc tcccggaagc cccgcccgac 300

cgcggctcct gacagacggg ccgctcagcc aaccggggtg gggcggggcc cgatggcgcg 360

cagccaatgg taggccgcgc ctggcagacg gacgggcgcg gggcggggcg tgcgcaggcc 420

cgcccgagtc tccgccgccc gtgccctgcg cccgcaaccc gagccgcacc cgccgcggac 480

ggagcccatg cgcggggcga accgcgcgcc cccgcccccg ccccgccccg gcctcggccc 540

cggccctggc cccgggggca gtcgcgcctg tgaacggtga gtgcgggcag ggatcggccg 600

ggccgcgcgc cctcctcgcc cccaggcggc agcaatacgc gcggcgcggg ccgggggcgc 660

ggggccggcg ggcgtaagcg gcggcggcgg cggcgggtgg gtggggccgg gcggggcccg 720

cgggcacagg tgagcgggcg tcgggggctg cggcgggcgg gggccccttc ctccctgggg 780

cctgcgggaa tccgggcccc acccgtggcc tcgcgctggg cacggtcccc acgccggcgt 840

acccgggagc ctcgggcccg gcgccctcac acccgggggc gtctgggagg aggcggccgc 900

ggccacggca cgcccgggca cccccgattc agcatcacag gtcgcggacc aggccggggg 960

cctcagcccc agtgcctttt ccctctccgg gtctcccgcg ccgcttctcg gccccttcct 1020

gtcgctcagt ccctgcttcc caggagctcc tctgtcttct ccagctttct gtggctgaaa 1080

gatgcccccg gttccccgcc gggggtgcgg ggcgctgccc gggtctgccc tcccctcggc 1140

ggcgcctagt acgcagtagg cgctcagcaa atacttgtcg gaggcaccag cgccgcgggg 1200

cctgcaggct ggcactagcc tgcccgggca cgccgtggcg cgctccgccg tggccagacc 1260

tgttctggag gacggtaacc tcagccctcg ggcgcctccc tttagccttt ctgccgaccc 1320

agcagcttct aatttgggtg cgtggttgag agcgctcagc tgtcagccct gcctttgagg 1380

gctgggtccc ttttcccatc actgggtcat taagagcaag tgggggcgag gcgacagccc 1440

tcccgcacgc tgggttgcag ctgcacaggt aggcacgctg cagtccttgc tgcctggcgt 1500

tggggcccag ggaccgctgt gggtttgccc ttcagatggc cctgccagca gctgccctgt 1560

ggggcctggg gctgggcctg ggcctggctg agcagggccc tccttggcag gtggggcagg 1620

agaccctgta ggaggacccc gggccgcagg cccctgagga gcgatgacgg aatataagct 1680

ggtggtggtg ggcgccggcg gtgtgggcaa gagtgcgctg accatccagc tgatccagaa 1740

ccattttgtg gacgaatacg accccactat agaggtgagc ctagcgccgc cgtccaggtg 1800

ccagcagctg ctgcgggcga gcccaggaca cagccaggat agggctggct gcagcccctg 1860

gtcccctgca tggtgctgtg gccctgtctc ctgcttcctc tagaggaggg gagtccctcg 1920

tctcagcacc ccaggagagg agggggcatg aggggcatga gaggtaccag ggagaggctg 1980

gctgtgtgaa ctccccccac ggaaggtcct gagggggtcc ctgagccctg tcctcctgca 2040

ggattcctac cggaagcagg tggtcattga tggggagacg tgcctgttgg acatcctgga 2100

taccgccggc caggaggagt acagcgccat gcgggaccag tacatgcgca ccggggaggg 2160

cttcctgtgt gtgtttgcca tcaacaacac caagtctttt gaggacatcc accagtacag 2220

gtgaaccccg tgaggctggc ccgggagccc acgccgcaca ggtggggcca ggccggctgc 2280

gtccaggcag gggcctcctg tcctctctgc gcatgtcctg gatgccgctg cgcctgcagc 2340

ccccgtagcc agctctcgct ttccacctct cagggagcag atcaaacggg tgaaggactc 2400

