FR2713657A1 - Nouveaux vecteurs pour le traitement du sida. - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne une cassette d'expression d'un gène IFN humain placé sous le contrôle d'éléments inductibles par le virus VIH. Elle couvre également un vecteur et une cellule comprenant ladite cassette ainsi que leur usage thérapeutique et une composition pharmaceutique pour le traitement ou la prévention des infections dues au VIH.

Description

NOUVEAUX VECTEURS POUR LE TRAITEMENT DU SIDA
La présente invention a pour objet une cassette comportant une séquence d'ADN codant pour un IFN humain dont l'expression est placée sous le contrôle d'éléments régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). La présente invention trouve une application intéressante dans le traitement ou la prévention des infections dues au VIH, notamment par thérapie génique.
Le VIH, agent étiologique du SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise), infecte préférentiellement une sous-population de lymphocytes T, (T helper) responsables de l'amplification de la réponse immunitaire. En conséquence, la maladie évolue vers un déficit de l'immunité cellulaire, ce qui rend les individus malades particulièrement sensibles aux infections opportunistes. Jusqu'à présent, aucun traitement ne s'est révélé totalement satisfaisant malgré les multiples efforts investis dans le développement de nouvelles molécules antivirales. Ces difficultés relèvent sans doute de la complexité particulière du virus VIH et de sa capacité à réprimer les systèmes de défense immunitaires dans les cellules infectées.
Le VIH est un rétrovirus appartenant à la famille des lentivirus. Son matériel génétique, constitué d'une molécule d'ARN, est encapsidé dans une capside de nature protéique, elle-même entourée d'une enveloppe virale. Outre les gènes structuraux (gag, pol et env) codant respectivement pour les protéines de la capside, la réverse transcriptase et la protéine d'enveloppe, le génome du VIH comprend des gènes régulateurs qui commandent la réplication virale. Parmi ces derniers, on peut citer les gènes tat et rev codant respectivement pour les protéines TAT et REV.
La protéine TAT a un rôle trans-activateur de l'expression de l'ensemble des gènes du
VIH (Arya et al., 1985, Science, 229, 69-73). Il semble que TAT intervient aussi bien à un niveau transcriptionnel que post-transcriptionnel. Elle interagit spécifiquement avec une courte séquence nucléotidique, désignée séquence TAR (pour Transactivation Responsive Region), et localisée à l'extrémité 5' du génome et des transcrits viraux (position +1 à +80 ; +I représentant le site d'initiation de la transcription) (Rosen et al., 1985, Cell, 41, 813-823).
La protéine REV favorise le transport vers le cytoplasme des ARN messagers (ARNm) codant pour les protéines de structure, pour y être traduits. De son çôté,
REV reconnaît spécifiquement une séquence RRE (pour REV Responsive Element) sur les ARNm. Celle-ci est localisée dans le gène env à proximité d'une autre séquence dite CRS (Cis-acting Repression Sequence), impliquée dans la rétention nucléaire des
ARNm la portant. On suppose que la fixation de la protéine REV au niveau de sa séquence cible RRE a pour effet de contrebalancer l'effet inhibiteur de CRS sur le passage des grands ARNm viraux vers le cytoplasme.
Les séquences essentielles à la transcription des gènes viraux sont localisées aux deux extrémités du génome au niveau des LTRs (Long Terminal Repeat). Alors que le LTR 5' contient les séquences promotrices ainsi que les séquences TAR, le LTR 3' comprend les séquences impliquées dans la terminaison de la transcription.
D'une manière générale, lorsqu'une cellule est infectée par un virus, elle secrète des interférons (IFNs) en réponse à l'infection virale. Il s'agit d'un groupe de protéines exerçant des effets antiviraux et classifié en trois types a, ss et y. S'il existe plus d'une vingtaine de sous-types d'IFN a, les IFNs ss et y semblent uniques.
Paradoxalement, la synthèse des IFNs cellulaires (endogènes) est réprimée dans les cellules infectées par le VIH. Cette répression empêche les cellules infectées par le
VIH et les cellules avoisinantes de se défendre efficacement contre l'infection virale (Mark, 1992, AIDS Res. Hum. Retrovirus, 8, 199-207).
