MXPA02001553A - Metodos y composiciones utiles para modulacion de angiogenesis usando proteina cinasa raf y ras. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe metodos para modular angiogenesis en tejidos que usan proteina RAF y/o RAS, proteina modificada RAF o RAS, y acidos nucleicos que las codifican. Particularmente la invencion describe metodos para inhibir angiogenesis usando una proteina inactiva RAF y/o RAS, o acidos nucleicos que codifican los mismos, o para potenciar angiogenesis usando una proteina activa RAF y/o RAS, o acidos nucleicos que codifican los mismos. La invencion tambien describe el uso de sistemas de suministro de genes para proporcionar acidos nucleicos que codifican para la proteina RAF o RAS, o formas modificadas de los mismos.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES ÚTILES PARA MODULACIÓN DE ANGIOGENESIS USANDO PROTEINA CINASA RAF Y RAS Campo Técnico La presente invención se refiere generalmente al campo de la medicina, y se relaciona específicamente a métodos y composiciones para modular la angiogénesis de tejidos usando la proteina cinasa Raf o Ras, variantes de Raf o Ras, usando reactivos que modulan Raf o Ras, y usando ácidos nucleicos que las codifican.

Antecedentes La angiogénesis es un proceso de vascularización de tejido que involucra el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos dentro de un tejido, y también se le refiere como neovasculapzación. El proceso es mediado por la infiltración de células del endotelio y células del músculo liso. El proceso se cree que procede en cualquier de tres formas: los vasos pueden brotar a partir de vasos preexistentes, el desarrollo de novo de vasos puede surgir a partir de células precursoras (vasculogénesis) , o los vasos pequeños que existen pueden aumentar de diámetro. Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032: 89-118 (1990). La angiogénesis es un proceso importante en el crecimiento neonatal, pero también es importante en la curación de heridas y en la patogénesis de una gran variedad de enfermedades clínicas que incluyen inflamación de tejido, artritis, crecimiento de tumor, retinopatia diabética, degeneración macular por neovascularización de la retina y condiciones similares. Estas manifestaciones clínicas asociadas con la angiogénesis se refieren como enfermedades angiode gens . Folkman et al., Science 235:442-447 (1987) . La angiogénesis está generalmente ausente en los tejidos adultos o maduros, aunque ocurre en la curación de heridas y en el ciclo de crecimiento del corpus luteum. Véase por ejemplo, Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990) . Se ha propuesto que la inhibición de la angiogénesis seria una terapia útil por restringir el crecimiento del tumor. La inhibición de la angiogénesis se ha propuesto por (1) inhibición de la liberación de "moléculas angiogénicas" tales como bFGF (factor de crecimiento del fibroblasto básico), (2) neutralización de moléculas angiogénicas, tales como por el uso de anticuerpos anti-bFGF, (3) uso de inhibidores del receptor de vitronectina avßs, y (4) inhibición de la respuesta de células del endotelio a estímulos angiogénicos. Esta última estrategia ha recibido atención, y Folkman et al., Cáncer Biology, 3:89-96 (1992), ha descrito diversos inhibidores de respuesta de células del endotelio, que incluyen inhibidor de colagenasa, inhibidores de recambio de la membrana base, esteroides angioestáticos, inhibidores de angiogénesis derivados de hongos, factor 4 de plaqueta, trombospondina, fármacos para artritis tales como D-penicila ina y tiomalato de oro, análogos de vitamina D3 alfa-interferón, y similares que pudieran usarse para inhibir la angiogénesis. Para inhibidores propuestos adicionales de angiogénesis, véase Blood et al., Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51 (1988), y Patentes Norteamericanas Nos. 5,092,885, ,112,946, 5,192,744, 5,202,352, 5,753,230 y 5,766,591.

Ninguno de los inhibidores de angiogénesis descritos en las referencias anteriores involucran las proteinas Raf, sin embargo. Para que ocurra la angiogénesis, las células del endotelio deben degradarse primero y cruzar la membrana base del baso sanguíneo en una forma similar a la usada por células de tumor durante la invasión y formación de metástasis. Se ha reportado previamente que la angiogénesis depende de la interacción entre las integrinas vasculares y las proteinas matriz extracelulares. Brooks et al., Science. 264:569-571 (1994). Además, se ha reportado que la muerte celular programada (apoptosis) de las células vasculares angiogénicas se inicia por la interacción, la cual seria inhibida por algunos antagonistas de la integrina vascular avß,. Brooks et al., Cell, 79:1157-1164 (1994) . Más recientemente, se ha reportado que el enlace de la metaloproteinasa-2 matriz (MMP-2) al receptor de vitronectina (avß5) puede inhibirse usando antagonistas avß5, e inhibiendo con eso la función enzimática de la proteinasa. Brooks et al., Cell, 85:683-693 (1996).

Sumario la Invención La presente invención contempla la modulación de la angiogénesis en tejidos en donde la angiogénesis depende de la actividad de la proteina cinasa Raf, también referida genéricamente en la presente como Raf. Se contemplan composiciones y métodos para modular la angiogénesis en un tejido asociado con una condición afectiva. Una composición que comprende una cantidad que modula la angiogénesis de una proteina de Raf se administra al tejido a ser tratado para una condición afectiva que responde a la modulación de la angiogénesis. La composición que proporciona la proteina Raf puede contener proteina purificada, fragmentos de proteina biológicamente activos, proteina Raf recombinántemente producida o fragmentos de proteina o fragmentos de fusión, o vectores de expresión de gen/ácido nucleico para expresar una proteina Raf. En donde se inactiva o inhibe la proteina Raf, la modulación es una inhibición del angiogénesis. En donde la proteina Raf es activa o activada, la modulación es una potenciación de la angiogénesis. El tejido a ser tratado puede ser' cualquier tejido en el cual es deseable la modulación de la angiogénesis. Para la inhibición de angiogénesis, es útil tratar tejido enfermo en donde está ocurriendo neovascularización perjudicial. Ejemplo de tejidos incluye tejido inflamado, tumores sólidos, metástasis, tejidos que sufren restenosis, y tejidos similares. Para la potenciación, es útil tratar pacientes con tejidos hipóxicos tales como aquellos después de ataque, infarto del miocardio o asociados con úlceras crónicas, tejidos en pacientes con extremidades isquémicas en las cuales existe circulación anormal, es decir, pobre, debido a condiciones diabéticas u otras. También pueden tratarse pacientes con lesiones crónicas que no sanan, y por lo tanto podrían beneficiarse del aumento en la proliferación de células vasculares y la neovascularización. Se prefiere particularmente el uso de la proteina Raf que contiene una secuencia de aminoácido modificada como se describe en la presente. Diversas proteinas Raf modificadas particularmente útiles, que incluyen proteinas de fusión Raf tales como Raf-caax y construcciones de ácido nucleico que codifican la expresión de las mismas se describen en la presente y están dentro de los limites de la presente invención. La presente invención también abarca una composición farmacéutica adecuada para inhibir la angiogénesis en un tejido de mamífero objetivo que comprende un vector de transferencia de gen viral o no viral que contiene un ácido nucleico, teniendo el ácido nucleico un segmento de ácido nucleico que codifica para una proteina Raf, y teniendo la proteina Raf cualquier residuo de aminoácido en el codón 375 excepto para lisina, y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente. Una modalidad particularmente preferida utiliza la proteina Raf designada como Raf K375M y descrita en los ejemplos posteriores. Otra construcción Raf inactiva es un ácido nucleico que codifica para una proteina Raf que tiene la porción terminal carboxi sustraída. Una modalidad preferida utiliza una proteina Raf designada Raf 1-305, que es una proteina Raf inactiva. También se contempla una composición farmacéutica adecuada para estimular la angiogénesis en un tejido de mamífero objetivo y que comprende un vector de transferencia de gen viral o no viral que contiene un ácido nucleico que tiene un segmento que codifica para una proteina Raf que tiene actividad de cinasa y un portador farmacéuticamente aceptable o excipiente del mismo. Un ácido nucleico preferido codifica para una proteina de fusión Raf inhibitoria que es Raf-caax. Otra construcción de Raf inhibitoria contiene un ácido nucleico qué" codifica para una proteina Raf que tiene la porción amino terminal de la proteina sustraída. Una modalidad preferida utiliza una proteina Raf designada Raf 306-648, y descrita en los ejemplos posteriores. La invención contempla adicionalmente la modulación del angiogénesis en tejidos por GTPasa Ras pequeña, también referida genéricamente en la presente Ras, debido a su papel para señalar Raf, como se describe en la presente. También se conceptualiza la modulación de la angiogénesis en tejidos que utilizan la combinación de Ras y modulación de Raf. Tal modulación combinada puede tomar la forma de una administración sencilla de formulaciones combinadas de proteina, o ácido nucleico que codifica la proteina de modulación, o la administración separada de dosis individuales, en una cantidad que modula la angiogénesis . Se contemplan composiciones y métodos para modular la angiogénesis en un tejido, asociado con una condición afectiva, en donde la modulación se dirige a la trayectoria de angiogénesis mediada por Raf por medio de la proteina Ras. Una composición que comprende una cantidad que modula la angiogénesis de una proteina Ras se administra al tejido a ser tratado para una condición afectiva que responde a la modulación de angiogénesis. La composición que proporciona la proteina Ras puede 'contener proteina purificada, fragmentos de proteina Ras biológicamente activos, proteina Ras recombinántemente producida o fragmentos de proteina o proteinas de fusión, o vectores de expresión de gen/ácido nucleico para expresar una proteina Ras. En donde la proteina Ras está inactivada o inhibida, la modulación es una inhibición de la angiogénesis. En donde la proteina Ras es activa o activada, la modulación es una potenciación de la angiogénesis. Las composiciones farmacéuticas y métodos de uso para proteinas Ras negativas dominantes, tales como S17N Ras o V12C40 Ras, se contemplan para uso en una forma similar a aquella de las proteinas de la familia Raf. En un aspecto adicional de esta invención, se contemplan las composiciones farmacéuticas y métodos de uso para proteinas Ras activas dominantes, tales como G12V Ras o V12S35 Ras, para usos comparables a aquellos para las proteinas de la familia Raf. Se contemplan adicionalmente métodos para modular la angiogénesis en un tejido asociado con una condición afectiva que comprende administrar una cantidad que modula la angiogénesis de una composición farmacéutica que comprende una proteina Raf o una secuencia de nucleótidos capaz de expresar la proteina Raf, y una proteina Ras o una secuencia del nucleótido capaz de expresar la pr'oteina Ras. En tales métodos en donde la modulación deseada es una inhibición de la angiogénesis, al menos una o ambas de las proteinas Raf o Ras es inactiva. En donde la modulación deseada es una estimulación de la angiogénesis, al menos una o ambas de las proteínas Raf o Ras son activas.

Breve Descripción de los Dibujos En los dibujos que forman una porción de esta descripción: Las FIGURAS 1A-1D ilustran que el retrovirus ecotróficamente empacado solamente infecta células de murino. Las células de empaque ecotróficas se transfectaron con una construcción retroviral que codifica el gen b-Galactosidasa (b-Gal) y el sobrenadante recolectado 24 horas después. El sobrenadante que contiene el virus se colocó sobre cualquiera de los fibroblastos derivados de murino (FIGURA ÍA) , células de endotelio derivadas de murino (FIGURA IB) , células de adenocarcinoma de epitelio humano (FIGURA 1C) , o células de melanoma humano (FIGURA ID) durante 24 horas. La actividad de b-Gal se visualizó usando métodos estándar. La FIGURA 2 ilustra que los aumentos inducidos por bFGF en la actividad de Raf se bloquearon por infección anterior con Raf K375M en una linea celulares de endotelio de ratón. Las células de empaque ecotróficas se transfectaron con una construcción retroviral que codifica el gen de Raf cinasa defectuoso y el sobrenadante recolectado 24 horas después. El sobrenadante que contiene virus se colocó sobre células de endotelio de ratón durante 24 horas. Las células se trataron después con bFGF durante 5 minutos y se lizaron. La actividad de Raf cinasa se cuantificó por la habilidad de la Raf cinasa inmunoprecipitada para fosforilar el sustrato MEK con j2P radioactivamente marcados. Las mezclas de reacción se fraccionaron por SDS PAGE y se cuantificaron usando densitometria de barrido. Las FIGURAS 3A-3B ilustran que el mutante inactivo Raf K375M bloquea la angiogénesis inducida por bFGF en un modelo de angiogénesis subcutáneá de murino. La angiogénesis se indujo inyectando 250 ul de matrigel reducido con factor de crecimiento enfriado hasta hielo que contiene 400 ng/ml bFGF, con o sin células de empaque que expresan retrovirus que expresan Raf K375M subcutáneamente en el flanco de ratón. Cinco dias despµés se inyectó lectina de Bandeiriea Simplifica B5 conjugada con FITC especifica de endotelio por medio de la vena de la cola y se dejó circular y limpiar durante 30 minutos. La angiogénesis se cuantificó después retirando, extrayendo, y probando el tejido angiogénico por contenido fluorescente (FIGURA 3A) . La neovascularización se confirmó por seccionamiento óptico (FIGURA 3B) . Las FIGURAS 4A-4B ilustran que la Raf mutacionalmente activa estimula angiogénesis en un modelo de angiogénesis subcutánea de murino. La angiogénesis se indujo inyectando 250 ul de matrigel reducido con factor de crecimiento enfriado hasta hielo que contiene células de empaque que expresan retrovirus que expresan control GFP o Ras cinasa sustraída de amino terminal (Raf 306-648), subcutáneamente en el flanco del ratón. Cinco dias después la angiogénesis se cuantificó retirando, extrayendo, y probando el tejido angiogénico por contenido fluorescente (FIGURA 4A) . La neovascularización se confirmo seccionado y tiñendo con tricromo de Masón (FIGURA 4B) . Las FIGURAS 5A-5D ilustran el suministro retroviral de Raf K375M cinasa a la apoptosis inducida por tumor en una forma especifica del endotelio. Los tumores humanos se inyectaron subcutáneamente sobre el flanco de ratones wehi (nu/nu) atimicos y se dejaron implantar. Cuando los tumores alcanzaron 100 mm~ se inyectaron intratumorálmente con sobrenadante de cultivo que contiene 10' pfu de Raf K375M empacada ecotróficamente. Cuarenta ocho horas después se recolectó el tumor, se seccionó, y se realizó inmunohistoquimica. Las células del endotelio se identificaron por expresión de vWF (FIGURA 5A) , mientras que el marcador de etiqueta del Indicador se usó para indicar células infectadas por el gen Raf K375M cinasa (FIGURA 5B) . Cada uno de estos marcadores se ven colocados con el marcador TÚNEL indicativo de células apoptóticas (FIGURAS 5C & 5D) . Las FIGURAS 6A-6B ilustran el suministro endotelial del crecimiento del tumor inhibido por el gen Raf K375M cinasa y la regresión estimulada del tumor. Los tumores humanos se inyectaron subcutáneamente sobre el flanco de ratones wehi (nu/nu) atimicos y se dejaron crecer a 100 mmJ En este punto se realizó una inyección sencilla de células de empaque que expresan Raf K375M cinasa en un sitio adyacente al tumor o se inició una serie de inyecciones intratu orales de sobrenadante viral. Esta estrategia resultó en regresiones rápidas de los tumores lo cual no fue visto con la inyección del gen GFP control (FIGURA 6A) . Esta regresión ocurrió rápidamente y se mantuvo completamente a lo largo del experimento (FIGURA 6B) . La FIGURA 7 representa una secuencia de ADNc que codifica para c-Raf humana que es la secuencia de codificación completa con los intrones sustraídos. La secuencia es accesible a través del Número de Acceso GenBank X03484 (GI=35841, HSRAFR) . (SEC. DE IDENT. NO.: 1). LA FIGURA 8 representa la secuencia de residuos de aminoácidos traducidos codificados de c-Raf humana de la secuencia de codificación representada en la secuencia de ácido nucleico mostrada en la FIGURA 7 (SEC. DE IDENT. NO.: 2) . La FIGURA 9 ilustra que la angiogénesis es dependiente de la activación de la trayectoria Ras-Raf-MEK-ERK. La actividad de Ras se elevó en lisados de membrana corioalantoica de pollo (CAM) expuestos a bFGF como determinado por una prueba para batir Ras. Las CAM a partir de embriones de pollo de 10 dias de edad se estimularon localmente con discos de filtros saturados con PBS o 30 nanogramos (ng) de bFGF. Después de 5 minutos, el tejido de CAM se resecó, homogenizó en regulador de lisis, y se determinó después la actividad de Ras por su capacidad de ser precipitada por un péptido de fusión GST que codifica el dominio de enlace Ras de Raf. Debido a que solamente la Raf activa enlaza Ras, se generó una proteina recombinante que consiste del dominio de enlace de Ras de Raf conjugado a la glutation-S-transfersa (GST) . A la vez se conjugó GST a lechos de cefarosa permitiendo la precipitación de Ras activa a partir de un lisado de tejido. La FIGURA 10 representa la secuencia de nucleótidos del dominio que codifican ADNc de la Ras humana tipo silvestre (wt H-Ras). (SEC. DE IDENT. NO.: 3). Una secuencia de codificación completa para el proto-oncogen c-Has-Rasl es accesible a través de GenBank "(GI=190890, HUMRASH) . (SEC. DE IDENT. NO.: 5). La FIGURA 11 representa la secuencia de residuos de aminoácido codificados por la secuencia de nucleótidos de ADNc de Ras humana tipo silvestre (wt H-Ras) mostrada en la FIGURA 10. (SEC. DE IDENT. NO.: 4). La FIGURA 12 ilustra esa infección con angiogénesis inducido por factor de crecimiento bloqueado con nuil Ras mutante en la CAM. Se aplicaron quince microlitros (ul) de retrovirus de sarcoma de Pollo de alto titulo, RCAS (A) , que codifica nuil Ras mutante, S17N Ras (tipo silvestre H-Ras con una sustitución de Asn por Ser en la posición 17) , a discos de filtro sobre las CAM conforme se estimularon con bFGF como se describe en la FIGURA 9. La angiogénesis se valoró después de 72 horas contando puntos de ramificación de vaso. Las FIGURAS 13A y 13B ilustran respectivamente esquemática y gráficamente que la infección con una construcción de Ras mutante, Ras V12S35, la cual activa selectivamente la trayectoria Ras-Raf-MEK-ERK induce angiogénesis mientras que una construcción mutante, Ras V12C40, que activa selectivamente la trayectoria PI3K, no. Quince ul de virus RCAS (A) de titulo alto que codifica la construcción Ras que activa Raf-MEK-ERK, Ras V12S35, o la construcción de Ras que activa la cinasa PI3, Ras V12C40, se aplicaron localmente a discos de filtro y los " resultados se valoraron como se describió en la FIGURA 12. La FIGURA 14 representa la secuencia de nucleótidos que codifica la proteina de fusión Ras-caax, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el término carboxi de la Raf humana (wt H-Raf) se fusiona con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de residuos de 20 aminoácidos del dominio de localización de membrana K-Ras (SEC. DE IDENT. NO.: 6). La FIGURA 15 representa la secuencia de residuos de aminoácido de Raf-caax, la proteina de fusión generada a partir de la secuencia de nucleótidos de fusión representados en la FIGURA 14 (SEC. DE IDENT. NO.: 7). Las FIGURAS 16A-16E y la FIGURA 16F, ilustran respectiva, pictórica y gráficamente que el inhibidor de MEK, PD98059, bloqueo la angiogénesis inducida por cualesquier Ras o Raf activas mutantes. El virus que codifica la construcción de Ras activante, Ras V12 (también referida como G12V, y la construcción de Raf activante, Raf-caax, se aplicaron localmente a discos de filtro como se describe en la FIGURA 12. Después de 24 horas, un (1) nanomol de inhibidor de MEK, PD98059, se agregó al disco. Las CAM se evaluaron después como se describe en la FIGURA 12. Los datos graficados son la media ± SE de 20 embriones. Las FIGURAS 17A-17F y la FIGURA 17G, respectivamente, ilustran pictórica y gráficamente que la angiogénesis inducida por Raf, pero no Ras, fue refractario a la inhibición por bloqueo de integrina. La infección con construcciones de Ras y Raf activas mutantes indujo angiogénesis pronunciada, pero solamente la angiogénesis inducida por Ras se inhibió por los anticuerpos que bloquean integrina avß3. Las CAM a partir de embriones de pollo de 10 dias de edad se estimularon como se describe en las FIGURAS 9 y 12 con discos de filtro saturados con cualquiera de PBS (control) , bFGF, las construcciones retrovirales RCAS (A) G12V-Ras o Raf-caax. LM609, un anticuerpo monoclonal para integrina avß3. se suministró intravenosamente después de 24 horas y se valoró la angiogénesis por análisis de punto de ramificación de base después de 72 horas. Las CAM representativas se muestran en la intercalación. Los datos son la media ± SE de 20 embriones . Las FIGURAS 18A-18D y 18E, respectivamente, ilustran pictórica y gráficamente que la co-infección de las CAM con una cinasa de adhesión focal nula mutante, FRNK, bloqueo la angiogénesis inducida por Ras pero no por Raf. Los virus RCAS (A) que codifican Ras V12 o Raf-caax se aplicaron localmente como se describe en la FIGURA 12 junto con el virus RCAS (B) que codifica la cinasa nula relacionada a FAK (FRNK) a los discos de filtro de CAM. Los datos son la media ± SE de 20 embriones. ' ' Las FIGURAS 19A y 19B-19G, ilustran respectiva, gráfica y pictóricamente, que FRNK bloqueado bFGF y Ras, pero no Raf, indujo angiogénesis en un modelo de angiogénesis subcutáneo de murino. La angiogénesis se indujo inyectando 250 ul de matrigel reducido con factor de crecimiento enfriado hasta hielo que contiene 400 ng/ml de células de empaque que expresan retrovirus Moloney o bFGF que expresan el gen descrito, subcutáneamente en el flanco de ratón. El retrovirus FRNK se agregó al matrigel como virus del alto titulo empacado con la proteina de recubrimiento vsv.g. Cinco dias después, se inyectó lectina de Bandeiriea Simplifica B5 conjugadas con FITC especifica de endotelio por medio de la vena de la cola y se dejó circular. La angiogénesis se cuantificó retirando, extrayendo, y probando el tejido angiogénico por contenido fluorescente . Las FIGURAS 20A y 20B ilustran que la coinfección de las CAM con una cinasa de adhesión focal nula mutante, FRNK, bloqueo la activación inducida por Ras de Raf. Las CAM se trataron como se describe en la FIGURA 18 con la excepción de que después de 24 horas el tejido angiogénico se resecó, solubilizó, inmunoprecipitó con Raf, y la actividad de Raf se valoró por su capacidad para fosforilar MEK destruido por cinasa. La FIGURA 20A muestra los resultados de las proteinas Raf totales versus inmunoprecipitadas activas probadas bajo cada una de las combinaciones por encima de los resultados. La FIGURA 20B gráfica gráficamente los resultados de las determinaciones de Raf activas bajo aquellas condiciones.

