JPH08506970A

JPH08506970A - エイズ治療のためのヒトインターフェロン発現ベクター

Info

Publication number: JPH08506970A
Application number: JP7516566A
Authority: JP
Inventors: マジッドメータリ; フィリッペレイスナー
Original assignee: トランスジーンソシエテアノニム
Priority date: 1993-12-13
Filing date: 1994-12-13
Publication date: 1996-07-30
Also published as: FR2713657B1; FR2713657A1; CA2155568A1; WO1995016784A1; EP0682712A1; SG49230A1; AU1275195A

Abstract

(57)【要約】ＨＩＶウィルスに誘導されるエレメントの制御下に配置されたヒトＩＦＮ遺伝子の発現カセット、ベクターおよび該カセットを含む細胞、それらの治療的使用、およびＨＩＶ関連感染症を治療または予防するための薬学的組成物を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】エイズ治療のためのヒトインターフェロン発現ベクター本発明の主題は、その発現が、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）により調節され得るエレメントの制御下に置かれている、ヒトＩＦＮをコードするＤＮＡ配列を含むカセットである。本発明は、ＨＩＶにより引き起こされる感染の治療または予防において、特に遺伝子治療により、有用な適用を見い出す。エイズ（後天性免疫不全症候群）の病因論的因子（agent）であるＨＩＶは、免疫反応の増幅に関わるＴリンパ球のサブポピュレーション（ヘルパーＴ）に選択的に感染する。結果として、この疾病は、細胞性免疫不全に進展し、病んだ個体を、特に日和見感染に罹りやすくする。新しい抗ウィルス性分子の開発に投じられた多くの努力にも拘わらず、今までのところ、いかなる治療も完全に満足なものと実証されていない。これらの困難さは、疑いもなく、ＨＩＶウィルスの特別の複雑さ、および感染細胞内で免疫防御システムを抑制するその能力が原因である。ＨＩＶは、レンチウィルス科に属するレトロウィルスである。その遺伝物質は、ＲＮＡ分子からなり、タンパク質の性質を有するカプシドの中にカプシド包膜化（encapsidate）されており、カプシドそれ自身、ウィルスのエンベロープに包まれている。カプシドタンパク質をコードする構造遺伝子（gag、polおよびenv）、逆転写酵素およびエンベロープタンパク質のそれぞれに加えて、ＨＩＶゲノムは、ウィルス複製を制御する調節遺伝子を含む。後者の中では、ＴＡＴおよびＲＥＶタンパク質をそれぞれコードするｔａｔおよびｒｅｖ遺伝子が言及され得る。ＴＡＴタンパク質は、ＨＩＶ遺伝子の全体としての発現において、トランスに活性化する役割を有する（Aryaら、1985、Science、229、69-73）。ＴＡＴは、転写および転写後レベルの両方で関与しているように思われる。それは、ＴＡＲ［（Transactivation Responsive Region）トランス活性化応答領域］配列と呼ばれる、ゲノムおよびウィルス転写物の５’末端（＋１位〜＋８０位；＋１は、転写開始部位を示す）に局在する、短いヌクレオチド配列と特に相互作用する（ Rosenら、1985、Cell、41、813-823）。ＲＥＶタンパク質は、構造タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（mR NA）の細胞質への移送を、その中で翻訳されるべく、増強する。その一部分として、ＲＥＶは、ｍＲＮＡ上のＲＲＥ（ＲＥＶ応答エレメント）配列を、特に認識する。後者は、もう１つのいわゆるＣＲＳ配列［（Cis-acting R epression Sequence）シス作用抑制配列］の近隣にあるｅｎｖ遺伝子内に局在しており、このＣＲＳ配列は、それを含むｍＲＮＡの核内保持に関与する。ＲＥＶタンパク質の、そのＲＲＥ標的配列のレベルでの結合は、より大きなウィルスｍＲＮＡの細胞質への運搬に対して、ＣＲＳの阻害効果を相殺する効果を有する。ウィルス遺伝子の転写に必要不可欠な配列は、ゲノムの両端の、ＬＲＴ（長末端反復）のレベルに局在している。５’ＬＴＲは、ＴＡＲ配列ならびにプロモーター配列を含むが、３’ＬＴＲは、転写の終止に関与する配列を含む。一般に、細胞がウィルスに感染するとき、それは、ウィルス感染に対する応答として、インターフェロン（ＩＦＮｓ）を分泌する。これは、抗ウィルス作用を発揮する一群のタンパク質であり、α、βおよびγの３型に分類される。αＩＦＮには、２０を越える亜型があるが、βおよびγのＩＦＮは、だだ１つと考えられている。逆説的であるが、細胞性（内因性）ＩＦＮの合成は、ＨＩＶ感染細胞で抑制される。この抑制により、ＨＩＶ感染細胞および近隣の細胞は、ウィルス感染からのそれ自身の効果的な防御が妨げられる（Mark、1992、AIDS Res．Hum．Retrovirus、8 、199-207）。その発現が、ＴＡＴおよび／またはＲＥＶウィルスタンパク質により誘導され得るヒトＩＦＮ（外因性ＩＦＮ）をコードする遺伝子の、細胞内への導入により、遺伝的に改変された細胞は、感染の状況（context）において、それ自身を防御可能にする。本発明の目的は、ＨＩＶのＴＡＴおよび／またはＲＥＶタンパク質によって調節され得る、種々のヒトＩＦＮ発現ベクターを提案することにある。このアプローチは、ＨＩＶウィルスの複製の特性を利用する。従って、感染という事象（event）において、細胞性ＩＦＮの合成は阻害されるが、外因性ＩＦＮの合成はＨＩＶウィルスそれ自身によって誘導され、こうしてそれに対する効果的な防御システムを再構成する。誘導可能な発現システムを使用することにより、非感染細胞内での細胞毒性の問題が回避される。