ggatgacgtg cccatggtgc tggtggggaa caagtgtgac ctggctgcac gcactgtgga 2460

atctcggcag gctcaggacc tcgcccgaag ctacggcatc ccctacatcg agacctcggc 2520

caagacccgg caggtgaggc agctctccac cccacagcta gccagggacc cgccccgccc 2580

cgccccagcc agggagcagc actcactgac cctctccctt gacacagggc agccgctctg 2640

gctctagctc cagctccggg accctctggg accccccggg acccatgtga cccagcggcc 2700

cctcgcactg taggtctccc gggacggcag ggcagtgagg gaggcgaggg ccggggtctg 2760

ggctcacgcc ctgcagtcct gggccgacac agctccgggg aaggcggagg tccttgggga 2820

gagctgccct gagccaggcc ggagcggtga ccctggggcc cggcccctct tgtccccaga 2880

gtgtcccacg ggcacctgtt ggttctgagt cttagtgggg ctactgggga cacgggccgt 2940

agctgagtcg agagctgggt gcagggtggt caaaccctgg ccagacctgg agttcaggag 3000

ggccccgggc caccctgacc tttgaggggc tgctgtagca tgatgcgggt ggccctgggc 3060

acttcgagat ggccagagtc cagcttcccg tgtgtgtggt gggcctgggg aagtggctgg 3120

tggagtcggg agcttcgggc caggcaaggc ttgatcccac agcagggagc ccctcaccca 3180

ggcaggcggc cacaggccgg tccctcctga tcccatccct cctttcccag ggagtggagg 3240

atgccttcta cacgttggtg cgtgagatcc ggcagcacaa gctgcggaag ctgaaccctc 3300

ctgatgagag tggccccggc tgcatgagct gcaagtgtgt gctctcctga cgcaggtgag 3360

ggggactccc agggcggccg ccacgcccac cggatgaccc cggctccccg cccctgccgg 3420

tctcctggcc tgcggtcagc agcctccctt gtgccccgcc cagcacaagc tcaggacatg 3480

gaggtgccgg atgcaggaag gaggtgcaga cggaaggagg aggaaggaag gacggaagca 3540

aggaaggaag gaagggctgc tggagcccag tcaccccggg accgtgggcc gaggtgactg 3600

cagaccctcc cagggaggct gtgcacagac tgtcttgaac atcccaaatg ccaccggaac 3660

cccagccctt agctcccctc ccaggcctct gtgggccctt gtcgggcaca gatgggatca 3720

cagtaaatta ttggatggtc ttgatcttgg ttttcggctg agggtgggac acggtgcgcg 3780

tgtggcctgg catgaggtat gtcggaacct caggcctgtc cagccctggg ctctccatag 3840

cctttgggag ggggaggttg ggagaggccg gtcaggggtc tgggctgtgg tgctctctcc 3900

tcccgcctgc cccagtgtcc acggcttctg gcagagagct ctggacaagc aggcagatca 3960

taaggacaga gagcttactg tgcttctacc aactaggagg gcgtcctggt cctccagagg 4020

gaggtggttt caggggttgg ggatctgtgc cggtggctct ggtctctgct gggagccttc 4080

ttggcggtga gaggcatcac ctttcctgac ttgctcccag cgtgaaatgc acctgccaag 4140

aatggcagac atagggaccc cgcctcctgg gccttcacat gcccagtttt cttcggctct 4200

gtggcctgaa gcggtctgtg gaccttggaa gtagggctcc agcaccgact ggcctcaggc 4260

ctctgcctca ttggtggtcg ggtagcggcc agtagggcgt gggagcctgg ccatccctgc 4320

ctcctggagt ggacgaggtt ggcagctggt ccgtctgctc ctgccccact ctcccccgcc 4380

cctgccctca ccctaccctt gccccacgcc tgcctcatgg ctggttgctc ttggagcctg 4440

gtagtgtcac tggctcagcc ttgctgggta tacacaggct ctgccaccca ctctgctcca 4500