Descripción Detallada de la Invención A. Definiciones Residuo de Aminoácido: Un aminoácido formado durante la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptidicos. Los residuos de aminoácidos descritos en la presente están preferentemente en la forma isomérica "L". Sin embargo, los residuos en la forma isomérica vD" pueden sustituirse por cualquier residuo de L-aminoácido, siempre y cuando la propiedad funcional deseada sea retenida por el polipéptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el término amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el término carboxi de un polipéptido. En cumplimiento con la nomenclatura de polipéptidos estándar (descrita en J. Biol. Chem., 243:3552 59 (1969) y adoptada en 37 CFR § 1.822 (b) (2) ) . Debe notarse que todas las secuencias de residuos de aminoácidos se representan en la presente por fórmulas cuya orientación izquierda y derecha está en la dirección convencional del término amino al término carboxi. Además, debe notarse que un guión al comienzo o final de una secuencia de residuos de aminoácido indica un enlace peptidico a una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácido. Polipéptido: se refiere a una serie lineal de residuos de aminoácido conectados uno con otro por enlaces peptidicos entre el grupo alfa-amino y el grupo carboxi de residuos de aminoácido contiguos. Péptido: como se usa en la presente se refiere a una serie lineal de no más de aproximadamente 50 residuos de aminoácido conectados uno con otro como en un polipéptido. Péptido Ciclico: se refiere a un compuesto que tiene una estructura de anillo de heteroátomo que incluye diversos enlaces amida como en un péptido típico. El péptido ciclico puede ser un polipéptido lineal ciclizado "cabeza con cola" en el cual un N-término del péptido lineal ha formado un enlace amida con el carboxilato terminal del péptido lineal, o puede contener una estructura de anillo en la cual el polimero es homodético o heterodético y comprende enlaces amida y/u otros enlaces para cerrar el anillo, tales como puentes disulfuro, enlaces tioéster, tioamidas, guanidino y similares. Proteina: se refiere a una serie lineal de más de 50 residuos de aminoácido conectados uno con otro como en un polipéptido. Proteina de fusión: se refiere a un polipéptido que contiene al menos dos diferentes dominios de polipéptido enlazados operativamente por un enlace peptidico típico ("fusionado") , en donde los dos dominios corresponden a péptidos no encontrados fusionados en la naturaleza. Péptido sintético: se refiere a una cadena quimicamente producida de residuos de aminoácido enlazados juntos con enlace peptidicos que están libres de proteinas que ocurren naturalmente y fragmentos de las mismas.

B. Consideraciones Generales La presente invención se refiere generalmente al descubrimiento de que la angiogénesis es mediada por la proteina Raf proteina cinasa, y que la angiogénesis puede modularse proporcionando proteinas activas o inactivas Raf para potenciar o inhibir la angiogénesis respectivamente. La invención también se refiere al descubrimiento de que una proteina Ras puede afectar Raf, y modular con eso la angiogénesis . Este descubrimiento es importante debido al papel que la angiogénesis juega en la formación de nuevos vasos sanguíneos, en una diversidad de procesos afectivos. Por otro lado, en donde los tejidos asociados con una 'condición afectiva requieren angiogénesis para el crecimiento de tejido, es deseable inhibir la angiogénesis e inhibir con esto el crecimiento del tejido enfermo. En donde el tejido herido requiere angiogénesis para el crecimiento y curación del tejido, es deseable potenciar o promover la angiogénesis y promover con esto la curación y crecimiento del tejido. En donde el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos es la causa de, o contribuye a, la patología asociada con un tejido enfermo, la inhibición de angiogénesis reducirá los efectos perjudiciales de la enfermedad. Al inhibir la angiogénesis, uno puede intervenir en la enfermedad, mejorar los síntomas, y en algunos casos curar la enfermedad. Ejemplos de tejidos asociados con enfermedad y neovascularización que se beneficiarán de la modulación inhibitoria del angiogénesis incluyen cáncer, artritis reumatoide, enfermedades oculares tales como retinopatia diabética, enfermedades inflamatorias, restenosis, y similares. En donde se requiere el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos para soportar el crecimiento de un tejido perjudicado, la inhibición de la angiogénesis reduce el suministro sanguíneo al tejido y contribuye con eso a la reducción en la masa de tejido con base en los requerimientos de suministro sanguíneo. ' ' Ejemplos particularmente preferidos incluyen el crecimiento de tumores en donde la neovascularización es un requerimiento continuo para que el tumor crezca más allá de unos cuantos milímetros de espesor, y para el establecimiento de las metástasis de tumor sólido. En donde el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos contribuye a la curación de tejido, la potenciación del angiogénesis asiste en la curación. Los ejemplos incluyen tratamiento de pacientes con extremidades isquémicas en las cuales existe circulación anormal, es decir deficiente como un resultado de diabetes u otras condiciones. También se contemplan pacientes con lesiones crónicas que no curan y por lo tanto podrían beneficiarse del aumento de la proliferación de células vasculares y la neovascularización. Los métodos de la presente invención son efectivos en parte debido a que la terapia es altamente selectiva para angiogénesis y no otros procesos biológicos. Como de describió anteriormente, la angiogénesis incluye una diversidad de procesos que involucran la neovascularización de un tejido que incluyen "brote", vasculogénesis, o aumento del vaso, todos de cuyos procesos de angiogénesis están afectados por la proteina Raf sola o junto con una proteina Ras. Con la excepción de la curación de heridas traumáticas, formación de corpus' ' luteum y embriogénesis, se cree que la mayoría de los procesos de angiogénesis están asociados con procesos afectivos y por lo tanto el uso de los métodos terapéuticos presentes son selectivos para la enfermedad y no tienen efectos secundarios perjudiciales.

C. Proteinas Raf Una proteina Raf proteina cinasa para uso en la presente invención puede variar dependiendo del uso intentado. Los términos "proteina Raf" o "Raf" se usan para referirse colectivamente a las diversas formas de la proteina Raf proteina cinasa, en formas activa o inactiva. Una "proteina Raf activa" se refiere a cualquiera de una diversidad de formas de proteina Raf que potencian, estimulan, activan, inducen o aumentan la angiogénesis. Las pruebas para medir la potenciación de la angiogénesis se describen en la presente, y no deben interpretarse como limitantes. Una proteina se considera activa si el nivel de angiogénesis es al menos 10% mayor, preferentemente 25% mayor, y más preferentemente 50% mayor que un nivel control en donde no se agrega Raf al sistema de prueba. La prueba preferida para medir la potenciación es la Raf cinasa in vi tro como se describe en los Ejemplos en los cuales el sustrato de MEK se fosforila con 32P. Ejemplos de proteinas Raf activas se describen en los Ejemplos. • - Una "proteina Raf inactiva" se refiere a cualquiera de una diversidad de formas de proteina Raf que inhibe, reducen, impiden, o restringen la angiogénesis. Las pruebas para medir la inhibición de angiogénesis se describen en la presente, y no deben interpretarse como limitantes. Una proteina se considera inactiva si el nivel de angiogénesis es al menos 10% inferior, preferentemente 25% inferior, y más preferentemente 50% inferior que un nivel control en donde no se agrega Raf exógena al sistema de prueba. La prueba preferida para medir la inhibición es la Raf cinasa in vi tro como se describe en los Ejemplos en los cuales el sustrato de MEK se fosforila con 32P. Ejemplos de proteinas Raf inactivas se describen en los Ejemplos. Una proteina Raf útil en la presente invención puede producirse por cualquiera de una diversidad de métodos que incluyen el aislamiento a partir de fuentes naturales que incluyen tejido, producción por expresión y purificación de ADN recombinante, similares. La proteina Raf también puede proporcionarse "in situ" por la introducción de un sistema de terapia de gen al tejido de interés el cual expresa después la proteina en el tejido. Un gen que codifica una proteina Raf puede prepararse por una diversidad de métodos conocidos en la técnica, y la invención no debe interpretarse como limitante a este respecto. Por ejemplo, la historia natural de Raf es bien conocida por incluir una diversidad de homólogos a partir de mamífero, avícola, viral y especies similares, y el gen puede clonarse fácilmente usando métodos de clonación de ADNc a partir de cualquier tejido que expresa la proteina. Una Raf preferida para uso en la invención es una proteina celular, tal como los homólogos de mamífero o avícola designados c-Raf. Particularmente preferida es la c-Raf humana. Una proteina Raf adicionalmente preferida de esta invención es una proteina de fusión de Raf que es constitutivamente activa pero independiente de la activación mediada por Ras. Tal proteina Raf puede ser una proteina fusionada. Una proteina Ras independiente de Raf preferida es Raf-caax la cual es una proteina fusionada carboxi terminal Raf tipo silvestre con el dominio de localización de membrana K-Ras como se describe adicionalmente en los Ejemplos.

D. Proteinas Ras Las GTPasas de la familia Ras para uso en la presente invención pueden variar dependiendo del uso intentado. Los términos "proteinas Ras" o "Ras" se usan en la presente referencia colectivamente a las diversas formas de proteinas Ras, ya sea en formas activas o inactivas. Una "proteina Ras activa" se refiere a cualquiera de una variedad de formas de proteinas Ras que potencian, estimulan, activan, inducen o aumentan la angiogénesis. Las pruebas para medir la potenciación del angiogénesis por Ras se describen en la presente, y no deben interpretarse como limitantes. Una proteina se considera activa si el nivel de angiogénesis es al menos 10% mayor, preferentemente 25% mayor, y más preferentemente 50% mayor que un nivel control en donde no se agrega Ras al sistema de prueba. Ejemplos de proteinas Ras activas son Ras G12V, también referidas como V12, y Ras V12S35, a bas de las cuales se describen adicionalmente en los Ejemplos. Una "proteina Ras inactiva" se refiere a cualquiera de una diversidad de formas de proteina Ras que inhiben, impiden, retrasan, o detienen la angiogénesis. Las pruebas para medir la inhibición de la angiogénesis se describe en la presente, y no deben interpretarse como limitantes. Una proteina se considera inactiva si el nivel de angiogénesis es al menos 10% inferior, preferentemente inferior, y más preferentemente 50r, inferior que un nivel control en donde no se agrega Ras exógeno al sistema de prueba. Ejemplos de proteinas Ras inactivas incluyen la Ras mutante nula referida como Ras S17N (o algunas veces N17) y V12C40, ambas de las cuales se describen adicionalmente en los Ejemplos. - - Una proteina Ras útil en la presente invención puede producirse por cualquiera de una diversidad de métodos que incluyen aislamiento a partir de fuentes naturales que incluyen tejido, producción por la expresión y purificación ADN recombinante, y similares. La proteina Ras también puede proporcionarse "in situ" por la introducción de un sistema de terapia de gen al tejido de interés el cual expresa después la proteina en el tejido. Un gen que codifica una proteina Ras puede prepararse por una diversidad de métodos conocidos en la técnica. La presente invención no debe interpretarse como limitante a este respecto. Por ejemplo, la historia natural de Ras es bien conocida por incluir una diversidad de homólogos a partir de mamífero, avícola, viral y especies similares, y el gen puede clonarse fácilmente usando métodos de clonación de ADNc a partir de cualquier tejido que expresa la proteina. Debe entenderse por las enseñanzas presentes que una proteina Ras en su forma colectiva puede usarse en las mismas diversas modalidades como se describe en la presente para una proteina Ras, y por lo tanto, los detalles para usar una proteina Ras no se reiteran. Por ejemplo, Ras puede presentarse en una forma activa o inactiva para modular la angiogénesis, o puede proporcionarse por la expresión de ácido nucleico del producto de proteina Ras, a través del uso de sistemas de suministro de vectores, y en diversas composiciones farmacéuticas (terapéuticas) y artículos de fabricación para practicar la invención. También se contemplan métodos para modular la angiogénesis usando un reactivo basado en Ras en lugar de los reactivos basados en Raf relatados.

E. Moléculas de ADN Recombinante y Sistemas de Expresión para la Expresión de una Proteina Raf o Ras La invención describe diversas secuencias de nucleótidos de uso particular en la presente invención.