従って、本発明の主題は、哺乳動物細胞内でその発現を確実に為し得るエレメント（element）の制御下に置かれた、少なくとも１つのヒトＩＦＮをコードするＤＮＡ配列を含み、前記エレメントが、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）によって調節され得ることを特徴とする、発現カセットである。本発明で使用されるＤＮＡ配列は、α、βまたはγ型のヒトＩＦＮをコードできる。これは、従来技術、特にＩＦＮαに関してShawら（1983、Nucleic Acid R es.、11、555-573）、ＩＦＮβに関してHigashiら（1983、J．Biol．Chem.、258 、9522-9529）およびＩＦＮγに関してGrayら（1982、Nature、295、503-508）に開示されている配列であって良い。これらの配列は、遺伝子またはＣＤＮＡから単離し得る。ヒトＩＦＮをコードする配列はまた、ＩＦＮアナログ（analog）をコードする配列を意味すると理解される。「アナログ」は、天然のＩＦＮと僅かに相違するが、その抗ウィルス機能のほとんどを保持する、アミノ酸配列を有する分子を意味すると理解される。実際には、そのようなアナログは、天然タンパク質またはそのフラグメントの、１個以上のアミノ酸の欠失、置換および／または付加によって得ることができる。当業者は、該タンパク質の生物学的機能を破棄することなく、これらの改変を行うことが可能な技術を熟知している。本発明の枠組み内で使用される、ＤＮＡ配列の発現を確実にするエレメント（ element）は、例えばプロモーターおよび翻訳の開始ならびに終止コドンのような、ＤＮＡ配列のｍＲＮＡへの転写および後者のタンパク質への翻訳を可能にする、慣用されているエレメントである。さらに、本発明に従うカセットは、ＨＩＶウィルスにより調節され得る配列を含む。一般に、哺乳動物細胞、好ましくは、ヒト細胞の中で機能するプロモーターが、選択される。それは、あらゆる真核遺伝子またはウィルスゲノムに由来するものであり得、特に、特定の組織特異的なまたは事象特異的な細胞シグナルへの応答において、遍在性または調節可能な性質のものであり得る。プロモーターの選択は、非常に広範囲で、当業者の能力の範囲内にある。しかしながら、マウス（ murine）のＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）およびβ−アクチン遺伝子のプロモーターまたはＳＶ４０（シミアンウィルス４０）プロモーターが、有利に使用される。好ましい実施態様に依れば、ＨＩＶにより調節され得る配列は、ＴＡＲタイプおよび／またはＲＲＥ／ＣＲＳタイプの配列から構成される。ＴＡＲタイプ配列は、ＴＡＴタンパク質と相互作用して、該遺伝子の発現を、その制御下に活性化する。その一部分として、ＲＲＥ／ＣＲＳタイプ配列は、ＲＥＶタンパク質と相互作用して、ｍＲＮＡの細胞質への運搬を増強させる。それは、天然には、アクセプタースプライシング部位（acceptor spli cing site）を含むと示されている。本発明で追求される目的に従えば、これらの配列は、それらがウィルスＴＡＴおよびＲＥＶタンパク質との相互作用に典型的であると仮定した上でのことであるが、天然のＴＡＲおよびＲＲＥ／ＣＲＳ配列（Wain-Hobsonらの、1985、Cell、40、9-17に刊行されている）と僅かに異なっていても良い。ＴＡＲタイプ配列に関して、後者は、プロモーターの３’、および最も好ましくは、＋１位（＋１は、転写の開始部位である）に挿入される。この状況（cont ext）において、哺乳動物細胞内で機能するプロモーターと、続いてその後ろにＴＡＲ配列（＋１位〜＋８０位に）を天然に含む、ＨＩＶ５’ＬＴＲを使用することは有利であり得る。最小のプロモーター配列（Ｓｐ１、ＣＡＡＴボックスおよびＴＡＴＡボックス配列）およびＴＡＲ配列を含む、その一部分を使用することも可能である。ミニＬＴＲという名称は、ＬＴＲの３’末端に対応し、ウイルスゲノムの−１２０位から＋８０位にまたがる２００塩基対のフラグメントを表す。他のアプローチに依れば、本発明のカセットは、慣用されているプロモーター、およびＨＩＶのＲＥＶウィルスタンパク質と相互作用し得るＲＲＥ／ＣＲＳタイプ配列を含む。従って、非感染細胞において、ｍＲＮＡは、核内でＣＲＳ作用下にブロックされる。他方、ウィルス感染およびＲＥＶ合成が起こるとすぐに、それらは、それらがＩＦＮに翻訳される場所である細胞質に運搬される。好ましくは、ＲＲＥ／ＣＲＳ配列は、ＩＦＮをコードするＤＮＡ配列の３’に導入される。他の変形（variant）に依れば、本発明で使用されるＤＮＡ配列の発現は、ＴＡＴおよびＲＥＶによる二重調節に従わせることができ、これにより、ある種のプロモーターを用いて通常観察される、逃避発現（escaping expression）の問題が回避可能となる。この場合、本発明の発現カセットは、逃避発現の場合には、産生される少数のｍＲＮＡが核内でブロックされたままになるように、ＴＡＲタイプ配列およびＲＲＥ／ＣＲＳタイプ配列を含み得る。ＨＩＶの侵入ならびにＴＡＴおよびＲＥＶウィルスタンパク質の合成のみが、ＩＦＮ合成の引き金となり得る。また、本発明の発現カセットは、さらに、ＩＦＮをコードするＤＮＡ配列の発現に寄与する他のエレメント、特に、イントロン、適切なスプライシングシグナルおよび転写終止のためのエレメント（ポリアデニル化シグナル）を含み得る。これらのエレメントの選択および局在化は、当業者の能力の範囲内にある。