MXPA02006207A - Angiogenesis y moduladores e inhibidores de la permeabilidad vascular - Google Patents

Abstract

La presente invención describe los métodos para modular la permeabilidad vascular (VP) en tejidos que utilizan la proteína Src o Src modificada. La proteína Yes o la proteína Yes modificada, inhibidores de la proteína tirosina cinasa de la familia Src yácidos nucleicos con capacidad de expresión de la proteína Src o Src modificada. La proteína Yes o la proteína Yes modificada y los inhibidores de la proteína tirosina cinasa de la familia Src, o mezclas de los mismos. La invención también describe los métodos para inhibir la VP utilizando una proteína Src o Yes inactiva o una mezcla de las mismas, o la proteína CSK o CSK modificada, o losácidos nucleicos que codifican para las mismas, o al utilizar inhibidores químicos de la proteína tirosina cinasa de la familia Src tales como por ejemplo, PP1, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 y Geldanamicina, o para potenciar la VP utilizando una proteína Src o Yes activa o una mezcla de las mismas, o losácidos nucleicos que codifican para las mismas. También se exponen las composiciones relacionadas y los artículos de fabricación.

Description

ANGIOGENESIS Y MODULADORES E INHIBIDORES DE LA PERMEABILIDAD VASCULAR REFERENCIA CRUZADA PE LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica la prioridad de las solicitudes de Patente de los Estados Unidos Nos. de serie 09/470,881, presentada el 22 de diciembre de 1999 y 09/538,248, presentada el 29 de marzo de 2000, las dos reivindican la prioridad para la solicitud de patente internacional número PCT/US99/11780, que designa los Estados Unidos de América y presentada el 28 de mayo de 1999, que reivindica la prioridad para la solicitud provisional de los Estados Unidos para la patente con No. de serie 60/087,220 presentada el 29 de mayo de 1998.

DECLARACIÓN DE DERECHOS GUBERNAMENTALES Algo del trabajo expuesto se ha apoyado en parte por concesiones del NIH a nombre de los Estados Unidos de .América. Por lo tanto, el gobierno de los Estados Unidos de América puede tener ciertos derechos en la invención.

CAMPO TÉCNICO La presente invención se relaciona en general con el campo de la medicina y se relaciona específicamente con los métodos y composiciones para modular e inhibir la permeabilidad vascular (VP, por sus siglas en inglés) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La angiogénesis es un proceso de vascularización de tejidos que incluye el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en desarrollo en el interior de un tejido y también se denomina como neovascularización. El proceso se suministra por la infiltración de células endoteliales y células de músculo liso. Se cree que el proceso prosigue en cualquiera de tres formas: los vasos se pueden generar a partir de vasos preexistentes, el desarrollo de -novo de los vasos se puede generar a partir de células precursoras (vasculogénesis ) , o los pequeños vasos existentes pueden agrandar su diámetro. Blood et al., Bioch. Biophys. Acta, 1032:89-118 (1990). Para que se presente la angiogénesis, las células endoteliales primero se deben degradar y cruzar la membrana basal del vaso sanguíneo de una forma similar a la utilizada por las células tumorales durante la invasión y formación de metástasis. En general, la angiogénesis está ausente en tejidos adultos o maduros, aunque se puede presentar en la curación de heridas y en el ciclo de crecimiento del cuerpo lúteo. Véase, por ejemplo, Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990). Mientras que la angiogénesis es un proceso importante en el desarrollo neonatal, también es importante en la curación de heridas y es un factor en la patogénesis de una gran variedad de enfermedades clínicas entre las que se incluyen inflamación de tejidos, artritis, crecimiento tumoral, retinopatia diabética, degeneración macular por neovascularización de la retina y condiciones similares. Estas manifestaciones clínicas asociadas con la angiogénesis se denominan como enfermedades angiogénicas. Folkman et al., Science, 235:442-447 (1987) . Se ha propuesto que la inhibición de la angiogénesis podria ser una terapia útil para restringir el crecimiento tumoral. La inhibición de la angiogénesis se ha propuesto por (1) la inhibición de la liberación de "moléculas angiogénicas" tales como por ejemplo, FGFb (factor del crecimiento de fibroblastos básico), (2) neutralización de las moléculas angiogénicas, tal como mediante el uso de anticuerpos anti-ßFGFb, (3) el uso de inhibidores del receptor avß3 de vitronectina, y (4) la inhibición de la respuesta celular endotelial a estímulos angiogénicos. Esta última estrategia ha recibido atención, Folkman et al., Cáncer Biology, 3:89-96 (1992), han descritos diversos inhibidores de respuesta celular endotelial, entre los que se incluyen el inhibidor de colagenaza, los inhibidores para el recambio de la membrana basal, esteroides angiostáticos, inhibidores de angiogénesis derivados de hongos, factor de plaquetas 4, trombospondina, fármacos para la artritis tales como por ejemplo, D-penicilamina y tiomalato de oro, análogos de vitamina D3, alfa-interferón y lo semejante que se podrían utilizar para inhibir la angiogénesis. Para inhibidores adicionales propuestos de la angiogé?esis , véase Blood et al., Bioch . Biophys . Acta. , 1032:89-118 (1990), Moses et al., Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber et al., Lab. Invest., 59:44-51 (1988), y las patentes de los Estados Unidos No. 5,092,885, No. 5,112,946, No. 5,192,744, No. 5,202,352, - No. 5,753,230 y No. 5,766,591. Sin embargo, ninguno de los inhibidores de la angiogénesis descritos en las referencias anteriores incluye las proteínas Src. Anteriormente se ha reportado que la angiogénesis depende de la interacción entre integrinas vasculares y proteínas de matriz extracelular. Brooks et al., Science, 264:569-571 (1994) . Además, se ha reportado que la muerte celular programada (apoptosis) de las células vasculares angiogénicas se inicia por la interacción, que podria inhibirse mediante ciertos antagonistas de la integrina avß3 vascular. Brooks et al., Cell, 79:1157-1164 (1994) . Más recientemente, , se ha reportado que la unión de la metaloproteinaza-2 matriz (MMP-2) al receptor de vitronectina (avß5) se puede inhibir utilizando los antagonistas de avßs y por lo tanto inhibir la función enzimática de la proteinaza. Brooks et al., Cell, 85:683-693 (1996). Las integrinas av se han identificado como componentes importantes en la supervivencia de las células endoteliales en vasos sanguíneos angiogénicos. Los antagonistas de la integrina av específicos bloquean el factor de crecimiento discreto inducido por las trayectorias de la angiogénesis. Por ejemplo, la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) se bloquea por los antagonistas de la integrina avß5, mientras que la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGFb) se bloquea por los antagonistas de la integrina avß3. La vasculatura cerebral se caracteriza por una barrera hemoencefálica bastante restrictiva que prohibe la extravasación de las moléculas en el interior del tejido cerebral circundante. La naturaleza de la barrera hemoencefálica en mamíferos ha sido de especial importancia con los estudios farmacológicos, a medida que se evita rutinariamente que muchos fármacos pasen de la vasculatura a los tejidos cerebrales debido a la barrera hemoencefálica bastante restrictiva. La presente invención incluye el descubrimiento inesperado de que la VP, según se mide por el escape vascular de sangre, se puede modular mediante Src o Yes. Además, la VP se ha asociado con la angiogénesis y otras patologías. La permeabilidad vascular aumentada inducida por inflamación se asocia con edemas e hinchazón. Un requerimiento para la actividad de tirosina cinasa Src para la angiogénesis inducida por VEGF pero no por FGFb demostró que existen diferencias significativas en las señales de regulación y activación entre estas trayectorias, tanto en embriones de pollo como en modelos de ratón. Eliceiri et al., Molecular Cell, 4:915-924 (1999). Los cambios en la permeabilidad vascular debidos a señales angiogénicas provenientes de células tumorales han proporcionado un modelo para examinar las trayectorias de señal relacionadas con cáncer, sin embargo, la permeabilidad vascular debida a lesión, enfermedad u otro trauma para los vasos sanguíneos es la causa principal del escape vascular y edema asociados con el daño a tejidos. Por ejemplo, la enfermedad cerebrovascular asociada con un accidente cerebrovascular (CVA, por sus siglas en inglés) u otra lesión vascular en el cerebro o tejidos espinales son la causa más común de un trastorno neurológico y una fuente principal de invalidez. Típicamente, el daño al cerebro o tejido espinal en la región de un CVA implica escape vascular y/o edema. Típicamente, el CVA puede incluir una lesión provocada por isquemia cerebral, interrupción del flujo sanguíneo normal al cerebro, insuficiencia cerebral debida a alteraciones pasajeras en el flujo sanguíneo; infarto, debido a embolismo o trombosis de las arterias intra o extracraneales ; hemorragia; y malformaciones arteriovenosas . La apoplejía isquémica y hemorragia cerebral se pueden desarrollar repentinamente, y el impacto del incidente en general refleja el área dañada del cerebro. (Véase The Merck Manual, 16ava ed. Cap. 123, 1992.) A diferencia del CVA, las infecciones o enfermedades del sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en inglés) también pueden afectar los vasos sanguíneos del cerebro y la columna vertebral, y pueden incluir inflamación y edema, como puede ser por ejemplo en meningitis bacteriana, encefalitis viral y formación de abscesos en el cerebro. (Véase The Merck Manual, 16ava ed. Cap. 125, 1992.) Las condiciones sistémicas de enfermedad también pueden debilitar los vasos sanguíneos y conducir a escapes en los vasos y edema, tal como diabetes, enfermedad renal, aterosclerosis y lo semejante. De esta forma, el escape vascular y el edema son patologías criticas, distintas e independientes del cáncer, que están en necesidad de una intervención terapéutica efectiva y especifica "junto con una variedad de condiciones de lesión, trauma o enfermedad. Se ha descubierto que la inhibición selectiva de la actividad tirosina cinasa de la familia Src reduce el aumento de la VP asociada con lesión o trauma en tejidos, y da por resultado en la mejoría de la patología relacionada con el escape de los vasos sanguíneos y/o edema.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a la modulación de la permeabilidad vascular (VP) mediante la proteina Src de tirosina cinasa, también denominada genéricamente en la presente como Src, o la tirosina cinasa Yes, también denominada genéricamente en la presente como Yes, o mediante la inhibición selectiva de la actividad de tirosina cinasa de la familia Src. De esta forma, un aspecto de la invención abarca las composiciones farmacéuticas para modular la VP en un tejido blanco de un mamífero. Las composiciones de la invención comprenden una cantidad moduladora de la VP terapéuticamente eficaz o una mezcla de la proteina tirosina cinasa Src y Yes, en un portador farmacéuticamente aceptable. En las composiciones que comprenden las proteínas cinasa Src y Yes, la modulación esperada es una potenciación o aumento en la permeabilidad vascular de los vasos sanguíneos en un tejido blanco. Cuando la proteina Src deseada es una cinasa activa, una Src preferida es Src-A. Otra proteina Src activa preferida es una en la cual el residuo de aminoácidos en la posición 527 de la proteina Src es cualquier residuo de aminoácidos excepto para tirosina, serina o treonina. La proteina Yes activa preferida tendrá la actividad cinasa de Yes humana tipo silvestre, tal como la proteina Yes-1. Otra Yes activa preferida es una en la cual el sitio de fosforilación inactivante de cinasa de la proteina Yes se muta para anular o reducir al minimo la fosforilación inactivante, similar a una mutación del residuo de aminoácidos 527 de Src para cualquier residuo de aminoácidos excepto para tirosina, serina o treonina. Cuando la composición comprende la proteina Src y Yes que son proteínas cinasa inactivas, la modulación esperada es una inhibición o disminución en la permeabilidad vascular de los vasos sanguíneos en el tejido blanco. Cuando la proteina Src deseada es una proteina inactiva, una Src preferida es Src 251. Una Src inactiva preferida, adicional, es la Src K295M. Una proteina Yes inactiva, preferida tendrá una actividad cinasa disminuida en comparación con la proteina tipo silvestre. Un aspecto adicional de la invención reivindicada es una composición farmacéutica que comprende una cantidad moduladora de la VP terapéuticamente eficaz de ácido nucleico capaz de expresar la proteina tirosina cinasa Src y Yes, cuando se transfecta en una célula blanco, en un portador farmacéutico adecuado. Los ácidos nucleicos que se pueden expresar y que codifican para la proteina Src o Yes pueden comprender segmentos e ácido nucleico que describen todo o parte de la proteina Yes o Src. Cuando se transfiere en células blanco, la célula blanco transcribe y traduce la secuencia de ácido nucleico para expresar la proteina deseada. Cuando la modulación es una potenciación o aumento en la permeabilidad vascular de los vasos sanguíneos en el tejido blanco, el ácido nucleico que codifica para la Src codificará para las formas activas de la Src, y los ácidos nucleicos que codifican para Yes codificarán para las formas activas de las proteínas cinasa Yes. Una vez transferidos en la célula hospedera blanco, los ácidos nucleicos se expresarán por la célula hospedera. Una ácido nucleico que codifica para Src, preferido, codifica para la proteina Src A activa. Un ácido nucleico que codifica para Src, preferida, adicional, codifica para una Src activa mutada, en donde el residuo de aminoácidos en la posición 527 de la proteina Src expresada es cualquier residuo de aminoácidos excepto para tirosina, serina o treonina. Un ácido nucleico que codifica para Yes, preferida, codificará para la proteina tipo silvestre, o para una proteina modificada para anular o inhibir el sitio de fosforilación inactivante de la proteina Yes, en una forma similar como la mutación Src en la posición 527 descrita. Cuando la modulación deseada es una inhibición o disminución en la permeabilidad vascular de los vasos sanguíneos en el tejido blanco, un ácido nucleico que codifica para Src, inactiva, preferida, codifica para la proteina Src 251. Un ácido nucleico que codifica para Src inactiva preferida, adicional, codifica para la Src K295M inactiva. Un ácido nucleico que codifica para Yes inactiva preferida codificará para una proteina que tiene una actividad cinasa disminuida. Se prevé que las composiciones de la invención pueden comprender una mezcla de ácidos nucleicos, en donde cada ácido nucleico puede comprender un gen Src o Yes que se puede expresar. Además, se prevé que un ácido nucleico individual puede comprender tanto un ácido nucleico que codifique para una proteina Src, como un ácido nucleico que codifique para una proteina Yes. Para la modulación refinada de la angiogénesis y la VP en tejidos blanco, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender una mezcla de proteina tirosina cinasa Src activa o inactiva, o proteina tirosina cinasa Yes. De manera similar, las composiciones farmacéuticas de la invención pueden comprender una mezcla de ácido nucleico capaz de expresar la proteina tirosina cinasa Src activa o inactiva o la proteina tirosina cinasa Yes. Al utilizar diferentes cantidades de una primera tirosina cinasa coadministrada con una cantidad mayor de una segunda tirosina cinasa, de acuerdo con la enseñanza de la invención se refine la modulación. En esta modalidad, al utilizar promotores que se pueden expresar de manera diferencial u otros elementos reguladores, un primer gen de la primera tirosina cinasa de baja expresión se pude coadministrar con un segundo gen de la segunda tirosina cinasa con alta expresión, de acuerdo con la enseñanza de la invención. En esta modalidad, un aumento en la angiogénesis se puede efectuar mientras que también se mantiene, se reduce al minimo o se reduce la VP, al utilizar un primer gen Src activo de baja expresión, en combinación con un segundo gen Yes inactivo de alta expresión. Esta coadministración se puede efectuar al utilizar vectores de expresión por separado, o una construcción del vector de expresión, combinada, individual. De manera similar, una disminución en la angiogénesis se puede realizar mientras que también se mantiene potencia o aumenta la VP, al utilizar un primer gen Src inactivo de baja expresión, en combinación con un segundo gen Yes activo de alta expresión. Se pueden realizar grados adicionales de modulación mediante las diversas permutaciones de alto/bajo y Src/Yes, en combinación con la selección de la actividad de los elementos promotor y los promotores que pueden ser inducidos. Se prevé que los genes Src y Yes individuales pueden estar bajo el control regulador de las mismas o diferentes secuencias de ácido nucleico regulador tales como por ejemplo, y sin limitar será elementos intensificadores represores y promotores. Cuando se pueden expresar dos o más proteínas a partir de un vector individual, se prevé que la regulación y control de la trascripción de los genes independientes de proteina pue'den estar bajo el control de los mismos elementos reguladores. También se prevé que la regulación y el control de la trascripción se pueden efectuar mediante dos o más elementos reguladores de operación, independientemente. Los elementos reguladores son conocidos en la técnica y pueden ser constitutivamente activos, o intensificador, promotor, supresor o lo semejante capaces de ser inducidos, secuencias de ácido nucleico. Se prevé que las composiciones de ácido nucleico de la invención pueden comprender un vector de transferencia de genes virales y/o no virales que contienen un segmento de ácido nucleico que codifica para una proteina Src y/o Yes. Los .vectores de transferencia y expresión de genes retrovirales y no virales son conocidos en ia técnica, y se describen brevemente más adelante. Un ácido nucleico preferido codifica para la proteina Src-A. Otra proteina Src activa, preferida, es una en la cual el residuo de aminoácidos en la posición 527 de la proteina Src es cualquier residuo de aminoácidos excepto para tirosina, serina o treonina . Se prevé que una mezcla de proteina Src y Yes, y/o ácido nucleico que codifica para esta proteina, puede combinar formas activas e inactivas de la proteina, dependiendo del nivel de modulación deseado y el efecto coordinado de la angiogénesis y la VP deseada, de acuerdo con la enseñanza de la presente invención. Una composición que proporciona la proteina Src o Yes puede contener proteina purificada, fragmentos biológicamente activos de proteina natural, proteina Src o Yes producida de manera recombinante o fragmentos de proteina, o proteínas de fusión, o vectores de expresión de genes/ácido nucleico para expresar una proteina Src o Yes, o mezclas de los mismos. Cuando la proteina Src o Yes se inactiva •• inhibe, la modulación es una inhibición de la VP. Cuando ia proteina Src o Yes es activa o se activ-1( la modulación es una potenciación de la VP . La presente invención abarca los métodos para tratar tejido de mamíferos con una composición que comprende una cantidad moduladora de la VP, terapéuticamente eficaz, de una proteina Src o Yes, o una combinación de las mismas. En los métodos de ! invención, la proteina tirosina cinasa Src y Yes, los vectores de expresión de ácido nucleico capaces de expresar esta proteina se administran al tejido que sufre de una condición de enfermedad que responde a la modulación de la VP . Cuando el efecto deseado de modulación de la VP terapéuticamente eficaz es un aumento o potenciación de la VP se contempla que las formas activas de la proteina Src y/o la proteina Yes se pueden administrar. De manera similar, los métodos abarcan la administración de ácidos nucleicos que se pueden expresar, y que codifican para formas activas o inactivas de la proteina Src y/o la proteina Yes, por consiguiente. El tejido que será tratado puede ser cualquier tejido en el cual sea conveniente la modulación de la VP . El tratamiento terapéutico se lleva a cabo al poner en contacto el tejido blanco con una cantidad eficaz de la composición moduladora deseada, y se deja un tiempo suficiente de contacto para que los componentes de la proteina o ácido nucleico del producto farmacéutico entren a-l tejido blanco. Para la inhibición de la VP, es útil tratar el tejido enfermo, en donde se esta presentando una carencia vascular dañina. Los tejidos de ejemplo incluyen tejido inflamado, tejidos asociados con la apoplejía, infarto al miocardio u otro bloqueo de flujo normal, tejidos que experimentan restenosis y los tejidos semejantes.

Para la potenciación, es útil tratar a los pacientes con miembros isquémicos en los cuales existe una circulación deficiente en los miembros a partir de condiciones diabéticas u otras, o para potenciar la administración de los fármacos al cerebro a través de la barrera hemoencefálica . Los pacientes con heridas crónicas que no cicatrizan y por lo tanto podrían verse beneficiadas del aumento en la proliferación celular vascular y también se puede tratar la neovascularización como la modulada por la VP . Un aspecto adicional de la presente invención son los artículos de fabricación que comprenden material de empaque y una composición farmacéutica contenida dentro de ese material de empaque, en donde la composición farmacéutica es capaz de modular la permeabilidad vascular en un tejido que sufre de una condición de enfermedad, en donde el material de empaque comprende una etiqueta que indica que la composición farmacéutica se puede utilizar para tratar condiciones de enfermedad mediante la modulación de la permeabilidad vascular, y en donde la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la proteina tirosina cinasa Yes, en un portador farmacéuticamente aceptable. Esta modalidad abarca la proteina Yes en forma activa o inactiva, y también los ácidos nucleicos que codifican para la proteina Yes activa o inactiva. Los vectores de transferencia/expresión de genes tanto retrovirales como no virales pueden contener un segmento de ácido nucleico que codifica para la proteina Yes, ya sea en la forma activa o inactiva, o en ambas. Cuando están presentes las formas tanto activas como inactivas de un gen de proteina cinasa, se contempla que los genes estén bajo la regulación del promotor que puede ser inducido, por separado, para permitir la expresión alternativa, según se desee. Un aspecto adicional de la presente invención son los artículos de fabricación en donde la composición farmacéutica comprende una cantidad moduladora de la VP terapéuticamente eficaz de una proteina tirosina cinasa Src y Yes, en un portador farmacéuticamente aceptable. Cuando el articulo de fabricación se envasa para indicar un efecto modulador de la VP potenciador, la Src y Yes están en forma activa. Una Src activa preferida es la proteina Src-A. Otra proteina Src activa, preferida, es una en la cual el residuo de aminoácidos en la posición 527 de la proteina Src es cualquier residuo de aminoácidos excepto para tirosina, serina o treonina . Un aspecto adicional de la presente invención son los artículos de fabricación que comprenden una composición farmacéutica en donde la composición farmacéutica comprende una cantidad moduladora de la VP terapéuticamente eficaz de una proteina tirosina cinasa inactiva Src y Yes, en un portador farmacéuticamente aceptable, en donde la modulación deseada es una activación o inhibición de la VP . Una Src inactiva preferida es la proteina Src 251. Otra proteina Src inactiva preferida es la Src K295M. De manera similar, un aspecto adicional de la presente invención son los artículos de fabricación en donde la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico capaz de expresar la proteina tirosina cinasa Src y Yes, en un portador farmacéutico adecuado. Un componente de ácido nucleico preferido de la composición farmacéutica de este articulo de fabricación codifica para una proteina Src activa, en donde la modulación deseada es una potenciación o activación de la VP . Se prevén adicionalmente ácidos nucleicos que codifican para la proteina Yes activa. Una Src activa preferida es la proteina Src-A. Otro ácido nucleico que codifica para Src activa preferida es uno en el cual el residuo de aminoácidos en la posición. 527 de la proteina Src es cualquier residuo de aminoácidos excepto para tirosina, serina o treonina. También se prevé que se pueda construir un ácido nucleico individual que expresará tanto Yes como Src, ya sea reguladas independient mente, o bajo el control trascripcional del mismo promotor intensificador, supresor, represor u otra secuencia de ácido nucleico reguladora adecuada. El daño al tejido relacionado con el escape vascular y/o el edema asociado con los cambios dañinos en la permeabilidad vascular se pueden mejorar mediante un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src. Para este fin, una cantidad moduladora de la permeabilidad vascular, eficaz, de un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src se administra a un tejido que necesita de este tratamiento. El daño al tejido debido al escape vascular o edema se pueden reducir de esta forma. En particular, la presente invención proporciona un método para inhibir el aumento de la permeabilidad vascular en un tejido que sufre de una condición de enfermedad que está asociada con el escape vascular y/o edema al poner en contacto i tejido con una cantidad inhibidora de . • permeabilidad vascular, terapéuticamente eficaz, un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src c* . * un portador farmacéuticamente aceptable del m?sm->. En una modalidad preferida, un inhibidor de tirosina cinasa Src especifico se administra al tejido. Cualquier patología que incluya un aumento inducido por lesión, dañina, en la permeabilidad vascular y el daño al tejido debido a escape vascular o edema se pueden tratar mediante este método. Es'. eventos patológicos pueden incluir trauma hacia L - vasos sanguíneos tales como por ejemplo, ligación fisica, bloqueo, separación, oclusión, trauma y lo semejante. Otros eventos patológicos sistémicos tales como por ejemplo, aterosclerosis, retinopatia diabética, enfermedad inflamatoria debida a infección por agentes microbianos, artritis y lo semejante también se tratan adecuadamente mediante un método de la invención. Los métodos de la presente invención son útiles para tratar una enfermedad cerebrovascular o trauma al mejorar el daño del tejido debido al escape vascular aumentado y/o edema asociado con el mismo. En particular, los métodos de la presente invención son útiles para mejorar el daño al tejido asociados con el aumento suministrado por Src inducida por el Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) en la permeabilidad vascular. Sin embargo, los métodos de la invención no están limitados a los aumentos inducidos por VEGF en la permeabilidad vascular, y también son adecuados para modular el aumento suministrado por la tirosina cinasa de la familia Src en la permeabilidad vascular en respuesta a otras señales reguladoras. En particular, al inhibir la tirosina cinasa Src, (también denominada genéricamente en la presente como Src), y la tirosina cinasa Yes estrechamente relacionada (también denominada genéricamente en la presente como Yes) los tejidos tratados se pueden modular específicamente para inhibir en los mismos un aumento en la permeabilidad vascular asociada con lesión o enfermedad. Un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src para los fines de la presente invención es un inhibidor químico seleccionado del grupo que consiste de PPl, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 y Geldanamicina . Otros inhibidores químicos de las tirosina cinasas de la familia Src también son adecuados para utilizarse en los métodos de la invención. La permeabilidad vascular en tejidos también se pueden modular al administrar al tejido un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src que sea un inhibidor de proteina, tal como por ejemplo, una proteina Src inactiva similar, a Src K295M o Src 251, o una proteina Yes inactiva, o una proteina cinasa Src (CSK) c-terminal, activa. Para la modulación de la permeabilidad vascular en un tejido también es adecuado un ácido nucleico que codifique para una proteina inhibidora de tirosina cinasa de la familia Src, tal como por ejemplo, una Src inactiva, Yes inactiva o proteina CSK activa. Estos inhibidores de ácido nucleico de la actividad tirosina cinasa de la familia Src pueden abarcar uno o más vectores de expresión retroviral, vectores de expresión no viral o lo semejante. Estos inhibidores de ácido nucleico pueden comprender las señales reguladoras adecuadas, tales como por ejemplo, promotores o intensificadores para uno o más segmentos que se pueden expresar de ácido nucleico o cualquier ácido nucleico determinado. En un aspecto adicional de la presente invención, los artículos de fabricación comprenden material de empaque y una composición farmacéutica contenida dentro de ese material de empaque, en donde la composición farmacéutica es capaz de modular la permeabilidad vascular en un tejido que sufre de una condición de enfermedad. El material de empaque comprende una etiqueta que indica que la composición farmacéutica se puede utilizar para tratar el escape vascular o las condiciones de enfermedad asociadas con edema y la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de tirosina cinasa de lá familia Src 'en un portador farmacéuticamente aceptable. Un articulo de fabricación de la invención puede contener como parte de la composición farmacéutica un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src que sea un inhibidor único. En particular, un inhibidor químico de tirosina cinasa de la familia Src, preferido, se selecciona del grupo que consiste de PPl, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 y Geldanamicina, o los compuestos con una actividad inhibidora Src similar. El inhibidor más preferido es PPl.