Estas definen secuencias de ácido nucleico que codifican para proteina Raf o Ras útiles en la invención, y diversos segmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante (ADNr) y vectores construidos para la expresión de la proteina Raf y/o Ras. Las moléculas de ADN (segmentos) de esta invención pueden comprender por lo tanto secuencias que codifican genes estructurales completos, fragmentos de genes estructurales, y unidades de transcripción como describe adicionalmente en la presente. Un segmento de ADN preferido es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina Ras como se define en la presente, o un fragmento biológicamente activo de la misma. • • Otro segmento preferido de ADN es una secuencia de nucleótidos que codifica una proteina Ras como se define en la presente, o un fragmento biológicamente activo del mismo. Por biológicamente activo, se quiere decir que la proteina expresada tendrá al menos algo de la actividad biológica de la proteina intacta encontrada en la célula, tal como un enlace ligando, o en el caso de formas activas de la proteina, actividad enzimática. La secuencia de residuos de aminoácido y secuencia nucleótidos de una c-Raf preferidas se describe en los Ejemplos. Un segmento de ADN preferido codifica por una secuencia de residuos de aminoácidos sustancialmente la misma que, y que consiste preferente y esencialmente de, una secuencia de residuos de aminoácido o porciones de la misma que corresponde a una proteina Raf o Ras descrita en la presente. Segmentos de ADN representativos y preferidos se describen adicionalmente en los Ejemplos. La secuencia de residuos de aminoácidos de una proteina o polipéptido se relaciona directamente por medios del código genético a la secuencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) del gen estructural que codifica la proteina. Asi, un gen estructural o segmento de ADN pueden definirse en términos de la secuencia de residuos de aminoácido, es decir, proteina o polipéptido, pa-ra la cual codifica . Una característica importante y bien conocida del código genético es su redundancia. Esto es, para la mayoría de los aminoácidos usados para ser proteínas, más de un triplete de nucleótidos codificando (codón) puede codificar o diseñar un residuo de aminoácido particular. Por lo tanto, un número de diferentes secuencias de nucleótidos pueden codificar para una secuencia de residuos de aminoácidos. Tales secuencias de nucleótidos son funcionalmente equivalentes puesto que pueden resultar en la producción de la misma secuencia de residuos de aminoácido en todos los organismos. Ocasionalmente, puede incorporarse una variante metilada de una purina o pirimidina dentro de una secuencia de nucleótidos dada. Sin embargo, tales metilaciones no afectan la relación codificadora en ninguna forma. Un ácido nucleico es cualquier polinucleótido o fragmento de ácido nucleico, si éste es un poliribonucleótido o polidesoxiribonucleótido, es decir, ARN o ADN, o análogos de los mismos. En modalidades preferidas, una molécula de ácido nucleico está en la forma de un segmento de ADN dúplex, es decir, un segmento de ADN, aunque para algunas metodologías biológicas moleculares, se prefiere ADN de hebra sencilla o ARN. Los segmentos de ADN se producen por un- número de medios que incluyen métodos de sintesis químicos y propuestas recombinantes, preferentemente por clonación o por reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Los segmentos de ADN que codifican toda o solamente porciones de una proteina Raf o Ras pueden sintetizarse fácilmente por técnicas químicas, por ejemplo, el método de fosfotriéster de Matteucci et al, J. Am. Chem. Soc, 103:3185-3191 (1981), o usando métodos de sintesis automatizada. Además, segmentos de ADN más grandes pueden prepararse fácilmente por métodos bien conocidos, tales como síntesis de un grupo de oligonucleótidos que definen el segmento de ADN, seguido por hibridación y ligación de oligonucleótidos para construir el segmento completo. Métodos alternativos incluyen el aislamiento de segmento de ADN preferido por PCR con un par de cebadores de oligonucleótido usados sobre una biblioteca de ADNc que se cree contiene miembros que codifican una proteina Raf o Ras. Desde luego, a través de la sintesis química, puede hacerse cualquier modificación deseada sustituyendo simplemente las bases apropiadas por aquellas que codifican la secuencia de residuos de aminoácido nativos. Este método es bien conocido, y puede aplicarse fácilmente a la producción de diversas proteinas Raf o Ras "modificadas" diferentes descritas en la presente. Además, los segmentos de ADN que • consisten esencialmente de genes estructurales que codifican una proteina Raf o Ras pueden modificarse subsecuentemente, como por mutagénesis aleatoria o dirigida al sitio, para introducir cualquier sustitución deseada. Se entiende que diversas formas alélicas de proteina Raf o Ras y genes que codifican para proteina Raf o Ras también son adecuadas para uso en la presente invención. 1. Clonando un Gen Raf o Ras Un gen Raf o Ras de esta invención puede clonarse a partir de una fuente adecuada de ADN genómico o ARN mensajero (ARNm) por una diversidad de métodos bioquímicos. La clonación de estos genes puede conducirse conforme a los métodos generales descritos en los Ejemplos y como se conocen en la técnica. Fuentes de ácidos nucleicos para clonar un gen Raf o Ras adecuado para uso en los métodos de esta invención pueden incluir ADN genómico o ARN mensajero (ARNm) en la forma de una biblioteca de ADNc, a partir de un tejido que se cree expresa estas proteinas. Un tejido preferido es tejido de pulmón humano, aunque puede usarse cualquier otro tejido adecuado. Un método de clonación preferida involucra la preparación de una biblioteca de ADNc usando métodos estándar, y aislando la secuencia de nucleó-tidos que codifica Raf o que codifica Ras por amplificación de PCR usando cebadores de oligonucleótidos emparejados sobre las secuencias de nucleótidos descritas en la presente. Alternativamente, los clones de ADNc deseados pueden identificarse y aislarse a partir de una biblioteca de ADNc o genómica por métodos de hibridización de ácido nucleico convencionales usando una sonda de hibridización basada en las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente. Otros métodos para aislar y clonar ácidos nucleicos que codifican Raf o que codifican Ras son fácilmente aparentes para alguien experimentado en la técnica. 2. Vectores de Expresión La invención contempla una molécula de ADN recombinante (ADNr) que contiene un segmento de ADN que codifica una proteina Raf y/o Ras como se describe en la presente. Un ADNr expresable puede producirse enlazando operativamente (en estructura, expresáblemente) un vector a un segmento de ADN que codifica Raf o Ras de la presente invención. Se contempla que puede construirse una expresión de combinación en donde el ácido nucleico que codifica Raf y que codifica Ras está presente, enlazado operablemente al mismo, o promotores separados. Asi, una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN híbrida que comprende al menos dos ácidos nucleicos de unas secuencias de nucleótidos normalmente no encontradas juntas en la naturaleza (es decir, gen y vector) . La selección del vector al cual un segmento de ADN de la presente invención se enlaza operativamente depende directamente, como es bien conocido en la técnica, de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, expresión de proteina, y la célula huésped a ser transformada. Consideraciones típicas en la técnica de construir moléculas de ADN recombinantes. Un vector contemplado por la presente invención es al menos capaz de dirigir la replicación, y preferentemente también la expresión, de un gen estructural incluido en los segmentos de ADN del vector, al cual se enlaza operativamente. Los vectores de expresión procarióticos y eucarióticos son familiares a alguien con experiencia común en la técnica de la construcción de vectores, y se describe por Ausebel, et al., en Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York (1993) y por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) . Estas referencias también describen muchos de los métodos de ADN recombinante generales referidos en la presente. En una modalidad, un vector contemplado por la presente invención incluye un replicón procariótico, es decir, una secuencia de ADN que tiene la habilidad de dirigir la replicación autónoma y el mantenimiento de la molécula de ADN recombinante extracromosomalmente en una célula huésped procariótica, tal como una célula huésped bacteriana en la misma. Tales replicones son bien conocidos en la técnica. Además, aquellas modalidades que incluyen un replicón procariótico también incluyen un gen cuya expresión confiere resistencia a fármaco a un huésped bacteriano transformado en el mismo. Los genes de resistencia a fármaco bacterianos típicos son aquéllos que confieren resistencia a ampicilina o tetraciclina. Aquellos vectores que incluyen un replicón procariótico también pueden incluir un promotor procariótico capaz de dirigir la expresión (transcripción y traducción) de un gen estructural en una célula huésped bacteriana, tal como E. coli, transformada con el mismo. Un promotor es un elemento de control de expresión formado por una secuencia de ADN que permite que ocurra el enlace de ARN polimerasa y la transcripción. Los promotores u otras secuencias de ácido nucleico reguladoras pueden ser inducibles o constitutivas dependiendo del control y/o efecto de expresión deseado. Las secuencias promotoras compatibles con los huéspedes bacterianos se proporciona tipicamente en vectores plásmidos que contienen sitios de restricción convenientes para inserción de un segmento ADN de la presente invención. Típico de tales plásmidos vector son pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329 disponibles a partir de Biorad Laboratories, (Richmond, CA) , pRSET disponible a partir de Invitrogen (San Diego, CA) y pPL y pKK223 disponibles a partir de Pharmacia, Piscataway, N.J. Los vectores de expresión compatible con células eucarióticas, preferentemente aquellos compatibles con células de vertebrado, también pueden usarse para formar las moléculas de ADN recombinante de la presente invención. Los vectores de expresión de célula eucariótica son bien conocidos en la técnica y están disponibles a partir de diversas fuentes comerciales. Tipicamente, se proporcionan tales vectores que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción del segmento de ADN deseado. Típico de tales vectores son pSVL y pKSV-10 (Pharmacia) , pBPV-l/pML2d (International Biotecnologies, Inc.), pTDTl (ATCC, #31255), pRc/CMV (Invitrogen, Inc.), el vector preferido descrito en los Ejemplos, y vectores de expresión eucarióticos similares. Un sistema particularmente preferido para expresión del gen en el contexto de esta invención incluye un componente de suministro de gen, esto es, la habilidad para suministrar el gen al tejido de interés. Los vectores adecuados son vectores "infecciosos" tales como virus de ADN recombinantes, vectores adenovirus o retrovirus que se diseñan para expresar la proteina deseada- • y tener características que permiten la infección de tejidos objetivo preseleccionados. Particularmente preferido es el sistema de vector retrovirus descrito en la presente. Pueden diseñarse sistemas de células de mamífero que utilizan virus recombinantes o elementos virales para dirigir la expresión. Por ejemplo, cuando se usan vectores de expresión adenovirus, la secuencia de codificación de un polipéptido puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción de adenovirus, por ejemplo, el último promotor y la secuencia lider tripartita. Este gen quimérico puede insertarse después dentro del genoma de adenovirus por recombinación in vi tro o in vi vo . La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, región El o E3) resultará en un virus recombinante que es viable y capaz de expresar el polipéptido en huéspedes infectados (por ejemplo, véase Logan et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:3655-3659 (1984)). Alternativamente, puede usarse el virus vaccinia 7.5K promotor (por ejemplo, véase, Mackett et al., Proc. Nati.

Acad. Sci., USA, 79:7415-7419 (1982); Mackett et al., J^ Virol, 49:857-864 (1984), Panicali et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 79:4927-4931 (1982)). De interés particular son los vectores basados en el virus de papiloma bovino el cual tiene la habilidad de replicarse como elementos extracromosomales (Sarver et al., Mol. Cell. Biol. 1:486 (1981)). Poco después de la entrada de este ADN dentro de las células objetivo, el plásmido se replica en aproximadamente 100 a 200 copias por célula. La transcripción de ADNc insertado no requiere integración del plásmido dentro del cromosoma del huésped, produciendo con eso un alto nivel de expresión. Estos vectores pueden usarse para la expresión estable incluyendo un marcador seleccionable en el plásmido, tal como el gen neo. Alternativamente, el genoma retroviral puede modificarse para uso como un vector capaz de introducir y dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido en células huésped (Cone et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6349-6353 (1984)). También puede lograrse la expresión de alto nivel usando promotores inducibles, que incluyen, pero no se limitan a el promotor metalotionina IIA y promotores de choque de calor. Recientemente, se ha estudiado la sobrevivencia a largo plazo de citomegalovirus (CMV) promotor versus terapia timidina cinasa (TK) impulsada por virus de sarcoma Rous (RSV) promotor en ratones desnudos que llevan cáncer de ovario humano. La eficiencia de destrucción de células de la terapia de gen TK de virus herpes simple impulsada por CMV promotor mediada por adenovirus se encontró ser 2 a 10 veces más efectiva que la terapia impulsada por RSV (Tong et al., Hybridoma 18(1): 93-97 (1999)). E-l • diseño de promotores quiméricos para aplicaciones de terapia de gen, que requiere la expresión de bajo nivel seguida por la expresión de alto nivel inducible también se ha descrito (Suzuki et al., Human Gene Therapy 7: 1883-1893 (1996)). Para la producción de alto rendimiento, de largo plazo de proteinas recombinantes, se prefiere la expresión estable, en vez de usar vectores de expresión que contienen orígenes virales de replicación, las células huésped pueden transformarse con un ADNc controlado por elementos de control de expresión apropiados (por ejemplo, secuencias promotoras y mejoradoras, terminadores de transcripción, sitios de poliadenilación, etc.), y un marcador seleccionable. Como se mencionó anteriormente, el marcador seleccionable en el plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite a las células integrar establemente el plásmido dentro de sus cromosomas y crecer para formar foci que a su vez pueden clonarse y expandirse dentro de lineas celulares. Por ejemplo, después de la introducción de ADN extraño, las células diseñadas pueden dejarse cultivar durante 1-2 dias en un medio enriquecido, y cambiarse después a un medio selectivo. Puede usarse un número de sistemas de selección, que incluyen pero no se limitan a los genes de timidina cinasa de virus herpes simple (Wigler et al., Cell, 11:223 (1977)), hipoxant-ina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska et al, Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 48:2026 (1962)), y genes de adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell, 22:817 (1980)), que pueden emplearse en células tk~, hgprt" o aprt" respectivamente. También, pueden usarse genes que confieren resistencia a antimetabolito como la base de selección; por ejemplo, los genes para dhfr, que confieren resistencia a metotrexato (Wigler et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA. 77:3567 (1980), O'Hare et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 78:1527 (1981); gpt, que confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglicosido G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol . , 150:1 (1981)); y hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre et al., Gene, 30:147 (1984)). Recientemente, se han descrito genes seleccionables adicionales, especialmente trpB, que permite a las células utilizar indol en lugar del triptofano; hisD, que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 85:804 (1988)); y ODC (ornitina descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de ornitina decarboxilasa, 2- (difluorometil) -DL-ornitina , DFMO, (McConlogue L., In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987)). - • Los vectores principales contemplados para terapia de gen humano, se derivan a partir de origen retroviral (Wilson, Clin. Exp. Immunol. 107 (Sup. 1): 31-32 (1997); Bank et al., Bioessays 18 (12) : 999-1007 (1996), Robbins et al., Pharmacol. Ther. 80(1): 35-47 (1998)). El potencial terapéutico de transferencia de genes y terapia antisentido a estimulado el desarrollo de muchos sistemas de vectores para tratar un diversidad de tejidos (vasculatura, Stephan et al., Fundam. Clin. Pharmacol. 11(2):97-110 (1997); Feld an et al., Cardiovasc. Res. 35(3) :391-404 (1997); Vassalli et al., Cardiovasc. Res. (3):459-69 (1997), Bael et al., Circ. Res. 82 (3) : 295-305 (1998); riñon, Lien et al., Kidney Int. Suppl. 61:S85-8 (1997); higado, Ferry et al., Hum Gene Ther. 9 ( 14 ): 1975-81 (1998); músculo, Marshall et al., Curr. Opn. Genet. Dev. 8(3): 360-5 (1998)). Además de estos tejidos, un objetivo critico para la terapia de gen humano es el cáncer, ya sea el tumor en si mismo, o tejidos asociados. (Runnebaum, Anticancer Res. 17 (4B) : 2887-90 (1997); Spear et al., J.

Neurovirol. 4(2):133-47 (1998)). Ejemplos específicos de sistemas de vectores para terapia de gen viral fácilmente adaptables para uso en los métodos de la presente invención se describen brevemente en lo siguiente. El suministro de gen retroviral se ha revisado recientemente por Federspiel y Hughes (Methods in Cell Biol. 52:179-214 (1998)) que describe en particular, la familia del retrovirus del virus de leucosis avícola (ALV) (Federspiel et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 93:4931 (1996); Federspiel et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 91:11241 (1994)). Los vectores retrovirales, que incluyen virus de leucemia de murino (MLV) y ALV se describen adicionalmente por Svoboda (Gene 206: 153-163 (1998) ) . Los sistemas de expresión retroviral/adenoviral modificados pueden adaptarse fácilmente para práctica de los métodos de la presente invención. Por ejemplo, los sistemas de virus de leucemia de murino (MLV) se revisan por Karavanas et al., Crit. Rev. in Oncology/Hematology 28:7-30 (1998). Los sistemas de expresión de adenovirus se revisan por Von Seggern y Nemerow in Gene Expression Systems (ed. Fernandez & Hoeffler, Academic Press, San Diego, CA, capitulo 5, páginas 112-157 (1999)). Los sistemas de expresión de proteina han mostrado que tienen uso efectivo in vi vo e in vi tro . Por ejemplo, la transferencia de gen eficiente a carcinomas de células escamosas humanas por un vector amplicón tipo 1 de virus herpes simple (HSV) se ha descrito. (Carew et al., 1998, Am. J. Surg. 176:404-408). El virus herpes simple se ha usado para transferencia de gen al sistema nervioso (Goins et al., J. Neurovirol. 3 (Sup. 1): S80-8 (1997)). Se han probado vectores suicidas seleccionados usando HSV-TK sobre tumores sólidos (Smiley et al., Hum. Gene Ther. 8(8): 965-77 (1997)). El vector tipo 1 de virus herpes simple se ha usado para terapia de gen de cáncer en células de carcinoma de colon (Yoon et al., Ann. Surg. 228(3): 366-74 (1998) ) . Se han desarrollado vectores híbridos para prolongar la longitud de tiempo de transfección, incluyendo híbridos HSV/AAV (virus adeno asociados) para tratar hepatocitos (Fraefel et al., Mol. Med. 3(12): 813-825 (1997) ) . El virus vaccinia se ha desarrollado para terapia de gen humano debido a su genoma grande. (Peplinski et al., Surg. Qncol. Clin. N. Am. 7(3):575-88 (1998)). El virus de vaccinia sustraído de timidina cinasa que expresa purina nucleósido pirofosforilasa se ha descrito para uso como un vector para terapia de gen dirigida a tumor (Puhlman et al., Human Gene Therapy 10: 649-657 (1999)). El virus adeno asociado 2 (AAV) se ha descrito para uso en terapia de gen humano, sin embargo AAV requiere un virus asistente (tal como adenovirus o herpes virus) para replicación óptima y empaque en células de mamífero (Snoeck et al., Exp. Nephrol . 5(6):514-20 (1997); Rabinowitz et al., Curr. Opn. Biotechnol. 9(5):470-5 (1998)). Sin embargo, se ha descrito el empaque in vi tro de un AAV recombinante infeccioso, haciendo este sis"tema mucho más promisorio (Ding et al., Gene Therapy 4:1167-1172 (1997) ) . Se ha mostrado que la transferencia mediada por AAV de ADNc receptor de retrovirus ecotrópico permite la transducción retroviral ecotrópica de células humanas establecidas y primarias (Qing et al., J. Virology 71 (7) : 5663-5667 (1997)). Se ha demostrado en la terpia de gen de cáncer usando un vector AAV que expresa p53 tipo silvestre humano (Qazilbash et al., Gene Therapy 4:675-682 (1997) ) . También se ha mostrado la transferencia de gen dentro de células vasculares usando vectores AAV (Maeda et al., Cardiovascular Res. 35:514-521 (1997)). Se ha demostrado AAV como un vector adecuado para terapia de gen dirigida al higado. (Xiao et al., J. Virol. 72(12): 10222-6 (1998)) . Se ha demostrado el uso de vectores AAV en terapia de gen de tejidos de cerebro y el sistema nervioso central (Chamberlin et al., Brain Res. 793(1-2): 169-75 (1998); During et al., Gen Therapy 5(6):820-7 (1998)). También se han comparado los vectores AAV con vectores adenovirus (AdV) para terapia de gen del pulmón y transferencia a células de epitelio humana con fibrosis sistica (Teramoto et al., J. Virol. 72 ( 11 ): 8904-12 (1998)). Los sistemas de vectores para terapia de gen quimérico/retroviral que incorporan las cualidades útiles de cada virus para crear un AdV no integrativo que se vuelve funcionalmente integrativo por medio' de la generación intermedia de una célula productora retroviral (Feng et al., Nat. Biotechnology 15(9):866-70 (1997), Bilbao et al., FASEB J ll(8):624-34 (1997)). Esta fuerte y nueva generación de vector para terapia de gen se ha adaptado para terapia de gen de cáncer seleccionado (Bilbao et al., Adv. Exp. Med. Biol. 451 :365-74 (1998)). La inyección sencilla de p53 que expresa AdV inhibió el crecimiento de nodulos de tumor subcutáneos de células de cáncer de próstata humana (Asgari et al., Int. J. Cáncer 71(3): 377-82 (1997)). Se ha descrito la transferencia de gen mediada por AdV de p53 tipo silvestre en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas (Schuler et al., Human Gene Therapy 9:2075-2082 (1998)). Este mismo cáncer ha sido el objeto de terapia de reemplazo de gen p53 mediada por vectores AdV (Roth et al., Semin. Oncol. 25(3 Suppl 8):33-7 (1998)). La transferencia de gen mediada por AdV de p53 inhibe la diferenciación de células del endotelio y la angiogénesis in vi vo (Riccioni et al., Gene Ther. 5(6):747-54 (1998)). También se ha descrito la expresión mediada por adenovirus de antigeno de melanoma gp75 como inmunoterapia para melanoma metastásico (Hirschowitz et al., Gene Therapy 5:975-983 (1998)). AdV facilita la infección de células humanas con retrovirus ecotrópico y aumenta la eficiencia de infección retroviral (Scott-Taylor, et al., Gene Ther. 5(5):621-9 (1998)). Se han usado vectores de AdV para transferirse de gen a células de músculo liso vascular (Li et al., Chin. Med. J. (Engl) 110(12) :950-4 (1997)), células de carcinoma de células escamosas (Goebel et al., Otolarynol Head Neck Surg 119(4): 331-6 (1998)), células de cáncer esofágico (Sen aru et al., Int J. Cáncer 78(3):366-71 (1998)), células mesangial (Nahman et al., J. Investie. Med. 46(5):204-9 (1998)), células gliales (Chen et al., Cáncer Res. 58 (16) :3504-7 (1998)), y para las articulaciones de animales (Ikeda et al., J. Rheumatol. 25(9): 1666-73 (1998)). Más recientemente, se ha demostrado la transferencia de gen pericardial basada en catéter mediada por vectores AcV (March et al., Clin. Cardiol. 22(1 Suppl 1): 123-9 (1999)). La manipulación del sistema AdV con los elementos genéticos controladores apropiados permite la expresión in vi vo del gen objetivo regulable mediada por AdV (Burcin et al., PNAS (USA) 96(2):355-60 (1999)). Se han desarrollado vectores alfavirus, para aplicaciones de terapia de gen humano, con lineas celulares de empaque adecuadas para transformación con cassettes de expresión adecuados para uso con vectores derivados de virus Sindbis y virus Semliki Forest (Polo et al., Proc . Nati. Acad. Sci., USA. 96:4598-4603 (1999)). También se han desarrollado sistemas basados en ARN replicón flavivirus no citopático (Varnavski et al., Virology 255-(2) : 366-75 (1999)). Se han usado vectores de virus sibis que contienen gen HSV-TK suicida para selección especifica de célula dentro de células de tumor (Iijima et al., Int. J. Cáncer 80 (1) :110-8 (1998) ) . Los vectores retrovirales basados en virus espumoso humano (HFV) también prometen como vectores para terapia de gen (Trowbridge et al., Human Gene Therapy 9:2517-2525 (1998)). Se han diseñado vectores de virus espumoso para terapia de gen suicida (Nestler et al., Gene Ther. 4(11): 1270-7 (1997)). También se han usado sistemas de citomegalovirus de murino recombinante y promotor como vectores para expresión de nivel alto (Manning et al., J. Virol. Meth. 73(l):31-9 (1998); Tong et al., Hybridoma 18 (1) :93-7 (1998) ) . El suministro de gen en células que no se dividen se ha hecho factible por la generación de vectores basados en virus Sendai (Nakanishi et al., J. Controlled Reléase 54 (1) :61-8 (1998) ) . En otros esfuerzos para permitir la transformación de células somáticas que no se dividen, se han explorado vectores lentivirales . Se ha descrito la terapia de gen de fibrosis cistica usando un virus de inmunodeficiencia humana defectivo en replicación (VIH) (Goldman et al., Human Gene Theraphy 8:2261-2268 (1997)). También se ha mostrado la expresión sostenida- -de genes suministrados dentro de higado y músculo por vectores lentivirales (Kafri et al., Nat. Genet. 17(3):314-7 (1997)). Sin embargo, las preocupaciones de seguridad son predominantes, y el desarrollo del vector mejorado está procediendo rápidamente (Kim et al., J^ Virol. 72(2): 994-1004 (1998)). El examen del VIH LTR y Tat producen información importante acerca de la organización del genoma para vectores en desarrollo (Sadaie et al., J. Med. Virol. 54(2): 118-28 (1998)). Asi, los requerimientos genéticos para un vector basado en VIH efectivo son ahora mejor entendidos (Gasmi et al., J. Virol. 73(3): 1828-34 (1999)). Se han descrito vectores auto inactivantes, o lineas celulares de empaque condicionales (por ejemplo, Zuffery et al., J. Virol. 72 ( 12 ): 9873-80 (1998), Miyoshi et al., J^ Virol 72 (10) :8150-7 (1998); Dull et al., J. Virol. 72 (11) :8463-71 (1998); y Kaul et al., Virology 249(1): 167-74 (1998)). Se ha mostrado la transducción eficiente de linfocitos humanos y células CD34+ por vectores VIH (Douglas et al., Hum. Gene Ther. 10(6):935-45 (1999); Miyoshi et al., Science 283 ( 5402 ): 682-6 (1999)). Se ha descrito la transducción eficiente de células humanas que no se dividen por vectores lentivirales de virus de inmunodeficiencia de felino (FIV) , que minimiza las preocupaciones de seguridad usando vectores basados en VIH (Poeschla et al., Nature Medicine 4(3):354-357 (1*998) ). Se ha demostrado la infección productiva de células mononucleares sanguíneas humanas por vectores FIV (Johnston et al., J. Virol. 73(3):2491-8 (1999)). Mientras que muchos vectores virales son difíciles de manejar, y la capacidad para el ADN insertado limitada, estas limitaciones y desventajas se han dirigido. Por ejemplo, además de lineas celulares de empaque viral simplificadas, se han desarrollado vectores Mini-virales, derivados a partir de virus herpes humano, virus herpes simple tipo 1 (HSV-1), y virus Epstein-Barr (EBV), para simplificar la manipulación de material genético y la generación de vectores virales (Wang et al., J. Virology 70(12): 8422-8430 (1996)). Se ha mostrado previamente que los plásmidos adaptadores simplifican la inserción de ADN extraño dentro de vectores retrovirales independientes de asistente (J. Virology 61 (10) : 3004-3012 (1987)). Los vectores virales no son el único medio para efectuar la terapia de gen, puesto que también se han descrito diversos vectores no virales. Se ha mostrado que un vector de suministro de gen no viral seleccionado basado en el uso de Factor de Crecimiento de Epidermis/ADN poliplex (EGF/ADN) resulta en el suministro de gen eficiente y especifico (Cristiano, Anticancer Res. 18:3241-3246 (1998)). Se ha demostrado la terapia de gen de la vasculatura y CNS usando liposomas catiónicos (Yáng et al., J. Neurotrauma 14(5):281-97 (1997)). También se ha logrado la terapia de gen transiente de pancreatitis usando liposomas catiónicos (Denham et al., Ann. Surg. 227(6): 812-20 (1998) ) . Se ha demostrado que unos complejos de vector basados en quitosan/ADN para suministro de gen son efectivos (Erbacher et al., Pharm. Res. 15(9): 1332-9 (1998) ) . Se ha descrito un vector de suministro de ADN no viral basado en un sistema terplex (Kim et al., 53(1-3) : 175-82 (1998)). También se han usado complejos de liposoma recubiertos con partícula de virus para efectuar la transferencia de gen (Hirai et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 241 (1) :112-8 (1997)). Se ha demostrado la terapia de gen de cáncer por inyecciones en tumor directas de vector T7 no viral que codifica un gen timidina cinasa (Chen et al., human Gene Therapy 9:729-736 (1998)). La preparación de 7ADN plásmido es importante para la transferencia de gen de inyección directa (Horn et al., Hum. Gene Ther. 6(5): 656-73 (1995)). Se han adaptado vectores plásmido modificados específicamente para inyección directa (Hartikka et al., Hum. Gene Ther. 7 (10) : 1205-17 (1996)). Asi, se conoce una amplia diversidad de vectores de transferencia de gen/terapia de gen y construcciones. Estos vectores se adaptan fácilmente para uso en los métodos de la presente invención. Por la - -apropiada manipulación usando técnicas de biología molecular/ADN recombinante para insertar un segmento de ácido nucleico que codifica Raf o Ras enlazada operativamente (ya sea activa o inactiva) dentro del vector de expresión/suministro seleccionado, pueden generarse muchos vectores equivalentes para la práctica de la presente invención.