好ましい実施例によると、カセットが、５’から３’に含むことが言及され得るのは：（１）ＨＩＶ５’ＬＴＲ、ＩＦＮをコードするＤＮＡ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；（２）ＨＩＶミニＬＴＲ、ＩＦＮをコードするＤＮＡ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；（３）ＰＧＫプロモーター、ＴＡＲ配列、ＩＦＮをコードするＤＮＡ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；（４）β−アクチンプロモーター、ＴＡＲ配列、ＩＦＮをコードするＤＮＡ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；（５）ＳＶ４０プロモーター、ＩＦＮをコードするＤＮＡ配列、ＲＲＥ／ＣＲＳ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；（６）ＨＩＶ５’ＬＴＲ、ＩＦＮをコードするＤＮＡ配列、ＲＲＥ／ＣＲＳ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；（７）ＨＩＶミニＬＴＲ、ＩＦＮをコードするＤＮＡ配列、ＲＲＥ／ＣＲＳ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；および（８）ＨＩＶミニＬＴＲ、（ＨＩＶｇａｇ遺伝子の）供与スプライシングサイト（donor splicing site）、ＩＦＮをコードするＤＮＡ配列、ＲＲＥ／ＣＲＳ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル。本発明は、本発明の発現カセットを含むベクターにも及ぶ。そのようなベクターは、それらを構築しそれらを増殖させる方法とともに、当業者には周知である。レトロウィルス、ヘルペスウィルス、アデノウィルスまたはアデノウィルス関連ウィルス由来のウィルスベクターが、有利に使用される。無論、合成ベクターを使用することも可能である。本発明の枠組み内で、複製能欠損ウィルス、および就中、レトロウィルスベクターが特に好ましい。有利な実施態様に依れば、本発明のカセットは、レトロウィルスベクターのＬＴＲに関して逆向きの配向に設置され、これは干渉を避ける目的でプロモーターを逆方向に設置するためである。無論、本発明のベクターは、さらに、抗生物質Ｇ４１８およびプロマイシンに対する耐性を付与する、例えばネオマイシンおよびプロマイシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子のような、選択可能マーカーをコードする遺伝子を含み得る。本発明は、本発明のベクターを、問題となるウィルスの構造タンパク質を産生する、特に両種性の細胞系にトランスフェクトすることにより得られる、カプシド包膜化したウィルスおよびウィルスベクターの粒子も包含する。本発明は、本発明の発現カセットまたはベクターを含む真核細胞にも関する。後者は、患者から採集した細胞にインビトロで、あるいは、直接的にインビボで、導入し得る。細胞は、有利にはヒト細胞、および好ましくは、造血細胞系（幹細胞または一次リンパ球）である。本発明は、ウィルス感染、特にＨＩＶにより引き起こされる感染の予防または治療を目的とする医薬品の製造のための、本発明の発現カセット、ベクターまたは細胞の、治療的使用にも関する。本発明は、本発明の発現カセット、ベクターまたは細胞を、薬学的に許容される賦形剤（vehicle）と組み合わせて含む、治療または予防剤としての、薬学的組成物にも関する。本発明の薬学的組成物は、慣用されている方法で製造し得る。特に、そのような治療剤または予防剤の治療的に有効な量を、担体、希釈剤または許容されるアジュバントと混合する。それは、当分野で使用されている、あらゆる慣用されている経路により、投与し得る。投与は、単一用量、またはある時間間隔をあけて繰り返す用量で行い得る。投与される量は、異なる基準、特に、投与経路、患者、疾病の進行および治療期間の関数として選択される。指針として、本発明の薬学的組成物は、ウィルスベクターの粒子を、１０³〜１０¹⁴ｐｆｕ（プラーク形成単位）、有利には１０⁵〜１０¹³ｐｆｕ、好ましくは１０⁶〜１０¹²ｐｆｕ、最も好ましくは１０⁷〜１０¹⁰ｐｆｕ含む。さらに、本発明は、ウィルス、特にＨＩＶの感染を治療する方法に関し、それに従うと、本発明の発現カセット、ベクターまたは細胞の治療的有効量が、そのような治療を要する患者に投与される。最初の治療的手順に依れば、それらは、直接的にインビボで、例えば経静脈的に投与されることができる。患者から骨髄幹細胞または末梢血リンパ球を採集し、それらを本発明のベクターでトランスフェクトし、それらを従来技術に従ってインビトロで培養し、そしてそれらを患者に投与する、ことからなる体細胞遺伝子治療の手順が、好ましくは採用される。指針として、１ｋｇ当たり１０⁶〜１０¹⁰細胞、好ましくは１０⁷〜１０⁹、そして好ましくは５×１０⁷〜５×１０⁸を使用すると有利であり得る。当然、この手順は、数多くの変形を受けることもできる。特に、異なる型のＩＦＮ、例えばＩＦＮαおよびＩＦＮβの発現を可能にする、少なくとも２つの、本発明のカセット、ベクターまたは細胞を組み合わすと有利であり得る。本発明は、後記の図を参照して、以下のように説明される。図１は、ＩＦＮαをコードするＤＮＡ配列の、ＨＩＶＬＴＲの制御下での発現を可能にする、ベクターpTG4313を図式的に示す。図２は、ＩＦＮα遺伝子とプロマイシン選択可能遺伝子を同時発現（coexpres s）する、ベクターpTG4344を示す。図３は、ＩＦＮ遺伝子およびそのＴＡＴで誘導される発現を伝達するための、レトロウィルスベクターpTG4379を図式的に示す。図４は、ＨＩＶ III Ｂに感染し、ＩＦＮα（□）、β（◆）およびγ（◇ ）を発現するベクターでトランスフェクトしたＵ９３７細胞における、感染の進行を、非トランスフェクト細胞（■）からなる対照群と比較して示す。図５は、（ＨＩＶミニＬＴＲの制御下に）ＩＦＮαおよび（レトロウィルス５ ’ＬＴＲの制御下に）ｎｅｏ選択可能遺伝子を発現するためのカセットを含む、レトロウィルスベクターpTG6324を示す。図６は、ベクターpTG6327で形質導入（transduce）され（△）、続いてＨＩＶ III Ｂウィルスに感染したＣＤ８^-ヒト末梢血リンパ球（PBLs）の感染の進行を、非形質導入細胞（◆）と比較して示す。