Un articulo de fabricación de la invención también abarca la composición farmacéutica que comprende un inhibidor de tirosina cinasa de la familia de la proteina Src que es una proteina Src inactiva tal como por ejemplo Src K295M o Src 251, una proteina Yes inactiva, o una proteina CSK activa. Alternativamente, la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico que codifica para un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src, en un portador farmacéuticamente aceptable. En esta composición farmacéutica, el inhibidor para el cual el ácido nucleico codifica puede ser una proteina Src inactiva, tal como por ejemplo, Src K295M o Src 251, una proteina Yes inactiva, o una proteina CSK activa. Los artículos de fabricación pueden incluir una o más composiciones farmacéuticas que contienen inhibidores de tirosina cinasa de la familia Src, terapéuticos, o cantidades sub-terapéuticas de más de uno de los inhibidores de tirosina cinasa de la familia Src, en un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de los artículos de fabricación de la invención pueden comprender mezclas de una o más cantidades para modulación de la VP sirb- terapéuticamente eficaces de un inhibidor de tiros ¡.ría cinasa de la familia Src, que actúan con untamente para proporcionar un efecto reductor de la VP sobre tejido tratado. La composición farmacéutica del articulo de fabricación puede variar dependiendo del efecto modulador deseado y la etiquetación del envase también variará de manera correspondiente. La composición farmacéutica del articulo de fabricación puede variar dependiendo del efecto modulador o inhibidor deseado y la etiquetación del envase también variará de manera co espondiente.

En las secuencias que forman una porción de esta exposición: La SEQ ID NO : 2 es una secuencia de ADNc que es Src-c de pollo que es la secuencia de codificación completa con los intrónes suprimidos como se describió primero por Takeya et al., Cell , 32:881-890 (1983) . La secuencia es accesible a través Je GenBank Número de Acceso J00844. La secuenc'..-. contiene 1759 nucleótidos con ia porción codifican**-de la proteina qué inicia y termina en las posicionc-i de nucleótido respectivas 112 y 1713 (SEQ ID NO : 2 ) . La SEQ ID NO : 3 es la secuencia de residuos de aminoácidos codificado de Src-c de pollo de la secuencia de codificación mostrada en la SEQ ID NO : 2. La SEQ ID NO : 4 es una secuencia de ADNc de Src-c humana que es como se describió primero por Braeumnger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:10411-10415 (1991) . La secuencia es accesible > través de GenBank Número de Acceso X59932 X71157. La secuencia contiene 2187 nucleótidos con la porción codificante de la proteina que inicia y termina en las posiciones 134 y 1486 de nucleótido respectivas (SEQ ID NO: 4) . La SEQ ID NO : 5 es la secuencia de residuos de aminoácidos codificados de la Src-c humana de la secuencia de codificación mostrada en la SEQ ID NO : 4. La Figura 1 ilustra la activación de la Src endógena mediante FGFb o VEGF como se describió en el Ejemplo 4. La porción superior de la Figura indica los resultados de un análisis de cinasa in vi tro con la cantidad de activación de Src-c endógena mediante cualquier FGFb y VEGF. La parte inferior de la Figura es la transferencia de análisis de cinasa probada con un anticuerpo anti-Src como un control de carga para la Src equivalente y el contenido de IgG. La Figura 2 ilustra el efecto de la expresión de genes suministrada por retrovirus de la Src-c A sobre la angiogénesis en la CAM de pollo como se describe en el Ejemplo 4. Las CAM de pollo de nueve dias de edad se expusieron a RCAS-Src A (Src-c mutada activa) o los retrovirus RCAS-GFP control (Proteina Fluorescente Verde; una proteina indicadora fluorescente) o un amortiguador durante 72 horas. El nivel de angiogénesis se cuantificó como se muestra en la Figura 2A con fotomicrografías representativas (4x) en la Figura 2B que corresponde a cada tratamiento tomado con un estereomicroscopio . La Figura 3 ilustra la expresión retroviral de Src-c 'A en la fosforilación de la cinasa MAP vascular activante. La Figura 3A muestra extractos de tejido de las CAM de pollo de 10 dias de edad que se hablan expuesto a VEGF o PMA durante 30 minutos o se infectaron con retrovirus de Src-c A durante 48 horas. NT significa sin tratamiento. La Src se inmunoprecipitó a partir de cantidades equivalentes de extracto de proteina total y se sometió a un análisis de cinasa compleja inmune, in vi tro, utilizando una proteina de fusión FAK-GST como un sustrato, se sometió a electroforesis y se transfirió a nitrocelulosa. Las alicuotas de los lisados de tejido total anteriores también se midieron para la fosforilación ERK endógena mediante inmunotransferencia con un anticuerpo anti-fosfo-ERK . La Figura 3B muestra las CAM de pollo de 10 dias de edad que se infectaron con RCAS simulado o RCAS que contiene SRC A. Después de dos dias, las CAM se desecaron, crioconservaron en OCT y se seccionaron en 4µm. Las secciones se inmunotiñeron con un anticuerpo anti-fosfori lado ERK (New England Biolabs), se lavaron y detectaron con un anticuerpo secundario conjugado con FITC de cabra anti-conejo. Las imágenes fluorescentes se capturaron en una cámara CCD enfriada (Princeton Inst.) . La Figura 4 ilustra el requerimiento selectivo para la actividad Src durante VEGF, pero sin angiogénesis inducida por FGFb. Las CAM de pollo de nueve dias de edad se expusieron a RCAS-Src 251 o los retrovirus RCAS-GFP control o el amortiguador durante 20 horas y luego se incubaron durante unas 72 horas adicionales en presencia o ausencia de FGFb o VEGF. El nivel de angiogénesis se cuantificó Figura 4A como se describió anteriormente, y las fotomicrografías representativas (6x) se tomaron con un estereomicroscopio como se muestra en la Figura 4B. La Figura 4C muestra una transferencia probada con un anticuerpo anti-Src para confirmar la expresión de Src 251 en células transfectadas en comparación con tratamientos simulados. La Figura 5 ilustra los resultados del suministro retroviral de RCAS-Src 251 para tumores humanos. La Figura 5A es una micrografia que muestra un fragmento tumoral de meduloblastoma humano infectado con RCAS-GFP (RCAS-Proteina Fluorescente Verde) que expresa GFP exclusivamente en los vasos sanguíneos del tumor (punta de flecha) según se detecta mediante seccionamiento óptico con un microscopio de exploración confocal láser Bio Rad (bar=500 µm) . La Figura 5B representa los datos de los tumores tratados con aplicación tópica de retrovirus, que se dejaron desarrollar durante 3 ó 6 dias después de los cuales se reseccionaron y se determinaron los pesos en número. Los datos se expresan como el cambio medio en el peso tumoral (a partir del peso inicial del tumor de 50 mg) +/- SEM de 2 replicados. La Figura 5C representa en micrografias representativas, tumores de meduloblastoma retirados quirúrgicamente de los embriones (bar=350 µm) . Los paneles inferiores son vistas bastante aumentadas de cada tumor que muestra la vasculatura de cada tumor en detalle (bar=350 µm) . La punta de flecha indica el rompimiento del vaso sanguíneo en tumores tratados con RCAS-Src251. La Figura 6 es un diagrama que ilustra un mapa de restricción de la construcción del vector RCASBP (RCAS) (SEQ ID NO : 1 ) . La secuencia de la página 154 representa la secuencia de residuos de aminoácidos codificados de la proteina Yes-c humana en una representación de aminoácidos de una sola letra (SEQ ID NO : 8 ) . La secuencia de aminoácidos descrita en las páginas 154, 155 y 156 representa la secuencia de ácido nucleico de un ADNc que codifica para la proteina Yes-c humana. La secuencia es accesible a través de GenBank Número de acceso M15990. La secuencia contiene 4517 nucleótidos con la porción codificante de proteínas que empieza y termina en las posiciones 208 y 1839 del nucleótido respectivo, y que se traducen al aminoácido representado en la página 154 . La Figura 7 representa los resultados del suministro retroviral de Src 251 y CSK en un modelo de angiogénesis de murino subcutáneo. La Figura 7A ilustra los resultados de inmunotransferencia para detectar la expresión flk. La Figura 7B ilustra los resultados de la inmunotrasferencia a partir del análisis para flk bajo las condiciones estimuladas por VEGF y FGFb. La Figura 7C es una gráfica en la que se traza el número de vasos sanguíneos CD34 positivos (promedio de ' campos aleatorios por triplicado a 20x) mediante el tratamiento a medida que se estimula por VEGF y FGFb en presencia de retrovirus GFP, Src 251, o CSK. La Figura 8 ilustra los resultados de un análisis de Miles modificado para la VP o VEGF en la piel de un ratón con deficiencia de Src, fyn y Yes. La Figura 8A son fotografías de orejas tratadas. La Figura 8B son gráficas de los resultados experimentales para la 'estimulación de los diverso. ratones con deficiencia. La Figura 8C traza . -. cantidad de tinté azul de Evan eluido mediante e. tratamiento . La Figura 9 es una gráfica que representa el tamaño relativo del infarto én Src +/-, Src-/-, tipo silvestre (WT) y un ratón tipo silvestre tratado con PPl. El tratamiento con PPl consistió de 1.5 mg/kg de peso corporal . La Figura 10 representa las exploración".*-: MRI secuenciales de control y de cerebro de ratn;. tratados con PPl que muestran menos infarto cerebral en el animal tratado con PPl (derecha) que en el animal control (izquierda) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A. Definiciones Residuo de aminoácidos: un aminoácido formado en el momento de la digestión química (hidrólisis) de un polipéptido en sus enlaces peptidicos. Los residuos de aminoácidos descritos en la presente de preferencia están en la forma isomérica "L". Sin embargo, los residuos en la forma isomérica "D" se pueden sustituir por cualquier residuo de L-aminoácidos, siempre y cuando la propiedad funcional deseada se mantenga por parte del polipéptido. NH2 se refiere al grupo amino libre presente en el término amino de un polipéptido. COOH se refiere al grupo carboxi libre presente en el término carboxi de un polipéptido. De conformidad con la nomenclatura de polipéptidos estándar (descrita en J. Biol. Chem., 243:3552-59 (1969) y adoptada en 37 CFR §1.822(b) (2)) . Se debe observar que todas las secuencias de residuos de aminoácidos se representan en la presente mediante fórmulas cuya orientación izquierda y derecha está en la dirección convencional del termino amino al término carboxi. Además, se debe observar que un guión al inicio o al final de una secuencia de residuos de aminoácidos indica un enlace peptidico para una secuencia adicional de uno o más residuos de aminoácidos . Polipéptido : se refiere a una serie lineal de residuos de aminoácidos conectados entre si mediante uniones peptidicas entre el grupo alfa amino y el grupo carboxi de los residuos de aminoácidos contiguos . Péptido : en el sentido en el que se utiliza en la presente se refiere a una serie lineal de no más de aproximadamente 50 residuos de aminoácidos conectados entre si como en un polipéptido. Péptido cíclico: se refiere a un compuesto que tiene una estructura de anillo heteroatómico que incluye diversos enlaces amida como en un péptido típico. El péptido cíclico puede ser un polipéptido lineal ciclisado "cabeza a cola" homodético en el cual un término n del péptido lineal ha formado un enlace amida con el carboxilato c-terminal del péptido lineal, o puede contener una estructura de anillo en la cual el polímero es heterodético y comprende enlaces amida y/u otros enlaces para cerrar el anillo, tal como fuentes disulfuro, tioésteres, tioamida, guanidino y los enlaces semejantes. Proteína : se refiere a una serie lineal de más de 50 residuos de aminoácidos conectados entre si como en un polipéptido. Proteína de fusión: se refiere a un polipéptido que contiene al menos dos dominios polipeptidicos diferentes enlazados operativamente mediante un enlace peptidico tipico ("fusionado"), en donde los dos dominios corresponden a los péptidos no encontrados fusionados en la naturaleza. Péptido sintético: se refiere a una cadena producida químicamente de residuos de aminoácidos enlazados conjuntamente mediante enlaces peptidicos que está libre de las proteínas que se presentan en la naturaleza y los fragmentos de las mismas.

B . Consideraciones generales La presente invención se relaciona en general con: (1) el descubrimiento de que la VP inducida por VEGF se suministra específicamente por las proteínas tirosina cinasa Src y Yes, y que la VP se puede modular al proporcionar cualesquiera proteínas Src o Yes activas o inactivas para potenciar o inhibir la angiogénesis, respectivamente; (2) el descubrimiento adicional de que el escape vascular y/o edema asociados con trauma, enfermedad de lesiones relacionadas se incrementan en la permeabilidad vascular que se puede modular específicamente y mejorar, mediante la inhibición de la actividad tirosina cinasa de la familia Src; y (3) el descubrimiento de que la administración in vi vo de un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src disminuye el daño al tejido debido al aumento relacionado con una enfermedad -o lesión- en la permeabilidad vascular que no está -asociada con cáncer o angiogénesis. Este descubrimiento es importante debido a la-función que la permeabilidad vascular desempeña en una variedad de procesos de enfermedad y en asociación con la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos. En donde los tejidos asociados con una condición de enfermedad requieren de la angiogénesis para el desarrollo de tejidos. Es conveniente inhibir la angiogénesis y con esto inhibir el desarrollo de tejido enfermo. La angiogénesis se puede inhibir de manera más efectiva mediante la inhibición simultánea de la VP . Cuando un tejido lesionado requiere de angiogénesis para el desarrollo de tejido y cicatrización, es conveniente potenciar o promover la VP y asi la angiogénesis, y con esto estimular la cicatrización y desarrollo de tej idos . Cuando el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos es la causa de, o contribuye a, la patología asociada con un tejido enfermo, la inhibición de la VP, y con esto la angiogénesis reducirán los efectos dañinos de la enfermedad. Al inhibir la VP asociada con la angiogénesis, se puede intervenir en la enfermedad, mejorar los síntomas y en algunos casos curar la enfermedad. En ciertos casos, es conveniente una VP aumentada para aumentar la eficiencia del suministro de fármacos via la administración sistémica. La barrera hemoencefálica es un término utilizado para describir la estricta regulación de la VP y de esta forma el acceso minimo de fármacos de molécula incluso pequeña al cerebro provenientes de la circulación. La capacidad de modular selectiva y específicamente la permeabilidad de la barrera hemoencefálica via la modulación de la VP de los vasos sanguíneos implicados permitirá la administración de fármacos que de otra manera podrían no ser capaces de pasar via la circulación en los tejidos cerebrales. De manera similar, muchas patologías y daños inducidos por apoplejía se provocan por el aumento repentino en la VP, y de esta forma la capacidad de modular específicamente la VP permitirá que los tratamientos novedosos y eficaces reduzcan los efectos adversos de la apoplejía. Los métodos de la presente invención son eficaces en parte debido a que la terapia es bastante selectiva para la VP y no para otros procesos biológicos . La presente invención se relaciona, en parte, con el descubrimiento de que la angiogénesis se proporciona mediante la proteina tirosina cinasa Src, y que la angiogénesis se puede modular al proporcionar cualesquiera proteínas Src activas o inactivas para potenciar o inhibir la angiogénesis, respectivamente . Este descubrimiento es importante debido a la función que la angiogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos, desempeña en una variedad de procesos de enfermedad. En donde los tejidos asociados con una condición de enfermedad requieren de angiogénesis para el desarrollo de tejidos, es conveniente inhibir la angiogénesis y con esto inhibir el desarrollo de tejido enfermo. Cuando un tejido lesionado requiere de la angiogénesis para el desarrollo y curación del tejido, es conveniente potenciar o estimular la angiogénesis y con esto estimular la cicatrización y desarrollo del tejido. En donde el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos es la causa de, o contribuye a, la patología asociada con un tejido enfermo, la inhibición de la angiogénesis reducirá los efectos dañinos de la enfermedad. Al inhibir la angiogénesis, se puede intervenir en la enfermedad, mejorar los síntomas y en algunos casos curar la enfermedad. Ejemplos de tejido asociado con la enfermedad y la neovascularización que se beneficiarán de la modulación inhibidora de la angiogénesis incluyen artritis reumatoide, retinopatia diabética, enfermedades inflamatorias, restenosis y lo semejante. En donde se requiere el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos para apoyar el desarrollo de un tejido dañino, la inhibición de la angiogénesis reducirá el suministro de sangre al tejido y con esto contribuirá a la reducción en la masa del tejido con base en los requerimientos de suministro sanguíneo. Los ejemplos incluyen el desarrollo de tumores en donde la neovascularización es un requerimiento continuo para que el tumor se desarrolle más allá de algunos milímetros de espesor, y para el establecimiento de metástasis de tumor sólido . En donde se cree que el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos contribuye a la cicatrización de tejidos, la potenciación de la angiogénesis ayudará en la cicatrización. Los ejemplos incluyen el tratamiento de pacientes con miembros isquémicos en los cuales existe una circulación deficiente en los miembros a partir de la diabetes u otras condiciones. También se contemplan a los pacientes con heridas crónicas que no cicatrizan y por lo tanto podrían beneficiarse del aumento de la proliferación celular vascular y la neovascularización. Los métodos de la presente invención son eficaces en parte debido a que la terapia es bastante selectiva para la angiogénesis y no para otros procesos biológicos. Como se describió anteriormente, la angiogénesis incluye una variedad de procesos que incluyen la neovascularización de un tejido que incluye "generación" vasculogénesis o agrandamiento de vasos, todos estos procesos de angiogénesis se ven afectados por la proteina Src. Con excepción de la cicatrización de heridas traumáticas, formación del cuerpo lúteo y embriogénes is , se cree que la mayoría de los procesos de angiogénesis están asociados con los procesos de enfermedad y por lo tanto el uso de los métodos terapéuticos de la presente son selectivos para la enfermedad y no tienen efectos secundarios dañinos. La presente invención también se relaciona, en parte, con el descubrimiento de que el escape vascular y/o edema asociados con el aumento relacionado con trauma, enfermedad o lesión en la permeabilidad vascular se pueden modular específicamente y mejorar, mediante la inhibición de la actividad tirosina cinasa de la familia Src. En particular, la presente invención se relaciona con el descubrimiento de que la administración i n vi vo de un inhibidor tirosina cinasa de la familia Src disminuye el daño al tejido debido al aumento relacionado con la enfermedad -o lesión- en la permeabilidad vascular que no está asociada con cáncer o angiogénesis. Mientras que la administración de un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src modula el aumento de la VP inducido por VEGF, la inhibición específica de la actividad cinasa de la familia Src mejora el daño a los tejidos circundantes provocados por el escape vascular y/o edema, sin embargo, se activa la señal cinasa de la familia Src. La permeabilidad vascular está implicada en una variedad de procesos de enfermedad independientes de cualquier asociación directa con la angiogénesis . Por ejemplo, muchas patologías y daños inducidos por apoplejía están provocados por el aumento repentino en la VP debido al trauma al vaso sanguíneo y de esta forma la capacidad de modular específicamente la VP permitirá tratamientos novedosos y eficaces para reducir los efectos adversos de la apoplejía. Ejemplos de tejido asociado con escape vascular y/o edema inducidos por enfermedad o lesión que se beneficiarán de la modulación inhibidora especifica utilizando un inhibidor cinasa de la familia Src incluyen artritis reumatoide, retinopatia diabética, enfermedades inflamatorias, restenosis v lo semejante. El trauma a la cabeza o columna vertebral y otros accidentes cerebrovasculares típicamente provocados por eventos isquémicos o he orrágicos, son la causa principal de los trastornos neurológicos y lesiones relacionadas. El edema cerebral o escape vascular que resulta de estas lesiones, es una patología que amenaza la vida que activa el daño sistémico y diseminado al cerebro y médula espinal (sistema nervioso central; CNS) y es muy útil la capacidad de modular específicamente los efectos que dañan al tejido del escape vascular y edema en estos casos . Las infecciones del CNS, meningitis, ceribritis, encefalitis, pueden todas dar por resultado en la patología adversa que incluye el edema cerebral. El tratamiento de la infección implícita se pueden complementar con una terapia específica para reducir el escape vascular o edema. Se ha reportado que la neutralización sistémica de la proteina VEGF que utiliza una proteína de fusión IgG del receptor VEGF reduce la intensidad del infarto después de la isquemia cerebral, este efecto se atribuyó a la reducción de la permeabilidad vascular suministrada por VEGF. N. van Bruggen et al., J. Clin. Inves. 104:1613-1620 (1999) . Sin embargo, VEGF no es el suministrador critico del aumento de permeabilidad vascular que en la actualidad se ha descubierto para ser Src. Otras enfermedades o condiciones en donde el aumento suministrado por Src en la permeabilidad vascular se implica y de esta forma son objetivos adecuados para el tratamiento mediante los métodos y con las composiciones de la presente invención pueden incluir: hemorragia cerebral, trauma del cerebro y la médula espinal, lesión del cerebro y médula espinal inducida por hipoxia, trastornos inflamatorios del CNS: infecciones virales o bacterianas (por ejemplo meningitis, encefalopatía por VIH), trastornos autoinmunes (por ejemplo esclerosis múltiple); enfermedades con un aumento crónico en la permeabilidad de la barrera hemoencefálica (por ejemplo Morbus Alzheimer); en cirugías en donde es necesario un deterioro temporal de la perfusión u oxigenación de tejidos, como un agente protector; síndrome de distrés respiratorio en adultos (ARDS); artritis reumatoide; y retinopatía diabética.

C. Proteínas tirosina cinasa de la familia Src Una proteína tirosina cinasa para utilizarse en la presente invención puede variar dependiendo del uso pretendido. Los términos "proteina Src" o "Src" se utilizan para referirse colectivamente a las diversas formas de la proteína tirosina cinasa Src descrita en la presente, ya sea en sus formas activas o inactivas. Los términos "proteína Yes" o "Yes" se utilizan para referirse colectivamente a las diversas formas de la proteina tirosina cinasa Yes descrito en la presente, ya sea en sus formas activas o inactivas. También, en el contexto de la descripción, también se hace referencia a Src o Yes que codifican para la secuencia genética o genes de ácido nucleico. El término "familia de Src" se refiere al grupo de tirosina cinasas que están relacionadas con la función y la secuencia de aminoácidos para Src.

Una "proteina Src activa" se refiere a cualquiera de una variedad de formas de la proteina Src que potencian la angiogénesis o la VP . Una "proteína Yes activa" se refiere a cualquiera de una variedad de formas de la proteína Yes que potencian la VP . Los análisis para medir la potenciación de la angiogénesis o la VP se describen en la presente, y no se pretende que sean limitantes. Una proteína se considera activa si el nivel de angiogénesis o la VP es de al menos 10% mayor, de preferencia 25% mayor y con lá máxima preferencia 50% mayor que el nivel control en donde no se agrega ninguna proteína al sistema de análisis. El análisis preferido para medir la potenciación de la angiogénesis es el análisis CAM que utiliza un vector viral RCAS como se describe en los ejemplos, en los cuales el índice angiogénico se calcula mediante el conteo de puntos de ramificación. Un análisis preferido para medir la potenciación de la VP es el análisis de Miles que utiliza un tinte azul de Evan en ratones como se describe en los Ejemplos, en los cuales la VP se mide por la cantidad de tinte azul de Evan filtrado de los vasos sanguíneos. Una proteína Src o Yes activa, preferida, también exhibe una actividad tirosina cinasa. Las proteínas Src o Yes activa, de Ejemplo, se describen en los Ejemplos e incluyen Src-A y Yes-1.

Una "proteína Src inactiva" se refiere a cualquiera de una variedad de formas de la proteína Src que inhiben la angiogénesis o la VP . Una "proteina Yes inactiva" se refiere a cualquiera de una variedad de formas de la prcteína Yes que inhiben la VP . Los análisis para medir la inhibición del aumento de la VP se describen en la presente, y no pretender ser limitantes. Una proteina Src se considera inactiva si el nivel de angiogénesis es al menos 10% inferior, de preferencia 25% inferior y con la máxima preferencia 50% inferior que un nivel control en donde no se agrega Src exógena al sistema de análisis. Una proteína Src o Yes se considera inactiva si el nivel de la VP es al menos el mismo que o 10% inferior, de preferencia 25% inferior y con la máxima preferencia 50% inferior que un nivel control en donde no se agrega Src o Yes exógena al sistema del análisis . El análisis preferido para medir la inhibición de la angiogénesis es el análisis CAM que utiliza un vector viral RCAS como se describe en los ejemplos, en los cuales el Índice angiogénico se calcula mediante el conteo de puntos de ramificación. Un análisis preferido para medir la inhibición de la VP es el análisis de Miles que utiliza tinte azul de Evan en ratones como se describe en los Ejemplos, en los cuales la VP se mide mediante la cantidad de tinte azul de Evan filtrado a partir de los vasos sanguíneos. Una proteína Src o Yes inactiva, preferida, también exhibe una actividad tirosina cinasa reducida. Las proteínas Src inactivas, de Ejemplo, se describen en los ejemplos, e incluyen Src-251 y Src K295M. Una proteina Src útil en la presente invención se puede producir mediante cualquiera de una variedad de métodos entre los que se incluyen el aislamiento de fuentes naturales que incluyen tejido, producción mediante la expresión y purificación de ADN recombinante y lo semejante. La proteina Src y/o Yes también se puede proporcionar " i n si t u" mediante la introducción de un sistema de terapia de genes al tejido de interés que luego se expresa la proteína en el tejido. Un gen que codifica para una proteína Src ^ Yes se puede preparar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, y la invención no se debe interpretar como limitante con respecto a esto. Por ejemplo, el historial natural de Src es bien conocido para incluir una variedad de homólogos a partir de mamíferos, aves, virales y especies semejantes, y el gen se puede clonar fácilmente utilizando métodos de clonación de ADNc a partir de cualquier te ido que exprese la proteina. Una Sr." preferida para utilizarse en la invención es una proteina celular, tal como por ejemplo, los homólogos mamíferos o avícolas designados Src-c. Se prefiere particularmente la Src-c humana. Una Yes preferida para utilizarse en la invención es una proteína celular humana, Yes-c. En particular se prefiere la Yes-l-c humana que codifica para la secuencia de aminoácidos representada en la secuencia de la página 154. La proteína Yes-1 de la secuencia de la página 154 se codifica para un segmento de la secuencia de ácido nucleico representada en la secuencia de aminoácidos descrita en las páginas 154, 155 y 156 y se identifica como el segmento de dominio codi ficante .