F. Métodos para la Modulación de Angiogénesis En un aspecto, la presente invención proporciona un método para la modulación de angiogénesis en un tejido asociado con un proceso o condición afectiva, y con eso afecta eventos en el tejido que dependen de angiogénesis. Generalmente, el método comprende administrar al tejido, asociado con, o que sufre de un proceso o condición afectiva, una cantidad que modula la angiogénesis de una composición que comprende una proteina Raf o un vector de ácido nucleico que expresa Raf activa o inactiva. Un método adicional comprende administrar al tejido, asociado con un proceso o condición afectiva, una cantidad que modula la angiogénesis de una composición que comprende una proteina Ras o un vector de ácido nucleico que expresa Ras activa o inactiva. Otro aspecto del método comprende administrar al tejido asociado con un proceso o condición afectiva, una cantidad que modula la angiogénesis de una proteina Raf y Ras o uno o más vectores de ácido nucleico que expresan Raf o Ras activa o inactiva. Cualquiera de una diversidad de tejidos, u órganos comprendidos de tejidos organizados, puede soportar la angiogénesis en condiciones afectivas que incluyen piel, músculo, intestino, tejido conectivo, tejido de cerebro, células nerviosas, articulaciones, huesos y tejido similar en cuyos vasos sanguíneos puede invadir durante los estímulos angiogénicos. El paciente a ser tratado conforme a la presente invención en sus muchas modalidades es un paciente humano, aunque la invención es efectiva con respecto a todos los mamíferos. En este contexto, un "paciente" es un paciente humano asi como un paciente de veterinario, un mamífero de cualquier especie de mamíferos en cuyo tratamiento de tejido asociado con enfermedades que involucran angiogénesis es deseable, particularmente especies agrícolas y de mamíferos domésticos. Asi, el método que abarca la presente invención comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición fisiológicamente tolerable que contiene una proteina Raf y/o Ras o vector de ácido nucleico para expresar una proteina Raf y/o Ras. Los rangos de dosificación para la administración ie una proteina Raf o Ras dependen de la forma de la proteina, y su potencia, como se describe adicionalmente en la presente, y son cantidades suficientemente grandes para producir el efecto deseado en el cual se mejoran la angiogénesis y los síntomas afectivos mediados por angiogénesis. La dosificación no debe ser tan grande como para causar efectos secundarios adversos, tales como síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardiaca congestiva, y similares. Generalmente, la dosificación variará con la edad, condición, sexo y alcance de la enfermedad en el paciente y puede determinarse por alguien con experiencia en la técnica. La dosificación también puede ajustarse por el médico individual en el caso de cualquier complicación. Una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad de proteina Raf o Ras, o ácido nucleico que codifica para una proteina Raf o Ras (activa o inactiva) , suficiente para producir una modulación mensurable de angiogénesis en el tejido que se trata, es decir, una cantidad que modula la angiogénesis. La modulación de angiogénesis puede medirse u observarse in vi tro por una prueba CAM como se describe en la presente, examen de tejidos de tumor, o por otros métodos conocidos por alguien con experiencia en la técnica. El proteina Raf o Ras o vector de ácido nucleico que expresa tal proteina puede administrarse parenteralmente por inyección o por infusión gradual durante el tiempo. Aunque el tejido a ser tratado puede accesarse tipicamente en el cuerpo por administración sistémica y por lo tanto más frecuentemente tratado por administración intravenosa de composiciones terapéuticas, se contemplan otros tejidos y medios de suministro en donde existe una posibilidad de que el tejido seleccionado contenga la molécula objetivo. Asi, pueden administrarse composiciones de la invención intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavidad y transdérmicamente, y puede suministrarse por medios peristálticos, si se desea. Las composiciones terapéuticas que contienen una proteina Raf o Ras o vector de ácido nucleico que expresa la proteina Raf o Ras puede administrarse en forma convencional intravenosamente, o por inyección de una dosis unitaria, por ejemplo. El término "dosis unitaria" cuando se usa con referencia a una composición terapéutica de la presente invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificación unitaria para el sujeto, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente fisiológicamente aceptable requerido; es decir, portador, o vehiculo . En una modalidad preferida el material activo se administra en una dosificación sencilla intravenosamente. La administración localizada puede lograrse por inyección directa o aprovechando compartimentos anatómicamente aislados, aislando la microcirculación de sistemas de órganos objetivo, reperfusión en un sistema circulante, u oclusión temporal basada en catéter de las regiones objetivo de la vasculatura asociadas con tejidos afectivos. Las composiciones se administran de una forma compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad terapéuticamente efectiva. La cantidad a ser administrada y el tiempo depende del sujeto a ser tratado, la capacidad del sistema del sujeto para utilizar el ingrediente activo, y el grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas de ingrediente activo requeridas para ser administradas dependen del juicio del practicante y son peculiares para cada individuo. Sin embargo, los rangos de dosificación adecuados para la aplicación sistémica se describen en la presente y dependen de la trayectoria de administración. Los regímenes adecuados para administración son también variables, pero se tipifican por una administración inicial seguida por dosis repetidas a intervalos de una o más horas por una inyección subsecuente u otra administración. Alternativamente, se contempla la infusión intravenosa continua suficiente para mantener concentraciones en la sangre en los rangos especificados para terapias in vi vo . 1. Inhibición de Angiogénesis Existe una diversidad de enfermedades en las cuales es importante la inhibición de angiogénesis, referidas como enfermedades angiogénicas, que incluyen pero no se limitan a, trastornos inflamatorios tales como inflamación inmune y no inmune, reumatismo articular crónico y psoriasis, trastornos asociados con la invasión inapropiada o inoportuna de vasos tales como retinopatia diabética, glaucoma neovascular, restenosis, proliferación capilar en placas ateroscleróticas y osteoporosis, y trastornos asociados con cáncer, tales como tumores sólidos, metástasis de tumor sólido, angiofibromas, fibroplasia retrolental, hemangiomas, sarcoma de Kaposi y cánceres similares que requieren neovascularización para soportar el crecimiento del tumor.

Asi, los métodos que inhiben la angiogénesis en un tejido asociado con una condición afectiva mejoran los síntomas de la enfermedad y, dependiendo de la enfermedad, pueden contribuir a curar la enfermedad. En una modalidad, la invención contempla la inhibición de angiogénesis, per se, en un tejido asociado con una condición afectiva. El alcance de la angiogénesis en un tejido, y por lo tanto el alcance de la inhibición lograda por los métodos presentes, puede evaluarse por una diversidad de métodos. Asi, en una modalidad, un tejido a ser tratado es un tejido inflamado y la angiogénesis a ser inhibida es angiogénesis de tejido inflamado en donde existe la neovascularización de tejido inflamado. Este método particular incluye la inhibición de angiogénesis en tejidos artríticos, tales como en un paciente con reumatismo articular crónico, en tejidos inflamados inmunes o no inmunes, en tejido psoriático, y similares. En otra modalidad, un tejido a ser tratado es un tejido retinal de un paciente que sufre de una enfermedad retinal tal como retinopatia diabética, degeneración macular o glaucoma neovascular y la angiogénesis a ser inhibida es angiogénesis de tejido retinal en donde existe neovascularización de tejido retinal. En una modalidad adicional, un tejido a ser tratado es un tejido de tumor de un paciente con un tumor sólido, una metástasis, un cáncer de piel, un cáncer de mama, una hemangioma o angiofibroma y cánceres similares, y la angiogénesis a ser inhibida es angiogénesis de tejido de tumor en donde existe neovascularización de un tejido de tumor. Los tejidos de tumor sólido típicos tratables por los métodos presentes incluyen tejidos de pulmón,- páncreas, mama, colon, de laringe, ovario, y similares. La inhibición de angiogénesis de tejido de tumor es una modalidad particularmente preferida debido al importante papel que la neovascularización juega en el crecimiento del tumor. En la ausencia de neovascularización de tejido de tumor, el tejido de tumor no obtiene los nutrientes requeridos, retarda el crecimiento, cesa el crecimiento adicional, regresa y finalmente se vuelve necrótico resultando en la destrucción del tumor. Dicho en otras palabras, la presente invención proporciona un método para inhibir la neovascularización de tumor inhibiendo la angiogénesis de tumor conforme a los métodos presentes. Igualmente, la invención proporciona un método para inhibir el crecimiento de tumor al practicar los métodos que inhiben la angiogénesis. Los métodos son también particularmente efectivos en contra de la formación de metástasis debido a que (1) su formación requiere la vascularización de un tumor primario de manera que las células de cáncer metastático pueden abandonar el tumor primario y (2) su establecimiento en un sitio secundario requiere la neovascularización para soportar el crecimiento de la metástasis. En una modalidad aún adicional, la invención contempla la práctica del método junto con otras terapias tales como quimioterapia convencional dirigida en- contra de tumores sólidos y para control del establecimiento de metástasis. La administración del inhibidor de angiogénesis se conduce tipicamente durante o después de quimioterapia, aunque es preferible inhibir la angiogénesis después de un régimen de quimioterapia a veces en donde el tejido de tumor estará respondiendo al asalto tóxico induciendo angiogénesis para recuperar la provisión de un suministro de sangre y nutrientes al tejido de tumor. Además, se prefiere administrar los métodos de inhibición de angiogénesis después de cirugía en donde se han retirado tumores sólidos como una profilaxis en contra de metástasis. Hasta donde aplican los métodos presentes para inhibición de neovascularización de tumor, los métodos también pueden aplicarse para la invención de crecimiento de tejido de tumor, para inhibición de formación de metástasis de tumor, y para regresión de tumores establecidos . La restenosis es un proceso de migración y proliferación de células de músculo liso (SMC) dentro del tejido en el sitio de angioplastia coronaria transluminar percutánea que estorba el éxito de la angioplastia. La migración y proliferación de las SMC durante el restenosis puede considerarse un proceso de angiogénesis que es inhibido por los métodos presentes. Por lo -tanto, la invención también contempla la inhibición de restenosis al inhibir la angiogénesis conforme a los métodos presentes en un paciente después de procedimientos de angioplastia. Para la inhibición de restenosis, la tirosina cinasa inactivada se administra tipicamente después del procedimiento de angioplastia debido a que la pared del vaso coronario está en riesgo de restenosis, de aproximadamente 2 hasta aproximadamente 28 dias, y más típicamente de aproximadamente los primeros 14 dias después del procedimiento . El método presente para inhibir angiogénesis en un tejido asociado con una condición afectiva, y por lo tanto para practicar también los métodos para tratamiento de enfermedades relacionadas con angiogénesis, comprende poner en contacto un tejido en el cual está ocurriendo angiogénesis, o esta en riesgo de ocurrir, con una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un proteina Raf inactivada o vector que expresa la proteina. La inhibición de la angiogénesis y la regresión del tumor ocurre tan pronto como 7 dias después del contacto inicial con la composición terapéutica. Es preferible la exposición adicional o prolongada a la proteina inactiva Raf o Ras durante 7 dias a 6 semanas, de preferencia aproximadamente 14, a 28 dias. Pueden ser útiles periodos más cortos de exposición en' 'donde los efectos moduladores se detectan más pronto, sin embargo se prefiere la administración y expresión subsecuente durante al menos 12 horas. 2. Potenciación de Angiogénesis En casos donde es deseable promover o potenciar la angiogénesis, la administración de una proteina Raf o Ras activa al tejido es útil. Las trayectorias y tiempo de administración son comparables a los métodos descritos anteriormente para inhibición.

G. Composiciones Terapéuticas La presente invención contempla composiciones terapéuticas útiles para practicar los métodos terapéuticos descritos en la presente. Las composiciones terapéuticas de la presente invención contienen un portador fisiológicamente tolerable junto con una proteina Raf o Ras o vector capaz de expresar una proteina Raf o Ras como se describe en la presente, disuelta o dispersa en las mismas como un ingrediente activo. En una modalidad preferida, la composición terapéutica no es inmunogénica cuando se administra a un mamífero o paciente humano para propósitos terapéuticos . Como se usa en la presente, los términos "farmacéuticamente aceptable" "fisiológicamente ' tolerable" y variaciones gramáticas de los mismos, según se refieren a composiciones, portadores, diluyentes y reactivos, se usan intercambiablemente y representan que los materiales son capaces de administrarse para o sobre un mamífero sin la producción de efectos fisiológicos indeseables tales como nausea, vértigo, trastorno gástrico y similares. La preparación de una composición farmacológica que contiene ingredientes activos disueltos o dispersos en la misma está bien entendida en la técnica y no necesita limitarse con base en la formulación. Tipicamente tales composiciones se preparan como inyectables ya sea soluciones liquidas o suspensiones, sin embargo, también pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución, o suspensiones, en liquido antes de usarse. La preparación también puede emulsificarse o presentarse como una composición de liposoma. El ingrediente activo puede mezclarse con excipientes que son farmacéuticamente aceptables y compatible con el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para uso en los métodos terapéuticos descritos en la presente. Los excipientes adecuados, son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de las mismas. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsificantes, agentes reguladores de pH y similares que mejoran la efectividad del ingrediente activo. La composición terapéutica de la presente invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes en la misma. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición acidas (formadas con los grupos amino libre del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como acético, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libre también pueden derivarse a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxido de sodio, potasio, amonio, calcio o férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaina y similares . Los portadores fisiológicamente tolerables son bien conocidos en la técnica. Ejemplos de portadores líquidos son las soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los ingredientes activos y agua, o contiene un regulador tal como fosfato de sodio a valor fisiológico de pH, solución salina fisiológica o ambos, tales como solución salina regulada con fosfatos. Aún adicionalmente, los portadores acuosos pueden contener más de una sal de regulador, asi como sales tales como cloruros de sodio y potasio, dextrosa polietilenglicol y otros solutos. Las composiciones liquidas también pueden contener fases liquidas además de y con la exclusión de agua. Ejemplos de tales fases liquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como aceite de algodón, y emulsiones de agua-aceite. Una composición terapéutica contiene una cantidad moduladora de angiogénesis de una proteina Raf o Ras de la presente invención, o suficiente vector de expresión de ADN recombinante para expresar una cantidad efectiva de proteina Raf o Ras, tipicamente formulada para contener una cantidad de al menos 0.1 por ciento en peso de proteina Raf o Ras por peso de la composición terapéutica total. Un por ciento en peso es una proporción en peso de proteina Raf respecto a la composición total. Asi, por ejemplo, 0.1 por ciento en peso es 0.1 gramos de protelna Raf o Ras por 100 gramos de composición total. Para vectores de expresión de ADN, la cantidad administrada depende de las propiedades del vector de expresión, el tejido a ser tratado, y las consideraciones similares. La cantidad adecuada administrada puede medirse por la cantidad de vector o la cantidad de proteina expresada que se espera.