実施例下記に詳述された全てのクローニング操作は、慣用されている分子生物学的技術（Maniatisら、1989、Laboratory Manual、Cold Spring Harbor、Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY）に従って行われる。これらの工程は、大腸菌（E．coli）の５Ｋ、ＸＬ１−Ｂｌｕｅまたは１１０６株で行われる。 αおよびβのＩＦＮをコードするヒト遺伝子は、リンパ系細胞、例えば、ＣＥＭ−Ａ３細胞（ＣＥＭ系由来、ATCCで番号CCL119で入手可能）のゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）によりクローン化した。そのようなライブラリーは、市販されている。ＤＮＡフラグメントのＰＣＲによる増幅は、公開された配列に相補的なプライマーを使用して、製造者の仕様書に従うか、またはＰＣＲプロトコール−Ａ（Innis、Gelfand、SninskyおよびWhite、Academic Press Incにより刊行されている）に記載の技法に従って、市販されているキットを使用して行い得る。ＩＦＮγをコードするヒト遺伝子は、公開番号2,583,429号のフランス特許出願に記載されているpTGllから得られる。適切な制限部位が、種々のＩＦＮ遺伝子の開始ＡＴＧおよび停止コドンの上流および下流に導入されて、その後のクローニング工程を促進できるようにした。さらに、５’突出制限部位は、E．c oli ＤＮＡポリメラーゼの大きなクレノウフラグメントで処理して平滑末端に変えて良いが、３’突出部位は、Ｔ４ポリメラーゼで処理する。実施例１：ＨＩＶＴＡＴタンパク質により誘導され、選択可能遺伝子がプロマイシン遺伝子からなるインターフェロン発現ベクターの構築Ａ．ＨＩＶプロモーターの制御下にＩＦＮを発現するための非ウィルスベクターＩＦＮα、βおよびγ遺伝子の発現がＨＩＶ５’ＬＴＲの制御下に置かれているベクターの構築を記載する。これらのベクターは、Mehtali（1992、AIDS an d HumanRetroviruses、8、1959-1965）に記載されているベクターpTG1322から構築され、ＨＩＶ５’ＬＴＲ（ＨＩＶゲノムの−６４５位〜＋８０位に対応する、７２５塩基対のXhoI-HindIIIフラグメント）の制御下に置かれた異種遺伝子を含む。このベクターも、イントロンおよびＳＶ４０ウィルスのポリアデニル化シグナルを有する。それを、HindIIIで消化し、クレノウで処理し、次にSmaIで消化する。このように処理したpTG1322に、ＩＦＮα遺伝子を、SmaIおよびEcoRI部位の境界を定めたフラグメント形態で導入し、クレノウで処理して、pTG4313を作成する（図１）。ＩＦＮβ遺伝子を有するSmaI-EcoRVフラグメントを、上述で得られたpTGl322の間に挿入することにより、pTG4314を得る。ＩＦＮγ遺伝子を、HpaI -PvuIIフラグメントの形態で、同じpTG1322部位の間に挿入することにより、pTG 4315を作成する。プロマイシンに対する耐性を付与する選択可能な遺伝子（プロマイシンＲ）は、クレノウ処理した１．２ｋｂのBamHI-Bgl11フラグメントの形態で、ＩＦＮ発現のための種々のベクターのEcoRI部位に導入する。このフラグメントは、ＳＶ４０ウィルス初期プロモーター、プロマイシンＲ遺伝子およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含む。プロマイシンＲ選択可能遺伝子およびＩＦＮα、βまたはγ遺伝子のそれぞれを同時発現させる、ベクターpTG4344（図２に示す）、pTG 4345およびpTG4346が得られる。Ｂ．ＩＦＮ遺伝子の伝達（transfer）および発現のためのレトロウィルスベクター構造物の基礎を形成するベクターは、pLXSPであり、これは、ネオマイシン選択可能遺伝子をプロマイシンＲ遺伝子で置換し、ＭＳＶ（ミエロサルコーマウィルス）の３’ＬＴＲをＭＰＳＶ（ミエロプロリフェラティブサルコーマウィルス）の３’ＬＴＲで置換した後のpL XSN（MillerおよびRossman、1989、Biotechniques、7、980-988）に由来する。ミニＬＴＲ（−１２０位〜＋８０位）に対応する２００塩基対のScaI-HindIII フラグメントを、ＨＩＶゲノムから単離し、次に、各ＩＦＮ遺伝子の上流に導入する。続いて、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを、該遺伝子の３’に導入する。このようにして得たベクターを、BglIIで消化し、クレノウで処理する。発現カセット「ミニＬＴＲ−ＩＦＮ−ポリアデニル化シグナル」を含むフラグメントを、レトロウィルスベクタ−pTG4056のHpaI-BglII部位間に導入する。このフラグメントが、５’および３’ＬＴＲに対して逆向きの配向に置かれているクローンを選択する。発現ブロックＳＶ４０プロモーター−プロマイシンＲの欠失、および、５’ＬＴＲの制御下に置かれるようにプロマイシンＲ遺伝子を正しい配向で再挿入した後に、pTG4056が、pLXSPから得られる。ＩＦＮα、βおよびγのそれぞれをコードする配列の伝達および発現を行わせる、レトロウィルスベクターpTG4392、pTG4391およびpTG4379（図３）が得られる。それらは、両種性カプシド包膜化細胞系（amphotropic encapsidation cell lille）である、例えば、PA317（Millerら、1986、Mol．Cell.、Biol．6、2895-2902）、Gp Env.Am（Markowitzら、1988、Virology、167、400-406）またはPG13（Mill erら、1991、J．Virol、65、2220-2224）系にトランスフェクトし得る。翌日、トランスフェクトされた細胞を、選択培地（プロマイシン６μｇ／ｍｌ）中に置く。ヒト細胞に感染可能な両種性粒子を産生する系を構成する耐性細胞を分離し、それから、抗エイズ遺伝子治療で使用可能なウィルスストックを構成することができる。