D. Moléculas de ADN recombinante y sistemas de expresión para la expresión de la proteína Src o Yes La invención describe diversas secuencias nucleotídicas de uso particular en la presente invención. Estas secuencias incluyen secuencias que codifican para una proteina Src útil en la invención y diversos segmentos de ADN, moléculas y vectores de ADN recombinante (ADNr) construidos para la expresión de una proteina Src. Estas secuencias también incluyen secuencias que codifican para una proteina Yes útil en la invención, y diversos segmentos de ADN, moléculas y vectores de ADN recombinante (ADNr) construidos para la expresión de la proteina Yes.

Las moléculas de ADN (segmentos) de esta invención por lo tanto pueden comprender secuencias que codifican para genes estructurales totales, fragmentos o genes estructurales, o una combinación de genes, y unidades de trascripción como se describe adicionalmente en la presente. Un segmento de ADN preferido es una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína Src o Yes o ambas como se define en la presente, o un fragmento biológicamente activo de la misma. La secuencia de residuos de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de una Src y Yes preferida se describe en los Ejemplos. Un segmento de ADN preferido codifica para una secuencia de residuos de aminoácidos sustancialmente igual, y de preferencia que consiste esencialmente de, una secuencia de residuos de aminoácidos o porciones de la misma que corresponden a una proteina Src o Yes descrita en la presente. Los segmentos de ADN representativos y preferidos se describen adicionalmente en los Ejemplos. La secuencia de residuos de aminoácidos de una proteína o polipéptido se relaciona directamente vía el código genético para la secuencia de ácido desoxirribonucleico (ADN) del gen estructural que codifica para la proteína. De esta forma, un gen estructural o segmento de ADN se puede definir en los términos de la secuencia de residuos de aminoácidos, es decir, la proteina o el polipéptido, para el cual codifica . Una característica importante y bien conocida del código genético es su redundancia. Es decir, para la mayoría de los aminoácidos utilizados para producir proteínas, más de un triplete de nucleótidos codificantes (codón) pueden codificar para o designar un residuo de aminoácidos particular. Por lo tanto, varias secuencias de nucleótidos diferentes pueden codificar para una secuencia de residuos de aminoácidos particular. Estas secuencias de nucleótidos se consideran funcionalmente equivalentes debido a que pueden dar por resultado en la producción de la misma secuencia de residuos de aminoácidos en todos los organismos. Ocasionalmente, una variante metilada de una urina o pirimidina se puede incorporar en una secuencia de nucleótidos determinada. Sin embargo, esta metilación no afecta la relación de codificación de ninguna forma. Un ácido nucleico es cualquier polinucleótido o fragmento de ácido nucleico, puede ser un polinucleótido de pol idesoxirr ibpnucleót ido , es decir ARN o ADN, o análogos de los mismos. En modalidades preferidas, una molécula de ácido nucleico está en ia forma de un segmento de ADN dúplex, es decir, un segmento de ADN, aunque para ciertas metodologías biológicas moleculares, se prefiere un ADN o ARN de cadena simple.

Los segmentos de ADN se producen mediante varios medios que incluyen los métodos de sintesis química y propuestas recombinantes, de preferencia mediante clonación o mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) . Los segmentos de ADN que codifican para las porciones de una proteina Src se pueden sintetizar fácilmente mediante técnicas químicas, por ejemplo, el método de fos fotriés ter de Matteucci et al, J. Am. Chem. Soc, 103:3185-3191, 1981, o utilizando métodos automatizados de síntesis. Además, los segmentos de ADN mayores se pueden preparar fácilmente mediante métodos bien conocidos, tales como por ejemplo, la síntesis de un grupo de oligonucleótidos que definen al segmento de ADN, seguida por la hibridización y ligación de oligonucleótidos para construir el segmento completo. Los métodos alternativos incluyen el aislamiento de un segmento de ADN preferido mediante PCR con un p t de cebadores de oligonucleótido utilizados en una biblioteca de ADNc que se cree contiene miembros que codifican para una proteína Src. Por supuesto, a través de la síntesis química, se pueden realizar modificaciones deseadas simplemente al sustituir las bases adecuadas por aquellas que codifican para la secuencia de residuos de aminoácidos naturales. Este método es bien conocido, y se puede aplicar fácilmente la produce i r. de diversas proteínas Src "modificadas" diferente.-í descritas en la presente. Además, los segmentos de ADN que consisten esencialmente de genes estructurales que codifican para una proteina Src o Yes se pueden modificar posteriormente, mediante mutagénesis sitiodirigida o aleatoria, para introducir cualesquiera sustituciones deseadas . 1. Clonación de un gen Src o Yes Un gen Src o Yes de esta invención se puede clonar a partir de una fuente adecuada de ADN genómico o ARN mensajero (ARNm) mediante una variedad de métodos bioquímicos. La clonación de estos genes se puede conducir de acuerdo con los métodos generales descritos en los Ejemplos y como se sabe en la técnica. Las fuentes de ácidos nucleicos para clonar un gen Src o Yes adecuado para utilizarse en los métodos de esta invención puede incluir ADN genómico o ARN mensajero (ARNm) en la forma de una biblioteca de ADNc, a partir de un tejido que se cree expresa estas proteínas. Un tejido preferido es un tejido pulmonar humano, aunque se puede utilizar cualquier otro tejido adecuado. Un método de clonación preferido incluye la preparación de una biblioteca de ADNc que utiliza métodos estándar, y aislar la secuencia de nucleótidos que codifica para Src o que codifica para Yes mediante la amplificación PCR utilizando cebadores oligonucleotídicos pareados con base en las secuencias de nucleótidos descritas en la presente. Alternativamente, los clones de ADNc deseados se pueden identificar y aislar a partir una biblioteca de ADNc o genómica mediante métodos de hibridización de ácido nucleico convencionales, utilizando una sonda de hibridización con base en las secuencias de ácido nucleico descritas en la presente. Otros métodos para aislar y clonar ácidos nucleicos que codifican para Src o Yes, adecuados, son fácilmente evidentes para alguien con experiencia en la técnica. 2. Trans erencia de genes y/o vectores de expresión La invención contempla una molécula de ADN recombinante (ADNr) que contiene un segmento de ADN que codifica para una proteína Src o Yes, o ambas, como se describe en la presente. Un ADNr que se puede expresar se puede producir al enlazar operativamente (en un marco, que se puede expresar) un vector a un segmento de ADN que codifica para Src o Yes de la presente invención. De esta forma, una molécula de ADN recombinante es una molécula de ADN híbrido que comprende al menos dos ácidos nucleicos de una de las secuencias nucleotídicas no encontradas por lo general juntas en la naturaleza. La elección del vector al cual se une operativamente un segmento de ADN de la presente invención depende directamente, como es bien sabido en la técnica, de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo, expresión de proteína y la célula hospedera que será transformada. Consideraciones típicas en la técnica para construir moléculas de ADN recombinante. Un vector contemplado por la presente invención es al menos capaz de dirigir la replicación y de preferencia también la expresión de un gen estructural incluido en los segmentos del A.DN vector, a los cuales se une operativamente . Cuando un vector de expresión contiene una secuencia de ácido nucleico tanto Src como Yes que se puede expresar, los dos genes se pueden regular mediante los mismos elementos reguladores en la dirección 5' del primer gen, o cada uno individualmente se puede regular mediante elementos reguladores por separado. Los vectores de expresión tanto procarióticos como eucarióticos son familiares para alguien con experiencia normal en la técnica de la construcción de vectores y se describen por Ausebel, et al . , en Current Protocols in Molecular Biology, Wiley and Sons, New York (1993) y por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) . Estas referencias también describen muchos de los métodos de ADN recombinante generales a los que se hace referencia en la presente. En una modalidad, un vector contemplado por la presente invención incluye un replicón procariótico, es decir, una secuencia de aAD que tiene la capacidad de dirigir la replicación autónoma y mantener la molécula de ADN recombinante extracromosómicamente en una célula hospedera procariótica, tal como por ejemplo, una célula hospedera bacteriana, transformada con la misma. Estos replicones son bien conocidos en la técnica. aAdemás, aquellas modalidades que incluyen un replicón procariótico también incluyen un gen cuya expresión confiere resistencia a fármacos a una hospedera bacteriana transformada con la misma. Los genes con resistencia a fármacos, bacterianos, típicos, son aquellos que confieren resistencia para la ampicilina o tetraciclina. Aquellos vectores que incluyen un replicón procariótico también pueden incluir un promotor procariótico capaz de dirigir la expresión (trascripción y traducción) de un gen estructural en una célula hospedera bacteriana, tal como por ejemplo, E . col i , t ansformada con la misma. Un promotor es un elemento para controlar la expresión formado mediante una secuencia de ADN que permite que se presente la unión ie la polimerasa de ARN y la trascripción. Las secuencias promotoras compatibles con hospederos bacterianos típicamente se proporcionan en vectores de plásmido que contienen sitios de restricción convenientes para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención. Típicos de estos plásmidos vectores son pUC8, pUC9, pBR322 y pBR329 disponibles de Biorad Laborato ies, (Richmond, CA) , pRSET y Invitrogen (San Diego, CJ ) y pPL y pKK223 disponibles de Pharmacia, Piscataway, N. J. Los vectores de expresión compatibles con células eucarióticas, de preferencia aquellas compatibles con células de vertebrados, también se pueden utilizar para formar las moléculas de ADN recombinantes de la presente invención. Los vectores de expresión de las células eucarióticas son bien conocidos en la técnica y están disponibles de diversas fuentes comerciales. Típicamente, estos vectores se proporcionan para que contengan sitios • restricción convenientes para la inserción e . segmento de ADN deseado. Típicos de estos vectorf...; son pSVL y pKSV-10 (Pharmacia), pBPV- l/pML2 :i (International Biotechnologies, Inc.), pTDTl (ATCC, #31255), pRc/CMV (Invitrogen, Inc.), el vector preferido descrito en los Ejemplos, y los vectores de expresión eucarióticos similares. Un sistema par icularmente preferido para la expresión de genes en el contexto de esta invencí :. incluye un componente para suministro de genes, <=> decir, la capacidad para suministrar el gen al tejido de interés. Los vectores adecuados son vectores "infecciosos" tales como por ejemplo, virus de ADN recombinante, adenovirus o vectores de retrovirus que se someten a ingeniería genética para expresar la proteína deseada y tener características que permitan la inserción de los tejidos blanco preseleccionados . Se prefiere en particular la replicación competente del virus de 'sarcoma avícola (RCAS) descrito en la presente. Los sistemas celulares de mamífero que utilizan los virus recombinantes o elementos virales para dirigir la expresión se pueden someter a ingeniería genética. Por ejemplo, cuando se utilizan vectores de expresión de adenovirus, la secuencia codificante de un polipéptido se puede ligar a un complejo de control de trascripción/ traducción de adenovirus, por ejemplo, el último promotor y la secuencia líder tripartita.- Este gen quimérico entonces se puede insertar en el genoma de adenovirus mediante recombinanción in vi tro o in vi vo . La inserción en una región no esencial del genoma viral (por ejemplo, la región El o E3) dará por resultado en. un virus recombinantes que es viable y capaz de expresar el polipéptido en hospederos infectados (por ejemplo, véase Logan et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:3655-3659 (1984)) . Alternativamente, se puede utilizar el promotor "7.5K del virus de vaccinia (por ejemplo, véase, Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:7415-7419 (1982); Mackett et al., J. Virol., 49:857-864 (1984); Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79:4927-4931 (1982)) . De particular interés son los vectores ccn base en virus de papiloma bovino que tienen la capacidad de replicarse como elementos extracromosómicos (Sarver et al., Mol. Cell. Biol., 1:486 (1981)) . Poco después de la entrada de este ADN en las células blanco, el plásmido se replica de entre aproximadamente 100 hasta 200 copias por célula. La trascripción del ADNc insertado no requiere de la integración del plásmido en el interior del cromosoma hospedero. Proporcionando con esto un alto nivel de expresión. Estos vectores se pueden utilizar para una expresión estable al incluir un marcador seleccionable en el plásmido, tal como por ejemplo, el gen neo . Alternativamente, el genoma retroviral se puede modificar para utilizarse como un vector capaz de introducir y dirigir la expresión de la secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido en las células hospederas, (Cone et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81 6349-6353 (1984)) . También se puede alcanzar un alto nivel de expresión utilizando promotores que pueden ser inducidos, incluyendo de manera enunciativa: el promotor de metalotionina IIA y les promotores de choque térmico. Recientemente, se ha estudiado la supervivencia a largo plazo del promotor de citomegalovirus (CMV) contra la terapia de genes de timidina cinasa (TK) conducida por el promotor del virus de sarcoma Rous (RSV) en ratones desnudos que portan cáncer ovárico humano. Se ha encontrado que la eficacia de extermino celular de la terapia de genes de TK del virus herpes simples dirigida por el promotor CMV suministrado por adenovirus es de 2 hasta 10 veces más eficaz que la terapia dirigida por RSV. (Tong et al., 1999, Hybridoma 18 (l) :93-97) . También se ha descrito el diseño de los promotores quiméricos para las aplicaciones de terapia con genes, que se requieren para una expresión de bajo nivel seguida por la expresión a alto nivel que puede ser inducida. (Suzuki et al., 1996, Human Gene Therapy 7:1883-1893) . Para la producción en alto rendimiento, a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere una expresión estable. Antes que utilizar vectoras de expresión que contienen orígenes virales \:e replicación, las células hospederas se pueden transformar con un ADNc controlado mediante elementos control de expresión, adecuados (por ejemplo, secuencias promotoras e intensi ficadoras , terminadores de trascripción, sitios " de poliadenilación, etc.), y un marcador que se pueda seleccionar. Como se mencionó anteriormente, .'^1 marcador que se puede seleccionar en el plásmiJ recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células se integren de manera estable al plásmido y en el interior de sus cromosomas y se desarrollen para formar focos que a su vez se pueden clonar y expandir en el interior de las líneas celulares . Por ejemplo, después de la introducción del ADN extraño, las células manipuladas por ingenieria genética se pueden dejar que se desarrollen durante 1-2 días en un medio enriquecido y luego se cambian a un medio selectivo. Se pueden utilizar varios sistemas de selección entre los que se incluyen de manera enunciativa: genes de timidina cinasa del virus de herpes simplex (Wigler et al., Cell , 11:223 (1977)), de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa (Szybalska et al, Proc .

Natl. Acad. Sci., USA, 48:2026 (1962)), y adenina fos forribosil'transferasa (Lowy et al., Cell , 22:817 (1980)), que se pueden emplear en células tk", hgprt" o aprt" respectivamente. También, se pueden utilizar genes que confieren resistencia a antimetabolitos como la base de selección; por ejemplo, los genes para dhfr que confieren resistencia al metotrexato (Wigler et al., Proc. Nati. Acad. Sci., USA, 77:3567 (1980); O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:1527 (1981); gpt que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78:2072, (1981)); neo que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Colberre-Garapin et al, J. Mol . Biol . , 150:1 (1981)); e higro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al, Gene, 30:147 (1984)) . Recientemente, se han descrito genes seleccionables adicionales, a saber, trpB, que permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano; hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina (Hartman et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:804 (1988)); y ODC (descarboxilasa de ornitina) que confiere resistencia al inhibidor de descarboxilasa ornitina, 2- (difluorometil ) -DL-ornit ina, DFMO (McConlogue L., En: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed., (1987)). Los vectores principales contemplados para la terapia con genes humanos, se derivan de origen retroviral. (Wilson, 1997, Clin. Exp. Immunol. 107 (Sup. l):31-32; Bank et al., 1996, Bioessays 18 (12) : 999-1007; Robbins et al., 1998, Pharmacol. Ther. 80 ( 1 ) : 35- 7 ) . El potencial terapéutico de la transferencia de genes y la terapia antisentido ha simulado el desarrollo de muchos sistemas vector para tratar una variedad de tejidos. (Vasculature, Stephan et al., 1997, Fundam. Clin. Pharmacol. 11 (2) : 97-110; Feldman et al., 1997, Cardiovasc. Res. 35 ( 3 ) : 391-404 ; Vassalli et al., 1997, Cardiovasc. Res. 35 ( 3 ) : 459- 69 ; Baek et al., 1998, Circ. Res. 82 ( 3 ) : 295-305 ; kidney, Lien et al., 1997, K dney Int. Suppl. 61:S85-8; liver, Ferry et al., 1998, Hum Gene Ther. 9(14) :1975-81; muscle, Marshall et al., 1998, Curr. Opn . Genet. Dev . 8(3) :360-5) . Además de estos tejidos, un blanco crítico para la terapia con genes humanos es el cáncer, ya sea el tumor mismos o los tejidos asociados. (Runnebaum, 1997, Anticancer Res. 17 (4B) : 2887-90; Spear et al., 1998, J. Neurovirol. 4(2) : 133-47) . Los ejemplos específicos de los sistemas vector de terapia con genes virales que se pueden adaptar fácilmente para utilizarse en los métodos de la presente invención se describen brevemente más adelante. El suministro de genes retrovirales se ha reexaminado recientemente por Federspiel and Hughes (1998, Methods ín Cell Biol. 52:179-214) que describe en particular, la familia de retrovirus de virus de leucosis avícola (ALV) (Federspiel et al., Proc . Natl. Acad. Sci., USA, 93:4931 (1996); Federspiel et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:11241 (1994)) . Los vectores retrovirales, que incluyen virus de leucemia de ALV y murino (MLV) se describen adicionalmente por Svoboda (1998, Gene 206: 153-163) . Los sistemas de expresión modificada retroviral/adenoviral se pueden adaptar fácilmente para la práctica de los métodos de la presente invención. Por ejemplo, los sistemas de virus de leucemia de murino (MLV) se reexaminan por Karavanas et al., 1998, Crit. Rev. n Oncology/Hematology 28:7- . Los sistemas de expresión de adenovirus se reexaminan por Von Seggern y Nemerow en Gene Expression Systems (ed. Fernandez & Hoeffler, Academic Press, San Diego, CA, 1999, capítulo 5, páginas 112-157) . Se ha demostrado que los sistemas de expresión de proteína tienen uso eficaz tanto i n vi vo como i n vi t ro . Por ejemplo, se ha descrito una transferencia de genes eficientes para carcinomas de célula escamosa humana mediante un vector amplicón tipo 1 del virus de herpes simplex (HSV) . (Carew et al., 1998, Am. J. Surg. 176:404-408) . El virus de herpes simplex se ha utilizado para transferencia de genes al sistema nervioso. (Goins et al., 1997, J^ Neurovirol . 3 (Sup. 1) :S80-8) . Los vectores suicidas blanco que utilizan HSV-TK se han probado sobre tumores sólidos. (Smiley et al., 1997, Hum. Gene Ther. 8 (8) : 965-77) . El vector tipo 1 del virus de herpes simplex se ha utilizado para terapia de genes de cáncer sobre células de carcinoma de colon. (Yoon et al., 1998, Ann. Surg. 228 ( 3 ) : 366-74 ) . Los vectores híbridos se han desarrollado para extender el periodo de tiempo de transfección, incluyendo los híbridos HSV/AAV (virus adeno-asociados ) para hepatocitos de tratamiento (F aefel et al., 1997, Mol. Med. 3(12) : 813 - 825 ) . El virus de vac mia se ha desarrollado para la terapia de genes humanos debido a su gran genoma.

(Peplinski et al., 1998, Surg. Oncol. Clin. N. Am. 7 ( 3) : 575-88 ) . El virus de vaccinia con timidina cinasa suprimida que expresa purina nucleósido pirofos forilasa se ha descrito para utilizarse como un vector de terapia con genes dirigida al tumor. (Puhlman et al., 1999, Human Gene Therapy 10:649-657) . El virus 2 adeno-asociado (AAV) se ha descrito para utilizarse en terapia con genes humanos, sin embargo el .AAV requiere de un virus auxiliar (tal como por ejemplo, un adenovirus o virus de herpes) para una replicación y empacamiento óptimo en células mamíferas. (Snoeck et al., 1997, Exp . Nephrol. 5 ( 6 ) : 514-20 ; Rabinowitz et al., 1998, Curr. Opn . Biotechnol. 9(5) :470-5) . Sin embargo, se ha descrito el empacamiento i n vi tro de un AAV recombinante infeccioso, haciendo que este sistema sea mucho más promisorio. (Ding et al., 1997, Ge:;? Therapy 4:1167-1172) . Se ha mostrado que : ¿ transferencia suministrada por AAV del ADNc dei receptor de retrovirus ecotrópico permite ! transducción retroviral ecotrópica de células humanas establecidas y primarias. (Qing et al., 1997, J .

Virology 71(7) :5663-5667) . Se ha demostrado i a i terapia con genes de cáncer que utiliza un vector .AAV que expresa p53 tipo silvestre de humano. (Qazilbash et al., 1997, Gene Therapy 4:675-682) . También se r.. mostrado la transferencia de genes en células vasculares que utilizan vectores AAV. (Maeda et al., 1997, Cardiovascular Res. 35:514-521) . El /AAV se ha demostrado como un vector adecuado para terapia de genes dirigida al hígado. (Xiao et al., 1998, J^_ Virol. 72 (12) : 10222-6) . Los vectores de AAV se han demostrado para utilizarse en terapia con genes en tejidos cerebrales y el sistema nervioso central. (Chamberlin et al., 1998, Brain Res. 793 ( 1-2 ) : 169-75 ; During et al., 1998, Gene Therapy 5(6) :820-7) . Los vectores de 7AAV también se han comparado con los vectores de adenovirus (AdV) para la terapia con genes del pulmón y 'la 'transferencia a células hepiteliales de fibrosis cistica humana. (Teramoto et al., 1998, J. Virol. 72 ( 11 ) : 8904-12 ) . Los sistemas vector de terapia con genes ADV/retrovirales y médicos que incorporan las calidades útiles de cada virus para crear un AdV no integrante que se hace funcionalmente integrante vía la generación intermedia de una célula productora retroviral. (Feng et al., 1997, Nat. Biotechnology 15 (9) :866-70; Bilbao et al., 1997, FASEB J 11(8) :624-34) . Esta nueva generación poderosa del vector de terapia con genes se ha adaptado para la terapia con genes de cáncer blanco. (Bilbao et al., 1998, Adv. Exp . Med. Biol . 451:365-74) . La inyección individual de p53 que expresa AdV inhibió el desarrollo de nodulos tumorales subcutáneos de células cancerosas de próstata humana. (Asgari et al., 1997, Int . J .