H. Articulo de Fabricación - - La invención también contempla un articulo de fabricación que es un recipiente enmarcado para proporcionar una proteina Raf o Ras de la invención. Un articulo de fabricación comprende material de empaque y un agente farmacéutico contenido dentro del material de empaque . El agente farmacéutico en un articulo de fabricación es cualquiera de las composiciones de la presente invención adecuadas para proporcionar una proteina Raf o Ras y formuladas dentro de una forma farmacéuticamente aceptable como se describe en la presente conforme a las indicaciones descritas. Asi, la composición puede comprender una proteina Raf y/o Ras o una molécula ADN que es capaz de expresar una proteina Raf y/o Ras. El articulo de fabricación contiene una cantidad de agente farmacéuticos para tratar una condición indicada en la presente, en dosificación unitaria o múltiple. El material del empaque comprende una etiqueta que indica el uso del agente farmacéutico contenido en la invención. Además, tales variaciones de la invención, no conocidas o desarrolladas después, que estarían dentro del alcance de un experto en la técnica deben considerarse que caen dentro del alcance de la presente invención reclamada posteriormente. 1. Preparación de Construcciones de Expresión de c-Raf Para preparar las construcciones de expresión útiles para modular la angiogénesis por los métodos de la presente invención, c-Raf ADNc se manipula e inserta dentro de una construcción/vector de expresión. La secuencia del ADNc que codifica para c-Raf humana tipo silvestre (es decir, endógena) se representa en la secuencia de ácido nucleico mostrada en la FIGURA 7 (SEC. DE IDENT. NO.: 1, nucleótidos 130... 2076) con la secuencia de residuos de aminoácido traducida codificada para la proteina Raf representada en la FIGURA 8 (SEC. DE IDENT. NO. : 2) . La presente invención describe dos categorías de función c-Raf para modular angiogénesis. Como se discutió previamente, una categoría contiene moléculas Raf que aumentan la angiogénesis y, asi, se consideran ser proteinas activas. La Raf tipo silvestre junto con diversas mutaciones se muestran en la presente invención para inducir la angiogénesis. bü misma, por ejemplo, para tratar condiciones asistidas por la inhibición o potenciación de angiogénesis, y las condiciones similares descritas en la presente. La etiqueta puede incluir adicionalmente instrucciones para uso y la información relacionada según pueda requerirse para comercialización. El material del empaque puede incluir el o los recipientes para almacenamiento del agente farmacéutico. Como se usa en la presente, el término material de empaque se refiere a un material tal como vidrio, plástico, papel, papel de estaño, y similares capaces de sostener dentro de un medio fijo un agente farmacéutico. Asi, por ejemplo, el material de empaque puede ser ampolletas de plástico o vidrio, envolturas laminadas y recipientes similares usados para contener una composición farmacéutica que incluye el agente farmacéutico. En modalidades preferidas, el material de empaque incluye una etiqueta que es una expresión tangible que describe el contenido del articulo de fabricación y el uso del agente farmacéutico contenido en la misma.

E emplos Los siguientes ejemplos que se refieren a esta invención son ilustrativos y no deben desde luego interpretarse como que limitan específicamente la Una mutación preferida de c-Raf tipo silvestre que funciona en este contexto con respecto a su habilidad para inducir el crecimiento de vasos sanguíneos y por lo tanto aumentar el peso del tumor in vi vo es la construcción mutante de Raf en la cual solamente los residuos de aminoácidos 306-648 de Raf (Raf 306-648) se expresan. Esta construcción carece del dominio de cinasa regulador completo y se le refiere por lo tanto como una proteina Raf activa constitutivamente. Las mutaciones en Raf también se han mostrado que tienen el efecto modulador opuesto sobre la angiogénesis, inhibiendo la angiogénesis en lugar de estimularla. Tales mutaciones se refieren como mutaciones Raf inactivas. Las proteínas que tienen mutaciones que confieren esta actividad inhibitoria también se refieren como proteinas Raf negativas dominantes en que inhiben la neovascularización, incluyendo la que resulta de la actividad endógena de Raf asi como la actividad de Raf mejorada que resulta de la estimulación de factor de crecimiento. Asi, algunas mutaciones de c-Raf tipo silvestre de la presente invención también pueden funcionar como un negativo dominante con respecto a su habilidad para bloquear el crecimiento de vasos sanguíneos, y por ejemplo, disminuir por lo tanto del tumor in vivo . Un ejemplo de construcción Raf inhibitoria es la mutación Raf en la cual el rebiduo de aminoácido lisina 375 se hace mutar dentro de cualquier otro aminoácido, preferiblemente una metionma (es decir, Raf K375M) . Esta mutación de punto en el dominio de cinasa previene el enlace de ATP y también bloquea las funciones Raf dependientes de cmasa relacionadas al señalamiento y proliferación de células vasculares y células tumorales. Otra mutante Raf inhibitoria comprenderla los residuos de aminoácidos 1-305 en la forma de una proteina Raf truncada (es decir, Raf 1-305), que carece del dominio de cinasa. Con respecto a las mutaciones de punto, cualquier mutación que resulta en la actividad inhibitoria o inhibidora deseada se contempla para uso en esta invención. Las construcciones de proteinas fusionadas que combinan la proteina Raf deseada (mutaciones o fragmentos de la misma) con etiquetas de aminoácidos expresados, epitopes antigénicos, proteina fluorescente, u otras proteinas o péptidos tales también se contemplan, siempre y cuando el efecto modulador deseado de la proteina de Raf este intacto. Para producir las mutaciones c-Raf deseadas en el ADNc, se utilizaron procedimientos de mutagénesis dirigidas al sitio estándar familiares para alguien con experiencia común en la técnica. También se diseñaron cebadores de PCR diseñados para incorporar las mutaciones deseadas con sitios de restricción para facilitar los pasos de clonación subsecuentes. Segmentos completos de secuencias de ácido nucleico que codifican Raf se sustraen de las construcciones de ácido nucleico a través de técnicas de amplificación de PCR con base en las secuencias de ADNc conocidas de pollo, humano y homólogos similares de Raf y la formación subsecuente de nuevas construcciones. Específicamente, la secuencia de Raf ADNc tipo silvestre mostrada en la FIGURA 7 se modificó en varias formas para construir mutantes de Raf para demostrar los principios de la presente invención. Estos mutantes se insertaron dentro del sistema de expresión de retrovirus descrito en la presente. Una primera Raf mutante, designada Raf K375M, se construyó en Raf humana tipo silvestre en la cual la lisina en la posición 375 de residuo de aminoácidos se sustituyó por una metionina. Raf K375M es una proteina Raf "inactiva" como define en la presente. Una segunda Raf mutante, designada Raf 306-648, se construyó en Raf humana tipo silvestre en la cual la porción terminal amino se sustrajo dejando los residuos 306-648 carboxi terminales truncados. La Raf 306-648 es una proteina Raf "activa" como se define en la presente. Una tercera mutante Raf, designada Raf 1-305, se construyó en Raf humana tipo silvestre en la cual la porción carboxi terminal se sustrajo, dejando los residuos 1-305 amino terminales truncados. La Raf 1-305 es una proteina Raf "inactiva" como se define en la presente. Los vectores de expresión alternativos para uso en la expresión de las proteinas Raf o Ras de la presente invención también incluyen vectores adenovirales como se describen en las Patentes Norteamericanas No. 4,797,368, No. 5,173,414, No. 5,436,146, No. 5,589,377, y No. 5,670,488. Los métodos alternativos para el suministro de las proteinas moduladoras Raf o Ras incluyen el suministro de la Raf o Ras ADNc con un sistema de vector no viral como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,675,954 y el suministro de ADNc en si mismo ADN desnudo como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,589,466. El suministro de construcciones de esta invención no se limita también a la aplicación local de un vector viral, preparaciones de vector viral también se inyectan intravenosamente para suministro sistémico dentro del lecho vascular, o pueden inyectarse subcutáneamente, intratejido, y similares. Estos vectores también son seleccionables para sitios de neovascularización aumentada por inyección localizada de un tumor, como un ejemplo. Las proteinas expresadas in vitro también se contemplan para suministro de las mismas después de expresión y purificación de la proteina Raf o Ras seleccionada por métodos útiles para el suministro de proteinas o polipéptidos. Un método tal incluye los sistemas de suministro de liposomas, tales como los descritos en las Patentes Norteamericanas No. 4,356,167, No. 5,580,575, No. 5,542,935 y No. 5,643,599. Otros sistemas de suministro de vectores y proteinas son bien conocidos por aquellos con experiencia común en la técnica para uso en la expresión y/o suministro de las proteinas Raf o Ras de la presente invención. 2. Modelo de Tumor Humano Para demostrar la eficiencia de la presente invención, se implantaron células tumorales humanas subcutáneamente en el flanco de ratones atimicos, y se dejaron crecer hasta aproximadamente 100 rom3. En este modelo de xenoinjerto, las células de endotelio de murino en el tejido que rodea al implante forman vasculatura que crece dentro del tumor humano que crece en respuesta a las señales angiogénicas normales, y el tumor se vasculariza. Asi, los microvasos se forman por células de endotelio de murino, mientras que el tejido de tumor en si mismo comprende células humanas. 3. El Vector de Suministro de Retrovirus Infecta Células de Linaje de Ratón, Células de Tumor no Humano El sistema de vector de expresión de retrovirus de Clonetech se usó para construir retrovirus ecotrófico que contiene las construcciones de Raf descritas en la presente. Para demostrar la especificidad de tejido del retrovirus infectante, una construcción de vector de expresión de retrovirus que expresa b-galactosidasa se empacó usando células de empaque ecotróficas como se describió en la leyenda de la FIGURA 1. Células de endotelio de ratón, ratón 3T3, células de adenocarcinoma LS174 de epitelio humano y células de melanoma M21 humano se cultivaron in vi tro, y se expusieron al retrovirus ecotróficamente empacados. Solamente las células de murino expresan b-galactosidasa detectable, indicando que solamente las células de murino se infectan por retrovirus ecotróficamente empacado en este sistema de expresión. 4. La Raf Cinasa Inactiva Desorganiza la actividad de Raf Cinasa In Vitro Para demostrar los efectos celulares de la Raf cinasa inactiva, se usó un modelo in vi tro usando células de endotelio de ratón inducidas por bFGF. La inducción normal de la actividad de Raf por administración de bFGF a células de endotelio de ratón se bloqueó cuando aquellas células se infectaron primero por una construcción retroviral que expresó la construcción de Raf K375M inactiva como se describió en la leyenda de la FIGURA 2. Los datos en la FIGURA 2 muestran que la cantidad de actividad de Raf cinasa se reduce sustancialmente cuando las células se infectan primero por el vector que expresa una Raf inactiva.

. La Raf Cinasa Inactiva Desorganiza la Angiogénesis In Vivo Usando un modelo subcutáneo de murino in vivo para angiogénesis, se estudiaron los efectos de Raf cinasa inactiva. Para ese fin, se indujo angiogénesis por inyección de células que expresan el retrovirus que produce la bFGF activa dentro o fuera de las células que expresan retrovirus que producen proteina cinasa Raf K375M inactiva como se describe en la leyenda de la FIGURA 3. Como se muestra en la FIGURA 3, la presencia de Raf cinasa inactiva sustancialmente reduce el índice angiogénico. 6. La Raf Cinasa Activa Induce la Angiogénesis In Vivo Usando un modelo subcutáneo de murino para angiogénesis, se estudiaron los efectos de Raf cinasa activa. Para ese fin, se indujo angiogénesis por inyección de células que expresan el retrovirus que produce la Raf 306-648 cinasa activa como se describe en la leyenda de la FIGURA 4. Como se muestra en la FIGURA 4, la Raf cinasa mutacionalmente activa induce la angiogénesis in vivo . 7. La Raf Cinasa Inactiva Induce Apoptosis Usando al modelo de xenoinjerto de ratón descrito anteriormente, se estudiaron los efectos in vivo de Raf inactiva. Para ese fin, el modelo se estableció como se describió en la leyenda de la FIGURA 5 por inyección de 1.5 millones de células de adenocarcinoma LS174 humano. Después del establecimiento de una masa de tumor de aproximadamente 100 mm3, se inyectó retrovirus que expresa la Raf K375M cinasa inactiva dentro de la masa del tumor, y se realizó inmunohistoquimica en secciones de la masa del tumor después de 48 horas. Los resultados mostrados en la FIGURA 5 (etiqueta de indicador) indican que la infección de retrovirus fue especifica de endotelio, y muestra adicionalmente por medio de la tinción vWF que las células de endotelio se co-localizan en la infección de retrovirus. La combinación de los datos de tinción muestra que las células del endotelio, la infección de virus y la ocurrencia de apoptosis todas se co-localizan, indicando que el suministro por virus de la proteina Raf inactiva es especifica del endotelio y que la Raf inactiva induce apoptosis. 8. La Raf Cinasa Inactiva Induce Regresión de Tumor Usando el modelo de xenoinjerto de ratón descrito anteriormente, se estudiaron los efectos in vi vo de Raf inactiva sobre la regresión de tumor. Para ese fin, el modelo se estableció como se describe en la leyenda en la FIGURA 6, y la Raf K375M cinasa inactiva se proporcionó como sobrenadante o células que expresan virus como se indica. El tumor establecido se vio regresar rápidamente durante la introducción de Raf cinasa inactiva. 9. La Angiogénesis es Dependiente de la Activación de la Trayectoria Ras-Raf-MEK-ERK Para determinar la interacción del receptor de factor de crecimiento y la ligación y activación del receptor de integrina en la activación de la cascada de proteina cinasa activada por mitógeno (MAPK) /cinasa regulada por señal extracelular (ERK) que está involucrada para modular la angiogénesis, se realizaron los siguientes estudios en los ejemplos 9-11. La activación de la cascada de MAPK por la adhesión celular mediada por integrina se ha investigado por un número de laboratorios como se revisó por Aplin et al., Pharmacol. Rev. 50:197-263 (1998). La cascada de ERK jerárquica se origina en la membrana celular con receptores para mitógenos y factores de crecimiento que recrudecen la pequeña guanosin trifosfato (GTPasa) Ras que activa después Raf, una proteina cinasa, enlazándose a Raf y recrudeciéndola a la membrana, en donde es activada por un mecanismo aún no determinado. La Raf activada se fosforila después y se activa MEK(MAPK/ERK cinasa). MEK, después, se fosforila y se activa ERK1 y ERK2 los cuales se translocan después al núcleo y se transactivan factores de transcripción para efectuar el crecimiento, diferenciación o mitosis a través de la expresión del gen alterada. (Véase, Tibbles et al., Cell Mol. Life Sci., 55:1230-1254 (1999) ) . La regulación hacia el extremo 5' de Ras en la activación de Ras que está mediada por el factor de crecimiento y/o señalamiento de integrina es el objeto de estudios presentes salvo que los mecanismos de señalamiento no están aún completamente entendidos. (Véase, Stewart et al., J. Biol. Chem., 275:8854-8862 (2000); Howe et al., J^ Biol. Chem., 273:27268-27274 (1998)). Sin embargo, y más notablemente, la activación de la cascada de Ras-Raf-MEK-ERK a través del señalamiento del receptor de membrana celular que resulta en la modulación de angiogénesis no se ha descrito antes de la presente invención. A. La Ras es Inducida por Exposición al bFGF Por lo tanto, para evaluar primero si la angiogénesis era dependiente de la trayectoria de Ras-Raf-MEK-ERK, se midió la actividad de Ras en lisados de membrana de pollo corioalantoico (CAM) expuestos a bFGF según se determinó por una prueba de abatimiento de Ras. La angiogénesis puede inducirse en la CAM después que la angiogénesis embriónica normal ha resultado en la formación de vasos sanguíneos maduros. La angiogénesis ha mostrado ser inducida en respuesta a citosinas especificas o fragmentos de tumor como se describió por Leibovich et al., Nature, 329:630 (1987) y Ausprunk et al., Am. J. Pathol. , 79:597 (1975). Las CAM se prepararon a partir de embriones de pollo para inducción subsecuente de angiogénesis e inhibición de la misma. Se obtuvieron embriones de pollo de diez dias de edad a partir de Mclntyre Poultry (Lakeside, CA) y se incubaron a 37°C con 60% de humedad. Se hizo un pequeño agujero a través de la cascara en el extremo del huevo directamente sobre el saco de aire con el uso de un pequeño taladro de oficio (Dremel, División of Emerson. Electric Co. Racine Wl) . Un segundo agujero se taladró en el lado amplio del huevo en una región desprovista de vasos sanguíneos embrionarios determinada previamente probando el huevo al trasluz. Se aplicó presión negativa al agujero original. Lo cual resultó en la separación de la CAM (membrana corioalantoica) de la membrana de la cascara y creando un saco de aire falso sobre la CAM. Se cortó una ventana de 1.0 centímetros (cm) x 1.0 cm cuadrados a través de la cascara sobre la CAM caida con el uso de un pequeño modelo de rueda de moler (Dremel) . La pequeña ventana permitió acceso directo a la CAM subyacente. La preparación de CAM resultante se usó después de los 10 dias de embriogénesis donde la angiogé?esis se habia calmado. La última preparación, de este - modo, se utilizó en esta invención para inducir angiogénesis renovada en respuesta al tratamiento de citosina o contacto de tumor, en donde era necesario, como se describe posteriormente. 1) Angiogénesis Inducida por Factores de Crecimiento La angiogénesis se ha mostrado que es inducida por citosinas o factores de crecimiento. La angiogénesis se indujo colocando un disco de filtro Whatman de 5 milímetros (mm) X 5 mm (papel filtro Whatman No. 1) saturado con Solución de Sal Equilibrada de Hanks (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) o HBSS que contiene factor de crecimiento de fibroblasto básico recombinante (bFGF) o factor de crecimiento de células del endotelio vascular (VEGF) (Genzyme, Cambrigde, MA) en la CAM de un embrión de polo de 9 ó 10 dias en una región desprovista de vasos sanguíneos y las ventanas se sellaron después con cinta. Otros factores de crecimiento también son efectivos para inducir crecimiento de vasos sanguíneos. Para pruebas en donde la inhibición de angiogénesis se evalúa con inyecciones intravenosas de antagonistas, tales como el anticuerpo monoclonal LM609, la angiogénesis se induce primero con bFGF o VEGF en un medio de crecimiento de fibroblasto, y se administran en inhibidores después como se describió en el Ejemplo 10. La angiogénesis se observó por fotomicroscopia después de 72 horas. Las CAM de embriones de pollo de 10 dias de edad se estimularon localmente con discos de papel filtro saturados con PBS o 30 nanogramos (ng) de bFGF. Después de 5 minutos, el tejido de CAM se resecó, se homogenizó en regulador de lisis, y la actividad de Ras se determinó después por su capacidad para precipitarse por un péptido de fusión GST que codifica el dominio de enlace Ras de Raf. Debido a que solamente la Ras activa enlaza Raf se generó una proteina recombinante que consiste del dominio que enlaza Ras de Raf a glutation-S-transferasa (GST) . A su vez GST se conjugó con lechos de sefarosa que permiten la precipitación de Ras activa a partir de un lisado de tejido. Los resultados se muestran en la FIGURA 9 en donde la actividad de Ras se elevó en lisados de CAM expuestos a bFGF como se determina por una prueba de abatimiento Ras. Asi, Ras es inducida con exposición a bFGF en la CAM. El papel de Ras en la formación de vasos sanguíneos angiogénicos en la CAM se evaluó adicionalmente como se describió en el Ejemplo 10.