aggggcttgc cctgccttgg gccaagttct aggtctggcc acagccacag acagctcagt 4560

cccctgtgtg gtcatcctgg cttctgctgg gggcccacag cgcccctggt gcccctcccc 4620

tcccagggcc cgggttgagg ctgggccagg ccctctggga cggggacttg tgccctgtca 4680

gggttcccta tccctgaggt tgggggagag ctagcagggc atgccgctgg ctggccaggg 4740

ctgcagggac actccccctt ttgtccaggg aataccacac tcgcccttct ctccagcgaa 4800

caccacactc gcccttctct ccaggggacg ccacactccc ccttctgtcc aggggacgcc 4860

acactccccc ttctctccag gggacgccac actcgccctt ctctccaggg gacgccacac 4920

tcgcccttct ctccagggga cgccacactc gcccttctgt ccaggggacg ccacactcgc 4980

ccttctctcc aggggacgcc acactcgccc ttctctccag gggacgccac actccccctt 5040

ctgtccaggg gacgccacac tcccccttct ctccagggga cgccacactc ccccttctct 5100

ccaggggacg ccacactcgc ccttctctcc aggggacgcc acactccccc ttctgtccag 5160

gggacgccac actcgccctt ctctccaggg gacgccacac tcgcccttct ctccagggga 5220

cgccacactc ccccttctct ccaggggacg ccacactccc ccttctctcc aggggacgcc 5280

acactccccc ttctgtccag gggacgccac actcgccctt ctctccaggg gacgccacac 5340

tcccccttct ctccagggga cgccacactc ccccttctct ccaggggacg ccacactccc 5400

ccttctgtcc aggggacgcc acactcgccc ttctctccag gggacgccac actcgccctt 5460

ctctccaggg gacgccacac tcgcccttct ctccagggga cgccacactt gcccttctgt 5520

ccagggaatg ccacactccc ccttctcccc agcagcctcc gagtgaccag cttccccatc 5580

gatagacttc ccgaggccag gagccctcta gggctgccgg gtgccaccct ggctccttcc 5640

acaccgtgct ggtcactgcc tgctgggggc gtcagatgca ggtgaccctg tgcaggaggt 5700

atctctggac ctgcctcttg gtcattacgg ggctgggcag ggcctggtat cagggccccg 5760

ctggggttgc agggctgggc ctgtgctgtg gtcctggggt gtccaggaca gacgtggagg 5820

ggtcagggcc cagcacccct gctccatgct gaactgtggg aagcatccag gtccctgggt 5880

ggcttcaaca ggagttccag cacgggaacc actggacaac ctggggtgtg tcctgatctg 5940

gggacaggcc agccacaccc cgagtcctag ggactccaga gagcagccca ctgccctggg 6000

ctccacggaa gccccctcat gccgctaggc cttggcctcg gggacagccc agctaggcca 6060

gtgtgtggca ggaccaggcc cccatgtggg agctgacccc ttgggattct ggagctgtgc 6120

tgatgggcag gggagagcca gctcctcccc ttgagggagg gtcttgatgc ctggggttac 6180

ccgcagaggc ctgggtgccg ggacgctccc cggtttggct gaaaggaaag cagatgtggt 6240

cagcttctcc actgagccca tctggtcttc ccggggctgg gccccataga tctgggtccc 6300

tgtgtggccc ccctggtctg atgccgagga tacccctgca aactgccaat cccagaggac 6360

aagactggga agtccctgca gggagagccc atccccgcac cctgacccac aagagggact 6420

cctgctgccc accaggcatc cctccaggga tcc 6453

<210>6

<211>2004

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：融合蛋白

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2004)