Cáncer 71 ( 3 ) : 377-82 ) . Se ha descrito la transferencia de genes suministrada por AdV de p53 tipo silvestre en pacientes con cáncer pulmonar de célula no pequeña avanzado. (Schuler et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2075-2082) . Este mismo cáncer ha sido el sujeto p53 de la terapia de reemplazo de genes suministrada por los vectores AdV. (Roth et al., 1998, Semin. Oncol. 25(3 Suplemento 8) :33-7) . La transferencia de genes suministrada por AdV de p53 inhibe la diferenciación celular endotelial y la angiogénesis i n vi vo . (Riccioni et al., 1998, Gene Ther . 5 ( 6) : 747-54 ) . También se ha descrito la expresión suministrada por adenovirus del antigeno de melanoma gp75 como inmunoterapia para melanoma metastático. (Hirschowitz et al., 1998, Gene Therapy 5:975-983) . El AdV facilita la infección de células humanas con retrovirus ecotrópicos y aumenta la eficiencia de la infección retroviral. (Scott-Taylor, et al., 1998, Gene Ther. 5(5) :621-9) . Se han utilizado vectores AdV para la transferencia de genes a células de músculo liso vascular (Li et al., 1997, Chin. Med. J. (Engl) 110 ( 12 ): 950-4 ) , células de carcinoma de célula escamosa (Goebel et al., 1998, Otolarynol Head Neck Surg 119 ( 4 ) : 331-6 ) , células de cáncer esofágico (Senmaru et al., 1998, Int J. Cáncer 78 ( 3 ) : 366-71 ) , células mesangiales (Nahman et al., 1998, J. Investí. Med. 46 ( 5 ) : 204-9 ) , células gliales (Chen et al., 1998, Cáncer Res. 58 ( 16 ) : 3504-7 ) y para las articulaciones de animales (Ikeda et al., 1998, J. Rheumatol . 25(9) :1666-73) . Más recientemente, se ha demostrado la transferencia de genes pericardiales con base en catéter suministrada por vectores AcV. (March et al., 1999, Clin. Cardiol . 22 (1 Suplemento 1) : 123-9) . La manipulación del sistema AdV con los elementos genéticos para control adecuado permite la expresión i n vi vo de genes blanco regulables suministrada por AdV. (Burcin et al., 1999, PNAS (USA) 96 (2) : 355-60) . Los vectores de alfavirus se han desarrollado para aplicaciones de terapia con genes humanos, con líneas celulares de empacado adecuadas para la transformación' con casetes de expresión adecuados para utilizarse con vectores derivados de virus Sindbis y Semliki Forest. (Polo et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci . , USA, 96:4598-4603). También se han desarrollado sistemas con base en ARN de replicón de flavivirus no citopáticos. (Varnavski et al., 1999, Virology 255 ( 2 ) : 366-75 ) . Los vectores de virus HSV-TK que contienen el gen sinbis suicida se han utilizado para el blanco especifico celular en el interior de células tumorales. (Iijima et al., 1998, Int. J. Cáncer 80 ( 1 ) : 110-8 ) . Los vectores retrovirales con base en virus espumoso humano (HFV) también muestran una promesa como vectores para terapia con genes. (Trobridge et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2517-2525) . Los vectores de virus espumoso se han diseñado para una terapia con genes suicida. (Nestier et al., 1997, Gene Ther. 4 ( 11 ) : 1270-7 ) . Los sistemas de citomegalovirus de murino recombinante y promotores también se han utilizado como vectores para una expresión de alto nivel. (Manning et al., 1998, J . Virol. Meth. 73(l) :31-9; Tong et al., 1998, Hybridoma 18(1) : 93-7) . El suministro de genes en células sin dividir se ha hecho factible mediante la generación de vectores con base en virus Sendai. (Nakanishi et al., 1998, J. Controlled Reléase 54 (1) : 61-8) . En otros esfuerzos para permitir la transformación de células somáticas sin dividir, los vectores lentivirales se han explorado. Se- ha descrito la terapia con genes de fibrosis cística que utiliza un vector con base en un virus de inmunodeficiencia humana (VIH) con replicación defectuosa. (Goldman et al., 1997, Human Gene Therapy 8:2261-2268) . También se ha mostrado la expresión sostenida de genes suministrados en el interior del hígado y el músculo mediante vectores lentivirales. (Kafri et al., 1997, Nat . Genet . 17(3) :314-7) . Sin embargo, las preocupaciones por la seguridad son predominantes, y el desarrollo de un vector mejorado esté procediendo rápidamente. (Kim et al., 1998, J. Viroi. 72 ( 2 ) : 994 - 1004 ) . El examen de HIV LTR y Tat proporciona una información importante acerca de la organización del genoma para desarrollar vectores. (Sadaie et al., 1998, J. Med. Virol . 54 (2) : 118-28) . De esta forma, los requerimientos genéticos para un vector con base en VIH eficaz en la actualidad se entienden mejor. (Gasmi et al., 1999, J. Virol. 73 ( 3 ) : 1828-34 ) . Se han descrito vectores de autoinactivación, o líneas celulares de empaque condicional. (Por ejemplo, Zuffery et al., 1998, J^ Virol . 72 ( 12 ) : 9873- 80 ; Miyoshi et al., 1998, J. Virol. 72 ( 10 ) : 8150-7 ; Dull et al., 1998, J. Virol. 72 ( 11 ) : 8463-71 ; y Kaul et al., 1998, Virology 249 ( 1 ) : 167-74 ) . Se ha mostrado la transducción eficiente de linfocitos humanos y células CD34+ mediante vectores de VIH. (Douglas et al., 1999, Hum. Gene Ther. 10 ( 6 ) : 935-45 ; Miyoshi et al., 1999, Science 283 ( 5402 ) : 682- 6 ) . Se ha descrito la transducción eficiente de células humanas sin dividir mediante vectores lentivirales de virus .¡e inmunodeficiencia felina (FIV, por sus siglas en inglés), que reduce al mínimo las preocupaciones ce seguridad con los que utilizan vectores con base > r. VIH. (Poeschla et al., 1998, Nature Medicine 4(3) :354-357) . Se ha mostrado la infección productiva de células mononucleares en sangre humana mediante vectores de FIV (Johnston et al., 1999, J. Virol . 73 (3) : 2491-8) . Mientras que muchos vectores virales sor. difíciles de manipular, y la capacidad para el Ai N insertado es limitada, se han enfrentado estas limitaciones y desventajas. Por ejemplo, además de las líneas celulares de empaque .viral simplificado, se han desarrollado vectores Minivirales, derivados de virus de herpes humano, tipo 1 de virus de herpes simplex (HSV-1) y virus Epstein-Barr (EBV), para simplificar la manipulación del material genético y la generación de vectores virales. (Wang et al., 1996, J. Virology 70 ( 12 ) : 8422-8430 ) . Se han mostrado anteriormente plásmidos adaptadores para simplificar la inserción de ADN extraño en el interior de los vectores retrovirales auxiliares-independientes. (1987, J. Virology 61 ( 10 ): 3004-3012 ) . Los vectores virales no son el único medio para efectuar la terapia con genes, también se han descrito diversos vectores no virales. Se ha mostrado que un vector para suministro de genes no virales blanco con base en el uso de poliplex del Factor de Crecimiento Epidérmico/ADN (EGF/DNA) da por resultado en un suministro de genes eficiente y específico. (Cristiano, 1998, Anticancer Res . 18:3241-3246) . Se ha demostrado que la terapia con genes de la vasculatura y el CNS utiliza liposomas catiónicos. (Yang et al., 1997, J. Neurotrauma 14(5) :281-97) . La terapia con genes efímeros de pancreatitis también se ha llevado a cabo utilizando liposomas catiónicos. (Denham et al., 1998, Ann . Surg. 227 (6) : 812-20) . Se ha mostrado que son eficaces los complejos del vector con base en quitosan/ADN para el suministro de genes. (Erbacher et al., 1998, Pharm. Res. 15 ( 9 ) : 1332-9 ) . Se ha descrito un vector para suministro de ADN no viral con base en un sistema terplex. (Kim et al., 1998, 53(1-3) :175-82) . Para efectuar una transferencia con genes también se han utilizado complejos de liposoma recubiertos con partículas virales. (Hirai et al., 1997, Biochem. Biophys. Res. Commun. 241 ( 1 ) : 112-8 ) . Se ha demostrado la terapia de genes mediante inyecciones directas en el tumor del vector T7 no viral que codifica para un gen de timidina cinasa. (Chen et al., 1998, Human Gene Therapy 9:729-736) . La preparación del ADN de plásmido es importante para la transferencia de genes mediante inyección directa. (Horn et al., 1995, Hum. Gene Ther . 6(5) : 656-73) . Los vectores de plásmido modificado se han adaptado específicamente para la inyección directa. (Hartikka et al., 1996, Hum. Gene Ther. 7(10) : 1205-17) . De esta forma, se conoce en la técnica una amplia variedad de vectores y construcciones para transferencia dé genes/ terapia con genes. Estos vectores se adaptan fácilmente para utilizarse en los métodos de la presente invención. Mediante la manipulación adecuada que utiliza técnicas de ADN recombinante/de biología molecular para insertar una Src o Yes enlazada operativamente, o ambas (ya sea activa o inactiva) en el interior del vector para expresión/suministro seleccionado, se pueden generar muchos vectores equivalentes para la práctica de la presente invención.

E . Métodos para la modulación de la permeabilidad vascular (VP) La invención proporciona un método para la modulación de la permeabilidad vascular (VP) de los vasos sanguíneos en un tejido asociado con un proceso o condición de enfermedad, y con esto efectúa los sucesos en el tejido que dependen de la VP . En general, el método comprende administrar al tejido, asociado con un proceso o condición de enfermedad, una composición que comprende una cantidad moduladora de la VP de una proteína Src o Yes, o una mezcla de las mismas, o un vector de ácido nucleico que expresa la Src o Yes activa o inactiva, o las dos, o un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src tal como por ejemplo, un inhibidor químico de Src, un inhibidor de la proteína Src, o un inhibidor Src de ácido nucleico, de acuerdo con los métodos de esta invención . Como se describe en la presente, cualquiera de una variedad de tejidos, u órganos comprendidos de tejidos organizados, pueden ser una ubicación para la VP en las condiciones de enfermedad que incluyen cerebro, piel, músculo, intestino, tejido conectivo, articulaciones, huesos y los tejidos semejantes en los cuales están presentes vasos sanguíneos. El paciente tratado en la presente invención en sus muchas modalidades convenientemente es un paciente humano, aunque se debe entender que los principios de la invención indican que la misma es eficaz con respecto a todos los mamíferos, que se pretenden incluir en el término "paciente". En este contexto, se entiende que un mamífero incluye cualquier especie mamífera en la cual es conveniente el tratamiento del tejido asociado con enfermedades que incluyen la angiogénesis, en particular especies mamíferas agrícolas y domésticas. De esta forma, el método comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición fisiológicamente tolerable que contiene una proteína Src o Yes, o una mezcla de las mismas, o un vector de ADN para expresar una proteína Src o Yes, o ambas, o un inhibidor de tirosina cmasa de la familia Src tal como por ejemplo, un inhibidor químico de Src, un inhibidor de la proteína Src o un inhibidor Src de ácido nucleico. Las variaciones de. dosis para la administración de una proteína Src o Yes dependen de la forma de la proteina y su potencia, como se describe adicionalmente en la presente, y son cantidades bastante grandes para producir el efecto deseado en el cual se mejoran la VP y los síntomas de enfermedad suministrados por la VP . La dosis no debe ser tan grande que provoque efectos secundarios adversos, tales como por ejemplo, síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardiaca congestiva y lo semejante. En general, la dosis variará con la edad, condición, sexo y grado de enfermedad en el paciente y se puede determinar por alguien con experiencia en la técnica. La dosis también se puede ajustar por el médico individual en el caso de cualquier complicación. Una cantidad moduladora de la VP terapéuticamente • eficaz es una cantidad de la proteína Src o Yes, o mezcla de las mismas, o un ácido nucleico que codifica para la proteína Src o Yes, suficiente para producir una modulación mensurable de la VP en el tejido que será tratado, es decir, una cantidad moduladora de la VP . La modulación de la VP se puede medir mediante un análisis como se describe en la presente o mediante otros métodos conocidos por alguien con experiencia en la técnica. La modulación de la VP se puede medir mediante el análisis Miller, como se describe en la presente, o mediante otros métodos conocidos por alguien con experiencia en la técnica. La proteina Src o Yes o el vector de ácido nucleico que expresa la proteína Src o Yes, o ambas, se puede administrar parenteralmente mediante inyección o mediante infusión gradual durante el tiempo. Aunque el tejido que será tratado se puede accesar típicamente en el cuerpo mediante administración sistémica y por lo tanto con mayor frecuencia se trata mediante administración intravenosa de las composiciones terapéuticas, se contemplan otros tejidos y medios de suministro, en donde existe la probabilidad de que el tejido blanco contenga la molécula blanco. De esta forma, las composiciones de la invención se pueden administrar de manera intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavidad, transdérmica y se pueden suministrar por medios peristálticos. Las composiciones terapéuticas que contienen una proteina Src o Yes, o un vector de ácido nucleico que expresa la proteina Src o Yes se pueden administrar convenientemente de manera intravenosa, mediante la inyección de una dosis unitaria, por ejemplo. El término "dosis unitaria", cuando se utiliza con referencia a una composición terapéutica de la presente invención, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitaria para el sujeto, cada unidad contiene una cantidad predeterminada del material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el diluyente requerido; es decir, el portador o vehículo . En una modalidad preferida, el reactivo se administra en una sola dosis de manera intravenosa. La administración localizada se puede llevar a cabo mediante inyección directa o al aprovechar los compartimientos anatómicamente aislados, que aislan la microcirculación de los sistemas orgánicos blanco, la reperfusión en un sistema circulatorio, o la oclusión temporal basada en una catéter de las regiones blanco de la vasculatura asociada con tejidos enfermos. Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación de la dosis y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad que será administrada y el tiempo dependen del sujeto que será tratado, la capacidad del sistema del sujeto para utilizar el ingrediente activo y el grado de efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas del ingrediente activo requeridas para ser administradas dependen del juicio del practicante y son especiales para cada individuo. Sin embargo, las variaciones de dosis adecuadas para la aplicación sistémica se exponen en la presente y dependen de la vía de administración. Los regímenes adecuados para la administración también son variables, aunque se tipifican mediante una administración inicial seguida por dosis repetidas a intervalos de una o más horas mediante una inyección posterior u otra administración. Alternativamente, se contemplan infusiones intravenosas continuas suficientes para mantener las concentraciones en la sangre y los intervalos especificados para las terapias in vi vo . Existe una variedad de enfermedades en las cuales se cree que es importante la inhibición de la angiogénesis, denominadas como enfermedades angiogénicas, entre las que se incluyen de manera enunciativa: trastornos inflamatorios tales como por ejemplo, inflamación inmune y no inmune, reumatismo articular crónico y psoriasis, trastornos asociados con la invasión inadecuada o inoportuna de vasos tales como por ejemplo, retinopatia diabética, glaucoma neovascular, , restenosis, proliferación capilar en placas ateroscleróticas y osteoporosis, y trastornos asociados con el cáncer, tales como por ejemplo, tumores sólidos, metástasis de tumores sólidos, angiofibromas , fibroplasia retrolental, hemangiomas, sarcoma de Kaposi y los cánceres semejantes que requieren de neovascularización para apoyar el desarrollo tumoral. Similarmente, la permeabilidad vascular es un componente importante de la angiogénesis y por su propio derecho está asociada con patologías perjudiciales. Por ejemplo, el daño debido a una permeabilidad vascular inducida por apoplejía activa el daño relacionado con la inflamación. De esta forma, los métodos que inhiben la permeabilidad vascular en un tejido asociado con una condición de enfermedad mejora los síntomas de la enfermedad y, dependiendo de la enfermedad, puede contribuir a curar la enfermedad. En una modalidad, la invención contempla la inhibición de la permeabilidad vascular, per se, en un tejido asociado con una condición de enfermedad. El grado de permeabilidad vascular en un tejido, y por lo tanto el grado de inhibición alcanzado por los métodos de la presente, se pueden evaluar mediante una variedad de métodos . De esta forma, en una modalidad relaciona, un tejido que será tratado es un tejido inflamado y la permeabilidad vascular que será inhibida es debida a la estimulación suministrada por VEGF. En esta clase, el método contempla la inhibición de la VP en tejidos artríticos, tal como por ejemplo, en un paciente con reumatismo articular crónico, en tejidos inflamados inmunes o no inmunes, en tejido psoriático y lo semejante. En otra modalidad relacionada, un tejido que será tratado es un tejido retinal de un paciente con una enfermedad de la retina tal como por ejemplo, retinopatia diabética, degeneración . macular o glaucoma neovascular y la VP que será inhibida es la VP del tejido retinal, en donde existe neovascularización del tejido retinal. Los métodos también son particularmente eficaces contra la formación de metástasis debido a que (1) su formación requiere de vascularización d.e un tumor primario de tal forma que las células de cáncer metastático puedan salir del tumor primario y (2) su establecimiento en un sitio secundario requiere la neovascularización para apoyar el desarrollo de las metástasis. En una modalidad relacionada, la invención contempla la práctica del método junto con otras terapias tales como por ejemplo, quimioterapia convencional dirigida contra tumores sólidos y para el control del establecimiento de metástasis. La administración del inhibidor de la VP se conduce típicamente durante o después de ia quimioterapia, aunque se prefiere inhibir la VP después de un régimen de quimioterapia en los tiempos en donde el tejido tumoral responderá al ataque tóxico al inducir a la VP para que se recupere mediante la provisión de un suministro sanguíneo y nutrientes para el tejido tumoral. Además, es posible administrar los métodos para inhibición de la permeabilidad vascular después de la cirugía, en donde los tumores sólidos se hayan eliminado como una profilaxis contra las metástasis. En lo que respecta a los métodos de la presente, se aplican para la inhibición de la permeabilidad vascular implicada con las metástasis. Los métodos también se pueden aplicar para la inhibición de la formación de metástasis y para la regresión de tumores establecidos. La restenosis es un proceso de migración y proliferación de células de músculo liso (SMC) en el interior del tejido en el sitio de la angioplastia coronaria transnominal percutánea que dificulta el éxito de la angioplastía. La migración y proliferación de las SMC durante la restenosis se puede considerar un proceso de la VP que se inhibe mediante los métodos de la presente. Por lo tanto, la invención también contempla la inhibición de restenosis al inhibir la permeabilidad vascular de acuerdo con los métodos de la presente en un paciente después de los procedimientos de angioplastia. Para la inhibición de restenosis, la tirosina cinasa activada típicamente se administra después del procedimiento de angioplastía debido a que la pared coronaria del vaso es un riesgo de restenosis, típicamente de entre aproximadamente 2 hasta 28 dias, y más típicamente de entre aproximadamente los primeros 14 dias después del procedimiento. El método de la presente para inhibir la permeabilidad vascular en un tejido asociado con una condición de enfermedad, y por lo tanto también para practicar los métodos para el tratamiento de las enfermedades relacionadas con la permeabilidad vascular, comprende poner en contacto un tejido en el cual se está presentando una permeabilidad vascular aumentada, o está en riesgo de presentarse, con una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína Src y/o Yes inactivada o un vector para expresar la proteina. En los casos en donde sea conveniente estimular o potenciar la VP, es útil la administración de una proteína Src y/o Yes activa al tejido. Las vías y tiempos de administración se pueden comparar con los métodos descritos anteriormente para la inhibición. Por ejemplo, se contempla la manipulación de la permeabilidad de la barrera hemoencefálica para modular el éxito de los fármacos para el tejido cerebral. Un aumento en la permeabilidad vascular de la barrera hemoencefálica permitirá que los fármacos, que no pueden cruzar normalmente la barrera, entren a los tejidos cerebrales. Se puede desear la modulación refinada de la angiogénesis junto con la VP, y de esta forma se puede administrar una mezcla de las formas activas e inactivas de la proteína Src, la proteína Yes o los ácidos nucleicos que se pueden expresar y que codifican para la proteína Src o Yes. La inhibición o potenciación del angiogénesis claramente se presenta de 5 a 7 dias después del contacto inicial con la composición terapéutica de los ejemplos. Similarmente, la modulación de la VP puede presentarse en un periodo de tiempo similar. Los efectos se pueden presentar dentro de un corto tiempo después de la administración de la composición terapéutica. Los factores limitantes de tiempo incluyen la velocidad de absorción del tejido, la ingestión celular, la transubicación de las proteínas o la traducción del ácido nucleico (dependiendo del terapéutico) y el blanco de la proteína. De esta forma, los efectos de la modulación de la VP se pueden presentar en un periodo corto como puede ser una hora desde el tiempo de administración. La exposición adicional o prolongada a la proteína Src y/o Yes inactiva también se puede realizar, utilizando las condiciones adecuadas. De esta forma, se puede diseñar una variedad de intervalos terapéuticos de tiempo deseados al modificar estos parámetros. El método de la invención también comprende administrar a un tejido asociado con un proceso de enfermedad o una lesión de vasos sanguíneos o condición traumática, una composición que comprende un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src. Un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src puede ser un inhibidor químico de Src, un inhibidor de la proteina Src o un inhibidor de ácido nucleico Src. Ejemplos de inhibidores químicos de tirosina cinasa de la familia Src, adecuados, incluyen de manera enunciativa: PPl, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146, Geldanamicina y lo semej ante . PPl (de Biomol, con licencia de Pfizer), fue el inhibidor de Src sintético utilizado para estos estudios. El PPl es parte de la familia de pirazolopirimidina de los inhibidores Src. Otros inhibidores Src sintéticos incluyen PP2 (de Calbiochem, con licencia de Pfizer) que se relaciona en estructura con PPl y también ha mostrado bloquear la actividad cinasa de la familia Src. (Hanke et al., 1996, J. Biol. Chem. 271 (2 ): 695-701 ) . Otros inhibidores de cinasa Src específicos incluyen PD173955 (Moasser et al., 1999, Cáncer Res. 59:6145-6152; Parke Davis) para el cual se haya publicado la estructura. PD162531 (Owens et al., 2000, Mol. Biol. Cell 11:51-64) también es un inhibidor de cinasa Src específico de Parke Davis aunque la estructura no está accesible a partir de la literatura. La Geldanamicina también es un inhibidor de cinasa Src, disponible de Life Technologies. Radicicol, que se ofrece comercialmente por diferentes compañías (por ejemplo Calbiochem, RBI, Sigma), es un antibiótico <n< lactona macrocíclica antifungoso que también actúa como un inhibidor de tirosina cinasa de la proteína no especifica y mostró inhibir la actividad de cinasa Src. Los inhibidores químicos preferidos son PPl y PP2 o lo semejante, un inhibidor químico más preferido es PPl. Los inhibidores de tirosina cinasa de la familia Src adecuados, se pueden identificar y caracterizar utilizando análisis estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, la selección de compuestos químicos para potenciar y seleccionar los inhibidores para Src u otras tirosinas cinasas se ha realizado y ha resultado en la identificación de entidades químicas útiles en inhibidores potentes de las tirosinas cinasas de la familia Src. Por ejemplo, los catecoles se han identificado como elementos importantes de unión para varios de los inhibidores de tirosina cinasa derivados de productos naturales y se han encontrado en compuestos seleccionados mediante la selección guiada por blancos combinatoria para los inhibidores selectivos de Src-c. Maly, D. J., et al. (2000, "Combinatorial target-guided ligand assembly: Identification of potent subtype-selective c-Src inhibitors" PNAS (USA) 97 ( 6 ) : 2419-2424 ) . La selección con base en la química combinatoria de los compuestos inhibidores candidato, que utilizan entidades conocidas para ser importantes para la inhibición de Src como un punto de inicio, es un medio potente y eficaz para aislar y caracterizar otros inhibidores quípp cos de las tirosinas cinasas de la familia Src. Sin embargo, incluso la selección cuidadosa de los elementos de unión potenciales con base en el potencial para imitar una amplia gama de funcionalidades presentes en los polipéptidos y ácidos nucleicos se puede utilizar para realizar las selecciones combinatorias de inhibidores activos. Por ejemplo, las bibliotecas O-metiloxima son particularmente adecuadas para este propósito, dado que la biblioteca se prepara fácilmente mediante la condensación de O-metilhidroxilamina con cualquiera de un gran número de aldehidos disponibles comercialmente. La formación de O-alquiloxima es compatible con una amplia gama de funcionalidades que son estables a un pH fisiológico. Malay et al., supra . Como se describió, los inhibidores de cinasa de la familia Src, adecuados, también incluyen una cantidad inhibidora de la VP de una proteína Src o Yes inactiva, o una mezcla de las mismas, o un vector de ácido nucleico que expresa Src o Yes inactiva, o ambas, de acuerdo con los métodos de esta invención. Otros inhibidores de cinasa de la familia Src, adecuados, incluyen CSK, o un vector de ácido nucleico que expresa cantidades inactivantes de CSK, de acuerdo con los métodos- de é's'ta invención. Corao se describe en ia presente,,-^ cj?al5uie¿a_ de una variedad de tejidos, u órganos comprendidos de tejidos organizados, pueden ser una ubicación para la VP en condiciones de enfermedad entre las que se incluyen: cerebro, piel, músculo, intestino, tejido conectivo, articulaciones, huesos y tejidos semejantes en los cuales están presentes vasos sanguíneos .

El paciente que puede ser tratado mediante un método que incorpora la presente invención convenientemente es un paciente humano, aunque se debe entender que los principios de la invención indican que los métodos de la presente son eficaces con respecto a todos los mamíferos. Por consiguiente, en el término "paciente" se incluyen en el sentido en el que se utiliza en la presente. En este contexto, se debe entender que un mamífero incluye cualquier especie mamífera en la cual es conveniente el tratamiento de escape vascular o edema asociado con un daño al tejido, en particular especies mamíferas agrícolas y domésticas. Un método que incorpora esta invención comprende administrar a un paciente mamífero una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición fisiológicamente tolerable que contiene un inhibidor químico de tirosina cinasa de la familia Src, una proteína Src o Yes inactiva, una proteína CSK activa, un ácido nucleico que codifica para esa proteína, mezclas de los mismos, para practicar los métodos de la invención. Las variaciones de dosis para la administración de los inhibidores químicos de tirosina cinasa de la familia Src, tales como por ejemplo, PPl pueden estar en el intervalo de entre aproximadamente .1 mg/kg de peso corporal hasta 1 '"* mg/kg de peso corporal, o el límite de solubilida.i del agente activo en el portador farmacéutico. De preferencia, las dosis típicas pueden ser de entre aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal hasta 9 mg/kg de peso corporal. Las dosis inferiores, tales como por ejemplo de .1 mg/kg de peso corporal hasta 1 mg/kg de peso corporal se pueden optimizar para una administración múltiple para tratar condiciones crónicas. Las dosis típicas para tratar condiciones graves que son menos severas, fácilmente accesibles, y en donde la vía de administración es más directa, pueden ser de ente aproximadamente 1 mg/kg de peso corporal hasta 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la lesión, ubica.ción, o la via de administración, se puede utilizar una dosis superior de ente aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal hasta 10 mg/kg de peso corporal (o el limite de solubilidad del agente en el portador farmacéutico), cuando se encuentra con una lesión más severa, una ubicación de difícil acceso o en donde la administración se puede realizar únicamente vía la ruta sistémica indirecta. En el caso de una lesión o trauma agudo, es mejor administrar el tratamiento tan pronto como sea posible después de la ocurrencia del incidente. Sin embargo, el tiempo para una administración eficaz de uno de los inhibidores de tirosina cinasa de la familia Src puede estar entre aproximadamente 48 horas desde el inicio de la lesión o trauma, en el caso de incidentes agudos. Se prefiere que la administración se presente dentro de aproximadamente 24 horas del inicio, dentro de las 12 horas que es lo mejor, y con la máxima preferencia que la administración se lleve a cabo dentro de aproximadamente 6 horas del inicio. La administración después de las 48 horas de la lesión inicial puede ser adecuada para mejorar el daño adicional del tejido debido a un escape vascular o edema adicional, sin embargo, el efecto del daño al tejido inicial se puede reducir de manera importante. Cuando la administración profiláctica se realiza para evitar el escape vascular o el edema asociado con un procedimiento quirúrgico, o realizado en vista de criterios de diagnóstico de predisposición, la administración se puede presentar antes de cualquier aumento de la VP real, o durante este incidente que provoca el aumento de la VP . Para el tratamiento de condiciones crónicas que conducen al aumento de la VP y están asociadas con el escape vascular o edema, la administración de los inhibidores de tirosina cinasa de la familia Src activa se puede realizar "con un régimen de dosificación continua. Las variaciones de dosis para la administración de una proteína Src o Yes inactiva, o una proteína CSK activa dependen de la forma de la forma de la proteina, y su potencia, como se describe adicionalmente en la presente, y son cantidades tan grandes que producen el efecto deseado en el cual se mejoran la VP y los síntomas de enfermedad suministrados por la VP . La dosificación no debe ser tan grande para provocar efectos secundarios adversos, tales como por ejemplo síndromes de hiperviscosidad, edema pulmonar, insuficiencia cardiaca congestiva y lo semejante. Una cantidad moduladora de la VP terapéuticamente eficaz es una cantidad de CSK activa o la proteína Src o Yes inactiva, o una mezcla de las mismas, o un ácido nucleico que codifica para esta proteína, suficiente para producir una modulación mensurable de la VP en el tejido que será tratado, es decir, una cantidad moduladora de la VP . La modulación de la VP se puede medir mediante un análisis como se describe en la presente, o mediante otros métodos conocidos por alguien con experiencia en la técnica. La modulación de la VP se puede medir mediante el análisis de Miller, como se describe en la presente, o mediante otros métodos conocidos por alguien con experiencia en la técnica. En general, la dosis puede variar con la edad, condición, sexo y grado de enfermedad en el paciente y se puede determinar por alguien con experiencia en la técnica. La dosis también se puede ajustar por el médico individual en el caso de cualquier complicación.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar parenteralmente mediante inyección o mediante infusión gradual mediante el tiempo. Aunque al tejido que será tratado se puede tener acceso típicamente en el cuerpo mediante administración sistémica y por lo tanto la mayoría con frecuencia se trata mediante la administración intravenosa de las composiciones terapéuticas, se contemplan otros tejidos y medios de suministro en donde haya una probabilidad de que el tejido blanco contenga la molécula blanco. De esta forma, las composiciones de la invención se pueden administrar de manera intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, intracavidad, transdérmica y se pueden suministrar mediante medios peristálticos. La administración intravenosa se efectúa mediante la inyección de una dosis unitaria, por ejemplo. El término "dosis unitaria" cuando se utiliza con referencia a una composición terapéutica de la presente invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dos.is unitaria para el sujeto, cada unidad contiene una cantidad predeterminada del material activo calculada par producir el efecto terapéutico deseado junto con el diluyente requerido; es decir, el portador o vehículo . En una modalidad preferida, el agente activo se administra en una sola dosis intravenosamente. La administración localizada se puede llevar a cabo mediante inyección directa o aprovechando los compartimientos anatómicamente aislados, aislando la microcirculación de los sistemas orgánicos blanco, la repercusión en un sistema circulatorio o la oclusión temporal basada en catéter de las regiones blanco de la vasculatura asociada con tejidos enfermos. Las composiciones se administran de una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad terapéuticamente eficaz. La cantidad que será administrada y el tiempo dependen del sujeto que será tratado, la capacidad del sistema del sujeto para utilizar el ingrediente activo y ei grado del efecto terapéutico deseado. Las cantidades precisas del ingrediente activo que será administrado dependen del juicio del practicante y sen características para cada individuo. Sin embarge, las variaciones de dosificación adecuadas para 1 i aplicación sistémica se exponen en la presente y dependen de la vía de administración. Los regímenes adecuados para la administración también son variables, aunque se tipifican por una administración inicial seguida por dosis repetidas en intervalos de una o más horas mediante una inyección posterior u otra administración. .Alternativamente, se contempla la infusión intravenosa continua suficiente para mantener las concentraciones en la sangre en los intervalos especificados para terapias i n vi vo . Los métodos de la invención que mejoran el daño al tejido debido a escape vascular o edema asociados con una condición de enfermedad, lesión o trauma mejoran los síntomas de la enfermedad y, dependiendo de la enfermedad, pueden contribuir a la curación de la enfermedad. El grado de permeabilidad vascular en un tejido, y por lo tanto el grado de inhibición alcanzada por los métodos de la presente, se pueden evaluar mediante una variedad de métodos. En particular, los métodos son adecuados para mejorar la lesión relacionada con apoplejía u otro accidente cerebrovascular con el CNS que se presentan debido al aumento de la VP inducido por lesión, y el daño por escape vascular posterior y/o edema a los tejidos asociados . En una modalidad relacionada, un tejido que será tratado es un tejido inflamado y la permeabilidad vascular que será inhibida es debido a la estimulación suministrada por VEGF. Para este tipo de enfermedad, el método contempla la inhibición de la VP en tejidos artríticos, tales como por ejemplo, en un paciente con reumatismo articular crónico, en tejidos inflamados inmunes o no inmunes, en tejidos psoriático y lo semejante. En otra modalidad relacionada, un tejido que será tratado es un tejido retinal de un paciente con una enfermedad de la retina tal como por ejemplo, retinopatia diabética, degeneración macular o glaucoma neovascular y la VP que será inhibida es una VP de tejido retinal en donde haya neovascularización del tejido retinal. El método de la presente para inhibir la permeabilidad vascular en un tejido asociado con una condición de lesión o enfermedad, y por lo tanto también para practicar los métodos de tratamiento de enfermedades relacionadas con la permeabilidad vascular, comprende poner en contacto un tejido en el cual se esté presentando la permeabilidad vascular aumentada, o está en riesgo de presentarse, con una composición que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src. La modulación de la VP, y la mejora del daño al tejido debido a escape vascular y edema se pueden presentar dentro de un corto periodo después de la administración de la composición terapéutica. La mayoría de los efectos terapéuticos se pueden visualizar dentro de los 3 días de administración, en el caso de lesión o trauma agudo. Típicamente, los efectos de la administración crónica no serán tan evidentes fácilmente. Los factores limitantes de tiempo incluyen la velocidad de absorción del tejido, la ingestión celular, la transubicación de la proteina o la traducción del ácido nucleico (dependiendo del terapéutico) y el blanco de la proteína. De esta forma, los efectos de modular el daño al tejido se pueden presentar en un tiempo tan corto como una hora desde el tiempo de administración del inhibidor. La exposición adicional o prolongada a los inhibidores de tirosina cinasa de la familia Src también se puede realizar, utilizando las condiciones adecuadas. De esta forma, una variedad de periodos de tiempo terapéuticos deseados se puede designar al modificar estos parámetros.