B . Ras es Necesaria para Angiogénesis Para determinar después si la angiogénesis era dependiente de la activación de Ras en la preparación CAM, la CAM se expuso a preparaciones retrovirales de RCAS para expresión de un mutante Ras negativo dominante, S17N Ras, en combinación con activación por bFGF de Ras como se describe posteriormente. Este mutante ha mostrado enlazarse a GDP con afinidad preferencial sobre GTP, proporcionando con eso la mutante para inhibir la activación de Ras endógeno secuestrando las Ras-GEF. Asi, el uso de la mutante en el modelo de angiogénesis de CAM proporciona un método para evaluar el papel de Ras en angiogénesis. La mutante de Ras S17N se crea a partir de la secuencia de Ras humana tipo silvestre (wt-H-Ras) por procedimientos de mutagénesis dirigida al sitio estándar como se describió previamente sustituyendo el triplete que codifica por un residuo de serina (S) en la posición 17 con un codón para codificar una aspargina (N) . Tales mutantes se han descrito por otros, por ejemplo, por Stewart et al., J. Biol. Chem., 275:8854-8862 (2000). Para preparar la construcción retroviral de la construcción de expresión negativa dominante, tal mutagénesis se realizó sobre la wt H-Ras, en donde la secuencia de ácido nucleico que la codifica se muestra en la FIGURA 10 (SEC DE IDENT NO.: 3). La FIGURA 11 (SEC DE IDENT NO.: 4) representa la secuencia de residuos de aminoácido codificados por la secuencia de nucleótidos de ADNc de la Ras humana tipo silvestre (wt H-Ras) mostrada en la FIGURA 10. Para producir las mutaciones deseadas en la wt H-Ras ADNc para hacer S17N Ras asi como aquellos descritos posteriormente, procedimientos de mutagénesis dirigido al sitio estándar familiares para alguien con experiencia común en la técnica se utilizaron. Los cebadores de PCR diseñados para incorporar las mutaciones deseadas también se diseñaron con sitios de restricción para facilitar los pasos de clonación subsecuente. Segmentos completos de secuencias de ácido nucleico que codifican Ras pueden sustraerse de las construcciones de ácido nucleico a través de técnicas de amplificación de PCR con base en las secuencias de ADNc conocidas de pollo, humano y los homólogos similares de Ras y la formación subsecuente de nuevas construcciones. Todas las construcciones mutantes construidas por PCR también se secuenciaron por PCR para confirmar la secuencia de ADN predicha de clones. La secuencia Ras mutada resultante se preparó después como una construcción de vector de expresión retroviral como se describió en la presente. Una construcción de expresión preferida por uso en la presente invención es la construcción RCAS (A) . Este vector de expresión se basa en una serie de virus de sarcoma avícola de replicación competente con una polimerasa Bryan mejorada (BP) para titulo mejorado, y es especifica para la glicoproteina de envoltura tipo A expresada en células avícolas normales (Revisado en Methods in Cell Biology, 52:179-214 (1997); véase también, Hughes et al., J. Virol. 61:3004-3012 (1987); Fekete & Cepko, Mol. Cellular Bioi. 13:2604-2613 (1993); Itoh et al., Development 122:291-300 (1996); y Scott et al., BioTechniques 24:660-666 (1998)). La secuencia completa de RCAS (A) , referida en la presente como RCAS, es conocida por alguien con experiencia común en la técnica y disponible en bases de datos. Cinco microgramos (ug) de construcciones de RCAS preparadas se transfectaron después dentro de la linea de fibroblasto inmortalizada de polvo, DF-1 (regalo de Doug Foster, U., de Minn.). Esta linea celular asi como los fibroblastos de embrión de pollo primarios fueron capaces de producir virus, sin embargo la linea celular DF-1 produjo títulos altos. Los sobrenadantes virales se recolectaron a partir de lineas celulares productoras de DF-1 subconfluentes en medios de CLM libres de suero [composición: medios base F-10 suplementados con DMSO, ácido fólico, ácido glutámico, y solución de vitaminas MEM] . Treinta y cinco ml de sobrenadante viral se concentraron por ultra centrifugación a 4°C durante 2 horas a 22,000 rpm. Estos granulos virales concentrados se resuspendieron en 1/100 del volumen original en medios de CLM y libres de suero, se tomaron alícuotas y se almacenaron a -80°C. El titulo se valoró por dilución en serie de un vector viral control que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica proteina fluorescente verde (GFP) , referida como RCAS-GFP, infección sobre fibroblastos de embrión de pollo primarios que se incubaron durante 48-72 horas. Los títulos de patrón viral que se obtuvieron después de la concentración excedieron habitualmente 108I.u./l ml. Para la prueba de CAM usando los patrones virales, se prepararon discos de papel filtro Whatman remojados en acetato de cortisona de 6 mm de diámetro en 3 mg/ml de acetato de cortisona durante 30 minutos en etanol al 95%. Los discos se secaron en una campana de flujo laminar y se remojaron después en 20 µl de patrón viral por disco durante 10 minutos. Estos discos se aplicaron a la CAM de unos embriones de pollo de 10 dias y se sellaron con cinta de celofán y se incubaron a 37°C durante 18-24 horas. Después se agregó PBS de imitación o factores de crecimiento a una concentración de 5 µg/ml a la CAM en un volumen de 15 microlitros (ul) del patrón de virus apropiado como un empuje adicional de virus al tejido de CAM. Después de 72 horas, las CAM se recolectaron y examinaron por cambios en el Índice angiogénico como se determina por conteo de doble ciego del número de puntos de ramificación en la CAM subyacente al disco. Para pruebas de cinasa, el tejido subyacente al disco se cosechó en RIPA, se homogenizó con un molino motorizado y se determinó Raf como se describió previamente en el Ejemplo 4. Para estudios de inmunofluorescencia, el tejido de CAM subyacente a los discos se congeló en OCT, un crio conservador, se seccionó a 4 um, se fijó en acetona durante 1 minuto, se incubó en 3% de suero de cabra normal durante 1 hora, seguido por una incubación en anticuerpo de conejo primario como se describió previamente (Eliceiri et al., J. Cell Biol., 140:1255-1263 (1998), se lavó en PBS y se detectó con anticuerpo secundario fluorescente. Los resultados, mostrados en la FIGURA 12, revelan gráficamente que la infección Ras nula mutante, S17N, bloqueó a la angiogénesis inducida por factor de crecimiento en la CAM, pero no tuvo efecto en las CAM que no se expusieron a bFGF para inducir angiogénesis. Por lo tanto, es necesaria para la angiogénesis inducida por bFGF.

C. El Señalamiento de Ras a través de la Trayectoria Raf-MEK-ERK es un Regulador Crucial de Angiogénesis Para valorar adicionalmente el papel de Ras en la trayectoria Raf-MEK-ERK para modular la angiogénesis, se usaron proteinas mutantés H-Ras adicionales en la preparación de CAM como se describió anteriormente, los resultados de lo cual se muestran posteriormente y en la FIGURA 13. En este contexto, la presente invención describe dos categorías de función de Ras que pueden modular la angiogénesis. Como se discutió previamente para las proteínas Raf, una categoría contiene moléculas Ras que aumentan la angiogénesis, y, asi, se considera que son proteinas activas. En la presente invención se muestra Ras tipo silvestre junto con diversas mutaciones que inducen angiogénesis . Una mutación preferida de H-Ras tipo silvestre que funciona en este contexto con respecto a su habilidad para inducir el crecimiento de vasos sanguíneos y por lo tanto aumentar el peso de tumor in vivo es la Ras G12V, también referida como V12, mutante que tiene una mutación de punto en la posición 12 de residuo de aminoácido (aa) que cambia glicina (G) en valina (V) . Este mutante Ras está activo constitutivamente. Otra proteina mutante H-Ras que se describe para la presente invención como un activador de angiogénesis constitutivo es Ras V12S35, en donde la glicina en la posición 12 se cambió en valina (V) y la trionina (T) en la posición 35 se cambió a una serina (S) resultando ambas mutaciones en Ras V12S35. Esta proteina H-Ras mutada ha mostrado activar solamente selectivamente la trayectoria Raf-MEK-ERK como se muestra en la FIGURA 13A. Un regulador negativo H-Ras de angiogénesis es la mutante Ras V12C40, en donde la glicina en la posición 12 se cambió en valina (V) como en Ras V12S35 pero la otra mutación estuvo en la posición 40 en donde un residuo de tirosina (Y) se cambió en una cisteina (C) , resultando, asi, ambas mutaciones en Ras V12C40. Se conoce que esta mutante H-Ras activa selectivamente la trayectoria de Pl-3 cinasa (P13K como se muestra en la FIGURA 13A) que activa Akt y Rae. Asi, Ras V12C40 no funciona en la trayectoria Raf-MEK-ERK y no estimula la angiogénesis sino más bien la inhibirla. Las proteinas que tienen mutación que confieren actividad inhibitoria en la angiogénesis también se refieren como proteinas Ras negativas dominantes porque inhiben la neovascularización, incluyendo la que resulta de la actividad endógena de Ras asi como también la que resulta de la actividad Ras mejorada de la estimulación del factor de crecimiento. Asi, algunas mutaciones de H-Ras tipo silvestre de la presente invención pueden funcionar como una negativa dominante con respecto a su habilidad para evitar el crecimiento de vasos sanguíneos, y por ejemplo, disminuir por lo tanto el peso de tumor in vi vo . Las tres construcciones de H-Ras y las proteinas mutantes se han descrito previamente por Joneson et al., Science, 271:810-812 (1996) . Con respecto a la mutación de punto, cualquier mutación que resulta en la actividad inhibitoria o estimuladora deseada se contempla para uso en esta invención. Las construcciones de proteina de fusión que combinan la Ras deseada (o proteina Raf como se muestra en los ejemplos posteriores) (mutación o fragmento de la misma) con etiquetas de aminoácidos expresadas, epitopes antigénicos, proteinas fluorescentes, u otras de tales proteinas o péptidos también se contemplan, siempre y cuando el efecto modulador deseado de la proteina Ras esté intacto. Para evaluar los papeles de las proteinas mutantes Ras adicionales para sellar la activación de la trayectoria de angiogénesis, se prepararon construcciones de expresión retroviral respectivas como se describió anteriormente. Quince ul de virus RCAS (A) de alto titulo que codifica la construcción Ras que activa Raf-MEK-ERK, Ras V12S35, o la construcción Ras que activa PI3 cinasa, Ras V12C40, se aplicaron localmente a discos de papel filtro en una preparación de CAM de 10 dias de edad y los resultados se valoraron como se describió anteriormente para el efecto de las proteinas Ras mutantes sobre la angiogénesis con respecto a la activación selectiva de las trayectorias de señalamiento. Las FIGURAS 13A y 13B ilustran esquemática, gráfica, y respectivamente que la infección con una construcción Ras mutante, Ras V12S35, que activa selectivamente la trayectoria Ras-Raf-MEK-ERK indujo angiogénesis, mientras que una construcción mutante, Ras V12C40, que no activa selectivamente la trayectoria PI3K. Asi, estos resultados confirman que la proteina Ras V12S35 es un estimulador de angiogénesis y que la activación mediada por Ras de la angiogénesis ocurre a través de la activación de la trayectoria de Raf-MEK-ERK y no por medio de la trayectoria P13K utilizada por la mutante H-Ras V12C40.

D. El Componente MEK de la Trayectoria MEK-ERK se Requiere para la Angiogénesis Inducida por Ras de Raf o Independiente de Ras Para valorar adicionalmente los papeles separados de Ras y Raf en la trayectoria Raf-MEK-ERK para modular la angiogénesis, una proteina mutante Raf, referida como Raf-caax, que se selecciona para la membrana plásmica que se conoce es constitutivamente y enzimáticamente activa en la ausencia de enlace de Ras se usó en las preparaciones de CAM como se describe en la presente junto con un inhibidor conocido de activación de MEK, PD98059. La FIGURA 14 representa la secuencia de nucleótidos que codifica la proteina fusionada Raf-caax, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica el término carboxi de Raf humana (wt H-Raf) se fusiona con una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de residuos de 20 aminoácidos del dominio de localización de la membrana K-ras (SEC DE IDENT NO.: 6). La FIGURA 15 (SEC DE IDENT NO.: 7) representa la secuencia de residuos de aminoácido de Raf-caax, la proteina fusionada generada a partir de la secuencia de nucleótidos de fusión mostrado en la FIGURA 14. La proteina fusionada se ha descrito por Leevers et al., Nature 369:411-414 (1994) y Stokoe et al., Science, 264: 1463-1467 (1994) . Para valorar la angiogénesis inducida por Ras independiente de Raf junto con la angiogénesis inducida por Raf, el inhibidor MEK PD98059, se usó en preparaciones de CAM como se describió anteriormente. El virus que codifica la construcción de Ras de activación, Ras V12 (Ras G12V) , preparada como se describió en el Ejemplo 9C y la construcción Raf de activación, Raf-caax, se aplicaron localmente a discos de papel filtro como se describe en el Ejemplo 9B . Después de 24 horas, un (1) nanomol del inhibidor MEK, PD98059, se agregó al disco. Las CAM se evaluaron después como se describe en el Ejemplo 9B y en la FIGURA 12. Los datos graficados son la media ± SE de 20 embriones. Las FIGURAS 16A-16E y FIGURA 16F, ilustran respectiva, pictórica y gráficamente que el inhibidor MEK, PD89059, bloqueo la angiogénesis (FIGURAS 16C y 16E) inducida por Ras activa mutante (FIGURA 16B) o Raf (FIGURA 16D) . Asi, Ras y Raf inducen angiogénesis a través de la trayectoria de MEK-ERK. Los datos graficados representan gráficamente los resultados de las fotografías de las CAM tratadas individuales.

. La Angiogénesis Inducida por Raf, pero no Ras, es Refractaria a la Inhibición por Bloqueo de Integrina Para determinar como el señalamiento de integrina activa la trayectoria Ras-Raf-MEK-ERK que resulta en angiogénesis, las pruebas de CAM con construcciones de Ras y Raf activas mutantes se realizaron en la presencia de anticuerpos que bloquean avß3 integrina. Las CAM de embriones de pollo de 10 dias de edad se estimularon como se describe en las FIGURAS 9 y 12 con discos de papel filtro saturados con PBS (control) , bFGF, las construcciones retrovirales RCAS (A) G12V-Ras o Raf-caax. LM609, un anticuerpo monoclonal para integrina ayß3 se suministró intravenosamente después de 24 horas y la angiogénesis se valoró por análisis de punto de ramificación de base después de 72 horas. Las CAM representativas se muestran en el inserto. Los datos son la media ± SE de embriones. Las FIGURAS 17A-17F y FIGURA 17G, ilustran respectiva, pictórica y gráficamente que la angiogénesis inducida por Raf pero no Ras, fue refractaria a la inhibición por bloqueo de integrina. La infección con construcciones de Ras y Raf activas mutantes inducen angiogénesis pronunciada como se muestra respectivamente en las FIGURAS 17B y 17C, pero solamente la angiogénesis inducida por Ras se inhibió por anticuerpos que bloquean a„ß3 integrina como se muestra en la FIGURA 17E. Puesto que la construcción Raf usada en la prueba es independiente de Ras, la carencia de inhibición de integrina de angiogénesis inducida por Ras indica que el señalamiento de integrina ocurre en o antes de la activación mediada por Ras de Raf. Los datos graficados representan gráficamente los resultados de las fotografías de las CAM tratadas individuales . 11. Regulación de la Trayectoria Ras-Raf-MEK-ERK por Cinasa de Adhesión Focal Para determinar el papel de la activación del receptor de factor de crecimiento de la trayectoria de angiogénesis Ras-Raf-MEK-ERK, se realizaron pruebas de angiogénesis CAM como se describió anteriormente con proteinas expresadas Ras V12 o Raf-caax en la presencia de una cinasa de adhesión focal nula mutante, referida como FRNK, la cual es una cinasa de adhesión focal inactiva. Los virus RCAS (A) que codifican Ras V12 o Raf-caax, preparados como se describió anteriormente, se aplicaron localmente como se describe en el Ejemplo 9B (FIGURA 12) junto con virus RCAS (B) que codifica cinasa nula relacionada a FAK (FRNK) para el disco de papel filtro de CAM. Los datos son la media ± Se de 20 embriones. Los resultados se muestran en las FIGURAS 18A-18D y 18E. Las FIGURAS 18A-18D ilustran en perspectiva que la co-infección de las CAM con una cinasa de adhesión focal nula mutante FRNK, bloqueó la angiogénesis inducida por Ras pero no Raf, como se indica por una insuficiencia de vasos sanguíneos en la FIGURA 18B en comparación a Ras no tratada (FIGURA 18A) , Raf no tratada (FIGURA 18C) y Raf tratada con FRNK (FIGURA 18D) . Los datos graficados gráficamente representan los resultados de las fotografías de las CAM tratadas individuales.