Ｃ．ＩＦＮ発現が真核プロモーターに支配される、ＴＡＴで調節可能なベクター１．マウス（murine）ＰＧＫプロモーターＴＡＲ配列（ＨＩＶゲノムのヌクレオチド＋１位〜＋８０位に対応する）を、化学的合成により作成する。次に、このようにして得た２本鎖オリゴヌクレオチドを、Adraらにその配列が刊行されている（1987、Gene、60、65-74）マウスＰＧＫプロモーターの＋１位に、挿入突然変異により導入する。ヒトＩＦＮα、β またはγをコードする配列、それに続いてＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを、ＴＡＲ配列の下流に挿入する。最後に、発現カセット「ＰＧＫプロモーター−ＴＡＲ−ＩＦＮ−ポリＡ］を、レトロウィルスベクターpLXSPに導入する。無論、レトロウィルスベクターは、各ＩＦＮα、βまたはγの配列に相応する。上述のように、各タイプのウィルス粒子を産生する両種性カプシド包膜化系（amphotropic encapsidation line）が確立される。２．マウス（murine）β−アクチンプロモーター先の実施例を、下記のように変形させて再現する：合成ＴＡＲ配列を、その配列が、Nudelらに記載（1983、Nucleic Acids Res. 、11、1759-1771）されている、ラットβ−アクチンプロモーターの＋１位に導入する。実施例２：ＨＩＶＴＡＴタンパク質により誘導され、選択可能遺伝子がネオマイシン遺伝子からなるヒトＩＦＮ発現のためのベクターの構築、および対応する両種性系の確立Ａ．ＩＦＮα発現のためのpTG6324の構築最初に、ＨＩＶミニＬＴＲを、ScaI-HindIII消化の後、ウィルスゲノムから単離し、あらゆるプラスミドに挿入し、SmaI-HindIIIフラグメントの形態で除去し、次にベクターpTG2359の同じ部位間にクローニングする。後者は、プラスミドｐ Bluescript KS（Strategene）へのＳＶ４０ウィルスポリアデニル化部位のクローニングに相当する。BalIでの消化の後に、ＩＦＮαをコードする配列を有するSmaI-HpaIフラグメントを導入して、pTG4347が得られる。最後に、発現カセット「ミニＬＴＲ−ＩＦＮα−ＳＶ４０ポリＡ」を、先の段階で得られたベクターpTG4355から、BamHI-BglIIフラグメントの形態で精製し、これを、pTG6320のBamHI部位にクローニングしてpTG6324（図５）を得る。後者は、従って、ｎｅｏ選択可能遺伝子の発現を支配するＭＳＶＬＴＲ、続いてその後に、プロモーター間での干渉現象を避けるために、カセット「ミニＬＴＲ− ＩＦＮα−ＳＶ４０ポリＡ」を逆向きの配向で置き、そして最後にMPSVレトロウィルス３’ＬＴＲを含む。指針として、プロマイシン遺伝子発現のためのカセットの欠失およびネオマイシン遺伝子（Colbele-Garapinら、1981、J．Mol．Biol. 、150、1-14）での置換の後に、pTG6320がpLXSPから得られる。Ｂ．ＩＦＮγ発現のためのpTG6328の構築クローニングの戦略は、上記のものと完全に同じである。ＩＦＮγをコードする配列を含むSmaI-HpaIフラグメントを、pTG4347のBalI部位に挿入して、ベクターpTG6311を得る。次に、pTG6311から精製したBamHI-BglIIフラグメントを、予めBamHIで消化したベクターpTG6320にクローニングして、レトロウィルスベクターpTG6328を得る。後者は、ＩＦＮα遺伝子の代わりにＩＦＮγ遺伝子を有するという点で相違する、pTG6324の等価物である。Ｃ．ＩＦＮβ発現のためのレトロウィルスベクターpTG6327の構築ＨＩＶミニＬＴＲを有するSmaI-HindIIIフラグメントを、同じpTG4356部位間に挿入して、pTG6312を作成する。ベクターpTG4356は、その中にＩＦＮβ遺伝子（SmaI-EcoRVフラグメント）がクローニング（BalI部位）されたベクターpTG235 9に対応する。上述のように、ＩＦＮβ発現のためのカセットを、BamHI-BglIIで消化した後、pTG6312から精製し、次にpTG6320のBamHI部位にサブクローニングして、pTG6327を得る。Ｄ．感染性ウィルス粒子の産生のための両種性系の確立感染性ウィルス粒子のストックは、先述のベクターpTG6324、pTG6327およびpT G6328の各々から作成し得る。そのために、後者を、エコトロピックなカプシド包膜化系、例えばGP+E86系（Markowitzら、1988、J．Virol.、62、1120-1124）に、慣用されている様にトランスフェクトする。トランスフェクションから４８時間後、細胞を、選択培地で培養する（Ｇ４１８１ｍｇ／ｍｌ）。Ｇ４１８耐性クローンの混合物を、選択培地で、さらに３日間維持する。培養上清を採取して、PA317系のような両種性カプシド包膜化系に、慣用されている様に感染させる。選択後、このようにして得た系は、感染性ウィルス粒子を産生する細胞を構成するものとなり、該粒子は、ヒト遺伝子治療の状況（context）内で、種々のＩＦＮを伝達し発現させる。活性なＩＦＮを産生するそれらの能力は、ザ・インターフェロン・システム（ The Interferon System）（W．E．Stewart、1979編：Springer-Verlag Wien、Ne w York）に記載の方法により、培養上清で評価し得る。この機能性のテストは、前述の工程で作成される細胞上で行われるとき、３つの場合で低レベルのＩＦＮが生ずる。他方、細胞が、プラスミドpHMG-TATにより一時的にトランスフェクトされるとき、測定されるレベルは高く、ｍｌ当り数百単位に達する。pHMG-TATは、天然のＴＡＴタンパク質発現のためのベクターであり、後者をコードする配列をベクターpHMGにクローニングして生ずる（Mehtaliら、1990、Gene、91、179-1 84）。また、産生クローンを分離することは有利であり得る。これは、クローン希釈技法（ウェル毎に０．