F. Composiciones terapéuticas (consideraciones generales) La presente invención contempla composiciones terapéuticas útiles para practicar los métodos terapéuticos descritos en la presente. Las composiciones terapéuticas de la presente invención contienen un portador fisiológicamente tolerable junto con una proteína Src y Yes o un vector capaz de expresar un proteína Src y/o Yes como se describe en la presente, o un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src como se describe en la presente, tal como por ejemplo un inhibidor químico de Src, un inhibidor de la proteina Src, o un inhibidor Src de ácido nucleico, disuelto o dispersado en los mismos como un ingrediente activo. En una modalidad preferida, la composición terapéutica no es inmunogénica cuando se administra a un paciente mamífero o humano para fines terapéuticos.

La proteina Src y Yes puede ser activa, inactiva o una mezcla de las mismas dependiendo de la modulación deseada. Las formas preferidas de Src y Yes se describieron anteriormente. La proteína CSK comprende la forma activa. En el sentido en el que se utiliza en la presente, los términos "farmacéuticamente aceptable, "fisiológicamente tolerable" y variaciones gramaticales de los mismos, según se refieren a composiciones, portadores, diluyentes y reactivos, se utilizan indistintamente y representan que los materiales son capaces de administrarse a un mamífero sin la producción de efectos fisiológicos indeseables tales como por ejemplo, nauseas, desvanecimiento, trastorno gástrico y lo semejante. La preparación de una composición farmacológica que contenga los ingredientes activos disueltos o dispersados en la misma se entenderá bien en la técnica y no necesita estar limitada con base en la formulación. Típicamente estas composiciones se preparan como soluciones o suspensiones liquidas inyectables, sin embargo, también se pueden preparar las formas sólidas adecuadas para solución, o suspensiones, en liquido antes de utilizarse. La preparación también se puede emulsionar o se puede presentar como una composición liposómica. El ingrediente activo se puede mezclar con excipientes que sean farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo y en cantidades adecuadas para utilizarse en los métodos terapéuticos descritos en la presente. Los excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o lo semejante y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la composición puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como por ejemplo agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores de pH y lo semejante que intensifiquen la efectividad del ingrediente activo. La composición terapéutica de la presente invención puede incluir sales farmacéuticamente aceptables de los componentes en la misma. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres del polipéptido) que se forman con ácidos inorgánicos tales como por ejemplo, ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos como acético, tartárico, mandélico y lo semejante. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también se pueden derivar de bases inorgánicas tales como por ejemplo, hidróxidos de sodio, poitasio, amonio, calcio o férrico, y estas bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina, procaína y lo semejante. Los portadores fisiológicamente tolerables son bien conocidos en la. técnica. Los ejemplos de portadores liquidos son soluciones acuosas estériles que no contienen materiales además de los ingredientes activos y agua, o que contienen un amortiguador tal como por ejemplo, fosfato de sodio a un valor de pH fisiológico, solución salina fisiológica o ambos, tal como por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato. Todavía adicionalmente, los portadores acuosos pueden contener más de una sal amortiguadora, así como también sales tales como por ejemplo, cloruro de sodio y potasio, dextrosa, polietilenglicol y otros solutos . Las composiciones líquidas también pueden contener fases líquidas en adición a y para la exclusión de agua. Ejemplos de estas fases líquidas adicionales son glicerina, aceites vegetales tales como por ejemplo aceite de semilla de algodón y emulsiones de agua-aceite.

F(i) Composiciones terapéuticas para modular la VP de la presente invención En una modalidad de la presente invención, una composición terapéutica contiene una cantidad para modular la permeabilidad vascular de una proteina Src y/o Yes, o un vector de expresión de ADN recombinante suficiente para expresar una cantidad eficaz de la proteína Src y/o Yes, típicamente formulada para contener una cantidad de al menos 0.1% en peso de la proteina Src o Yes en peso de la composición terapéutica total. Un porcentaje en peso es una proporción en peso de la proteína Src o Yes para la composición total. De esta forma, por ejemplo, 0.1% en peso es 0.1 gramos de proteina Src o Yes por 100 gramos de la composición total. Para los vectores de expresión de ADN, la cantidad administrada depende de las propiedades del vector de expresión, el tejido que será tratado y las consideraciones similares.

F(ii) Composiciones terapéuticas inhibidoras de tirosina cinasa de la familia Src de la presente invención Las composiciones terapéuticas químicas de la presente invención contienen un portador fisiológicamente tolerable junto con un inhibidor de tirosina cinasa de la famili-a Src disuelto o dispersada en el mismo como un ingrediente activo. Las composiciones terapéuticas de la proteína de la presente invención contienen un portador fisiológicamente tolerable junto con una proteina Src inactiva Yes inactiva o CSK activa disuelta o dispersada en el mismo como un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src. Las composiciones terapéuticas de ácido nucleico de la presente invención contienen un portador fisiológicamente tolerable junto con un ácido nucleico que codifica para una proteína Src inactiva, Yes inactiva o CSK activa disuelta o dispersada en el mismo como un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src. Los inhibidores de tirosina cinasa de la familia Src, adecuados, inhibirán específicamente la actividad de tirosina cinasa biológica de las tirosina cinasas de la familia Src. Una tirosina cinasa de la familia Src más adecuada tendrá una especificidad primaria para inhibir la actividad de la proteina pp6Src, y de manera secundaria inhibirá las tirosina cinasas de la familia Src más estrechamente relacionada tal como Yes. Ejemplos de inhibidores de tirosina cinasa de la familia Src, particularmente adecuados, incluyen PPl, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146, Geldanamicina y los semejante. Los inhibidores químicos de tirosina cinasa de la familia Src, adecuados adicionales, se pueden identificar y caracterizar utilizando análisis estándar conocidos en la técnica. Las mutaciones en Src mostradas para inhibir la VP en lugar de estimularla, se denominan como mutaciones de Src inactiva. Las proteínas que tienen mutación y que confieren esta actividad inhibidora también se denominan como proteínas Src negativas dominantes ya que inhiben la VP, incluyendo lo que resulta de la actividad endógena de Src asi como también la act.ividad Src intensificada resultante de la estimulación del facto de crecimiento. De esta forma, ciertas mutaciones de Src-c de tipo silvestre de la presente invención también pueden funcionar como un negativo dominante con respecto a su capacidad para bloquear el desarrollo de vasos sanguíneos y la VP, y por ejemplo, por lo tanto disminuir la VP in vi vo . Por lo tanto, otros inhibidores de tirosina cinasa de la familia Src adecuados, pueden incluir las formas inactivas de la proteina Src y Yes que pueden antagonizar con la actividad Src o Yes, dando por resultado en la inhibición o disminución de la permeabilidad vascular de los vasos sanguíneos en el tejido blanco. Una proteina Src inactiva, preferida es la Src 251. Otra proteina Src inactiva, preferida, es la Src K295M. Una proteína Yes inactiva, preferida, tendrá una actividad de cinasa disminuida en comparación con la proteína tipo silvestre. Otros inhibidores de tirosina cinasa de la familia Src pueden ser ácidos nucleicos antisentido, análogos de ácido nucleico o ácidos nucleicos de proteína que inhiben la expresión de los genes Src o Yes en células blanco. Las moléculas antisentido pueden ser una cantidad moduladora de la VP terapéuticamente eficaz cuando el ácido nucleico antisentido, capaz de hibridarse con el ARNm que codifica para la proteína Src o Yes, se pueden hibridizar con este ARNm y dar por resultado en una inhibición de la expresión celular de la proteína tirosina cinasa Src o Yes, cuando se transfecta en una célula blanco en un portador farmacéuticamente adecuado. Como se describió, la proteina Src-c inhibidora, preferida, incluye la Src 251 en la cual únicamente se expresan los primeros 251 aminoácidos. Esta construcción carece de un dominio completo de cinasa y por lo tanto se denomina como proteina Src "absolutamente de cinasa". Una segunda construcción es la mutación Src (K295M) en la cual el residuo 295 del aminoácido lisina se muta en una metionina. Esta mutación puntual en el dominio cinasa evita la unión ATP y también bloquea las funciones Src dependientes de cinasa relacionadas con la señalización y proliferación de células vasculares y células tumorales . Con respecto a las mutaciones puntuales, se contempla cualquier mutación que resulte en i a actividad inhibidora deseada para utilizarse en esta invención. También se contemplan las construcciones de proteina de fusión que combinan la proteina Src deseada (mutación o fragmento de la misma) con marcas de aminoácido expresado, epítopes antigénicos, proteínas fluorescente u otras de estas proteínas o péptidos, con la condición de que el efecto de modulación deseado de la proteína Src esté intacto. Similarmente, la adición de un inhibidor exógeno de la actividad de la proteina Src o la estimulación o expresión de este inhibidor dentro de los tejidos blanco, tal como por ejemplo, CSK (cinasa Src C-terminal) también es un medio para inhibir la actividad Src. La fosforilación de Src inactivante de tirosina es un medio para la regulación negativa mediante la Src cinasa c-terminal, denominada como CSK. (Nada et al., 1991, Nature 351: 69-72; Okada et al., 1991, J. Biol. Chem. 266(36) : 24249-24252) . Cuando CSK fosforila aa527 en la Src tipo silvestre, la proteina Src se inactiva. De esta forma, CSK es un inhibidor útil y potente de la actividad Src. La secuencia de la proteina CSK humana de 450 aminoácidos se identifica mediante el número de accesos P41240 y se puede encontrar en la base de datos Suiza de proteínas. Una CSK humana que codifica para la secuencia de ácido nucleico ARNm se identifica con el número de acceso NM 004383 en la base de datos GenBank. En una modalidad de la invención, una composición farmacéutica contiene una cantidad moduladora de la permeabilidad vascular de una proteina Src, Yes y/o CSK, o un vector de expresión suficiente para expresar una cantidad eficaz de la proteina Src inactiva, Yes o CSK activa, formulada típicamente para contener una cantidad de al menos 0.1% en peso de la proteína en peso de la composición farmacéutica total. De esta forma, por ejemplo, 0.1% en peso es 0.1 gramos de proteína por 100 gramos de la composición total. Para los vectores de expresión, la cantidad administrada depende de las propiedades del vector de expresión, el tejido que será tratado y las consideraciones similares. De esta forma, una cantidad eficaz de un inhibidor de tirosina de la familia Src en una composición farmacéutica es aquella cantidad que de por resultado en la modulación terapéuticamente eficaz de la permeabilidad vascular regulada por Src. Una cantidad terapéutica de cualquier composición farmacéutica es una que, en si misma, de por resultado en la mejora del escape vascular o edema relacionado con el daño al tejido.

G (i) Consideraciones generales; artículo de fabricación En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término material de empaque se refiere a un material tal como por ejemplo, vidrio, plástico, papel, hoja y lo semejante capaz de mantener dentro de medios fijos un agente farmacéutico. De esta forma, por ejemplo, el material de empaque puede ser plástico o frascos de vidrio, sobres laminados y recipientes similares utilizados para contener una composición farmacéutica que incluye el agente farmacéutico . En modalidades preferidas, el material de empaque incluye una etiqueta que es una expresión tangible que describe el contenido del artículo de fabricación y el uso del agente farmacéutico contenido en el mismo.

G(ii) Composiciones terapéuticas para modular la VP; artículo de fabricación La invención contempla un articulo de fabricación que comprende un recipiente etiquetado para proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de una mezcla de proteina Src y proteina Yes. Un articulo de fabricación comprende material de empaque y un agente farmacéutico contenido dentro del material de empaque. El agente farmacéutico en un artículo de fabricación es cualquiera de las composiciones de la presente invención adecuadas para proporcionar una proteina Src y Yes, formulada en una forma farmacéuticamente aceptable como se describe en la presente de acuerdo con las indicaciones expuestas. De esta forma, la composición puede comprender una proteina Src y Yes, o una molécula de ADN que es capaz de expresar una proteina Src, un ADN capaz de expresar una proteina Yes o un ADN capaz de expresar las dos proteínas. . El artículo de fabricación contiene una cantidad del agente farmacéutico suficiente para utilizarse en el tratamiento de una condición indicada en la presente, ya sea en dosis unitarias o múltiples. La proteina Src o Yes puede ser activa o inactiva, o una mezcla de las mismas, dependiendo del nivel de modulación deseado. Las formas preferidas de la Src y Yes activa e inactiva se describieron anteriormente . El material de empaque comprende una etiqueta que indica el uso del agente farmacéutico contenido en el mismo, por ejemplo, para tratar condiciones ayudado por la inhibición o potenciación de la permeabilidad vascular, y las condiciones similares expuestas en la presente. La etiqueta puede incluir además las instrucciones para utilizarse y la información relacionada como puede requerirse para su comercialización. El material de empaque puede incluir recipientes para el almacenamiento del agente farmacéutico.

G(iii) Composición del inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src; artículos de fabricación La invención también contempla un articulo de fabricación que es un recipiente etiquetado para proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src. El inhibidor puede ser un producto químico, proteina o un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src de ácido nucleico empacado, combinaciones de más de uno o mezclas de los mismos. Un articulo de fabricación comprende material de empaque y el agente farmacéutico contenido dentro del material de empaque. El articulo de fabricación también puede contener dos o más cantidades subterapéuticamente eficaces de una composición farmacéutica, que conjuntamente actúan sinérgicamente para dar por resultado en la mejora del daño al tejido debido a un escape vascular o edema. El agente farmacéutico en un artículo de fabricación es cualquiera de las composiciones de la presente invención adecuadas para proporcionar un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src, formulado en una forma farmacéuticamente aceptable como se describe en la presente de acuerdo con las indicaciones expuestas. De esta forma, la composición puede comprender un inhibidor químico tal como por ejemplo, PPl, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 y Geldanamicina, un inhibidor de proteína tal como por ejemplo una proteina Src inactiva, una Yes inactiva, una CSK activa, o una molécula de ácido nucleico que sea capaz de expresar esta proteina o la combinación de proteínas. El artículo de fabricación contiene una cantidad del agente farmacéutico suficiente para utilizarse en el tratamiento de una condición indicada en la presente, ya sea en dosis unitarias o múltiples . El material de empaque comprende una etiqueta que indica el uso del agente . farmacéutico contenido en el mismo, por ejemplo, para tratar condiciones ayudadas por la inhibición del aumento de la permeabilidad vascular y las condiciones similares expuestas en la presente. La etiqueta puede incluir adicionalmente instrucciones para utilizarse y la información relacionada como puede requerirse para su comercialización. El material de empaque puede incluir recipientes para el almacenamiento del agente farmacéutico .

Ejemplos Los siguientes ejemplos que se relacionan con esta invención son ilustrativos y por supuesto no deben interpretarse específicamente como limitantes de la invención. Además, estas variaciones de la invención, ahora conocidas o desarrolladas posteriormente, las cuales podrían estar dentro de la competencia de alguien experto en la técnica se deben considerar que quedan dentro del alcance de la presente invención reclamada de aquí en adelante. 1. Preparación de construcciones de expresión Src-c o Yes-c Para preparar las construcciones de expresión útiles para modular la VP y la angiogénesis mediante los métodos de la presente invención, el ADNc de la Src-c se manipula y se inserta en una- construcción/vector de expresión. La secuencia de ADNc que codifica para la Src-c de pollo tipo silvestre (es decir, endógena) se muestra en la SEQ ID NO : 2 , (SEQ ID NO : 2 ) con la secuencia de residuos de aminoácidos codificada, mostrada en la SEQ ID NO : 3 , (SEQ ID NO : 3 ) . La secuencia codificada de proteína se traduce de las posiciones 112 hasta 1713 del nucleótido de ADNc. La secuencia de ácido nucleico que corresponde a la secuencia de ácido nucleico de ADNc Src-c de humano (SEQ ID NO : ) y las secuencias codificadas del residuo de aminoácidos (SEQ ID ' O : 5 ) se muestran respectivamente en las SEQ ID NO : 4 y SEQ ID NO : 5. Para la secuencia de proteina humana, la secuencia codificante inicia en la posición 134 hasta 1486 del nucleótido del ADNc. Se prepararon los ADNc de Src-c tipo silvestre así como también varios del tipo mutado. Las construcciones Src-c mutadas se prepararon mediante mutagénesis sitiodirigida como se describe por Kaplan et al., EMBO J., 13:4745-4756 (1994). Las construcciones de Src-c mutada para las proteínas Src mutadas codificantes para utilizarse en los métodos de la presente invención se describen en Kaplan et al., id.. Kaplan et al. describen diversas construcciones de Src-c mutada y las proteínas codificadas útiles para la práctica de esta invención. Por ejemplo, Kaplan et al., representan diversos productos de los alelos de Src-c de pollo en su SEQ ID N0:2, que incluyen SrcA y Src251. La presente invención describe dos categorías de la función Src-c para modular la VP . Como se analizó anteri'ormente, una categoría contiene las moléculas de Src que aumentan la VP y de esta forma se consideran para ser proteínas activas. La Src tipo silvestre junto con diversas mutaciones se muestran en la presente invención para inducir la VP . Una mutación de Src-c tipo silvestre que funciona en este contexto con respecto a su capacidad de inducir el desarrollo de vasos sanguíneos y la VP es la Src A mutante que tiene una mutación puntual en la posición 527 del residuo de aminoácidos (aa) que cambia la tirosina 527 a fenilalanina. Este sitio normalmente es un sitio para la regulación negativa por parte de la cinasa Src-c, denominada como CSK de cinasa. Cuando la CSK se fosforila en aa527 en la Src tipo silvestre, la proteína se inactiva. Sin embargo, en la Src A mutada en aa527, la tirosina reguladora se convierte a fenilalanina confiriendo de esta forma a la proteina una proteina constitutivamente (es decir, permanentemente) sin sujeto para la inactivación mediante fosforilación. Se muestran en la presente otras mutaciones en Src que tienen el efecto modulador opuesto sobre la VP, que inhiben la VP en lugar de estimularla. Estas mutaciones se denominan como mutaciones de Src inactivas. Las proteínas que tienen mutación y que confieren esta actividad inhibidora también se denominan como proteínas Src negativas dominantes ya que inhiben la VP, incluyendo lo que resulta de la actividad endógena de la Src asi como también la actividad Src intensificada resultante de la estimulación del factor de crecimiento. De esta forma, ciertas mutaciones de la Src-c tipo silvestre de la presente invención también pueden funcionar como un negativo dominante con respecto a su capacidad para bloquear el desarrollo de vasos sanguíneos y la VP, y por ejemplo, por lo tanto disminuir la VP in vi vo . Esta proteína Src-c inhibidora preferida incluye la Src 251, en la cual únicamente se expresan los primeros 251 aminoácidos de la Src. Esta construcción carece del dominio total de cinasa y por lo tanto se denomina como proteína Src "absolutamente de cinasa". Una segunda construcción es la mutación Src (K295M) en la cual el residuo 295 del aminoácido lisina se muta en una metionina. Esta mutación puntual en el dominio cinasa evita la unión de ATP y también bloquea las funciones Src que dependen de la cinasa relacionadas con la señalización y proliferación de células vasculares y células tumorales . Con respecto a las mutaciones puntuales, se contempla cualquier mutación que resulte en la actividad inhibidora o estimuladora deseada para utilizarse en esta invención. . Las construcciones de la proteina de fusión que combinan la proteína Src deseada (mutación o fragmento de la misma) con marcas de aminoácido expresado, epítopes antigénicos, proteína fluorescente u otras de estas proteínas o péptidos también se contemplan, siempre y cuando el efecto modulador deseado de la proteína Src esté intactato . Por ejemplo, para la mutación activante de la Src en el residuo 527, siempre y cuando el residuo de aminoácido mutado resultante no sea tirosina, serina o treonina, la presente invención contempla que la presencia de un" aminoácido alterno en la posición deseada dará por resultado en una proteina Src con un activo deseado, la actividad moduladora que estimula la VP . Anteriormente se ha descrito la cinasa Yes de la familia Src, aunque no se sabe mucho acerca de su función celular. (Burck et al., 1988, The Oncoaenes , Springer-Verlag, New York, pp . 133-155; Marth et al., 1985, Cell, 43:393; Semba et al., 1986, PNAS (USA) 83:5459; Shibuya et al., 1982, J. Virol. 42:143; Yoshida et al., 1985, Jpn. J. Cáncer Res. 76:559) . La proteina Yes humana activa, preferida, se codifica para el ácido nucleico descrito en Sukegawa et al. (1987, Mol. Cell Biol. 7:41-47) . Las modificaciones inactivantes para la proteína Yes humana y los ácidos nucleicos que codifican para Yes también se pueden llevar a cabo como se describió para Src.