<400>6

atg gag cac ata cag gga gct tgg aag acg atc agc aat ggt ttt gga 48

Met Glu His Ile Gln Gly Ala Trp Lys Thr Ile Ser Asn Gly Phe Gly

1 5 10 15

ttc aaa gat gcc gtg ttt gat ggc tcc agc tgc atc tct cct aca ata 96

Phe Lys Asp Ala Val Phe Asp Gly Ser Ser Cys Ile Ser Pro Thr Ile

20 25 30

gtt cag cag ttt ggc tat cag cgc cgg gca tca gat gat ggc aaa ctc 144

Val Gln Gln Phe Gly Tyr Gln Arg Arg Ala Ser Asp Asp Gly Lys Leu

35 40 45

aca gat cct tct aag aca agc aac act atc cgt gtt ttc ttg ccg aac 192

Thr Asp Pro Ser Lys Thr Ser Asn Thr Ile Arg Val Phe Leu Pro Asn

50 55 60

aag caa aga aca gtg gtc aat gtg cga aat gga atg agc ttg cat gac 240

Lys Gln Arg Thr Val Val Asn Val Arg Asn Gly Met Ser Leu His Asp

65 70 75 80

tgc ctt atg aaa gca ctc aag gtg agg ggc ctg caa cca gag tgc tgt 288

Cys Leu Met Lys Ala Leu Lys Val Arg Gly Leu Gln Pro Glu Cys Cys

85 90 95

gca gtg ttc aga ctt ctc cac gaa cac aaa ggt aaa aaa gca cgc tta 336

Ala Val Phe Arg Leu Leu His Glu His Lys Gly Lys Lys Ala Arg Leu

100 105 110

gat tgg aat act gat gct gcg tct ttg att gga gaa gaa ctt caa gta 384

Asp Trp Asn Thr Asp Ala Ala Ser Leu Ile Gly Glu Glu Leu Gln Val

115 120 125

gat ttc ctg gat cat gtt ccc ctc aca aca cac aac ttt gct cgg aag 432

Asp Phe Leu Asp His Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Ala Arg Lys

130 135 140

acg ttc ctg aag ctt gcc ttc tgt gac atc tgt cag aaa ttc ctg ctc 480

Thr Phe Leu Lys Leu Ala Phe Cys Asp Ile Cys Gln Lys Phe Leu Leu

145 150 155 160

aat gga ttt cga tgt cag act tgt ggc tac aaa ttt cat gag cac tgt 528

Asn Gly Phe Arg Cys Gln Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Glu His Cys

165 170 175

agc acc aaa gta cct act atg tgt gtg gac tgg agt aac atc aga caa 576

Ser Thr Lys Val Pro Thr Met Cys Val Asp Trp Ser Asn Ile Arg Gln

180 185 190

ctc tta ttg ttt cca aat tcc act att ggt gat agt gga gtc cca gca 624

Leu Leu Leu Phe Pro Asn Ser Thr Ile Gly Asp Ser Gly Val Pro Ala

195 200 205

cta cct tct ttg act atg cgt cgt atg cga gag tct gtt tcc agg atg 672

Leu Pro Ser Leu Thr Met Arg Arg Met Arg Glu Ser Val Ser Arg Met

210 215 220

cct gtt agt tct cag cac aga tat tct aca cct cac gcc ttc acc ttt 720

Pro Val Ser Ser Gln His Arg Tyr Ser Thr Pro His Ala Phe Thr Phe

225 230 235 240

aac acc tcc agt ccc tca tct gaa ggt tcc ctc tcc cag agg cag agg 768

Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ser Glu Gly Ser Leu Ser Gln Arg Gln Arg

245 250 255

tcg aca tcc aca cct aat gtc cac atg gtc agc acc acg ctg cct gtg 816

Ser Thr Ser Thr Pro Asn Val His Met Val Ser Thr Thr Leu Pro Val

260 265 270

gac agc agg atg att gag gat gca att cga agt cac agc gaa tca gcc 864

Asp Ser Arg Met Ile Glu Asp Ala Ile Arg Ser His Ser Glu Ser Ala

275 280 285

tca cct tca gcc ctg tcc agt agc ccc aac aat ctg agc cca aca ggc 912

Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ser Ser Pro Asn Asn Leu Ser Pro Thr Gly