Los datos en la prueba de CAM se confirmaron en el modelo de angiogénesis subcutáneo de murino, preparado como se describió anteriormente. La angiogénesis se indujo inyectando 250 ul de matrigel reducido con factor de crecimiento, enfriado hasta hielo que contiene 400 ng/ml de bFGF o células de empaque que expresan retrovirus Moloney que expresan en el gen descrito subcutáneamente en el flanco de ratón. Se agregó retrovirus FRNK al matrigel como virus de alto titulo empacado con la proteina de recubrimiento vsv.g. Cinco dias después, se inyectó lectina B5 de Bandeiriea Simplifica conjugada con FITC especifica de endotelio por medio de la vena de la cola y se dejó circular. La angiogénesis se cuantificó después retirando, extrayendo, y probando el tejido angiogénico por contenido fluorescente. Las FIGURAS 19A y 19B-19G, respectiva, gráfica y pictóricamente, ilustran que FRNK bloqueó bFGF y angiogénesis inducida por Ras, pero no por Raf en un modelo de angiogénesis subcutánea de murino. Para verificar el nivel en el cual ocurre la activación de cinasa en la trayectoria de Ras-Raf-MEK-ERK, las CAMS se co-infectaron con un retrovirus que expresa FRNK, la cinasa de adhesión focal nula mutante, con ras G12V o Raf-caax. Las CAM se trataron como se describen en la FIGURA 18 con la excepción de que después de 24 horas el tejido angiogénico se resecó, se solubilizó, se inmunoprecipitó con Raf y se valoró la actividad Raf por su capacidad para fosforilar MEK inerte por cinasa. Las FIGURAS 20A y 20B ilustran que la co-infección de las CAM con una cinasa de adhesión focal nula mutante, FRNK, bloqueó a la activación inducida por Ras de Raf. La FIGURA 20A muestra el inmunoprecipitado activo versus las proteinas Raf totales probadas bajo cada una de las combinaciones arriba de los resultados. La FIGURA 20B gráfica gráficamente los resultados de la determinación Raf activa bajo esas condiciones. Asi, FRNK no inhibe directamente la actividad de Raf sino más bien inhibe la activación de Raf por Ras. 12. Discusión Los estudios anteriores indican que la Raf cinasa es necesario y suficiente para la angiogénesis in vi vo . Adicionalmente, la selección de Raf cinasa mutacionalmente inactiva para crecer vasos sanguíneos induce apóptosis de endotelio local. La misma selección también suprime la angiogénesis que resulte en la supresión y aún la regresión de tumores humanos preexistentes. El suministro retroviral de un gen que codifica formas mutacionalmente inactivas de Raf cinasa (Raf K375M) demostró un impacto sustancial en la angiogénesis de tumor in vi vo . Importantemente, el vector retraído ha usado infecta específicamente las células de proliferación de linaje de murino. Por lo tanto, solamente el compartimiento vascular de xenoinjertos de tumor humano se infectó (FIGURAS 1 y 4) . El suministro de Raf K375M cinasa inactiva se encontró que suprime la actividad de cinasa Raf inducida por factor de crecimiento in vi tro y bloqueó al angiogénesis inducida por factor de crecimiento in vi vo (FIGURAS 2 y 3) . En contraste, el suministro retroviral de una forma mutacionalmente activa de Raf cinasa (Rad 306-648) fue suficiente para inducir la angiogénesis in vivo (FIGURA 4) . Además, el suministro de virus que expresa Raf cinasa inactiva al tumor en ratones se encontró que induce apoptosis en una forma especifica de endotelio (FIGURA 5) . Finalmente, los animales inoculados con tumores humanos y tratados después con el virus que expresa Raf inactivo experimentaron una regresión de tumor la cual se mantuvo a través del curso del tiempo del experimento (FIGURA 6) . Por lo tanto, Raf cinasa es suficiente y necesaria para la angiogénesis y seleccionar esta cinasa puede suprimir la angiogénis y obviar la enfermedad dependiente de angiogénesis . Como un resultado de las pruebas de angiogénesis anteriores en ratón y en pollo como se describe en los Ejemplos 9-11, representados en las FIGURAS 9, 12, 13 y 16-20, la presente invención proporciona proteinas activadoras de angiogénesis en Raf-caax, Ras G12V Ras, y Ras V12S35, y proteinas inhibidoras de angiogénesis en Ras S17N y Ras V12C40. Además, los estudios proporcionan la base para entender la activación mediada por Ras de Raf en la trayectoria de Ras-Raf-MEK-ERK identificando que la Ras es necesaria para la activación de Ras pero el señalamiento mediado por integrina interacciona en o antes de la activación de Raf pero no hacia el extremo 3' de la misma. Mientras que la especificación escrita anterior es suficiente para permitir a un experto en la técnica practicar la invención, diversas modificaciones de la invención además de aquellas mostradas y descritas en la presente se volverán aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y que cae dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