TABLA I Src/Mutación Función de Src Efecto sobre la VP y la angiogénesis c-Src + activo Se estimula SrcA (T527F) + activo Se estimula Src527 (punto) + activo Se estimula Src251 — inactivo Se inhibe Src (truncado) - inactivo Se inhibe Src (K295M) - inactivo Se inhibe Src295 (punto) - inactivo Se inhibe Una construcción de expresión preferida para utilizarse en la presente invención es la construcción RCASBP (A) (SEQ ID NO : 1 ) . Este vector de expresión se basa en una serie de virus de sarcoma avícola con replicación competente con una polimerasa de Bryan (BP) intensificada para un título mejorado y es especifico para la glucoproteína envuelta tipo A expresada sobre células avícolas normales (Reviewed in Methods in Cell Biology, 52: 179-214 (1997); también véase, Hughes et al., 1987, J. Virol . 61:3004-3012; Fekete & Cepko, 1993, Mol. Cellular Biol . 13(4) :2604-2613; Itoh et al., 1996, Development 122: 291-300; y Stott et al., 1998, BioTechniques 24:660-666). La secuencia completa de RCASBP (A) (SEQ ID NO:l) se proporciona en el listado de secuencias, y un mapa de restricción de la construcción se representa como la Figura 6, a la que se hace referencia en la presente como RCAS. La construcción de Src 251 original se subclonó por el Dr . Pam Schwart zberg, en NIH en el laboratorio del Dr . Harold Varmus. En resumen, la clonación de una secuencia de ADNc de Src para la expresión de la misma se llevó a cabo al insertar un enlazante que contiene sitios de restricción Not I-BstBl-Not I en un sitio Not I único en el extremo 5' de la Src 251. La Src tiene un sitio Cía I único en el extremo 3' . La digestión de la Src 251 con BstBl y Cía I generó un fragmento BstBl-Clal que luego se ligó en el sitio Cía I sobre RCASBP (A) . Una saliente BstBl permite la ligación con una saliente Cía I que no será recortada con Cía I . Las construcciones de Src adecuadas para utilizarse en la práctica de la presente invención se obtienen fácilmente en el vector anterior al diferir primero el vector RCAS que contiene la Src 251 sin Not I y Cía I (en un DAM+ antecedente) par permitir la inserción de un ADNc de Src digerido similarmente. Por lo tanto, esta construcción RCASBP (A) inicial que contiene la Src 251 se utilizó adicionalmente para subclonar todas las otras construcciones Src como se describió anteriormente y en Kaplan et al., en (1994, The EMBO J. 13 (20) : 4745-4756) , via un fragmento RCASBP (A) generado a través de la construcción Not I-Cla I Src 251. Para producir las mutaciones Src-c deseadas en el ADNc, se utilizaron los procedimientos de mutagénesis sitiodirigida estándar familiares para alguien con experiencia normal en la técnica. Los cebadores PCR diseñados para incorporar las mutaciones deseadas también se diseñaron con sitios de restricción para facilitar los pasos de clonación posteriores. Los segmentos completos de la Src que codifica para las secuencias de ácido nucleico se suprimieron de las construcciones de ácido nucleico a través de técnicas de amplificación mediante PCR con base en las secuencias de ADNc conocidas de pollo, humano y los homólogos similares de Src y la formación posterior de nuevas construcciones. En una modalidad de la invención, el cebador PCR3' utilizado para amplificar los ácidos nucleicos Src también codifica para una secuencia en marco. El uso de este cebador agrega una marca del epitope 9E10-myc al término carboxilo de la construcción Src posterior. Los siguientes aminoácidos se agregaron después del aminoácido 251 de la Src para generar las construcciones vector que contienen la marca del epitope 9E10-myc: VDMEQKLIAEEDLN (SEQ ID NO : 6 ) . Se llevaron a cabo dos PCR por separado para cada construcción y se obtuvieron resultados similares. Todas las construcciones mutantes construidas por PCR también se secuenciaron mediante PCR para confirmar la secuencia de clones del ADN predicho. Los ADNc de la Src tipo silvestre y mutada para utilizarse en los sistemas de expresión de la presente invención también están disponibles de Upstate Biotech Laboratories, Lake Placid, NY que vende las formas mutadas avícolas así como también la Src humana y diversas absolutamente de cinasa y activadas. Los vectores de expresión alternativos para utilizarse en la expresión de las proteínas Src o Yes de la presente invención también incluyen vectores adenovirales como se describe en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,797,368, 5,173,414, 5,436,146, 5,589,377 y 5,670,488. Los métodos alternativos para el suministro de las proteínas moduladoras de Src o Yes incluyen el suministro de ADNc de Src o Yes con un sistema vector no viral como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,675,954 y el suministro del ADNc mismo como ADN puro como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,589,466. El suministro de construcciones de esta invención tampoco está limitado a la aplicación tópica de un vector viral como se describe en el sistema de análisis CAM más adelante. Por ejemplo, las preparaciones del vector viral también se inyectan intravenosamente para el suministro sistémico en el lecho vascular. Estos vectores también pueden ser el blanco para los sitios de una neovascularización aumentada mediante la inyección localizada de un tumor, como un ejemplo. Las proteínas expresadas in vi tro también se contemplan para el suministro de las mismas después de la expresión y purificación de la proteina Src seleccionada mediante los métodos útiles para el suministro de proteínas o polipéptidos. Uno de estos métodos incluye sistemas para suministro liposómico, tales como por ejemplo los descritos en las patentes de los Estados Unidos Nos. 4,356,167, 5,580,575, 5,542,935 y 5,643,599. También se conocen por aquellos con experiencia normal en la técnica otros sistemas vector y para suministro de proteína, para utilizarse en la expresión y/o suministro de las proteínas Src o Yes de la presente invención. 2. Caracterización de la membrana corioalantóica de pollo sin tratar (CAM) A. Preparación de la CAM La angiogénesis se puede inducir sobre la membrana corioalantóica de pollo (CAM) después de que la angiogénesis embriónica normal ha dado por resultado en la formación de vasos sanguíneos maduros. La angiogénesis ha mostrado que se induce en respuesta a citosinas específicas o fragmentos tumorales como se describe por Leibovich et al., Nature, 329:630 (1987) y Ausprunk et al., Am. J. Pathol . , 79:597 (1975) . Las CAM se preparan a partir de embriones de pollo para una inducción posterior de la angiogénesis y la inhibición de la misma. Los embriones de pollo de diez días de edad se obtuvieron de Mclntyre Poultry (Lakeside, CA) y se incubaron a 30°C con una humedad del 60%. Se hizo un pequeño orificio a través de la capa en el extremo del huevo directamente sobre el saco de aire con el uso de un taladro Crafts pequeño (Dremel, División of Emerson Electric Co . Racine Wl) . Se taladró un segundo orificio sobre el lado amplio del huevo en una región desprovista de vasos sanguíneos embriónicos determinada anteriormente mediante examen a trasluz del huevo. Se aplicó presión negativa al orificio original, lo que dio por resultado en la extracción de la CAM (membrana corioalantóica) lejos de la membrana protectora y creando un saco falso de aire sobre la CAM. Se cortó una ventana cuadrada de 1.0 centímetro (cm) x 1.0 cm a través de la capa sobre la CAM caida con el uso de una rueda para trituración de modelo pequeño (Dremel) . La pequeña ventana permitió el acceso directo a la CAM implícita. La preparación de la CAM resultante luego se utilizó ya sea a los 6 días de la embriogénesis, una etapa marcada por la neovascularización activa, sin tratamiento adicional para que la CAM reflejara el modelo utilizado para evaluar los efectos sobre la neovascularización embrionica o se utilizó a los 10 días de la embriogénes i s en donde se había subsidiado la angiogénesis. La última preparación se utilizó aqui en esta invención para inducir una angiogénesis renovada en respuesta al tratamiento con citosina o el contacto tumoral como se describirá más adelante. 3. Análisis de angiogénesis de la CAM A. Angiogénesis inducida por factores de crecimiento Se ha mostrado que la angiogénesis se induce por citosinas o factores de crecimiento. La angiogénesis se indujo al colocar un disco de filtro Whatman de 5 milímetros (mm) x 5 mm (papel filtro Whatman No. 1) saturado con solución salina balanceada Hanks (HBSS, GIBCO, Grand Island, NY) o HBSS que contiene 2 microgramos/mililitros (µg/ml) del „ factor de crecimiento de fibroblastos, básico, recombinante (FGFb) o factor de crecimiento celular endotelial vascular (VEGF) (Genzyme, Cambridge, MA ) sobre ia CAM de cualquier embrión de pollo de 9 ó 10 dias en una región desprovista de vasos sanguíneos y las ventanas se sellaron por último con cinta adhesiva. Otras concentraciones de factores de crecimiento también son eficaces para inducir el desarrollo de vasos sanguíneos. Para los análisis en donde se evalúa la inhibición de la angiogénesis con inyecciones intravenosas de antagonistas, la angiogénesis se induce primero con 1-2 ug/ml de FGFb o VEGF en medio para desarrollo de fibroblastos. La angiogénesis se monitoreo mediante fotomicroscopia después de 72 horas.

B . Angiogénesis embriónica La preparación de la CAM para evaluar el efecto de los inhibidores de angiogénesis sobre la formación natural de la neovasculatura embriónica es el embrión de pollo embriónico de 6 días como se describió anteriormente. En esta etapa del desarrollo, los vasos sanguíneos experimentaron de novo crecimiento y de esta forma proporcionaron un sistema útil para la valoración de la modulación de angiogénesis mediante las proteínas Src de la presente invención. El sistema CAM se preparó como se describió anteriormente con excepción de que el análisis se realizó en embriones de 6 días en lugar de embriones de 9 ó 10 dias. 4. Modulación de la angiogénesis según se mide en el análisis CAM Para valorar el efecto de las proteínas Src sobre la angiogénesis, se realizaron los siguientes análisis en preparaciones CAM de pollo de 10 días de edad. Las construcciones de cinco µg de RCAS preparadas como se describió en el Ejemplo 1 se transfectaron en la línea de fibroblastos inmortalizados de pollo, DF-1 (donación de Doug Foster, U. of Minn.) . Esta línea celular así como también los fibroblastos de embriones de pollo primarios fueron capaces de producir virus, sin embargo la línea celular DF-1 produjo títulos superiores. Se recolectaron los so renadantes virales a partir de las líneas celulares productoras de DF-1 subconf luentes en medios CLM libre de suero [composición: base media F-10 complementada con DMSO, ácido fólico, ácido glutamico y solución de vitaminas MEM] . Se concentraron treinta y cinco ml de sobrenadante viral mediante ui t acent p fugación a 4°C durante 2 horas a 22,000 rpm. Estos sedimentos virales concentrados se resuspendieron en 1/100 del volumen original en medio CLM libre de suero, se realizaron alícuotas y se almacenaron a -80°C. Ei título se valoró mediante dilución en serie de un vector viral control que tiene una secuencia nucleotídica qae co ifica para la proteina fluorescente verde (GFP), denominada como RCAS-GFP, infección sobre fibroblastos de embriones de potl< primarios que se incubaron curante 48-72 horas. Lo? títulos del material viral que se obtuvieron después de la concentración excedieron rutinariamente 1C I.U./ l. Para el análisis CAM que utiliza los materiales virales, se prepararon discos de filtro Whatman de 6 mm de d?-¡netro empapados con acetato de cortisona en 3 mg/ml : • < e^ato de cortisona durante 30 minutos en etanol . - ¿. Los discos se secaron en una cubierta de fin i i- 'nar y luego se empapare' sobre 20 µl de material viral por disco durante 10 minutos. Estos discos se aplicaron a la CAM de embriones de pollo de 9 ó 10 días y se sellaron con cinta de celofán y se incubaron a 37°C durante 18-24 horas. Luego se agregaron PBS simulada o factores de crecimiento a una concentración de 5 µg/ml para ia CAM en un volumen de 20 µl del material de v?r?,.s adecuado como un aumento adicional de virus para 3. tejido de la CAM. Después de 72 horas, las CAM -.t recolectaron y se examinaron para cambios en ei índice angiogénicc según se determinó mediante conteo doble ciego del número de puntos de ramificación er la CAM que cubre el disco. Para análisis de ciñas a, el tejido que cubre el disco se recolectó en RIPA, " homogenizó con una trituradora motorizada y ^ mmunopreci pi tó Src a partir de cant ?daan ~ equivalentes de proteína total y se sometió a análisis de cmasa m vi tro utilizando una protei ae fusión FAK-GST como un sustrato. Para i * estudios de inmunof luorescencia, el tejido de la C"' que cubre los discos se congeló en OCT, cpconservador se secciono en 4 µm, se fi o . acetona durante 1 minuto, se incubó en suero norm l de cabra al 3% durante 1 hora, seguido por un-. incubación en anticuerpos primario de ERK anti-fosfoplado de conejo como se describió anter íormen - (Eliceiri et al., J_. e 11 Bio 1. , 140:1255-12- (1998)), lavado en PBb / detectado con anticuer: secundario fluorescente A. Activación de la Src endógena mediante FGFb o VEGF Para valorar los efectos de los factores de crecimiento sobre la actividad Src para modular la angiogénesis, se realizaron los siguientes análisis. Los extractos de tejido de las CAM de pollo de 10 días de edad que se habían expuesto a FGFb o VEGF (2 µg/ml) durante 2 horas se Usaron. La Src endógena se inmunoprecipi tó a partir de cantidades equivalentes de proteína total y se sometió a un análisis de cinasa compleja inmune i n vi t ro utilizando una proteína de fusión FAK-GST como un sustrato, se sometió a electroforesis y se transfirió a nitrocelulosa. Los resultados del análisis se muestran en la Figura 1, en donde el aumento en la actividad Src es evidente en la densidad aumentada del gel con el tratamiento ya sea FGFb o VEGF en comparación con las muestras no tratadas (simuladas) que son indicativas de los valores iniciales de la actividad Src en el análisis CAM. Tanto FGFb como VEGF dieron por resultado en aproximadamente 2 veces el aumento de la actividad Src endógena presente en la CAM. La transferencia del análisis de cinasa anterior también se probó con un anticueroo anti-Src como un control de carga para el contenido le Src e IgG equivalente.

B . Efecto de la expresión de genes suministrada por retrovirus de la Src A sobre la angiogénesis en la CAM de pollo Se realizó el siguiente análisis para valorar el efecto de las proteínas Src mutadas sobre la angiogénesis en la preparación de la CAM. Para el análisis, se expusieron las CAM de pollo de 9 días de edad a los retrovirus que expresan RCAS-Src A o RCAS-GFP o al amortiguador durante 72 horas después del protocolo descrito ante iormente. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 2A, en donde el nivel de angiogénesis se cuantificó como se describió anteriormente. Las fotomicrografías representativas (4x) se tomaron con un estereomicroscopio como se muestra en la Figura 2B. Los valores iniciales de la actividad Src endógena tuvieron un índice angiogénico de aproximadamente 50. Por contraste, las CAM tratadas con RCAS-Src A expresado con el vector retroviral que tienen una mutación puntual en 1 posición 527 del residuo de aminoácidos a partir de una tirosina para una fenilalanina dieron por resultado en una intensificación (inducción) de la angiogénesis de un índice angiogénico de aproximadamente 90. La intensificación del angiogénesis suministrada por Src-A también fue evidente en las fotografías mostradas en la Figura 2B.

C . Expresión retroviral de la Src A activa la fosforilación de la cmasa MAP vascular El efecto de la Src A en comparación con los factores de crecimiento VEGF y PMA sobre la fosforilación de cinasa MAP vascular también se valoro siguiendo los procedimientos de análisis descritos anteriormente y en la presente. Los extractos de tejido de las CAM de pollo de 10 días de edad expuestas a VEGF o PMA (otro mitogeno en una concentración comparable) durante 30 minutos se compararon con aquellos infectados con retrovirus que expresa Src A durante 48 horas. La Src fue la que se mmunoprecipi to a partir de cantidades equivalentes del extracto de proteina total y se sometió a un análisis ae cinasa compleja inmune m vi t ro que utiliza una proteina de fusión FAK-GST como un sustrato, se sometió a electroforesis y se transfirió a microcelulosa. Los resultados de este análisis se muestran en la Figura 3A, en donde las CAM no tratadas (NT) exhibieron valores iniciales de fosforilación de cmasa MAP vascular suministrada por Src endógena. Tanto VEGF como PMA dieron por resultado en un aumento aproximado de 2 veces con respecto a los valores iniciales. Por contraste, la Src A intensifico la actividad aproximadamente de 5 hasta 10 veces con respecto a observada con las muestras sin tratar .

Las alícuotas de los lisados de tejido total anteriores también se midieron para la fosforilación ERK endógena mediante inmunot rans ferencia con un anticuerpo ant i- fos fo-ERK como se muestra en la Figura 3B. Para esta valoración, se infectaron las CAM de 10 días de edad ya sea con RCAS simulada o RCAS que expresa SRC A. Después de dos días, las CAM se cortaron en pedazos, se crioconservaron en OCT y se seccionaron en 4 µ . Las secciones se inmunot iñeron con un anticuerpo ERK ant i- fos for i lado (New England Biolabs), se lavaron y se detectaron con un anticuerpo secundario conjugado con FITC de cabra anti-conejo. Las imágenes fluorescentes se capturaron en una cámara CCD enfriada (Princetcn Inst.) . Las fo omicrografías indican una inmunofluorescencia intensificada con las preparaciones tratadas con Src A en comparación con los controles simulados.

D . Requerimiento selectivo para una actividad Src durante la VEGF, aunque sin angiogénesis inducida por FGFb Para valorar el efecto de la actividad moduladora Src sobre ia angiogénesis inducida por el facto de crecimiento, se realizaron los siguientes análisis. Se expusier*:: Las CAM de pollo de nueve días de edad a la p:-r ..- -. • • .' o n del vector retroviral que expresó la muta • - :. Src negativa dominante denominada como Src 251 o Src K295M como se describió anteriormente. Los retrovirus RCAS-Src 251 o RCAS-GFP control o las CAM amortiguadoras se trataron durante 20 horas y luego se incubaron durante unas 72 horas adicionales en presencia o ausencia de FGFb o VEGF. El nivel de amgogenes i s , cuantif icado c ^^ se describió anteriormente, se muestra en la Fi . ' . 4A. Las fotomicrografías representativas ( 6/ , mostradas en la Figura 4B, se tomaron con estereomicroscopio . La Figura 4C ilustra una transferencia probada con un anticuerpo anti-Src para confirmar la expresión de la Src 251 en las celular transfectadas en comparación con tratamient -simulados . Los resultados de los análisis descrit •*< anteriormente indican tanto FGFb como VEGF tratan con las CAM en presencia de la angiogenesis inducí por los controles RC?3-GFP sobre los valo_ iniciales de angiogenesis suministrada por observados con preparaciones de CAM simulada o ^ tratar. La Src 251 mutante negativa dominai ' j expresada fue eficaz para inhibir la angiogenesis inducida por VEGF nuevamente para los niveles íe valores iniciales mientras que no fue eficaz pa inhibir la angiogenes1 suministrada por FGFb. Li fotomicrografías riostra ?as en la Figura 4B confir-gráficamente los datos mostrados en la Figura 4A. esta forma, la Src 251 expresada retroviralmente es un inhibidor eficaz de la angiogénesis , cuando la angiogénesis se induce con VEGF. Las aplicaciones de las proteínas Src de esta invención con otros modelos de angiogenesis como se describe en los siguientes Ejemplos se contemplan en la presente invención.

. Regresión del desarrollo de tejido tumoral con moduladores Src según se mide mediante análisis modelo de ojo de conejo in vivo El efecto de los moduladores Src sobre la angiogénesis inducida por el factor de crecimiento se puede observar en estructuras naturalmente transparentes como se ejemplifica por la córnea del ojo. Nuevos vasos sanguíneos se desarrollan a partir del borde la córnea, que tiene un suministro rico de sangre, hacia el centro de la córnea, que normalmente no tiene un suministro de sangre. Los estimuladores de la angiogénesis , tales como por ejemplo FGFb, cuando se aplican a la cornea inducen el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos a partir del borde la córnea. Los antagonistas de la angiogénesis , aplicados a la cornea, inhiben el desarrollo de o nuevos vasos sanguíneos a partir del borde la córnea.

De esta forma, la cornea experimenta angiogenesis a través de una invasión de células endoteliales desde el borde de la cornea ^n el interior del te ido córneo duro empacado con colágeno que es visible fácilmente. El análisis modelo de ojo de conejo por lo tanto proporciona un modelo i n vi vo - para la observación directa de la estimulación e inhibición de la angiogénesis después de la implantación de los compuestos directamente en la córnea del ojo.