290 295 300

tgg tca cag ccg aaa acc ccc gtg cca gca caa aga gag cgg gca cca 960

Trp Ser Gln Pro Lys Thr Pro Val Pro Ala Gln Arg Glu Arg Ala Pro

305 310 315 320

gta tct ggg acc cag gag aaa aac aaa att agg cct cgt gga cag aga 1008

Val Ser Gly Thr Gln Glu Lys Asn Lys Ile Arg Pro Arg Gly Gln Arg

325 330 335

gat tca agc tat tat tgg gaa ata gaa gcc agt gaa gtg atg ctg tcc 1056

Asp Ser Ser Tyr Tyr Trp Glu Ile Glu Ala Ser Glu Val Met Leu Ser

340 345 350

act cgg att ggg tca ggc tct ttt gga act gtt tat aag ggt aaa tgg 1104

Thr Arg Ile Gly Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Lys Trp

355 360 365

cac gga gat gtt gca gta aag atc cta aag gtt gtc gac cca acc cca 1152

His Gly Asp Val Ala Val Lys Ile Leu Lys Val Val Asp Pro Thr Pro

370 375 380

gag caa ttc cag gcc ttc agg aat gag gtg gct gtt ctg cgc aaa aca 1200

Glu Gln Phe Gln Ala Phe Arg Asn Glu Val Ala Val Leu Arg Lys Thr

385 390 395 400

cgg cat gtg aac att ctg ctt ttc atg ggg tac atg aca aag gac aac 1248

Arg His Val Asn Ile Leu Leu Phe Met Gly Tyr Met Thr Lys Asp Asn

405 410 415

ctg gca att gtg acc cag tgg tgc gag ggc agc agc ctc tac aaa cac 1296

Leu Ala Ile Val Thr Gln Trp Cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr Lys His

420 425 430

ctg cat gtc cag gag acc aag ttt cag atg ttc cag cta att gac att 1344

Leu His Val Gln Glu Thr Lys Phe Gln Met Phe Gln Leu Ile Asp Ile

435 440 445

gcc cgg cag acg gct cag gga atg gac tat ttg cat gca aag aac atc 1392

Ala Arg Gln Thr Ala Gln Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys Asn Ile

450 455 460

atc cat aga gac atg aaa tcc aac aat ata ttt ctc cat gaa ggc tta 1440

Ile His Arg Asp Met Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Gly Leu

465 470 475 480

aca gtg aaa att gga gat ttt ggt ttg gca aca gta aag tca cgc tgg 1488

Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Lys Ser Arg Trp

485 490 495

agt ggt tct cag cag gtt gaa caa cct act ggc tct gtc ctc tgg atg 1536

Ser Gly Ser Gln Gln Val Glu Gln Pro Thr Gly Ser Val Leu Trp Met

500 505 510

gcc cca gag gtg atc cga atg cag gat aac aac cca ttc agt ttc cag 1584

Ala Pro Glu Val Ile Arg Met Gln Asp Asn Asn Pro Phe Ser Phe Gln

515 520 525

tcg gat gtc tac tcc tat ggc atc gta ttg tat gaa ctg atg acg ggg 1632

Ser Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Ile Val Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly

530 535 540

gag ctt cct tat tct cac atc aac aac cga gat cag atc atc ttc atg 1680

Glu Leu Pro Tyr Ser His Ile Asn Asn Arg Asp Gln Ile Ile Phe Met

545 550 555 560

gtg ggc cga gga tat gcc tcc cca gat ctt agt aag cta tat aag aac 1728

Val Gly Arg Gly Tyr Ala Ser Pro Asp Leu Ser Lys Leu Tyr Lys Asn

565 570 575

tgc ccc aaa gca atg aag agg ctg gta gct gac tgt gtg aag aaa gta 1776

Cys Pro Lys Ala Met Lys Arg Leu Val Ala Asp Cys Val Lys Lys Val

580 585 590

aag gaa gag agg cct ctt ttt ccc cag atc ctg tct tcc att gag ctg 1824

Lys Glu Glu Arg Pro Leu Phe Pro Gln Ile Leu Ser Ser Ile Glu Leu

595 600 605

ctc caa cac tct cta ccg aag atc aac cgg agc gct tcc gag cca tcc 1872

Leu Gln His Ser Leu Pro Lys Ile Asn Arg Ser Ala Ser Glu Pro ger

610 615 620

ttg cat cgg gca gcc cac act gag gat atc aat gct tgc acg ctg acc 1920

Leu His Arg Ala Ala His Thr Glu Asp Ile Asn Ala Cys Thr Leu Thr

625 630 635 640

acg tcc ccg agg ctg cct gtc ttc tac tcg ttc ctg ccg ttc ttc ttc 1968

Thr Ser Pro Arg Leu Pro Val Phe Tyr Ser Phe Leu Pro Phe Phe Phe

645 650 655

ttc ttc ttc tcg ttc tgt ttc acg cct agt aca ttc 2004

Phe Phe Phe Ser Phe Cys Phe Thr Pro Ser Thr Phe

660 665

<210>7

<211>668

<212>PRT

<213>人工序列

<400>7

Met Glu His Ile Gln Gly Ala Trp Lys Thr Ile Ser Asn Gly Phe Gly

1 5 10 15

Phe Lys Asp Ala Val Phe Asp Gly Ser Ser Cys Ile Ser Pro Thr Ile

20 25 30

Val Gln Gln Phe Gly Tyr Gln Arg Arg Ala Ser Asp Asp Gly Lys Leu

35 40 45

Thr Asp Pro Ser Lys Thr Ser Asn Thr Ile Arg Val Phe Leu Pro Asn

50 55 60

Lys Gln Arg Thr Val Val Asn Val Arg Asn Gly Met Ser Leu His Asp

65 70 75 80

Cys Leu Met Lys Ala Leu Lys Val Arg Gly Leu Gln Pro Glu Cys Cys

85 90 95

Ala Val Phe Arg Leu Leu His Glu His Lys Gly Lys Lys Ala Arg Leu

100 105 110

Asp Trp Asn Thr Asp Ala Ala Ser Leu Ile Gly Glu Glu Leu Gln Val

115 120 125

Asp Phe Leu Asp His Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Ala Arg Lys

130 135 140

Thr Phe Leu Lys Leu Ala Phe Cys Asp Ile Cys Gln Lys Phe Leu Leu

145 150 155 160

Asn Gly Phe Arg Cys Gln Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Glu His Cys

165 170 175

Ser Thr Lys Val Pro Thr Met Cys Val Asp Trp Ser Asn Ile Arg Gln

180 185 190

Leu Leu Leu Phe Pro Asn Ser Thr Ile Gly Asp Ser Gly Val Pro Ala

195 200 205

Leu Pro Ser Leu Thr Met Arg Arg Met Arg Glu Ser Val Ser Arg Met

210 215 220

Pro Val Ser Ser Gln His Arg Tyr Ser Thr Pro His Ala Phe Thr Phe

225 230 235 240

Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ser Glu Gly Ser Leu Ser Gln Arg Gln Arg

245 250 255

Ser Thr Ser Thr Pro Asn Val His Met Val Ser Thr Thr Leu Pro Val

260 265 270

Asp Ser Arg Met Ile Glu Asp Ala Ile Arg Ser His Ser Glu Ser Ala

275 280 285

Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ser Ser Pro Asn Asn Leu Ser Pro Thr Gly