３細胞）により、慣用されている様に行われる。力価５× １０⁶〜１０⁷ｐｆｕ／ｍｌの、優れたビリオン産生体であるクローンが、マウス細胞NIH -3T3（ATCC CRL1658）をクローン培養上清のアリコートで感染させた後で選択される。ＩＦＮを産生するその能力を、上述のようにチェックする。再度、クローン希釈を、先述のクローンから開始して行い、サブクローンを生じさせる。ＩＦＮの滴定およびアッセイの後に、ビリオンおよびＩＦＮの優れた産生体であるサブクローンを、それらの各々に関して選択する。サブクローンを、遺伝子治療の目的で使用する前に、凍結する。実施例３：ＨＩＶＲＥＶタンパク質により誘導されるヒトＩＦＮ発現のためのベクターの構築レトロウィルスベクターを説明すると、ベクターpLXSPの中に、ＬＴＲに対して逆配向で挿入される、発現カセットの５’から３’に含まれるものは： −ＳＶ４０ウィルスプロモーター； −ヒトＩＦＮα、βまたはγをコードするＤＮＡ配列； −ＲＲＥ／ＣＲＳ配列。後者は、ＨＩＶ−１Ｌａｉ単離物のゲノムから、Bg lII-BamHIフラグメント（Wain-Hobsonら、上記、に公開されている配列の、ヌクレオチド７１７８〜８０３２にわたる）の形態で、単離する。このフラグメントは、適切な制限部位に導入される前に、クレノウで処理され得る；および −ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル。上述のように、両種性カプシド包膜化系へのトランスフェクションの後、ウィルスストックが構成され得る。実施例４：ＨＩＶＴＡＴおよびＲＥＶタンパク質により誘導されるヒトＩＦＮ発現のためのベクターの構築クレノウ処理され、ＩＦＮの１つをコードする配列とＳＶ４０ポリアデニル化シグナルとの間にＨＩＶＲＲＥ／ＣＲＳ配列を有するBamHI-BglIIフラグメントを、ベクターpTG4392、pTG4391およびpTG4379に挿入する。さらに、このようにして得たベクターは、ＨＩＶＬＴＲとＩＦＮ遺伝子との間に、供与スプライシング部位を挿入することにより、改変し得る。上述のように、このようにして得たベクターの各々に対応する、感染性粒子を産生する両種性系を作成することが可能である。実施例５：ＴＡＴにより誘導されるＩＦＮ発現のためのベクターでトランスフェクトした細胞系のウィルス感染に対する耐性下記の実施例が行われるのは、ＨＩＶで自然に感染し得る細胞系で、例えば： −ヒト単球由来のＵ９３７系（ATCC CRL1593）；および −ＣＤ４＋ヒトリンパ球細胞由来のＣＥＭ−Ａ３系（ATCC CCL119）である。実際には、細胞を、供給者の推奨に従って培養し、少なくとも２０μｇのＤＮＡを、適切な装置（Gene Pulser Biorad、電圧210V、静電容量960μF）を用いて、エレクトロポレーションにてトランスフェクトする。最初の実験では、pTG4314は、ベクターpLXSPとともに、２０：１のＤＮＡ濃度比で、Ｕ９３７細胞（２×１０⁷細胞）に同時エレクトロポレーションする。細胞を、５％ＣＯ₂の存在下、３７℃で再接種し、その翌日、それらを選択培地（プロマイシン０．５μｇ／ｍｌ）に置く。抗生物質に耐性の細胞を、選択する。ＨＩＶ調製物を、高いＴＣＩＤ₅₀（少なくとも、１０００）にて感染させることにより、感染に対するそれらの耐性をテストする。ＴＣＩＤ₅₀は、ＣＥＭ細胞のようなＨＩＶに感染し得る細胞系に対して、Reedらに記載されている方法（19 38、Am．J．Hyg.、27、493-497）に従って測定する。それは、５０％の細胞が感染し、５０％が感染しない用量に相当する。それを、使用されるＨＩＶの各バッチについて、チェックする。これのために、約１０⁶細胞に対応する、エレクトロポレーションされたＵ９３７細胞培養物の分画を、採集し、低速で遠心する。洗浄の後、細胞ペレットを、血清を含んでいない２００μｌの培養培地中に取る。次に、細胞を、ウィルス調製物の種々の希釈物で処理する。感染は、３７℃で１時間、続けられる。細胞を、次に、培養培地中で２回洗浄し、１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）を補足した同じ培地の５ｍｌ中に接種する。この培地は、週に２〜３回、新しいものに変える（renewed）。ウィルスの増殖（propagation）は、Spireらに記載されている方法（1985、Lancet、i、188-189）に従って、培養上清中で、逆転写酵素活性を、一定の間隔で測定することにより、評価する。インターフェロン発現ベクターでエレクトロポレーションしていない対照群のＵ９３７細胞と比較して、感染後１４日間にわたり、有意な逆転写酵素活性の減少（８５％まで）が観察される。今度は、実験を、初期にpTG4344、pTG4345またはpTG4346でエレクトロポレーションしたＵ９３７細胞に対して繰り返す。対照群の非エレクトロポレーション細胞と比較すると、３件のケースにおいて、感染後２１日間にわたり、逆転写酵素活性のより大きな減少が観察される（図４）。実施例６：ＨＩＶ感染への耐性の分子的メカニズムエレクトロポレーションし、インビトロでＨＩＶに感染させたＵ９３７細胞について、分析を行う（図５）。先ず、ＨＩＶゲノムの存在を、細胞のゲノムＤＮＡ調製物中で測定する。これは、ウィルスｇａｇ遺伝子のフラグメントの増幅を可能とする適切なプライマーを用いて、ＰＣＲにより行う。予測されたサイズの増幅バンドの存在は、ＩＦＮの発現が、ＨＩＶゲノムのプロウィルス形態での細胞染色体への組込み（integr ation）と干渉しないことを示す。ｇａｇ遺伝子の産物をコードするｍＲＮＡの存在を、逆転写ＰＣＲ法（上述と同じプライマー）により検出することも可能であった。このことは、ＩＦＮの発現が、プロウィルス配列の転写に、いかなる顕著な影響も及ぼさないことを示唆する。最後に、プロウィルスタンパク質ｇｐ１２０の存在および局在化を、抗ｇｐ１２０抗体（血清陽性の患者からの血清から得られる）を用いて、免疫蛍光法により評価する。