LISTA DE SECUENCIA < 110> THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE HOOD, John ELICEIRI , Brian CHERESH, David < 120> MÉTODOS Y COMPOSICIONES ÚTILES PARA MODULACIÓN DE ANGIOGENESIS USANDO PROTEINA CINASA RAF Y RAS <130> TSRI 710. 2 <140> <141> <150> US 60/148,924 <151> 1999-08-13 <150> US 60/215,951 <151> 2000-07-05 <160> 7 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 2977 <212> DN? <213> Ho o aapienß <220> <221> CDS <222> (130).. (2073) <400> 1 ccgaatgtga ccgcctcccg ctccctcacc cgccgcgggg aggaggagcg ggcgagaagc 60 tgccgccgaa cgacaggacg ttggggcggc ctggctccct caggtttaag aattgtttaa 120 gctgcatca atg gag cae ata cag gga gct tgg aag aeg ate age aat ggt 171 Met Glu Hiß He Gln Gly Ala Trp Lya Thr He Ser Aßn Gly 1 5 10 ttt gga ttc aaa gat gcc gtg ttt gat ggc tcc age tgc ate tet cct 219 Phe Gly Phe Lys Aßp Ala Val Phe Asp Gly Ser Ser Cyß He Ser Pro 15 20 25 30 acá ata gtt cag cag ttt ggc tat cag cgc cgg gca tea gat gat ggc 267 Thr He Val Gln Gln Phe Gly Tyr Gln Arg Arg Ala Ser Aap Aap Gly 3S 40 45 aaa etc acá gat cct tet aag acá age aac act ate cgt gtt ttc ttg 315 Lys Leu Thr Asp Pro Ser Lys Thr Ser Asn Thr He Arg Val Phe Leu 50 55 60 ceg aac aag ca aga acá gtg gtc aat gtg cga aat gga atg age ttg 363 Pro Asn Lys Gln Arg Thr Val Val Asn Val Arg Asn Gly Met Ser Leu 65 70 75 cat gac tgc ctt atg aaa gca etc aag gtg agg ggc ctg caá cea gag 411 His Aßp Cys Leu Met Lys Ala Leu Lys Val Arg Gly Leu Gln Pro Glu 80 85 90 tgc tgt gca gtg ttc aga ctt etc cae gaa cae aaa ggt aaa aaa gca 459 Cys Cys Ala Val Phe Arg Leu Leu His Glu Hiß Lys Gly Lyß Lyß Ala 95 100 105 110 cgc tta gat tgg aat act gat gct gcg tet ttg att gga gaa gaa ctt 507 Arg Leu Aßp Trp Aßn Thr Aßp Ala Ala Ser Leu He Gly Glu Glu Leu 115 120 125 caá gta gat ttc ctg gat cat gtt ecc etc acá acá cae aac ttt gct 555 Gln Val Asp Phe Leu Asp His Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Ala 130 135 140 cgg aag aeg ttc ctg aag ctt gcc ttc tgt gac ate tgt cag aaa ttc 603 Arg Lys Thr Phe Leu Lys Leu Ala Phe Cys Asp He Cys Gln Lys Phe 145 150 155 ctg etc aat gga ttt cga tgt cag act tgt ggc tac aaa ttt cat gag 651 Leu Leu Asn Gly Phe Arg Cys Gln Thr Cys Gly Tyr Lys Phe His Glu 160 165 170 cae tgt age acc aaa gta cct act atg tgt gtg gac tgg agt aac ate 699 His Cys Ser Thr Lys Val Pro Thr Met Cys Val Asp Trp Ser Asn He 175 180 185 190 aga caá etc tta ttg ttt cea aat tcc act att ggt gat agt gga gtc 747 Arg Gln Leu Leu Leu Phe Pro Asn Ser Thr He Gly Asp Ser Gly Val 195 200 205 cea gca cta cct tet ttg act atg cgt cgt atg cga gag tet gtt tcc 795 Pro Ala Leu Pro Ser Leu Thr Met Arg Arg Met Arg Glu Ser Val Ser 210 215 220 agg atg cct gtt agt tet cag cae aga tat tet acá cct cae gcc ttc 843 Arg Met Pro Val Ser Ser Gln His Arg Tyr Ser Thr Pro His Ala Phe 225 230 235 acc ttt aac acc tcc agt ecc tea tet gaa ggt tcc etc tcc cag agg 891 Thr Phe Aan Thr Ser Ser Pro Ser Ser Glu Gly Ser Leu Ser Gln Arg 240 245 250 cag agg tcg acá tcc acá cct aat gtc cae atg gtc age acc aeg ctg 939 Gln Arg Ser Thr Ser Thr Pro Asn Val His Met Val Ser Thr Thr Leu 255 260 265 270 cct gtg gae age agg atg att gag gat gca att cga agt cae age gaa 987 Pro Val Aßp Ser Arg Met He Glu Asp Ala He Arg Ser His Ser Glu 275 280 285 tea gcc tea cct tea gcc ctg tcc agt age ecc aac aat ctg age cea 1035 Ser Ala Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ser Ser Pro Aßn Asn Leu Ser Pro 290 295 300 acá ggc tgg tea cag ceg aaa acc ecc gtg cea gca caá aga gag cgg 1083 Thr Gly Trp Ser Gln Pro Lys Thr Pro Val Pro Ala Gln Arg Glu Arg 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acagttatct 2933 gatggtccct caattatgtt attttaataa aataaattaa attt 2977 <210> 2 <211> 648 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Glu Hia He Gln Gly Ala Trp Lyß Thr He Ser Asn Gly Phe Gly 1 5 10 15 Phe Lys Aßp Ala Val Phe Asp Gly Ser Ser Cyß He Ser Pro Thr He 20 25 30 Val G n Gln Phe Gly Tyr G n Arg Arg Ala Ser Aßp Asp Gly Lys Leu 35 40 45 Thr Aßp Pro Ser Lyß Thr Ser Aßn Thr He Arg Val Phe Leu Pro Asn 50 55 60 Lyß Gln Arg Thr Val Val Asn Val Arg Aßn Gly Met Ser Leu Hiß Asp 65 70 75 80 IO: Cys Leu Met Lys Ala Leu Lys Val Arg Gly Leu Gln Pro Glu Cys Cys 85 90 95 Ala Val Phe Arg Leu Leu His Glu Hia Lyß Gly Lyß Lys Ala Arg Leu 100 105 110 Asp Trp Asn Thr Asp Ala Ala Ser Leu He Gly Glu Glu Leu Gln Val 115 120 125 Aßp Phe Leu Asp Hiß Val Pro Leu Thr Thr His Asn Phe Ala Arg Lys 130 135 140 Thr Phe Leu Lys Leu Ala Phe Cya Aßp He Cys Gln Lyß Phe Leu Leu 145 150 155 160 Aßn Gly Phe Arg Cys Gln Thr Cys Gly Tyr Lyß Phe Hiß Glu His Cys 165 170 175 Ser Thr Lyß Val Pro Thr Met Cys Val Asp Trp Ser Asn He Arg Gln 180 185 190 Leu Leu Leu Phe Pro Asn Ser Thr He Gly Asp Ser Gly Val Pro Ala 195 200 205 Leu Pro Ser Leu Thr Met Arg Arg Met Arg Glu Ser Val Ser Arg Met 210 215 220 Pro Val Ser Ser Gln His Arg Tyr Ser Thr Pro Hiß Ala Phe Thr Phe 225 230 235 240 Aan Thr Ser Ser Pro Ser Ser Glu Gly Ser Leu Ser Gln Arg Gln Arg 245 250 255 Ser Thr Ser Thr Pro Aßn Val His Met Val Ser Thr Thr Leu Pro Val 260 265 270 Aßp Ser Arg Met He Glu Asp Ala He Arg Ser His Ser Glu Ser Ala 275 280 285 Ser Pro Ser Ala Leu Ser Ser Ser Pro Aan Asn Leu Ser Pro Thr Gly 290 295 300 Trp Ser Gln Pro Lys Thr Pro Val Pro Ala Gln Arg Glu Arg Ala Pro 305 310 315 320 Val Ser Gly Thr Gln Glu Lys Asn Lys He Arg Pro Arg Gly Gln Arg 325 330 335 Aßp Ser Ser Tyr Tyr Trp Glu He Glu Ala Ser Glu Val Met Leu Ser 340 345 350 Thr Arg He Gly Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Lys Trp 35S 360 365 Hiß Gly Asp Val Ala Val Lys He Leu Lyß Val Val Aßp Pro Thr Pro 370 375 380 Glu Gln Phe Gln Ala Phe Arg Asn Glu Val Ala Val Leu Arg Lys Thr 385 390 395 40Q Arg Hiß Val Aßn He Leu Leu Phe Met Gly Tyr Met Thr Lya Aßp Asn 405 410 415 - Leu Ala He Val Thr Gln Trp Cys Glu Gly Ser Ser Leu Tyr Lys His 420 425 430 Leu His Val Gln Glu Thr Lys Phe G n Met Phe Gln Leu He Asp lie 435 440 445 Ala Arg Gln Thr Ala Gln Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lyß Aßn He 450 455 460 He His Arg Asp Met Lyß Ser Aßn Aßn He Phe Leu Hiß Glu Gly Leu 465 470 ' 475 480 Thr Val Lyß He Gly Asp Phe Gly Leu Ala Thr Val Lyß Ser Arg Trp 485 490 495 Ser Gly Ser Gln Gln Val Glu Gln Pro Thr Gly Ser Val Leu Trp Met 500 505 510 Ala Pro Glu Val He Arg Met Gln Aßp Aßn Aßn Pro Phe Ser Phe Gln 515 520 525 Ser Aßp Val Tyr Ser Tyr Gly He Val Leu Tyr Glu Leu Met Thr Gly 530 535 540 Glu Leu Pro Tyr Ser Hiß He Asn Asn Arg Aßp Gln He He Phe Met 545 550 555 560 Val Gly Arg Gly Tyr Ala Ser Pro Aßp Leu Ser Lyß Leu Tyr Lyß Aßn 565 570 575 Cys Pro Lyß Ala Met Lyß Arg Leu Val Ala Aßp Cys Val Lyß Lys Val 580 585 590 Lys Glu Glu Arg Pro Leu Phe Pro G n He Leu Ser Ser He Glu Leu 595 600 605 Leu Gln Hiß Ser Leu Pro Lyß He Aßn Arg Ser Ala Ser Glu Pro Ser 610 615 620 Leu His Arg Ala Ala His Thr Glu Asp He Aßn Ala Cys Thr Leu Thr 625 630 635 640 Thr Ser Pro Arg Leu Pro Val Phe 645 <210> 3 <211> 570 <212> DNA <213> Homo sapiens . . <220> <221> CDS <222> (1) .. (567) <400> 3 atg aeg gaa tat aag ctg gtg gtg gtg ggc gcc ggc ggt gtg ggc aag 48 Met Thr Glu Tyr Lyß Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 agt gcg ctg acc ate cag ctg ate cag aac cat ttt gtg gac gaa tac 96 Ser Ala Leu Thr He Gln Leu He Gln Asn Hia Phe Val Asp Glu Tyr 20 25 30 gac ecc act ata gag gat tcc tac cgg aag cag gtg gtc att gat ggg 144 Asp Pro Thr He Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val He Asp Gly 35 40 45 gag aeg tgc ctg ttg gac ate ctg gat acc gcc ggc cag gag gag tac 192 Glu Thr Cyß Leu Leu Aßp He Leu ?ßp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 age gcc atg cgg gac cag tac atg cgc acc ggg gag ggc ttc ctg tgt 240 Ser Ala Met ?rg Aßp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys 65 70 75 80 gtg ttt gcc ate aac aac acc aag tet ttt gag gac ate cae cag tac 288 Val Phe Ala He Aßn Aßn Thr Lys Ser Phe Glu Asp He Hiß Gln Tyr 85 90 95 agg gag cag ate aaa cgg gtg aag gac tcg gat gac gtg ecc atg gtg 336 Arg Glu Gln He Lyß Arg Val Lyß Aßp Ser Aßp Aßp Val Pro Met Val 100 105 110 ctg gtg ggg aac aag tgt gac ctg gct gca cgc act gtg gaa tet cgg 384 Leu Val Gly Asn Lya Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg 115 120 125 cag gct cag gac etc gcc cga age tac ggc ate ecc tac ate gag acc 432 Gln Ala Gln Aßp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly He Pro Tyr He Glu Thr 130 135 140 tcg gcc aag acc cgg cag gga gtg gag gat gcc ttc tac aeg ttg gtg 480 Ser Ala Lyß Thr Arg Gln Gly Val Glu Aßp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 cgt gag ate cgg cag cae aag ctg cgg aag ctg aac cct cct gat gag 528 Arg Glu He Arg Gln His Lyß Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Asp Glu 165 170 175 agt ggc ecc ggc tgc atg age tgc aag tgt gtg etc tcc tga 570 Ser Gly Pro Gly Cyß Met Ser Cys Lyß Cys Val Leu Ser 180 185 <210> 4 <211> 189 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys 1 5 10 15 Ser Ala Leu Thr He Gln Leu He G n Asn His Phe Val Aßp Glu Tyr 20 25 30 Aßp Pro Thr He Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val He Aap Gly 35 40 45 Glu Thr Cys Leu Leu Aßp He Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr 50 55 60 Ser Ala Met Arg Aap Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cyß 65 70 75 80 Val Phe Ala He Aßn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Aßp He Hiß Gln Tyr 85 90 95 Arg Glu Gln He Lys Arg Val Lys Aßp Ser Aßp Aßp Val Pro Met Val 100 105 110 Leu Val Gly Aßn Lys Cys Asp Leu Ala Ala Arg Thr Val Glu Ser Arg 115 120 125 Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly He Pro Tyr He Glu Thr 130 135 140 Ser Ala Lys Thr Arg Gln Gly Val Glu Aßp Ala Phe Tyr Thr Leu Val 145 150 155 160 Arg Glu He Arg Gln Hiß Lyß Leu Arg Lys Leu Asn Pro Pro Aßp. Glu 165 170 175 Ser Gly Pro Gly Cyß Met Ser Cyß Lys Cys Val Leu Ser 180 185 <210> 5 <211> 6453 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> prim_transcript <222> (1664) .. (3744) <220> <221> intron <222> (1775) .. (2041) <220> <221> intron <222> (2221) .. (2373) <220> <221> intron <222> (2534) .. 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acccgggagc ctcgggcccg gcgccctcac acccgggggc gectgggagg aggcggccgc 900 ggccacggca cgcccgggca cccccgattc agcatcacag gtcgcggacc aggccggggg 960 cctcagcccc agtgcctttt ccctctccgg gtctcccgcg ccgcttctcg gccccttcct 1020 gtcgctcagt ccctgcttcc caggagctcc tctgtcttct ccagctttct gtggctgaaa 1080 gatgcccccg gttccccgcc gggggtgcgg ggcgctgccc gggtctgccc tcccctcggc 1140 ggcgcctagt acgcagtagg cgctcagcaa atacttgtcg gaggcaccag cgccgcgggg 1200 cctgcaggct ggcactagcc tgcccgggca cgcegtggcg cgctccgccg tggccagacc 1260 tgttctggag gacggtaacc tcagccctcg ggcgcctccc tttagccttt etgccgaccc 1320 agcagcttct aatttgggtg cgtggttgag agcgctcagc tgtcagccct gcctttgagg 1380 gctgggtccc ttttcccatc actgggtcat taagagcaag tgggggcgag gcgacagccc 1440 tcccgcacgc tgggttgcag ctgcacaggt aggcacgctg cagtccttgc tgcctggcgt 1500 tggggcccag ggaccgctgt gggtttgccc ttcagatggc cccgccagca gccgccctgt 1560 ggggcctggg gctgggcctg ggcctggctg agcagggccc tcettggcag gtggggcagg 1620 agaccctgta ggaggacccc gggccgcagg cccctgagga gcgatgacgg aatataagct 1680 ggtggtggtg ggcgccggcg gtgtgggcaa gagtgcgctg accatccagc tgatecagaa 1740 ccattttgtg gacgaatacg accccactat agaggtgagc ctagcgccgc cgtccaggtg 1800 ccagcagctg ctgcgggcga gcccaggaca cagccaggat agggctggct gcageccctg 1860 gtcccctgca cggtgctgtg gccctgtctc ctgcttcctc tagaggaggg gagtccctcg 1920 tctcagcacc ccaggagagg agggggcatg aggggcatga gaggtaccag ggagaggctg 1980 gctgtgtgaa ctccccccac ggaaggtect gagggggtec ctgagccctg tcctcctgca 2040 ggattectac cggaagcagg tggtcattga tggggagacg tgcctgttgg acatcctgga 2100 taccgccggc caggaggagt acagcgccat gegggaccag tacatgegea ccggggaggg 2160 cttcctgtgt gtgtttgcca tcaacaacac caagtctttt gaggacatcc accagtacag 2220 gtgaaccccg tgaggctggc ccgggagccc acgccgcaca ggtggggcca ggccggctgc 2280 gtccaggcag gggcctcctg tcctctctgc gcatgtcctg gatgccgctg cgcctgcagc 2340 ccccgtagcc agctctcgct ttccacctct cagggagcag atcaaacggg tgaaggactc 2400 ggatgacgtg cccatggtgc tggtggggaa caagtgtgac ctggctgcac gcactgtgga 2460 atctcggcag gctcaggacc tcgcccgaag ctacggcatc ccctacatcg agacctcggc 2520 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ctgtccaggg gacgccacac tcccccttct ctccagggga cgccacactc ccccttctct 5100 ccaggggacg ccacactcgc ccttctctcc aggggacgcc acactccccc ttctgtccag 5160 gggacgccac actcgccctt ctctccaggg gacgccacac tcgcccttct ctccagggga 5220 cgccacactc ccccttctct ccaggggacg ccacactccc ccttctctcc aggggacgcc 5280 acactccccc ttctgtccag gggacgccac actcgccctt ctctccaggg gacgccacac 5340 tcccccttct ctccagggga cgccacactc ccccttctct ccaggggacg ccacactccc 5400 ccttctgtcc aggggacgcc acactcgccc ttctctccag gggacgccac actcgccctt 5460 ctctccaggg gacgccacac tcgcccttct ctccagggga cgccacactt gcccttctgt 5520 ccagggaatg ccacactccc ccttctcccc agcagcctcc gagtgaccag cttccccatc 5580 gatagacttc ccgaggccag gagccctcta gggctgccgg gtgccaccct ggctccttcc 5640 acaccgtgct ggtcactgcc tgctgggggc gtcagatgca ggtgaccctg tgcaggaggt 5700 atctctggac ctgcctcttg gtcattacgg ggctgggcag ggcctggtat cagggccccg 5760 ctggggttgc agggctgggc ctgtgctgtg gtcctggggt gtccaggaca gacgtggagg 5820 ggtcagggcc cagcacccct gctccatgct gaactgtggg aagcatccag gtccctgggt 5880 ggcttcaaca ggagttccag cacgggaacc actggacaac ctggggtgtg tcctgatctg 5940 gggacaggcc agccacaccc cgagtcctag ggactccaga gagcagccca ctgccctggg 6000 ctccacggaa gccccctcat gccgctaggc cttggcctcg gggacagccc agctaggcca 6060 gtgtgtggca ggaccaggcc eccatgtggg agctgacccc ttgggattct ggagctgtgc 6120 tgatgggcag gggagagcca gctcctcccc ttgagggagg gtct-tgatgc ctggggttac 6180 ccgcagaggc ctgggtgccg ggacgctccc cggtttgget gaaaggaaag cagatgtggt 6240 cagcttctcc actgagccca tctggtcttc ccggggctgg gccccataga tctgggtccc 6300 tgtgtggccc ccctggtctg atgecgagga tacccctgca aactgccaat cccagaggac 6360 aagactggga agtccctgca gggagagccc atccccgcac cctgacccac aagagggact 6420 cctgctgccc accaggcatc cctccaggga tcc 6453 <210> 6 <211> 2004 <212> DNA <2i3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial : proteína de fusión <220> <221> CDS <222> (1) .. (2004) <400> 6 atg gag cae ata cag gga gct tgg aag aeg ate age aat ggt ttt gga 48 Met Glu His He Gln Gly Ala Trp Lyß Thr He Ser Aßn Gly Phe Gly 1 5 10 5 ttc aaa gat gcc gtg ttt gat ggc tcc age tgc ate tet cct acá ata 96 Phe Lys Aßp Ala Val Phe Asp Gly Ser Ser Cyß He Ser Pro Thr He 20 25 30 gtt cag cag ttt ggc tat cag cgc cgg gca tea gat gat ggc aaa etc 144 Val Gln Gln Phe Gly Tyr Gln Arg Arg Ala Ser Aßp Aßp Gly Lyß Leu 35 40 45 acá gat cct tet aag acá age aac act ate cgt gtt ttc ttg ceg aac 192 Thr Aap Pro Ser Lyß Thr Ser Asn Thr He Arg Val Phe Leu Pro Aßn 50 55 60 aag caá aga acá gtg gtc aat gtg cga aat gga atg age ttg cat gac 240 Lyß Gln Arg Thr Val Val Aßn Val Arg Asn Gly Met Ser Leu Hiß Aßp 65 70 75 80 tgc ctt atg aaa gca etc aag gtg agg ggc ctg caá cea gag tgc tgt 288 Cyß Leu Met Lyß Ala Leu Lys Val Arg Gly Leu Gln Pro Glu Cys Cyß 85 90 95 gca gtg ttc aga ctt etc cae gaa cae aaa ggt aaa aaa gca cgc tta 336 Ala Val Phe Arg Leu Leu Hiß Glu Hiß Lyß Gly Lyß Lys Ala Arg Leu 100 105 110 gat tgg aat act gat gct gcg tet ttg att gga gaa gaa ctt ca gta 384 Asp Trp Asn Thr Asp Ala Ala Ser Leu He Gly Glu Glu Leu G n Val 115 120 125 gat ttc ctg gat cat gtt ecc etc acá acá cae aac ttt gct cgg aag 432 Aßp Phe Leu Aßp Hiß Val Pro Leu Thr Thr Hiß Aßn Phe Ala Arg Lys 130 135 140 aeg ttc ctg aag ctt gcc ttc tgt gac ate tgt cag aaa ttc ctg etc 480 Thr Phe Leu Lyß Leu Ala Phe Cys ?sp He Cyß Gln Lyß Phe Leu Leu 145 150 155 160 aat gga ttt cga tgt cag act tgt ggc tac aaa ttt cat gag cae tgt 528 Asn Gly Phe Arg Cyß Gln Thr Cyß Gly Tyr Lyß Phe Hiß Glu His Cys 165 170 175 age acc aaa gta cct act atg tgt gtg gac tgg agt aac ate aga caá 576 Ser Thr Lyß Val Pro Thr Met Cys Val Asp Trp Ser Aßn He Arg Gln 180 185 190 etc tta ttg ttt cea aat tcc act att ggt gat agt gga gtc cea gca 624 Leu Leu Leu Phe Pro Asn Ser Thr He Gly Asp Ser Gly Val Pro Ala 195 200 205 cta cct tet ttg act atg cgt cgt atg cga gag tet gtt tcc agg atg 672 Leu Pro Ser Leu Thr Met Arg Arg Met Arg Glu Ser Val Ser Arg Met 210 215 220 cct gtt agt tet cag cae aga tat tet acá cct cae gcc ttc acc ttt 720 Pro Val Ser Ser Gln Hia Arg Tyr Ser Thr Pro His Ala Phe Thr Phe 225 230 235 240 aac acc tcc agt ecc tea tet gaa ggt tcc etc tcc cag agg cag agg 768 Asn Thr Ser Ser Pro Ser Ser Glu Gly Ser Leu Ser Gln Arg Gln Arg 245 250 255 tcg acá tcc acá cct aat gtc cae atg gtc age acc aeg ctg cct gtg 816 Ser Thr Ser Thr Pro Asn Val His Met Val Ser Thr Thr Leu Pro Val 260 265 270 gac age agg atg att gag gat gca att cga agt cae age gaa tea gcc 864 Asp Ser Arg Met He Glu Asp Ala He Arg Ser Hiß Ser Glu Ser Ala 275 280 285 tea cct tea gcc ctg tcc agt age ecc aac aac ctg age cea acá ggc 912 Sßr Pro Ser ?la Leu Ser Ser Ser Pro Aan Aßn Leu Ser Pro Thr Gly 290 295 300 tgg tea cag ceg aaa acc ecc gtg cea gca caá aga gag cgg gca cea 960 Trp Ser Gln Pro Lyß Thr Pro Val Pro Ala Gln Arg Glu ?rg ?la Pro 305 310 315 320 gta tet ggg acc cag gag aaa aac aaa att agg cct cgt gga cag aga 1008 Val Ser Gly Thr Gln Glu Lys ?sn Lys He Arg Pro Arg Gly Gln Arg 325 330 335 gat tea age tat tat tgg gaa ata gaa gcc agt gaa gtg atg ctg tcc 1056 Asp Ser Ser Tyr Tyr Trp Glu He Glu Ala Ser Glu Val Met Leu Ser 340 345 350 act cgg att ggg tea ggc tet ttt gga act gtt tat aag ggt aaa tgg 1104 Thr Arg He Gly Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lyß Gly Lyß Trp 355 360 365 cae gga gat gtt gca gta aag ate cta aag gtt gtc gac cea acc cea 1152 Hiß Gly Aßp Val Ala Val Lya He Leu Lys Val Val Aßp Pro Thr Pro 370 375 380 gag caá ttc cag gcc ttc agg aat gag gtg gct gtt ctg cgc aaa acá 1200 Glu Gln Phe Gln Ala Phe Arg Asn Glu Val Ala Val Leu Arg Lyß Thr 385 390 395 400 cgg cat gtg aac att ctg ctt ttc atg ggg tac atg acá aag gac aac 1248 ?rg Hiß Val ?an He Leu Leu Phe Mee Gly Tyr Met Thr Lys ?ßp ?sn 405 410 415 ctg gca att gtg acc cag tgg tgc gag ggc age age etc tac aaa cae 1296 Leu Ala He Val Thr Gln Trp Cyß Glu Gly Ser Ser Leu Tyr Lys His 420 425 430 ctg cat gtc cag gag acc aag ttt cag atg ttc cag cta att gac att . 1344 Leu His Val Gln Glu Thr Lys Phe Gln 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Claims (67)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto se reclama como propiedad lo descrito en las siguientes reivindicaciones. 1. Un articulo de fabricación que comprende material del empaque y una composición farmacéutica contenida dentro del material de empaque, caracterizado porque la composición farmacéutica es capaz de modular la angiogénesis en un tejido asociado con una condición afectiva, en donde el material de empaque comprende una marca que indica que la composición farmacéutica puede usarse para tratar condiciones afectivas modulando la angiogénesis, y en donde la composición farmacéutica comprende una proteina Raf o un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos capaz de expresar la proteina.
2. 2. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina Raf es una proteina Raf activa y la modulación aumenta la potencia de la angiogénesis.
3. 3. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteina Raf activa es Raf de tipo silvestre.
4. 4. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteina Raf activa es una proteina fusionada.
5. 5. El articulo de fabricación de conformidad conla reivindicación 4, caracterizado porque la 'protelna fusionada Raf activa es Raf-caax.
6. 6. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el tejido tiene deficiente circulación.
7. 7. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina Raf es una proteina Raf inactiva y la modulación inhibe la angiogénesis.
8. 8. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la protelna Raf inactiva tiene una mutación en el residuo 375 tal que el aminoácido en la posición 375 no es lisina.
9. 9. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el tejido está inflamado y la condición es artritis o artritis reumatoide.
10. 10. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el tejido es un tumor sólido o metástasis de tumor sólido.
11. 11. El artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la administración se conduce junto con quimioterapia.
12. 12. El artículo de fabricación de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el tejido es tejido retinal en la condición de retmopatia, retmopatia aiabetica, o degeneración macular.
13. 13. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el tejido esta en el sitio de angioplastia coronaria y la condición es restenosis .
14. 14. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la administración comprende administración intravenosa, transdérmica, mtrasinovial, intramuscular u oral.
15. 15. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la administración comprende una dosis sencilla intravenosamente.
16. 16. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende adicionalmente un liposoma.
17. 17. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende un vector de expresión viral capaz de expresar la secuencia de nucleótidos.
18. 18. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende un vector de expresión no viral capaz de expresar la secuencia de nucleotidos.
19. 19. Un método para modular la angiogenesis en un tejido asociado con una condición afectiva que comprende administrar al tejido una cantidad que modula angiogenesis de una composición farmacéutica que comprende una proteina Raf o una secuencia de nucleotidos capaz de expresar la proteina.
20. 20. El método de conformidad .con la reivindicación 19, caracterizado porque la proteina Raf es una proteina Raf activa y la modulación potencial del angiogenesis .
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque la proteina Raf activa es Raf de tipo silvestre.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque las proteinas Raf activa es una proteina fusionada.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque la proteina fusionada Raf activa es Raf-caax.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el tejido tiene una circulación anormal.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la proteina Raf es una proteina Raf inactiva y la modulación inhibe la angiogenesis .
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la proteina Raf inactiva tiene una mutación en el residuo 375 tal que el aminoácido en la porción 375 no es lisina.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el " tejido se inflama y la condición es artritis o artritis reumatoide.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el tejido es un primer sólido o metástasis de tumor sólido.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la administración se conduce junto con quimioterapia.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el tejido es tejido retinal y la condición es retinopatia, retinopatia diabética o degeneración macular.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el tejido está en el sitio de angioplastia coronaria y el tejido está en riesgo de restenosis.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la administración comprende administración intravenosa, transdérmica, intrasinovial, intramuscular u oral.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la administración comprende una dosis sencilla intravenosamente.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende adicionalmente un liposoma". •
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende un vector de expresión retroviral capaz de expresar la secuencia de nucleótidos.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende un vector de expresión no viral capaz de expresar la secuencia de nucleótidos.
37. 37. Una composición farmacéutica para estimular angiogénesis en un tejido de mamífero objetivo caracterizada porque comprende un vector de transferencia de gen viral que contiene un ácido nucleico, teniendo el ácido nucleico un segmento de ácido nucleico que codifica para una proteina Raf, teniendo la proteina Raf actividad de cinasa, y un portador y excipiente farmacéuticamente aceptable .
38. 38. Una composición farmacéutica para estimular la angiogénesis en un tejido de mamífero objetivo caracterizada porque comprende un vector de transferencia de gen no viral que contiene un ácido nucleico, teniendo el ácido nucleico un segmento de ácido nucleico que codifica para una proteina Raf, teniendo la proteina Raf actividad de cinasa y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
39. 39. Una composición farmacéutica • para la angiogénesis en un tejido de mamífero objetivo caracterizada porque comprende un vector de transferencia de gen viral que contiene un ácido nucleico, teniendo el ácido nucleico un segmento de ácido nucleico que codifica para una proteina Raf, no teniendo la proteina Raf actividad de cinasa, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
40. 40. Una composición farmacéutica para inhibir la angiogénesis en un tejido de mamífero objetivo caracterizada porque comprende un vector de transferencia de gen no viral que contiene un ácido nucleico, teniendo el ácido nucleico un segmento de ácido nucleico que codifica para una proteina Raf, no teniendo la proteina Raf actividad de cinasa, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
41. 41. Una composición farmacéutica para estimular angiogénesis en un tejido de mamífero objetivo caracterizada porque comprende una cantidad terapéutica de una proteina Raf, teniendo la proteina Raf actividad de cinasa, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable .
42. 42. Una composición farmacéutica para inhibir angiogénesis en un tejido de mamífero objetivo caracterizada porque comprende una cantidad terapéutica de una proteina Raf, no teniendo la proteina Raf actividad de cinasa, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
43. 43. Un articulo de fabricación que comprende material de empaque y una composición farmacéutica contenida dentro del material de empaque, caracterizado porque la composición farmacéutica es capaz de modular la angiogénesis en un tejido asociado con una condición afectiva, en donde el material de empaque comprende una etiqueta que indica que la composición farmacéutica puede usarse para tratar condiciones afectivas modulando la angiogénesis, y en donde la composición farmacéutica comprende una proteina Ras o un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos capaz de expresar tal proteina.
44. 44. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la proteina Ras u oligonucleótido que codifica la proteina es una proteina Ras inhibitoria.
45. 45. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la Ras inhibitoria es Ras V12C40.
46. 46. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque la Ras inhibitoria es Ras S17N.
47. 47. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque la proteina Ras u oligonucleótido que codifica la proteina es una proteina Ras estimuladora.
48. 48. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la Ras estimuladora es Ras G12v.
49. 49. El articulo de fabricación de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la Ras estimuladora es Ras V12S35.
50. 50. Un método para modular la angiogénesis en un tejido asociado con una condición afectiva caracterizado porque comprende administrar al tejido una cantidad que modula la angiogénesis de una composición farmacéutica que comprende una proteina Ras o una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteina.
51. 51. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la proteina Ras u oligonucleótido que codifica para la proteina es una proteina Ras inactiva.
52. 52. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la Ras inactiva es Ras V12C40.
53. 53. El método de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la Ras inactiva es Ras S17N. - •
54. 54. El método de conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la proteina Ras u oligonucleótido que codifica para la proteina es una proteina Ras activa.
55. 55. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la Ras activa es Ras GV12.
56. 56. El método de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado porque la Ras activa es Ras V12S35.
57. 57. Una composición farmacéutica para modular la angiogénesis en un tejido de mamífero objetivo que comprende un vector de transferencia de gen viral que contiene un ácido nucleico, teniendo el ácido nucleico un segmento de ácido nucleico que codifica para una proteina Ras, teniendo la proteina Ras actividad que modula la angiogénesis, en un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
58. 58. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 57, que inhibe la angiogénesis en un tejido de mamífero objetivo caracterizada porque la proteina Ras tiene una actividad inhibidora de angiogénesis .
59. 59. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque Ja proteina Ras es Ras V12C40.
60. 60. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada porque la proteina Ras es Ras S17N.
61. 61. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque la proteina Ras tiene actividad que activa angiogénesis.
62. 62. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la proteina Ras es Ras G12V.
63. 63. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la protelna Ras es Ras V12S35.
64. 64. Una composición farmacéutica para modular la angiogénesis y un tejido de mamífero objetivo caracterizada porque comprende un vector de transferencia de gen no viral que contiene un ácido nucleico, teniendo el ácido nucleico un segmento de ácido nucleico que codifica para una proteina Ras, y teniendo la proteina Ras actividad que modula la angiogénesis, y un portador o e?üj.µi-cnuc farmacéuticamente aceptable.
65. 65. Un método para modular la angiogénesis en un tejido asociado con una condición afectiva caracterizado porque comprende administrar al tejido una cantidad que modula la angiogénesis de una composición farmacéutica que comprende una proteina Raf o una secuencia de nucleótidos capaz de expresar la proteina.
66. 66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la modulación es una inhibición del angiogénesis, y al menos una de las proteinas Raf y Ras son inactivas.
67. 67. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la modulación es una estimulación de la angiogénesis, y al menos una de las proteinas Raf y Ras son activas.