El análisis del modelo de ojo de conejo in vivo demuestra la angiogénesis inducida por factores de crecimiento La angiogénesis induce en el análisis modelo de ojo de conejo in vi vo con factores de crecimiento FGFb o VEGF y se describe en las siguientes secciones . Los sedimentos del polímero Hydron que contienen el factor de crecimiento se prepararon como se describe por D'Amato, et al.,' Proc . Natl . Acad. Sci., USA, 91:4082-4085 (1994) . Los sedimentos individuales contienen 650 ng de los factores de crecimiento por separado unidos a sucralfato (Carafet, Marión Merrell Dow Corporation) para estabilizar el factor de crecimiento y asegurar su lenta liberación en el tejido circundante. Además, los sedimentos Hydron se prepararon para contener un retrovirus que expresa la Src deseada como se describió anteriorme e. Los sedimentos se repartieron en tapones de teflón preparados especialmente que tuvieron un núcleo perforado de 2.5 mm en sus superficies. Aproximadamente 12 µl del material repartido se colocaron en cada tapón y se polimer i zaron durante la noche en una cubierta estéril. Los sedimentos luego se esterilizaron mediante radiación ultravioleta. Los efectos de las proteínas Src luego se valoraron como se describió anteriormente . 6. Regresión m vivo de desarrollo de tejido tumoral con moduladores Src según se m de mediante análisis de ratón quimérico : humano Un modelo de ratón quimérico : humano í n vi vo se generó al reemplazar una porción de piel proveniente de un ratón SCID con prepucio neonatal de humano. El modelo de ratón quimérico : humano i n vi vo se preparó esencialmente como se describe en Yan, et al., J. Cl n. Invest., 91:986-996 (1993). En resumen, un área cuadrada de 2 cm" de piel se retiró quirúrgicamente de un ratón SCID (6-8 semanas de edad) y se reemplazó con prepucio humano. El ratón se anestesió y se retiró el pelo de un área de 5 cm" sobre cada lado de la región abdominal lateral mediante afeitado. Dos lechos circulares de injerto de 2 cm" se prepararon al eliminar el espesor total de la piel hacia la venda. El espesor total de los injertos de piel humana del mismo tamaño derivados de prepucio neonatal humano se colocaron sobre los lechos de herida y se .-_> aturaron en su lugar. El injerto se cubrió con una bandita que se suturó a la piel. La cinta de tela microporosa también se aplicó para cubrir la herida. La línea celular oe melanoma humano M21-L o la línea celular de carcinoma de mama MDA 23.1 (ATCC HTB 26; a ß, negativo mediante inmunorreact i vidad de las secciones de tejido con mAb LM609), se utilizaron para formar los tumores sólidos de humano sobre los injertos de piel humana en los ratones SCID. Una suspensión celular individual de 5 x 10° M21-L o células MDA 23.1 se inyectó intradérmicamente en el injerto de piel humana. Los ratones luego se observaron durante 2 hasta 4 semanas para permitir el desarrollo de tumores humanos mensurables. Después de que se estableció un tumor mensurable, las prepa aciones de retrovirus de la presente invención o PBS se inyectaron en la vena de la cola del ratón. Después de un periodo de 2-3 semanas, el tumor se extirpo se analizó en peso y mediante histología. Luego se valoró él efecto de las proteínas Src expresadas de la presente invención sobre los tumores . 7. Regresión in vi tro del desarrollo de tejido tumoral de humano con moduladores Src según se mide mediante análisis CAM El desarrcL. '_ amoral depende de la angiogénesis (Folkman, ''-"', J . Biol . Chem . 267:10931- 10934; Weidner et al., 1991, N.E. J. Med. 324:1-8; Brooks et al., 1994, Cell 79:1157-1164) . De hecho, los reportes recientes sugieren que el desarrollo tumoral es susceptible a los efectos anti-angiogénicos de los antagonistas del receptor VEGF (Kim et al., 1993, Nature 362:8451-8 ) . Por Lo tanto, se examino si la supresión de la ang?ogenec s mediante el suministro de Src 251 suprimió la cina-a podría incluir en el desarrollo de un meduloblast^" i humano (DAOY), un tumor bastante angiogenico conocpc para producir VEGF y muy poco FGFb. Los análisis de crecimiento tumoral de meduloblastoma DAOY de 3 y 6 días se realizaron en > -. CAM de pollo esencialmente como se descric anteriormente, (Brooks et al., 1994, supra) . La-= células DAOY 5 x 10 cultivadas en RPMI 1640 s^e contenían suero fetal de ternero al 10% se lavaron se semoraron sobre la CAM de un embrión de 10 di . para producir fragmentos tumorales DAOY. Después 7 días, 50 mg de fragmentos tumoraies se secc?onar y se volvieron a sembrar sobre otro embrión de días y se incubaron durante otros 3 ó 6 días con aplicación tópica (25µl) de ya sea retrovirus RCAS-GFP control, RCAS-Src 251 o tratamiento simulada... Utilizando la formación de imágenes confocal d--te ido total de tumores infectados como una guía, tuvo la capacidad de i-terminar que hubiera expresión significativa de las construcciones RC ' alrededor y dentro del fragmento tumoral con esta propuesta tópica. Las resecciones y el pesaje del tumor se realizaron de una forma doble ciego que elimina únicamente la masa tumoral sólida que se puede definir fácilmente (Brooks et al., 1994, supra) . Los pesos del tumor en un húmedo después de 3 ó 6 días se compararon con el peso inicial y el cambio porcentual del peso tumoral determinado para cada grupo . Estos tumores se desarrollaron fácilmente sobre la CAM y produjeron angiogénesis activa (Figura 5) permitiendo dirigir de manera selectiva la vasculatura tumoral derivada de aves al utilizar un retrovirus RCAS específico avícola. La Figura 5, representa los resultados que muestran el suministro retroviral de RCAS-Src 251 a tumores humanos en desarrollo sobre el crecimiento tumoral inverso de la CAM de pollo. La Figura 5A muestra meduloblas tomas humanos que se desarrollaron sobre la CAM de embriones de pollo como se describió anteriormente. Los retrovirus que contenían RCAS-GFP o RCAS-Src 251 se aplicaron tópicamente a los tumores preestablecidos de más de 50 mg . Una micrografía representativa de un fragmento tumoral de meduloblastoma infectado con GFP que expresa RCAS-GFP revela la expre.sión exclusiva en los vasos sanguíneos del tumor (cabeza de flecha) como se detecta mediante seccionamiento óptico :on un microscopio de exploración confocal láser Bio Rad (bar=500µm) . La Figura 5B muestra los resultados de los tumores tratados como se hizo anteriormente que se dejaron desarrollar durante 3 o 6 días después de los cuales se reseccionaron y se determinaron los pesos en número. Los datos se expresan como el cambio medio en el peso del tumor (a partir de un peso inicial de un tumor de 5 mg) +/- SEM de 2 replicados. La RCAS-Src 251 tuvo un impacto significativo sobre el desarrollo de tumores después de 3 días (*, P<0.002) y 6 días (**, P<0.05). La Figura 5C muestra es tereomicrografí as representativas de tumores de meduloblastoma retirados quirúrgicamente a partir de los embriones extraídos con un estereomicroscopio Olympus (bar=350µm) . (Panel inferior) una micrografía con aumento alto de cada tumor que muestra la vasculatura de cada tumor en detalle (bar=350µm) . La punta de flecha indica el rompimiento de vasos -sanguíneos en tumores tratados con RCAS-Src251. Los resultados muestran que el suministro de RCAS que contiene Src 251 para meduloblas tomas preestablecidos dio por resultado en la expresión viral selectiva en los vasos sanguíneos asociados con el tumor (Figura 5A) y esto condujo por último a la regresión de estos tumores en un lapso de seis días (Figura 5B) . De manera importante, los vasos sanguíneos asociados con el tumor en animales tratados con virus que contiene la Src 251 se rompieron severamente y ás bajo en número en comparación con los vasos del tumor en animales control (Figura 5C) . El hecho de que los tumores infectados con RCAS-GFP mostraron una localización GFP únicamente en la vasculatura tumoral sugiere que los efectos anti-tumor observados con Src 251 suministrada retroviralmente fueron debido a sus propiedades ant i-angiogénicas . 8. Requerimiento de Src para la supervivencia de células endoteliales durante VGEF-, aunque sin angiogénesis suministrada por FGFb Las evidencias recientes sugieren que los receptores del factor de crecimiento (Choi and Baliermann, 1995, J. Biol. Chem. 270:211 4-21150; Satake et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Comm. 244:642-646) y las mtegrinas (Meredith et al., 1993, Mol. Biol. Cell 4:953-961; Brooks et al., 1994a, Science 264:569-571) estimulan la supervivencia de células endoteliales angiogénicas. El hecho de que tanto los factores de crecimiento como los receptores de adhesión también regulan la actividad Src impulsaron el examen de la función de la Src en la supervivencia de células endoteliales durante la angiogénesis. Las CAM estimuladas ya sea con FGFb o VEGF se infectaron con retrovirus que contienen Src 251, y las secciones de postato de estos tejidos se examinaron para la presencia de células apoptóticas. En resumen, las cposecciones de las CAM tratadas con RCAS-GFP o RCAS-Src 251 tratadas con FGFb o VEGF se analizaron para células apoptoticas que utilizan el Equipo Apoptag (Oncor; Gai thersburq, MD) . Las secciones también se inmuno t meron con anti-vWf policlonal de conejo (biogenix, San Ramón, CA) y se contratiñeron con 1 ug/ml de DAP I. Las imágenes fluorescentes se capturaron con una cámara CCD enfriada (Roper, Trenton, NJ) , y las imágenes fluorescentes . se procesaron y la exposición coincidieron entre tra amientos experimentales como se describió anteriormente (Ellcelri et al. 1998, supra) . Para medir el índice apoptótico de los tejidos Ci infectados con retrovirus, la anexina V conjugada con FITC iCLontech, Palo Alto, CA) se utilizó para teñir las suspensiones celulares y las células lavadas se ana 1 i ¿.a ron mediante citometría de flujo. Las suspensiones celulares de las células CAM se prepararon a partir de CAM simuladas o infectadas con virus mediante la digestión con 0.1% (p/v) tipo IV de colagenaza (Wortnington Biochemicals , Lakewood, NJ) , en RPMI 1640 de tf-nido CAM desmenuzado que gira durante 1 hora a 37°C me se describió anteriormente (Brooks et al., 199'-.^ , se tiltró a través de una malla de nylon de 1 l< ' '-' peton Dickinson, Fountain Lakes, NJ) . La f . -. -^ n c i a se midió con ar citómetro de flujo FACscan (Becton Dickinson) para un conteo de 10,000 células. La medición de la tinción vWf mediante los FAC se realizó con preparaciones celulares de tejido CAM diferidas con colagenaza en paralelo, que se fijaron en paraformaldehído al 1.8%, se permeabili zaron en etanol al 70%, incubaron el. anticuerpo anti-vWf y se detectaron con un. anticuerpo secundario conjugado con FITC. El suministro de Src 251 estimulado mediante tinción TÚNEL extensiva entre el antígeno relacionado con el' facto VIII (von Willebrand factor [vWf]) los vasos sanguíneos positivos en VEGF-but pero no bFGF-, estimuló las CAM. De hecho, se observó una apoptósi= mínima entre otros tipos celulares en estas CAM . Loque sugiere un -requerimiento específico de células endoteliales para la actividad cinasa de Src para '* --. supervivencia celular en vasos sanguíneos activad... por VEGF. En una segunda serie de experimentos, 1,: -CAM infectadas por retrovirus estimuladas con VEGF FGFb se sometieron a digestión limitada de colágena::--, para preparar una suspensión celular individual . Estas células derivadas de CAM se mostraron para contener aproximadamente 20%-50% de células endoteliales (vWf positiva) y se analizaron para apoptósis mediante detección citométrica de flujo d* células positivas con anexina V, como el marcador :•• apoptósis anterior. Las células derivadas de las C.-"•!•' estimuladas por VEGF infectadas con Src 251 tuvieron una tinción de anexina V aumentada significativamente con relación a las células provenientes de las CAM infectadas con RCAS-GFP simulada tratadas con VEGF. Por contraste, las células derivadas de las CAM infectadas simuladas o aquellas infectadas con RCAS-Src 251 y estimuladas con FGFb exhibieron poca o ninguna tinción con anexina V. Además, no se detectó tinción "con anexma V entre las células derivadas de las CAM no estimuladas o estimuladas por FGFb. Estos datos demuestran que la actividad de cinasa Src se requiere selectivamente para la supervivencia de células endoteliales durante VEGF, pero no para la angiogénesis suministrada por FGFb en la CAM. 9. Requerimiento selectivo para la actividad cinasa Src en un modelo de angiogénesis subcutánea de murino Para analizar adicionalmente la función de la Src en la angiogénesis, se empleó un modelo de murino. En este caso, lá angiogénesis se indujo mediante inyección subcutánea de Matrigel agotado por el factor de crecimiento complementado con ya sea FGFb (100 ng/ml) o VEGF (400 ng/ml) en wehl atímico (nu/nu) de ratón adulto y se analizó después de 5 días (Passaniti et al., 1992) . La angiogénesis se cuantificó al eliminar y homogenizar el tejido, aislando las proteínas y la inmunotrans ferencia con un anticuerpo receptor de VEGF (flk-1) (Figura 7A) que es específico para células endoteliales. Como se observó en el pollo, la expresión del ADNc de Src 251 suprimido por cinasa bloqueó la angiogénesis inducida por VEGF en este modelo de murino mientras que no tuvo ningún efecto sobre la angiogénesis inducida por bFGF (Figura 7B) . Para establecer la función de la Src endógena en este modelo, los tejidos se infectaron con un Cak que expresa retrovirus que inhibe la actividad Src endógena mediante la fosforilación del sitio regulador C-terminal (Nada et al., 1991, Nature 361:68-72) . La expresión de Cak bloqueada por VEGF-, pero no por FGFb-, indujo la angiogénesis (Figura 7), que confirma una función para la actividad Src endógena en la angiogénesis suministrada por VEGF-. La neovascularización de estos tejidos estimulados por VEGF infectados con virus se confirmó mediante inmunofluorescencia directa con un anticuerpo anti-DC34 conjugado con FITC (Figura 7) o un anticuerpo anti-flk-1 y se cuantificó al enumerar el número de vasos sanguíneos CD34 teñidos positivamente en cada criosección (Figura 7C) . En resumen, la angiogénesis se indujo mediante una inyección subcutánea de Matrigel agotado por el factor de crecimiento que contuvo solución salina o VEGF (400 ng/ml) con 2 x 106 de células de empaque ectrópico que expresan retrovirus GFP en el flanco de ratones Wahl atímicos (nu/nu) y se analizaron después de 5 días de incubación. La neovascularización se cuantificó mediante inmunotransferencia con un anticuerpo receptor VEGF (flk-1) que es específico para células endoteliales. La Figura 9 representa los resultados de la inmuno trans ferencia . Los efectos de la Src-251 suprimida por cinasa, Csk, o retrovirus GFP sobre la angiogénesis inducida por VEGF- (400 ng/ml) o bFGF- (400 ng/ml) se analizó mediante inmunotrans ferenci a de los lisados de tejido con un anticuerpo anti-flk-1. Un ejemplo de estos resultados se representan en la Figura 9B . El efecto de los retrovirus que expresan Src 251- y Csk sobre la neovascularización inducida por VEGF- se cuantifico al enumerar el número de vasos positivos CD34 en las secciones tranversales del tejido mediante inmunofluorescencia indirecta en campos aleatorios por triplicado a 20x. Las criosecciones de las obturaciones también se sometieron a tinción inmunof luorescente con un anticuerpo anti-CD34 o un anticuerpo anti-flk, se fotografiaron y se cuantificaron como se describió anteriormente para los análisis de angiogénesis CAM. La fluorescencia directa de cantidad completa del fragmento del tumor infectado con RCAS-GFP se llevó a cabo al dividir un fragmento de tumor y formar una imagen del tejido no fijo directamente sobre un portaobjetos cun un mocroscopio confocal láser (MRC 1024: Bio-Rad, Hercules, CA) . El efecto de la expresión mtradérmica de VEGF en las orejas de ratones src" o src +/- Continuando con los resultados obtenidos con los modelos de angiogénesis de pollo y ratón, se empleó un enfoque genético directo para examinar la angiogénesis inducida por VEGF mtradermica en ratones src" ~. También se examinaron los efectos sobre la permeabilidad vascular, ya que se mostró que la VEGF inicia el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos y puede estimular la permeabilidad vascular (Senger et al., 1983 Science 218:983-985; Ferrera and Davis-Smyth, 1997, Endocr. Rev. 16:4-25) . Las inyecciones mt radérmicas de adenovirus que expresan un ADNc de VECF humano se realizaron en la oreja de ratones src" " y src"-, mientras que los adenovirus que expresan ß-ga lactos idasa control se inyectaron en la oreja opuesta de cada ratón. E i desarrollo de nuevos v^os sanguíneos que depende de VEGF en las orejas de src '" se detectaron primero dentro de las 48 horas y ia neovasculari zación se analizó después de 5 días. En resumen, s e .[eneraron ratones deficientes (129/8v/Ev x C57B16/J, pp " " , pp60 "yes, pp60r"*"' , como se describió c • * ' r- - lorment e (Sopano et al., 1991, Cell 64: 693-7'." . Se obtuvieron materiales adicionales de Jacksor os. Las orejas de los ratones se inyectaron intradérmicamente (Eriksson et al., 1980, Microvasc. Res. 19:374-378) con 5 ml de adenovirus que expresan ya sea VEGF o ß-galactosidasa y las orejas se fotografiaron después de 5 días con un estereoscopio. Se encontró que hubo niveles de expresión viral idénticos en src"" y src-'- según se determinó mediante tinción X-gal de las orejas inyectadas c*-el adenovirus ß-galactosidasa. En las orejas src" inyectadas con VEGF, no hubo una disminución significativa en la angiogénesis según se midió mediante conteo de los puntos de ramificación (p<0.05) . Sin embargo, de manera sorprendente, el genotipo más evidente en estos animales fue ei bloqueo completo del escape vascular en comparad :> n con las orejas src+ - inyectadas con VEGF. El examen de las orejas inyectadas con VEGF confirma el g a--r~ de escape vascular en los ratones src"'", que est-. esencialmente ausente en los ratones src-'-. .- . escape vascular en estos animales sugirió que . -actividad de la VP, que había sido asociada con - . angiogénesis i n vi vo (Dvorak et al., 1995, Am . Pathol . 148:1029-1039), se podría romper selectivamente en ratones deficientes ppoUc"SI . 11. El VEGF fracasa para comprometer la barrera hemoencefálica en ratones que carecen de pp60c"src La vasculatu a cerebral se caracteriza p : una barrera hemoencefálica bastante restrictiva que prohibe la extravasación de pequeñas moléculas en el tejido circundante del cerebro. El desarrollo de tumores dentro del cerebro puede comprometer esta barrera debido en parte a la producción de factores de crecimiento angiogénico tales como por ejemplo VEGF. Por lo tanto, se examinó la naturaleza de la barrera hemoencefálica en ratones srct/_ o src"/-. En este caso, el VEGF o solución salina se inyectaron estereotáct icamente en el hemisferio derecho o izquierdo del cerebro, respectivamente. Todos los ratones recibieron inyecciones sistémicas del tinte azul de Evan para monitorear la actividad de la VP . En resumen, la solución salina o VEGF (200 ng en 2 ul) se inyectó es tereotáct icamente en los 92 mm del lóbulo frontal izquierdo o derecho para la izquierda/derecha de la línea media, 0.5 mm de rostral a partir del bregma y 3 mm de profundidad a partir duramadre, respectivamente. Estos animales recibieron una solución de filtro azul de Evan intravenosamente 30 minutos después de la inyección, como se describió anteriormente. Después de unos 3-0 minutos adicionales, los ratones se sometieron a perfusión y los cerebros se retiraron. Se observó la fluorescencia de tinte azul de Evan utilizando microscopía láser confocal de criosecciones no fijas frescas del cerebro. El escape vascular de la sangre se localizó hacia el hemisferio inyectado con VGEF en ratones src+/", aunque hubo una ausencia completa de escape vascular en los ratones src- -. Este también fue el caso cuando se examinó la VP al medir la acumulación del tinte azul de Evan según se detectó por análisis de epifluorescencia de secciones criostato de estos cerebros. De esta forma, el VEGF compromete la barrera hemoencefálica de una forma que depende de la _pp_ 60c-s rc 12. VP suministrada por VEGF, pero sin VP asociada con inflamación, depende de pp60c"srG Para analizar y cuantificar adicionalmente el efecto de VEGF como un factor de la VP en ratones src+/" o src-/", se utilizó un análisis de Miles (Miles & Miles, 1952) para medir cuantitativamente la permeabilidad vascular en la piel de estos animales. El VEGF se inyectó intradérmicamente en ratones src*'" o src_ " que habían recibido una administración sistémica intravenosa de tinte azul de Evan. Dentro de los 15 minutos después de la inyección del VEGF, hubo un aumento de 3 veces en la VP en los ratones src4/". Sin embargo, en los ratones src"'" no se observó ninguna actividad VP detectable. La elusión del tinte de los parches de piel inyectados se cuantificó y se comparó con la solución salina control y FGFb. Los controles FGFb o en solución salina inyectados adyacentes al VEGF no mostraron ningún aumento significativo en la VP . En resumen, el análisis de Miles (Miles et al., 1962) se adaptó para los ratones mediante la inyección de 10 µl de VEGF (400 ng/ml), isotiocianato de alilo (aceite de mostaza, 20% p/v en aceite mineral), o solución salina intradérmicamente en ratones que antes se habían inyectado intravenosamente con 100 µl de tinte azul de Evan al 0.5%. Después de 15 minutos, los parches de piel se diseccionaron, se fotografiaron y se eluyeron a 58°C con formalina y se cuantificaron con un espectrofotómetro . El escape/permeabilidad vascular también se conoce para que se presente durante la inflamación, que permite la acumulación de proteína adhesiva asociada con el suero y las células inflamatorias en tejidos. De hecho, los mediadores inflamatorios en si mismos estimulan directamente el escape vascular. Por lo tanto, uno de estos mediadores inflamatorios, el isotiocianato de alilo, también se conoce como aceite de mostaza (Inoue et al., 1997, supra), se probó en ratones src"'" o src-/" para su capacidad de producir la VP . A diferencia de lo observado en los animales src"/_ estimulados por VEGF, no se detectó ninguna disminución en la VP producida por la inyección del mediador inflamatorio de isotiocianato de alilo. De esta forma, se puede concluir que la Src desempeña una función selectiva en la actividad VP inducida con VEGF y no influye en la VP asociada con los procesos inflamatorios. 13. La actividad VP suministrada por VEGF depende de la Src y Yes, pero no de Fyn La especificad del requerimiento de Src para la VP se exploró al examinar la actividad VP inducida por VEGF asociada con SFK tal como Fyn o Yes, las cuales, similares a la Src, se muestran para que se expresen en células endoteliales (Bull et al., 1994, FEBS Letters, 361:41-44; Kiefer et al., 1994, Curr. Biol . 4:100-109) . Se ha confirmado que estos tres SFK se expresaron equivalentemente en las aortas de los ratones tipo silvestre. Los ratones src"'" similares, animales deficientes en Yes también fueron defectuosos en la VP inducida por VEGF. Sin embargo, de manera sorprendente los ratones que carecen de Fyn retuvieron una alta VP en respuesta a la VEGF que no fue significativamente diferente de los animales control. El rompimiento de ia vp inducida por VEGF en ratones src"'" o yes"'" demostró que la actividad cinasa de los SFK específicos es esencial para el evento de señalización suministrado por VEGF que conduce a la actividad VP pero no a la angiogénesis. Las propiedades de permeabilidad vascular del VEGF en la piel de los ratones src+/" (Figura 8A, panel izquierdo) o src" " (Figura 8A, panel derecho) se determinó mediante invección intradérmica de solución salina o VEGF (400 ng) en ratones que se hablan inyectado intravenosamente con tinte azul de Evan. Después de 15 minutos, los parches de piel se fotografiaron (escala bar, 1 mm) . Las estrellas indican los sitios de inyección. Las regiones que rodena los sitios de inyección de VEGF, FGFb o solución salina se cortaron en pedazos y la VP cuantificada mediante elusión del tinte azul de Evan en formamida a 58°C durante 24 horas, y la absorbancia se midió a 500 nm (Figura 8B, gráfica izquierda) . Las capacidad de un mediador de inflamación ( isotiocinato de alilo), conocido para inducir la inflamación relacionada con VP, se probó en ratones src " o src"'- (Figura 8B, derecha) . La capacidad del VEGF para inducir la VP se comparó en los ratones src -"/- fyn" o yes en el análisis de Miles (Figura 8C) . Los datos para caca uno de los análisis de Miles se expresaron como i i media ± SD de los animales por triplicado. Los defectos de la VP src- " y yes"7" en comparación con ios animales control fueron estadísticamente significativos (*p <0.05, prueba t pareado), mientras que los defectos de la VP en ninguno de los ratones fyn tratados con VEGF ni los ratones src*'" tratados con isotiocinato de alilo fueron estadísticamente significativos (**p<0.05 . 14. Ratones tratados con el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src Y ratones Src -/- mostraron un daño a .1 tej ido reducido asociado con trauma o lesión a los vasos sanguíneos que los ratones tipo silvestre sin tratar La administración específica de los inhibidores de las cinasas de la familia Src actúa como los inhibidores del escape vascular patológico y la permeabilidad durante la lesión vascular o los trastornos tales como por ejemplo apoplejía. El endotelio vascular es un tipo de célula dinámica que responde a muchas señales para regular los procesos tales como por ejemplo, la generación de nuevos vasos sanguíneos durante la angiogénesis de un tumor, para la regulación de la permeabilidad de la pared de los vasos durante el edema y daño al tejido inducido por la apoplejía. La reducción de la permeabilidad vascular en dos modelos de apoplejía de ratón, mediante la inhibición del fármaco de la trayectoria Src, es suficiente para inhibir el daño cerebral al reducir el escape vascular inducido por isquemia. Además, en ratones genéticamente deficientes en Src, mientras que han reducido el escape/permeabilidad bascular, también se reduce el volumen de infarto. La combinación de los datos del inhibidor Src sintético, con la evidencia genética de apoyo para reducir el escape vascular en apoplejía y otros modelos relacionados demuestra la relevancia fisiológica de este enfoque para reducir el daño cerebral después de la apoplejía. La inhibición de estas trayectorias con una gama de inhibidores de cinasa de la familia Src disponible de estas cascadas de señalización tiene el beneficio terapéutico de mitigar el daño cerebral proveniente del daño al tejido relacionado con la permeabilidad vascular. Se utilizaron dos métodos diferentes para la inducción de isquemia cerebral total. Los dos modelos animales de isquemia cerebral focal fueron bien establecidos y se utilizaron ampliamente en la investigación de la apoplejía. Los dos modelos se habían utilizado anteriormente para investigar la patofisiologia de la isquemia cerebral así como también para probar los fármacos antiapoplejía novedosos . a) los ratones se anestesiaron con avertina y la temperatura corporal se mantuvo al mantener al animal sobre una almohadilla de calentamiento. Se realizó una incisión entre la oreja derecha y el ojo derecho. La espadilla se expuso mediante la retracción del músculo temporal y una pequeña protuberancia del orificio se perforó en la región sobre la arteria cerebral media (MCA) . Las meninges se retiraron y la MCA derecha se ocluyó mediante coagulación utilizando un filamento de calentamiento. Se dejó que los animales se recuperaran y luego regresaran a sus cajas. Después de 24 horas, los cerebros se sometieron a perfusión, se retiraron y se cortaron en secciones transversales de 1 mm . Las secciones se sumergieron en cloruro de 2,3,5-tri feniltetrazolio al 2% (TTC) y el área infartada del cerebro se identificó como un tejido no teñido (blanco) rodeado por tejido viable (rojo) . El volumen de infarto se definió como la suma de áreas no teñidas de las secciones multiplicada por su espesor. Se utilizaron ratones deficientes en Src (Src-/-) para estudiar la función de la Src en la isquemia cerebral. Los ratones Src+/- sirvieron como controles. Se encontró que en los ratones Src-/- el volumen de infarto se redujo de 26 ± 1 Omm3 a 16 ± 4 mmJ en los controles de 24 horas después del traumatismo. El efecto incluso fue más pronunciado cuando los ratones tipo silveste C57B16 se inyectaron con 1.5 mg/kg de PPl intraperitonealmente (i.p.) 30 minutos después de la oclusión de los vasos. La dimensión del infarto se redujo de 31 ± 12 mm3 en el grupo sin tratar a 8 ± 2 mmJ en el grupo tratado con PPl . b) En un segundo modelo de isquemia cerebral focal, el MCA se ocluyó mediante la colocación de un émbolo en el origen del MCA. Se colocó un coagulo homólogo de 24 horas rico en fibrina, intacto, individual en el origen del MCA que utiliza un catéter PE-50 modificado. La inducción de la isquemia cerebral se probó mediante la reducción del flujo sanguíneo cerebral en el hemisferio ipsilateral en comparación con el hemisferio contralateral. Después de 24 horas, los cerebros se retiraron, se prepararon secciones en serie y se tiñeron con hematoxi I ina-eos ina (HE) . Los volúmenes de infarto se determinaron al agregar las áreas de infarto en secciones HE en serie multiplicadas por la distancia entre cada sección. La dosis de PPl utilizado en este estudio (1.5 mg/kg i.p.) se seleccionó empíricamente. Se sabe que el VEGF primero se expresa aproximadamente 3 horas después de la isquemia cerebral en el cerebro con un máximo después de 12 a 24 horas. En este PPl de estudio se proporcionó 30 minutos después del establecimiento del infarto para bloquear por completo el aumento de permeabilidad vascular inducida por VEGF. De acuerdo con el curso de tiempo de la expresión de VEGF típica, una ventana terapéutica potencial para la administración de los inhibidores de Src podría ser hasta de 12 horas después de la apoplejía. En enfermedades asociadas con un aumento suspendido de permeabilidad vascular, es adecuada una administración crónica del fármaco para inhibir la Src. La Figura 9 es una gráfica que representa los resultados comparativos del volumen de infarto promedio (mm3) en cerebros de ratón después de la lesión, en donde los ratones fueron mutantes de Src heterogéneos (Src +/-), de Src negativos dominantes (Src-/-), ratones de tipo silvestre (WT) o ratones tipo silvestre tratados con 1.5 mg/kg de PPl (PPl) . La Figura 10 ilustra exploraciones MRI secuenciales de la muestra de cerebro de ratón sometido a perfusión, aislado, después del tratamiento para inducir una lesión al CNS, en donde la progresión de exploraciones en el animal tratado cn PPl (derecha) muestra claramente menos infarto que la progresión de exploraciones en el animal control sin tratar (izquierda) . Los métodos de la presente invención son particularmente adecuados para la intervención específica del daño al tejido inducido por VP debido a que la inhibición blanco de la acción de tirosina cinasa de la familia Src se enfoca a la inhibició:; sobre la VP sin un efecto a largo plazo sobre otras respuestas inducidas por VEGF que pueden ser benéficas para la recuperación de la lesión. Por contraste a la proteína de VEGF neutralizante, la inhibición de la Src no interfiere con el efecto angiogénico acumulativo de VEGF que podria ser benéfico en una etapa posterior de la enfermedad. El uso de inhibidores sintéticos de molécula pequeña en general es seguro y más manejable que e* uso de proteínas grandes. El uso de proteínas recombinantes, tales como por ejemplo una proteina de fusión de inmunoglobulina de murino receptor de VEGF es potencialmente peligroso y no permite una administración repetida por el miedo de provocar una reacción alérgica cuando se utiliza en seres humanos (es decir un anticuerpo anti-ratón de humano; H.AMA) . Por último, el VEGF no es el único activador de la Src en la dirección 3' otras citosinas implicadas en la patofisiología de isquemia cerebral que pueden influir en la permeabilidad vascular, tales como por ejemplo IL-6 y TNF- . De esta forma, la inhibición de VEGF puede no inhibir todas las lecciones posteriores relacionadas con la activación de la Src. De hecho, la reducción de la dimensión del infarto mediante PPl es más pronunciada que el antagonismo de VEGF que indica que otras trayectorias pueden activar las cinasas Src que facilitan el aumento de la permeabilidad. La especificación escrita anterior se considera suficiente para permitir que un experto en la técnica practique la invención. La presente invención no estará limitada en su alcance por ningún depósito de linea celular, debido a que cualquier modalidad depositada se pretende como una ilustración individual de un aspecto de la invención y cualquier línea celular que sea funcionalmente equivalente queda dentro del alcance de esta invención. El depósito de material no constituye una admisión de que la descripción descrita contenida en la presente es inadecuada para permitir la práctica de cualquier aspecto de la invención, incluyendo el mejor modo de la misma, ni se debe interpretar como limitante del alcance de las reivindicaciones para la ilustración específica que representa. Verdaderamente, diversas modificaciones de la invención además de aquéllas mostradas y descritas en la presente serán evidentes para aquellos expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y quedan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.