290 295 300

Trp Ser Gln Pro Lys Thr Pro Val Pro Ala Gln Arg Glu Arg Ala Pro

305 310 315 320

Val Ser Gly Thr Gln Glu Lys Asn Lys Ile Arg Pro Arg Gly Gln Arg

325 330 335

Asp Ser Ser Tyr Tyr Trp Glu Ile Glu Ala Ser Glu Val Met Leu Ser

340 345 350

Thr Arg Ile Gly Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Lys Trp

355 360 365

His Gly Asp Val Ala Val Lys Ile Leu Lys Val Val Asp Pro Thr Pro

370 375 380

Glu Gln Phe Gln Ala Phe Arg Asn Glu Val Ala Val Leu Arg Lys Thr

385 390 395 400

Arg His Val Asn Ile Leu Leu Phe Met Gly Tyr Met Thr Lys Asp Asn

405 410 415

Leu Ala Ile Val Thr Gln Trp Cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr Lys His

420 425 430

Leu His Val Gln Glu Thr Lys Phe Gln Met Phe Gln Leu Ile Asp Ile

435 440 445

Ala Arg Gln Thr Ala Gln Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys Asn Ile

450 455 460

Ile His Arg Asp Met Lys Ser Asn Asn Ile Phe Leu His Glu Gly Leu

465 470 475 480

Thr Val Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Lys Ser Arg Trp

485 490 495

Ser Gly Ser Gln Gln Val Glu Gln Pro Thr Gly Ser Val Leu Trp Met

500 505 510

Ala Pro Glu Val Ile Arg Met Gln Asp Asn Asn Pro Phe Ser Phe Gln

515 520 525

Ser Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Ile Val Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly

530 535 540

Glu Leu Pro Tyr Ser His Ile Asn Asn Arg Asp Gln Ile Ile Phe Met

545 550 555 560

Val Gly Arg Gly Tyr Ala Ser Pro Asp Leu Ser Lys Leu Tyr Lys Asn

565 570 575

Cys Pro Lys Ala Met Lys Arg Leu Val Ala Asp Cys Val Lys Lys Val

580 585 590

Lys Glu Glu Arg Pro Leu Phe Pro Gln Ile Leu Ser Ser Ile Glu Leu

595 600 605

Leu Gln His Ser Leu Pro Lys Ile Asn Arg Ser Ala Ser Glu Pro Ser

610 615 620

Leu His Arg Ala Ala His Thr Glu Asp Ile Asn Ala Cys Thr Leu Thr

625 630 635 640

Thr Ser Pro Arg Leu Pro Val Phe Tyr Ser Phe Leu Pro Phe Phe Phe

645 650 655

Phe Phe Phe Ser Phe Cys Phe Thr Pro Ser Thr Phe

660 665

Claims

1.Raf蛋白或能够表达所述蛋白的核苷酸序列在制备用于调节病症相关组织中血管生成的药物中的用途。

2.权利要求1的用途，其中所述Raf蛋白是一种活性Raf蛋白，而所述调节增强血管生成。

3.权利要求2的用途，其中所述活性Raf蛋白是一种野生型Raf。

4.权利要求3的用途，其中所述活性Raf蛋白是一种融合蛋白。

5.权利要求4的用途，其中所述活性Raf融合蛋白是Raf-caax。

6.权利要求2的用途，其中所述组织的循环异常。

7.权利要求1的用途，其中所述Raf蛋白是一种无活性Raf蛋白，而所述调节抑制血管生成。

8.权利要求7的用途，其中所述无活性Raf蛋白在SEQ ID NO：2的残基375具有一个突变，使得第375位的氨基酸不是赖氨酸。

9.权利要求7的用途，其中所述组织是炎症组织，而所述病症是关节炎或类风湿性关节炎。

10.权利要求7的用途，其中所述组织是实体瘤或实体瘤转移瘤。

11.权利要求7的用途，其中所述组织是视网膜组织，而所述病症是视网膜病、糖尿病性视网膜病或黄斑变性。

12.权利要求7的用途，其中所述组织位于冠状血管成形术部位，而所述组织有再狭窄的危险。

13.权利要求1的用途，其中所述药用组合物还包含脂质体。

14.权利要求1的用途，其中所述药用组合物包含一种能够表达所述核苷酸序列的反转录病毒表达载体。

15.权利要求1的用途，其中所述药用组合物包含一种能够表达所述核苷酸序列的非病毒表达载体。