On a maintenant trouvé que l'introduction dans une cellule d'un gène codant pour un
IFN humain (IFN exogène) dont l'expression est inductible par les protéines virales
TAT et/ou REV, permet à la cellule génétiquement modifiée de se défendre dans un contexte infectieux. La présente invention a pour but de proposer différents vecteurs d'expression d'IFN humain régulables par les protéines TAT et/ou REV du VIH. Cette
approche met à profit les caractéristiques de réplication du virus VIH. Ainsi, en cas d'infection, la synthèse des IFNs cellulaires est inhibée mais la synthèse des IFNs exogènes est induite par le virus VIH lui même, reconstituant ainsi un système de
défense efficace à son encontre. L'usage d'un système d'expression inductible évite les problèmes de toxicité cellulaire dans les cellules non infectées.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet une cassette d'expression comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour un IFN humain, placée sous le contrôle des éléments capables d'assurer son expression dans une cellule de mammifère, caractérisée en ce que lesdits éléments sont régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH).
Une séquence d'ADN en usage dans la présente invention, peut coder pour un IFN humain de type a, ss ou y. Il peut s'agir des séquences divulguées dans l'art antérieur et notamment dans Shaw et al. (1983, Nucleic Acid Res., 11, 555-573) pour l'IFN ct,
Higashi et al. (1983, J. Biol. Chem., 258, 9522-9529) pour l'IFN ss et Gray et al.
(1982, Nature, 295, 503-508) pour l'IFN y. Ces séquences peuvent être isolées du gène ou de l'ADNc. Dans le cadre de la présente invention, on peut également mettre en oeuvre une séquence codant pour un analogue d'un IFN. Par "analogue", on entend une molécule qui aurait une séquence en acides aminés légèrement différente d'un IFN natif mais qui conserverait l'essentiel de la fonction antivirale. En pratique, un tel analogue peut être obtenu par délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés de la protéine native ou d'un fragment de celle-ci. L'homme du métier connaît les techniques qui permettent d'effectuer ces modifications sans abolir la fonction biologique de la protéine.
Les éléments assurant l'expression d'une séquence d'ADN en usage dans le cadre de la présente invention, sont les éléments conventionnels permettant la transcription de la séquence d'ADN en ARNm et la traduction de ce dernier en protéine, comme par exemple un promoteur et les codons d'initiation et de terminaison de la traduction. En outre, une cassette selon l'invention comprend des séquences régulables par le virus
VIH.
D'une manière générale, on choisit un promoteur fonctionnel dans une cellule de mammifère et, de préférence, dans une cellule humaine. Il peut être issu d'un gène eucaryote quelconque ou d'un génome viral et être de nature ubiquitaire ou régulable, notamment en réponse à certains signaux cellulaires tissu-spécifiques ou événementspécifiques. Le choix du promoteur est très large et à la portée de l'homme de l'art.
Cependant, on aura avantageusement recours au promoteur des gènes murins PGK (PhosphoGlycérate kinase) et ss-actine ou au promoteur SV40 (Simian Virus 40).
Selon un mode particulièrement préféré, les séquences régulables par le VIH sont constituées d'une séquence de type TAR et/ou RRE/CRS. Une séquence de type TAR interagit avec la protéine TAT pour activer l'expression des gènes sous son contrôle.
De son côté, une séquence de type RRE/CRS interagit avec la protéine REV pour favoriser le transport des ARNm dans le cytoplasme. On indique qu'elle contient naturellement un site accepteur d'épissage. Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, ces séquences peuvent être légèrement différentes des séquences
TAR et RRE/CRS natives (telle que publiées par Wain-Hobson et al., 1985, Cell, 40, 9-17), à condition toutefois d'être capables d'interagir avec les protéines TAT et REV virales.
S'agissant d'une séquence de type TAR, celle-ci est insérée en 3' du promoteur et, de manière tout à fait préférée, en position +l (+1 étant le site d'initiation de la transcription). Dans ce contexte, il peut être avantageux d'avoir recours au LTR 5' du
VIH qui comprend naturellement un promoteur fonctionnel dans les cellules de mammifère suivi de la séquence TAR (en position +1 à +80). On peut également mettre en oeuvre une portion de celui-ci, qui comprend les séquences promotrices minimales (séquences Sp i, NF kB, TATA box et CAAT box) et la séquence TAR. On désigne sous le nom de mini LTR un fragment de 200 pb correspondant à l'extrémité 3' du LTR et s'étendant des positions -120 à +80 du génome viral.
Selon une autre approche, une cassette selon l'invention comprend un promoteur conventionnel et une séquence de type RRE/CRS capable d'interagir avec la protéine virale REV du VIH. Ainsi, dans une cellule non infectée, les ARNm seront bloqués dans le noyau sous l'action de CRS. Par contre, dès l'infection virale et la synthèse de
REV, ils seront transportés dans le cytoplasme où ils seront traduits en IFN. De manière préférée, la séquence RRE/CRS est introduite en 3' de la séquence d'ADN codant pour un IFN.