ADNc DE SRC-C DE POLLO (SEQ ID NO:2) 1 tctgacaccc atctgíctgt ctgtctgtgt gctgcaggag ctgagctgac tctgctgtgg 61 cctcgcgtac cactgtggcc aggcggtagc tgggacgtgc agcccaccac catggggagc 121 agcaagagca agcccaagga ccccagccag cgccggcgca gcctggagcc acccgacagc 181 acccaccacg ggggattccc agcctcgcag acccccaaca agacagcagc ccccgacacg 241 caccgcaccc ccagccgctc ctttgggacc gtggccaccg agcccaagct cttcgggggc 301 ttcaacactt ctgacaccgt tacgtcgccg cagcgtgccg gggcactggc tggcggcgtc 361 accactttcg tggctctcta cgactacgag tcccggactg aaacggactt gtccttcaag 421 aaaggagaac gcctgcagat tgtcaacaac acggaaggtg actggtggct ggctcattcc 481 ctcactacag gacagacggg ctacatcccc agtaactatg tcgcgccctc agactccatc 541 caggctgaag agtggtactt tgggaagatc actcgtcggg agtccgagcg gctgctgctc 601 aaccccgaaa acccccgggg aaccttcttg gtccgggaga gcgagacgac aaaaggtgcc 661 tattgcctct ccgtttctga ctttgacaac gccaaggggc tcaatgtgaa gcactacaag 721 atccgcaagc tggacagcgg cggcttctac atcacctcac gcacacagtt cagcagcctg 781 cagcagctgg tggcctacta ctccaaacat gctgatggct tgtgccaccg cctgaccaac 841 gtctgcccca cgtccaagcc ccagacccag ggactcgcca aggacgcgtg ggaaatcccc 901 cgggagtcgc tgcggctgga ggtgaagctg gggcagggct gctttggaga ggtctggatg 961 gggacctgga acggcaccac cagagtggcc aíaaagactc tgaagcccgg caccatgtcc 1021 ccggaggcct tcctgcagga agcccaagtg atgaagaagc tccggcatga gaagctggtt 1081 cagctgtacg cagtggtgtc ggaagagccc atctacatcg tcactgagta catgagcaag 1141 gggagcctcc tggatttcct gaagggagag atgggcaagt acctgcggct gccacagctc 1201 gtcgatatgg ctgctcagat tgcatccggc atggcctatg tggagaggat gaactacgtg 1261 caccgagacc tgcgggcggc caacatcctg gtgggggaga acctggtgtg caaggtggct 1321 gactttgggc tggcacgcct catcgaggac aacgagtaca cagcacggca aggtgccaag 1381 ttccccatca agtggacage ccccgaggca gccctctatg gccggttcac catcaagtcg 1441 gatgtctggt ccttcggcat cctgctgact gagctgacca ccaagggccg ggtgccatac 1501 ccagggatgg tcaacaggga ggtgctggac caggtggaga ggggctaccg catgccctgc 1561 ccgcccgagt gccccgagtc gctgcatgac ctcatgtgcc agtgctggcg gagggaccct 1621 gaggagcggc ccacttttga gtacctgcag gccttcctgg aggactactt cacctcgaca 1681 gagccccagt accagcctgg agagaaecta taggcctgga gctcctcctg gaccagaggc 1741 ctcgctgtgg ggtacaggg PROTEÍNA CODIFICADA DE SRC-c DE POLLO (SEQ ID NO:3) MGSSKSKPKDPSQRRRSLEPPDSTHHGGFPASQTPNKTAA PDTHRTPSRSFGTVATEPKLFGGFNTSDTVTSPQRAGALA GGVTTFVALYDYESRTETDLSFKKGERLQGV^ TEGDWWL AHSLTTGQTGYIPSNYVAPSDSIQAEE YFGKITRRESER LLLNPENPRGTFLVRESETTKGAYCLSVSDFDNAKGLN^ HYKIRKLDSGGFYITSRTQFSSLQQLVAYYSKHADGLCHR LTNVCPTSKPQTQGLAKDAWEIPRESLRLEVK GQGCFGE VWMGTWNGTTRVAIKTLKPGTMSPEAFLQEAQVMKKLRHE KLVQLYAWSEEPIYIVTEYMSKGSLLDFLKGEMGKYLRL PQLVDMAAQIASGMAYVERMNYVHRDLRAANILVGE L VCKVADFGLARLIEDNEYTARQGAÍ FPIKWTAPEAALYGR F?KSDV SFGILLTELTTKGRVPYPGMVNREVLDQVERG YRMPCPPECPESLHDLMCQCWRRDPEERPTFEYLQAFLE DYFTSTEPQYQPGENL ADNc DE SRC-c DE HUMANO (SEQ ID NO:4) 1 gcgccgcgtc ccgcaggccg tgatgccgcc cgcgcggagg tggcccggac cgcagtgccc 61 caagagagct ctaatggtac caagtgacag gttggcttta ctgtgactcg gggacgccag 121 agctcctgag aagatgtcag caatacaggc cgcctggcca tccggtacag aatgtattgc 181 caagtacaac ttccacggca ctgccgagca 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ttcgtgcatc gagacctggc 1081 tgcccgcaat gtgctggtgt ctgaggacaa cgtggccaag gtcagcgact ttggtctcac 1141 caaggaggcg tccagcaccc aggacacggg caagctgcca gtcaagtgga cagcccctga 1201 ggccctgaga gagaagaaat tctccactaa gtctgacgtg tggagtttcg gaatccttct 1261 ctgggaaatc tactcctttg ggcgagtgcc ttatccaaga attcccctga aggacgtcgt 1321 ccctcgggtg gagaagggct acaagatgga tgcccccgac ggctgcccgc ccgcagtcta 1381 tgaagtcatg aagaactgct ggcacctgga cgccgccatg cggccctcct tcctacagct 1441 ccgagagcag cttgagcaca tcaaaaccca cgagctgcac ctgtgacggc tggcctccgc 1501 ctgggtcatg ggcctgtggg gactgaacct ggaagatcat ggacctggtg cccctgctca 1561 ctgggcccga gcctgaactg agccccagcg ggctggcggg cctttttcct gcgtcccagc 1621 ctgcacccct ccggccccgt ctctcttgga cccacctgtg gggcctgggg agcccactga 1681 ggggccaggg aggaaggagg ccacggagcg ggaggcagcg ccccaccacg tcgggcttcc 1741 ctggcctccc gccactcgcc ttcltagagt tttattcctt tccttttttg agattttttt 1801 tccgtgtgtt tattttttat tatttttcaa gataaggaga aagaaagtac ccagcaaatg 1861 ggcattttac aagaagtacg aatcttattt ttcctgtcct gcccgtgagg gtggggggga 1921 ccgggcccct ctctagggac ccctcgcccc agcctcattc cccattctgt gtcccatgtc 1981 ccgtgtctcc tcggtcgccc cgtgtttgcg cttgaccatg ttgcactgtt tgcatgcgcc 2041 cgaggcagac gtctgtcagg ggcttggatt tcgtgtgccg ctgccacccg cccacccgcc 2101 ttgtgagatg gaattgtaat aaaccacgcc atgaggacac cgccgcccgc ctcggcgctt 2161 cctccaccga aaaaaaaaaa aaaaaaa PROTEÍNA CODIFICADA DE SRC-C DE HUMANO (SEQ ID NO:5) MSAIQAAWPSGTECIAKYNFHGTAEQDLPFCKGDVLTIVAVTKD PNWYKAK^^VGREGIp>ANYVQK3lEGVKAGTKLSLMPWFHGKIT REQAERLLYPPETGLFLVRESTNYPGDYTLCVSCDGKVEHYRIMY HASKLSIDEEVYFENLMQLVEHYTSDADGLCTRLIKPKVMEGTVA AQDEFYRSGWALNMKELKLLQTIGKGEFGDVMLGDYRGNKVAV KCIK^TOATAQAFLAEASV TQLRHSNLVQLLGVTVEEKGGLYIVTE YMAKGSLVDYLRSRGRSVLGGDCLLKFSLDVCEA EYLEGNNFVH RDLAAR2 rVLVSEDNVAKVSDFGLTKEASSTQDTGKLPVKWTAPEAL REKKFSTKSDVWSFGILL EIYSFGRVPYPRIP KDVVPRVEKGYKM DAPDGCPPAVYEVMK CWHLDAAMRPSFLQLREQLEHIKTHELHL Secuencia de aminoácidos de la proteína Yes-1 de ' humano "MGCIKSKENKSPAIKYRPENTPEPVSTSVSHYGAEPTTVSPCPS SSAKGTAVNFSSLSMTPFGGSSGVTPFGGASSSFSWPSSYPAGLTGGVTIFVALYDY EARTTEDLSFKKGERFQI INNTEGDWWEARS I ATGKNGYI PSNYVAPADSIQAEEWYF GKMGRKDAERLLLNPGNQRGIFLVRESETTKGAYSLSIRDWDEIRGDNVKHYKIRKLD NGGYYITTRAQFDTLQ LVKHYTEHADGLCHKLTTVCPTVKPQTQGLAKDA EIPRES LRLEVKLGQGCFGEV MGTWNGTTKVAIKTLKPGTMMPEAFLQEAQIMKKLRHDKLVP ^ LYA SEEPIYIVTEFMS GSLLDFLKEGDGKYLKLPQLVDMAAQIADGMAYIERMNY m «-• IHRDLRAANILVGENLVCKIADFGLARLIEDNEYTARQOAKFPIKWTAPEAALYGRFT IKSDV SFGILQTELVTKGRVPYPGMVNREVLEQVERGYRMPCPQGCPESLHELMNLC W KDPDERPTFEYIQSFLEDYFTATEPQYQPGENL" i gcggagccaa ggcacacggg tctgaccctt gggccggccc ggagcaagtg acacggaccg €1 gtcgcctatc ctgaccacag caaagcggcc cggagcccgc ggaggggacc tgacgggggc 121 gtaggcgccg gaaggctggg ggccccggag ccgggccggc gtggcccgag t ccggtgag 181 cggacggcgg cgcgcgcaga tttgataat ggctgcatta aaagtaaaga aaacaaaagt 243. ccagccatta aatacagacc tgaaaatact ccagagcctg tcagtacaag tgtgagccat 301 tatggagcag aacccactac agtgtcacca tgtccgtcat cttcagcaaa gggaacagca 361 gttaatttca gcagtctttc catgacacca tttggaggat cctcaggggt 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gcccctctat tttcaggata taattcttaa ctatcattat ttacctgatt ttaatcatca 3841 gattcgaaat tctgtgccat ggcgtatatg ttcaaattca aaccattttt aaaatgtgaa 3901 gatggacttc atgcaagttg gcagtgg c tggtactaaa aattgtggtt gttttttctg 3961 tttacgtaac ctgcttagta ttgacactct ctaccaagag ggtcttccta agaagagtgc 4021 tgtcattatt tcctcttatc aacaacttgt gacatgagat tttttaaggg ctttatgtga 4081 actatgatat tgtaattttt ctaagcatat tcaaaagggt gacaaaatta cgtttatgta 4141 ctaaatctaa tcaggaaagt aaggcaggaa aagttgatgg tattcatcag gttttaactg 4201 aatggagcag ttccttatat aataacaatt gtatagtagg gataaaacac taacaatgtg 4261 tattcatttt aaattgttct gtatttttaa attgccaaga aaaacaactt tgtaaatttg 4321 gagatatttt ccaacagctt ttcgtcttca gtgtcttaat gtggaagtta acccttacca 4381 aaaaaggaag ttggcaaaaa cagccttcta gcacactttt ttaaatgaat aatggtagcc 4441 taaacttaat atttttataa agtattgtaa tattgttttg tggataattg aaataaaaag 4501 ttctcactga atgcacc

Claims (115)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES : 1. Una composición farmacéutica que comprende las proteínas Src y Yes de tirosina cinasa, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
2. 2. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en donde la proteina Src es Src-A.
3. 3. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en donde la proteina Src tiene en el residuo 527 de aminoácidos cualquier residuo de aminoácidos excepto para tirosina, serina o treonina.
4. 4. La composición farmacéutica según la reivindicación 1, en donde la proteína Src es inactiva .
5. 5. La composición farmacéutica según 1 -. reivindicación 4, en donde la proteína Src es Sr ~ K295M.
6. 6. La composición farmacéutica según ia reivindicación 4, en donde la proteína Src es Src 251.
7. 7. La composición farmacéutica según ia reivindicación 1, en donde la proteína Yes es una proteína Yes inactiva.
8. 8. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos capaz de expresar las proteínas Src y Yes de tirosina cinasa, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
9. 9. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, en donde la proteina Src es Src-A.
10. 10. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, en donde la proteina Src tiene en el residuo 527 de aminoácidos cualquier residuo de aminoácidos excepto para tirosina, serina o treonina.
11. 11. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, en donde la proteina Src es Src inactiva .
12. 12. La composición farmacéutica según la reivindicación 11, en donde la proteina Src es Src K295M.
13. 13. La composición farmacéutica según la reivindicación 11, en donde la proteina Src es Src 251.
14. 14. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, en donde la proteina Yes es una proteina Yes inactiva.
15. 15. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, que comprende un vector de transferencia de genes virales.
16. 16. La composición farmacéutica según la reivindicación 8, que comprende un vector de transferencia de genes no virales.
17. 17. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos capaz de expresar la proteína Src de tirosina cinasa y un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos capaz de expresar una proteína Yes de tirosina cinasa, junto con un portador farmacéuticamente aceptable.
18. 18. La composición farmacéutica según la reivindicación 17, en donde la proteina Src es Src-A.
19. 19. La composición farmacéutica según la reivindicación 17, en donde la proteina Src tiene en el residuo 527 de aminoácidos cualquier residuo de aminoácidos excepto para tirosina, serina o treonina.
20. 20. La composición farmacéutica según la reivindicación 17, en donde la proteina Src es Src inactiva.
21. 21. La composición farmacéutica según la reivindicación 20, en donde la proteina Src es Src K295M.
22. 22. La composición farmacéutica según la reivindicación 20, en donde la proteína Src es Src 251.
23. 23. La composición farmacéutica según la reivindicación 17, en donde la proteina Yes es una proteína Yes inactiva.
24. 24. La composición farmacéutica según la reivindicación 17, que comprende un vector de transferencia de genes virales.
25. 25. La composición farmacéutica según la reivindicación 17, que comprende un vector de transferencia de genes no virales.
26. 26. Un método para modular la permeabilidad vascular en un tejido que sufre de una condición de enfermedad y que comprende poner en contacto el tejido con una cantidad moduladora de la VP terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende una proteína tirosina cinasa seleccionada del grupo que consiste de Src, Yes o una mezcla de las mismas.
27. 27. El método según la reivindicación 26, en donde la proteína tirosina cinasa es una Src activa, y la modulación potencia la permeabilidad vascular.
28. 28. El método según la reivindicación 27, en donde la proteina Src activa es Src A.
29. 29. El método según la reivindicación 27, en donde la proteína Src tiene en el residuo 527 de aminoácidos cualquier residuo de aminoácidos excepto para tirosina, serina o treonina.
30. 30. El método según la reivindicación 26, en donde la proteína tirosina cinasa es una proteína Yes activa, y la modulación potencia la permeabilidad vascular .
31. 31. El método según la reivindicación 26, en donde la proteína tirosina cinasa es una mezcla de la proteína Src activa y la proteína Yes, y la modulación potencia la permeabilidad vascular.
32. 32. El método según la reivindicación 26, en donde la proteina tirosina cinasa es una proteína Src inactiva y la modulación inhibe la permeabilidad vascular.
33. 33. El método según la reivindicación 32, en donde la proteína Src inactiva es Src K295M.
34. 34. El método según la reivindicación 32, en donde la proteína Src inactiva es Src 251.
35. 35. El método según la reivindicación 26, en donde la proteína tirosina cinasa es una proteína Yes inactiva y la modulación inhibe la permeabilidad vascular .
36. 36. El método según la reivindicación 26, en donde la proteína tirosina cinasa es una mezcla que incluye la proteína Src inactiva y la modulación inhibe la permeabilidad vascular.
37. 37. El método según la reivindicación 36, en donde la proteína Src inactiva es Src K295M.
38. 38. El método según la reivindicación 36, en donde la proteína Src inactiva es Src 251.
39. 39. El método según la reivindicación 26, en donde la proteína tirosina cinasa es una mezcla que incluye la proteína Yes inactiva y la- modulación inhibe la permeabilidad vascular.
40. 40. Un método para modular la permeabilidad vascular en un te ido que sufre de una condición de enfermedad y que comprende poner en contacto el tejido con una cantidad moduladora de la VP terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico capaz de expresar la proteina tirosina cinasa seleccionada del grupo que consiste de la proteína Src, la proteína Yes o una mezcla de las mismas.
41. 41. El método según la reivindicación 40, en donde la composición farmacéutica incluye un vector de expresión retroviral.
42. 42. El método según la reivindicación 40, en donde la composición farmacéutica incluye un vector de expresión no viral.
43. 43. El método según la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico es capaz de expresar la proteína Src activa, y ia modulación es la potenciación de la permeabilidad vascular.
44. 44. El método según la reivindicación 43, en donde la proteína Src es Src-A.
45. 45. El método según la reivindicación 43, en donde la proteína Src tiene en el residuo 527 ae aminoácidos cualquier residuo de aminoácidos except'. para tirosina, serina o treonina.
46. 46. El método según la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico es capaz de expresar una proteína Src inactiva, y la modulación es la inhibición de la permeabilidad vascular.
47. 47. El método según la reivindicación 46, en donde la proteína Src inactiva es Src K295M.
48. 48. El método según la reivindicación 46, en donde la proteína Src inactiva es Src 251.
49. 49. El método según la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico es capaz de expresar una proteina Yes inactiva, y la modulación inhibe la permeabilidad vascular.
50. 50. El método según la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico es capaz de expresar una proteína Yes activa, y la modulación potencia la permeabilidad vascular.
51. 51. El método según la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico es capaz de expresar la proteina Src inactiva y la proteina Yes inactiva, y la modulación inhibe la permeabiliad vascular.
52. 52. El método según la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico es una mezcla que incluye un ácido nucleico capaz de expresar la proteina Yes inactiva .
53. 53. El método según la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico es una mezcla que incluye un ácido nucleico capaz de expresar la proteina Src inactiva.
54. 54. El método según la reivindicación 53, en donde la proteina Src inactiva es Src K295M.
55. 55. El método según la reivindicación 53, en donde la proteína Src inactiva es Src 251.
56. 56. El método según la reivindicación 53, en donde ia proteína tirosina cinasa Src inactiva es una mezcla de la proteina Src 251 y la Src K295M.
57. 57. El método según la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico es capaz de expresar la proteina Src activa y la proteina Yes activa.
58. 58. El método según la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico es una mezcla que incluye un ácido nucleico capaz de expresar la proteina Yes activa .
59. 59. El método según la reivindicación 40, en donde el ácido nucleico es una mezcla que incluye un ácido nucleico capaz de expresar la proteína Src activa.
60. 60. Un artículo de fabricación que comprende un material de empaque y una composición farmacéutica contenida dentro del material de empaque, en donde la composición farmacéutica es capaz de modular la permeabilidad vascular en un tejido que sufre de una condición de enfermedad, en donde el material de empaque comprende una etiqueta que indica que la composición farmacéutica se puede utilizar para tratar condiciones de enfermedad mediante la modulación de la permeabilidad vascular, y en donde la composición farmacéutica comprende una proteína Src tirosina cinasa y una proteína Yes, en un portador farmacéuticamente aceptable.
61. 61. El articulo de fabricación según la reivindicación 60, en donde la proteina Src es una Src activa.
62. 62. El artículo de fabricación según la reivindicación 61, en donde la proteína Src activa es Src-A.
63. 63. El artículo de fabricación según la reivindicación 61, en donde la proteína Src tiene en el residuo 527 de aminoácidos cualquier residuo de aminoácidos excepto para tirosina, serina o treonina.
64. 64. El artículo de fabricación según la reivindicación 60, en donde la proteína Src es inactiva .
65. 65. El artículo de fabricación según la reivindicación 64, en donde la proteína Src es Src K295M.
66. 66. El artículo de fabricación según la reivindicación 64, en donde la proteína Src es Src 251.
67. 67. El artículo de fabricación según la reivindicación 60, en donde la proteína Yes es activa .
68. 68. El artículo de fabricación según la reivindicación 60, en donde la proteina Yes es inactiva .
69. 69. Un artículo de fabricación que comprende un material de empaque y una composición farmacéutica contenida en el material de empaque, en donde la composición farmacéutica es capaz de modular la permeabilidad vascular en un tejido que sufre de una condición de enfermedad, en donde el material de empaque comprende una etiqueta que indica que la composición farmacéutica se puede utilizar para tratar condiciones de enfermedad mediante la modulación de la permeabilidad vascular, y en donde la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico capaz de expresar una proteína Src tirosina cinasa y una proteína Yes, en un portador farmacéuticamente aceptable.
70. 70. El artículo de fabricación según la reivindicación 69, en donde la proteína Src es una Src activa.
71. 71. El artículo de fabricación según la reivindicación 70, en donde la proteína Src activa es Src-A.
72. 72. El artículo de fabricación según la reivindicación 70, en donde la proteína Src tiene en el residuo 527 de aminoácidos cualquier residuo de aminoácidos excepto para tirosina, serina o treonina.
73. 73. El artículo de fabricación según la reivindicación 69, en donde la proteína Src es inactiva .
74. 74. El artículo de fabricación según la reivindicación 73, en donde la proteína Src es Src K295M.
75. 75. El artículo de fabricación según la reivindicación 73, en donde la proteína Src es Src 251.
76. 76. El artículo de fabricación según la reivindicación 69, en donde la proteína Yes es activa .
77. 77. El artículo de fabricación según la reivindicación 69, en donde la proteína Yes es inactiva .
78. 78. El artículo de fabricación según la reivindicación 69, en donde las proteínas Src y Yes se codifican mediante una mezcla de ácidos nucleicos capaces de expresar la proteina Src y capaces de expresar la proteina Yes, en un portador farmacéuticamente aceptable.
79. 79. Un artículo de fabricación que comprende un material de empaque y una composición farmacéutica contenida dentro del material de empaque, en donde la composición farmacéutica es capaz de modular la permeabilidad vascular en un tejido que sufre de una condición de enfermedad, en donde el material de empaque comprende una etiqueta que indica que la composición farmacéutica se puede utilizar para tratar condiciones de enfermedad mediante ia modulación de la permeabilidad vascular, y en donde la composición farmacéutica comprende un aci e nucleico capaz de expresar una proteína Yes d tirosina cinasa, en un portador farmacéuticamen aceptable .
80. 80. El artículo de fabricación según la reivindicación 79, en donde la proteina Yes es activa.
81. 81. El artículo de fabricación según i a reivindicación 79, en donde la proteina Yes e= inactiva .
82. 82. Un artículo de fabricación que comprende un material de empaque y una composición farmacéutica contenida dentro del material de empaque, en donde la composición farmacéutica es capaz de modular la permeabilidad vascular en un tejido que sufre de una condición de enfermedad, en donde el material de empaque comprende una etiqueta que indica que la composición farmacéutica se puede utilizar para tratar condiciones de enfermedad mediante la modulación de la permeabilidad vascular, y en donde la composición farmacéutica comprende una proteína Yes de tirosina cinasa, en un portador farmacéuticamente aceptable.
83. 83. El artículo de fabricación según la reivindicación 82, en donde la proteina Yes es activa .
84. 84. El artículo de fabricación según la reivindicación 82, en donde la proteina Yes es inactiva .
85. 85. Un método para mejorar el daño al tejido relacionado con escape vascular o edema que comprende poner en contacto el tejido con una cantidad moduladora de la permeabilidad vascular de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src.
86. 86. El método según la reivindicación 85, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src es un inhibidor químico.
87. 87. El método según la reivindicación 86, en donde el inhibidor químico se selecciona del grupo que consiste de PPl, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 y Geldanamicina.
88. 88. El método según la reivindicación 87, en donde el inhibidor es PPl .
89. 89. El método según la reivindicación 85, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src es una proteina Src inactiva.
90. 90. El método según la reivindicación 89, en donde la proteína Src inactiva es Src K295M.
91. 91. El método según la reivindicación 89, en donde la proteína Src inactiva es Src 251.
92. 92. El método según la reivindicación 85, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src es una proteína Yes inactiva.
93. 93. El método según la reivindicación 85, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src es una proteína cinasa Src (CSK) c-terminal.
94. 94. El método según la reivindicación 85, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src es un ácido nucleico que codifica para una proteína inhibidora de tirosina cinasa de la familia Src .
95. 95. El método según la reivindicación 94, en donde la composición farmacéutica incluye un vector de expresión retroviral.
96. 96. El método según la reivindicación 94, en donde la composición farmacéutica incluye un vector de expresión no viral.
97. 97. El método según la reivindicación 94, en donde la proteína inhibidora se selecciona del grupo que consiste de la proteína Src inactiva, la proteína Yes inactiva, la cinasa Src (CSK) c-terminal y una mezcla de las mismas.
98. 98. El método según la reivindicación 97, en donde la proteína Src inactiva es Src K295M.
99. 99. El método según la reivindicación 97, en donde la proteína Src inactiva es Src 251.
100. 100. El método según la reivindicación 85, en donde el inhibidor es un inhibidor de tirosina cinasa Src .
101. 101. Un artículo de fabricación que comprende un material de empaque y una composición farmacéutica contenida dentro del material de empaque, en donde la composición farmacéutica es capaz de modular el aumento de la permeabilidad vascular en un tejido que sufre de una condición de enfermedad, en donde el material de empaque comprende una etiqueta que indica que la composición farmacéutica se puede utilizar para el tratamiento de escape vascular o edema asociados con condiciones de enfermedad, y en donde la composición farmacéutica comprende un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src y un portador farmacéuticamente aceptable del mismo.
102. 102. El artículo de fabricación según la reivindicación 101, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src es un inhibidor químico.
103. 103. El articulo de fabricación según la reivindicación 102, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src se selecciona del grupo que consiste de PPl, PP2, PD173955, AGL1872, PD162531, Radicicol R2146 y Geldanamicina.
104. 104. El articulo de fabricación según la reivindicación 102, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src es PPl.
105. 105. El artículo de fabricación según la reivindicación 101, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src es una proteina Src inactiva.
106. 106. El artículo de fabricación según la reivindicación 105, en donde la proteína Src inactiva es Src K295M.
107. 107. El artículo de fabricación según la reivindicación 105, en donde la proteína Src inactiva es Src 251.
108. 108. El artículo- de fabricación según la reivindicación 101, en donde el inhibidor, de tirosina cinasa de la familia Src es una proteína Yes inactiva.
109. 109. El artículo de fabricación según la reivindicación 101, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src es una proteína cinasa Src (CSK) c-terminal activa.
110. 110. Un artícuLo de fabricación que comprende un material de empaque y una composición farmacéutica contenida dentro del material de empaque, en donde la composición farmacéutica es capaz de modular la permeabilidad vascular en un tejido que sufre de una condición de enfermedad, en donde el material de empaque comprende una etiqueta que indica que la composición farmacéutica se puede utilizar para el tratamiento de escape vascular o edema asociados con condiciones de enfermedad, y en donde la composición farmacéutica comprende un ácido nucleico que codifica para un inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src en un portador farmacéuticamente aceptable.
111. 111. El artículo de fabricación según la reivindicación 110, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src es la proteina Src inactiva.
112. 112. El artículo de fabricación según ia reivindicación 111, en donde la proteína Src inactiva es Src K295M.
113. 113. El artículo de fabricación según la reivindicación 111, en donde la proteína Src inactiva es Src 251.
114. 114. El artículo de fabricación según la reivindicación 110, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src es la proteína Yes inactiva.
115. 115. El artículo de fabricación según ia reivindicación 110, en donde el inhibidor de tirosina cinasa de la familia Src es la proteína cinasa Sr~ (CSK) c-terminal.