ＩＦＮを発現する細胞では、ｇｐ１２０タンパク質は、細胞内形態であることが観察されるが、ウィルス粒子の出芽（budding）を可能にするには、サブメンブレン形態であるべきである。全体として、これらの結果は、ＩＦＮが、ウィルスサイクルの遅い段階のレベルで、恐らくは、ビリオン集合（virion assembly）のレベルで、作用することを示す。実施例７：遺伝子治療によるエイズの治療方法人間に適用される遺伝子治療の枠組み内で、２つのタイプの標的細胞が企図され得る： −特に白血球搬出（leukapheresis）により採集され得る、末梢血のＣＤ４＋リンパ球、および −骨髄サンプルまたは末梢血から得られ得るＣＤ３４＋造血幹細胞（化学療法または造血性増殖因子の作用による動態化（mobilization））。Ａ．ＣＤ４＋細胞に適用可能な手順患者に対して、血液サンプル採集または白血球搬出を行う。赤血球を除去した後、フィコール上での遠心により、単核球を分離し、従来技術の技法に従って培養する。最初に、培養フラスコのプラスチックに付着している細胞を取り除く。細胞懸濁液を回収し、抗ＣＤ８抗体（Immunotech）でコートしたフラスコ内で培養して、ＣＤ８＋細胞を取り除く。このようにして得た細胞懸濁液は、主としてＣＤ４＋リンパ球から構成されている。無論、他の濃厚化技法（enriching techniques）も使用し得る。細胞分裂を誘導するために、レトロウィルス形質導入を行う前に、これらを刺激する。この目的のために使用し得る増殖因子は様々である。指針として、ヒト抗ＣＤ３抗体（Immunotech、約１０ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ−２（Cetus；１００Ｕ／ｍｌ）との混合物、または代わりに、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン、Ｓｉｇｍａ、約５μｇ／ｍｌの濃度で）とＩＬ−２との混合物が言及され得る。これらの条件下での培養の７２時間後、細胞を、レトロウィルスベクターで形質導入する。種々の方法論が、適用可能である： −ＣＤ４＋細胞と実施例１〜４の両種性産生細胞の同時培養（co-culture）。 −２つの細胞タイプ、即ち、培養ウェル中に置かれるＣＤ４＋細胞とトランスウェル（Transwell）（Coster）中の該産生細胞との同時培養 −好ましくは１〜５であるｍ．ｏ．ｉ．（感染多重度）に基づき、該産生細胞の培養上清のアリコートによるＣＤ４＋細胞の感染。一般に、形質導入（transduction）は、ウィルスの細胞表面への付着を高めるために、硫酸プロタミンの存在下（約５μｇ／ｍｌの濃度）で行う。翌日、細胞培養物を、選択培地［（実施例１のベクターの状況（context）でのプロマイシン、または実施例２のベクターの状況でのＧ４１８］に移し、適切な細胞数が得られるまで、７〜８日間、維持する。Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）およびＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）で補足し、血清を含まないＡＩＭＶ培地（Gibc o BRL）の使用が有利であり得ることが示される。これらの細胞のＨＩＶ複製を阻害する能力を、インビトロでテストする。それらは、従来技術の慣用されている方法論に従って、感染多重度（m.o.i.）１０^-2 で、ＨＩＶ−１ＩＩＩＢにより感染させる。洗浄および再接種の後、ウィルスの増殖（propagation）を、培養上清中の逆転写酵素活性を測定することにより、評価する（図６）。後者は、培養の少なくとも２０日間は、非常に低いレベルで推移する。比較すると、非形質導入細胞の場合は、培養の３日目から、逆転写酵素活性が最大値まで非常に強力に増大し、その後すみやかに細胞死が起こる。Ｂ．ＣＤ３４＋細胞に適用可能な手順ＣＤ３４細胞の精製工程は、以下の通りである： −フィコール遠心分離法による、末梢血または骨髄のサンプルからの単核細胞の分離、 −付着細胞の除去（depletion）、および −抗ＣＤ３４抗体（Immunotech）でコートしたフラスコ中での、またはこの抗体でコートしたビーズの存在下での培養による、ＣＤ３４＋細胞の捕捉。懸濁液中の細胞を除去し、付着細胞を、例えばパパインを作用させた後で回収する。上述のように、このようにして得たＣＤ３４＋細胞を種々の増殖因子で刺激して、それらを分裂サイクルにおき、このようにしてレトロウィルス感染を増強させる。この目的のために、先に示した手順に従って形質導入を行う前に、４８時間かけて、ＩＬ−３（約１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（約５０Ｕ／ｍｌ）およびＳＣＦ（幹細胞因子、約５０Ｕ／ｍｌ）の混合物を、培養培地に混合して使用することが可能である。これらの因子は、市販されている。その後、細胞を、患者に再投与する。

【手続補正書】特許法第１８４条の７第１項【提出日】１９９５年４月２８日【補正内容】請求の範囲１．ヒトＩＦＮをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を、哺乳動物細胞中でその発現を確実に為し得るエレメントの制御下に置いて含むカセットであって、該エレメントが少なくとも１つのプロモーターおよびＴＡＲおよび／またはＲＲＥ／ＣＲＳタイプ配列を含み、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）により調節され得ることを特徴とするカセット。２．ＩＦＮがα、βおよびγ型のヒトＩＦＮから選択されることを特徴とする請求項１に記載のカセット。３．ＴＡＲタイプ配列が前記プロモーターの３’に置かれていることを特徴とする請求項１および２のいずれかに記載のカセット。４．ＲＲＥ／ＣＲＳタイプ配列がヒトＩＦＮをコードするＤＮＡ配列の３’に置かれていることを特徴とする請求項１〜３の１つに記載のカセット。５．哺乳動物細胞中で機能するプロモーターがマウスのＰＧＫおよびβ−アクチン遺伝子、ＨＩＶ５’ＬＴＲおよびそのフラグメント（ミニＬＴＲ）から選択されることを特徴とする請求項１〜４の１つに記載のカセット。６．前記エレメントがさらに供与スプライシング部位を含むことを特徴とする請求項１〜５の１つに記載のカセット。７．前記エレメントがさらにポリアデニル化シグナルを含むことを特徴とする請求項１〜６の１つに記載のカセット。８．請求項１〜７の１つに記載のカセットを含むベクター。９．レトロウィルスベクターであることを特徴とする請求項８に記載のベクター。１０．請求項１〜７の１つに記載の発現カセットが前記ベクターのＬＴＲに関して逆向きの配向に置かれていることを特徴とする請求項９に記載のベクター。１１．さらに選択可能遺伝子を含むことを特徴とする請求項８〜１０の１つに記載のベクター。１２．選択可能遺伝子がプロマイシンに対する耐性を付与することを特徴とする請求項１１に記載のベクター。１３．請求項１〜７の１つに記載のカセットまたは請求項８〜１２の１つに記載のベクターを含む真核細胞。１４．造血系のヒト細胞であることを特徴とする請求項１３に記載の細胞。１５．ＨＩＶにより引き起こされる感染の予防または治療を意図する医薬製品の製造のための、請求項１〜７の１つに記載のカセット、請求項８〜１２の１つに記載のベクターまたは請求項１３〜１４のいずれかに記載の細胞の使用。１６．請求項１〜７の１つに記載のカセット、請求項８〜１２の１つに記載のベクターまたは請求項１３〜１４のいずれかに記載の細胞の治療的有効量を薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む薬学的組成物。１７．請求項８〜１２の１つに記載のベクターを１０³〜１０¹³ｐｆｕ含むことを特徴とする請求項１６に記載の薬学的組成物。１８．異なる型のＩＦＮをそれぞれ発現する請求項１〜７の１つに記載のカセット、請求項８〜１２の１つに記載のベクターまたは請求項１３〜１４のいずれかに記載の細胞の少なくとも２つを含み、ＨＩＶにより引き起こされる感染の予防または治療に同時に、別々にまたは時差的に使用するための製品。１９．ＨＩＶにより引き起こされる感染の予防または治療のための医薬製品を製造することを意図する、異なる型のＩＦＮをそれぞれ発現する請求項１〜７の１つに記載のカセット、請求項８〜１２の１つに記載のベクターまたは請求項１３〜１４のいずれかに記載の細胞の少なくとも２つの同時な、別々なまたは時差的な使用。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＡ６１Ｋ 48/00 8314−4ＣＣ１２Ｎ 5/10 // Ａ６１Ｋ 38/21 ＡＤＹ 9455−4ＣＡ６１Ｋ 37/66 ＡＤＹＺ

Claims

【特許請求の範囲】１．ヒトＩＦＮをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を、哺乳動物細胞中でその発現を確実に為し得るエレメントの制御下に置いて含むカセットであって、該エレメントがヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）により調節され得ることを特徴とするカセット。２．ＩＦＮがα、βおよびγ型のヒトＩＦＮから選択されることを特徴とする請求項１に記載のカセット。３．哺乳動物細胞中での発現を確実に為し得る前記エレメントが少なくとも１つのプロモーターおよびＴＡＲおよび／またはＲＲＥ／ＣＲＳタイプ配列を含むことを特徴とする請求項１または２に記載のカセット。４．ＴＡＲタイプ配列が前記プロモーターの３’に置かれていることを特徴とする請求項３に記載のカセット。５．ＲＲＥ／ＣＲＳタイプ配列がヒトＩＦＮをコードするＤＮＡ配列の３’に置かれていることを特徴とする請求項３または４に記載のカセット。６．哺乳動物細胞中で機能するプロモーターがマウスのＰＧＫおよびアクチン遺伝子、ＨＩＶ５’ＬＴＲおよびそのフラグメント（ミニＬＴＲ）から選択されることを特徴とする請求項１〜５の１つに記載のカセット。７．前記エレメントがさらに供与スプライシング部位を含むことを特徴とする請求項１〜６の１つに記載のカセット。８．前記エレメントがさらにポリアデニル化シグナルを含むことを特徴とする請求項１〜７の１つに記載のカセット。９．請求項１〜８の１つに記載のカセットを含むベクター。１０．レトロウィルスベクターであることを特徴とする請求項９に記載のベクター。１１．請求項１〜８の１つに記載の発現カセットが前記ベクターのＬＴＲに関して逆向きの配向に置かれていることを特徴とする請求項１０に記載のベクター。１２．さらに選択可能遺伝子を含むことを特徴とする請求項９〜１１の１つに記載のベクター。１３．選択可能遺伝子がプロマイシンまたはネオマイシンに対する耐性を付与することを特徴とする請求項１２に記載のベクター。１４．請求項１〜８の１つに記載のカセットまたは請求項９〜１３の１つに記載のベクターを含む真核細胞。１５．造血系のヒト細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の細胞。１６．ウィルス感染の予防または治療を意図する医薬製品の製造のための、請求項１〜８の１つに記載のカセット、請求項９〜１３の１つに記載のベクターまたは請求項１４または１５に記載の細胞の使用。１７．ＨＩＶにより引き起こされる感染の予防または治療を意図する請求項１６に記載の使用。１８．請求項１〜８の１つに記載のカセット、請求項９〜１３の１つに記載のベクターまたは請求項１４または１５に記載の細胞の治療的有効量を薬学的に許容される賦形剤と組み合わせて含む薬学的組成物。１９．請求項９〜１３の１つに記載のベクターを１０³〜１０¹⁴ｐｆｕ含むことを特徴とする請求項１８に記載の薬学的組成物。２０．異なる型のＩＦＮをそれぞれ発現する請求項１〜８の１つに記載のカセット、請求項９〜１３の１つに記載のベクターまたは請求項１４または１５に記載の細胞の少なくとも２つを同時に、別々にまたは時差的に使用する、ウィルス感染とくにＨＩＶにより引き起こされる感染の予防または治療を意図する使用。