Selon une autre variante, on peut soumettre l'expression d'une séquence d'ADN en usage dans la présente invention, à une double régulation par TAT et REV, ce qui permet de contourner les problèmes d'échappement de l'expression observés couramment avec certains promoteurs. Dans ce cas, une cassette d'expression selon l'invention, peut comprendre une séquence de type TAR et une séquence de type
RRE/CRS; de sorte qu'en cas d'échappement de l'expression, les quelques ARNm produits resteront bloqués dans le noyau. Seule la pénétration du VIH et la synthèse des protéines virales TAT et REV pourront déclencher la synthèse d'IFN.
Par ailleurs une cassette d'expression selon l'invention peut, en outre, contenir d'autres éléments contribuant à l'expression de la séquence d'ADN codant pour IFN, notamment, un intron, des signaux d'épissage adéquates et des éléments de terminaison de la transcription (signal de polyadénylation). Le choix et la localisation de ces éléments est à la portée de l'homme du métier.
A titre d'exemples préférés, on peut citer une cassette comprenant de 5' vers 3': (1) Le LTR 5' du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de
polyadénylation de SV40, (2) Le mini LTR du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de
polyadénylation de SV40; (3) Le promoteur PGK, la séquence TAR, une séquence d'ADN codant pour un
IFN et le signal de polyadénylation de SV40; (4) Le promoteur 13-actine, la séquence TAR, une séquence d'ADN codant pour un
IFN et le signal de polyadénylation de SV40; (5) Le promoteur SV40, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence
RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40; (6) Le LTR 5' du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence
RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40; (7) Le mini LTR du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence
RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40 ; et.
(8) Le mini LTR du VIH, un site donneur d'épissage (du gène gag du VIH), une
séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de
polyadénylation de SV 40.
L'invention s'étend également aux vecteurs comprenant une cassette d'expression selon l'invention. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme de l'art, ainsi que les méthodes pour les construire et les propager. On aura avantageusement recours à des vecteurs viraux dérivés des rétrovirus, adénovirus ou virus associés à l'adénovirus.
Dans le cadre de l'invention, les vecteurs défectifs pour la réplication, et notamment les vecteurs rétroviraux, sont particulièrement préférés. Selon un mode de réalisation avantageux, une cassette selon l'invention est positionnée en orientation réverse par rapport aux LTRs du vecteur rétroviral, afin de positionner les promoteurs en sens inverse pour éviter les interférences. Bien entendu, un vecteur selon l'invention peut, en outre, comprendre un gène codant pour un marqueur de sélection, comme par exemple, les gènes néomycine et puromycine conférant une résistance aux antibiotiques G4 18 et puromycine. L'invention couvre également les virus et particules de vecteur viral obtenus par transfection du vecteur selon l'invention, dans une lignée cellulaire d'encapsidation, notamment amphotrope, produisant les protéines structurales du virus en cause.
L'invention a également trait à une cellule eucaryote comprenant, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Ces derniers peuvent être introduits soit in vitro dans une cellule prélevée du patient soit directement in vivo. La cellule est avantageusement une cellule humaine et, de manière préférée, une cellule de la lignée hématopoïétique (cellules souches ou lymphocytes primaires).
L'invention concerne également l'usage thérapeutique d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des infections dues au VIH.
L'invention s'adresse également à une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique une cassette d'expression, un vecteur ou une cellule selon l'invention, en association avec un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace d'un tel agent thérapeutique ou prophylactique à un support, un diluant ou un adjuvant acceptable. Elle peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine de l'art. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée après un certain délai d'intervalle. La quantité à administrer sera choisie en fonction de différents critères, en particulier la voie d'administration, le patient, I'état d'évolution de la maladie et la durée du traitement. A titre indicatif, une composition pharmaceutique selon l'invention contient de 103 à 1013 ptù, avantageusement de 105 à 1012 pfu et de préférence de 106 à 1011 pfù de particules de vecteur viral.
Par ailleurs, I'invention concerne une méthode de traitement des infections à VIH; selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquement efficace, d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement. Selon un premier protocole thérapeutique, on peut les administrer directement in w vo, par exemple par voie intraveineuse. On préférera adopter un protocole de thérapie génique somatique qui consiste à prélever des cellules souches de moelle osseuse ou des lymphocytes du sang périphérique d'un patient, de les transfecter avec un vecteur selon l'invention, de les cultiver in vitro selon les techniques de l'art et de les réimplanter au patient.
Naturellement, ce protocole peut être sujet à de nombreuses variantes. En particulier, il peut être avantageux de combiner au moins deux cassettes, vecteurs ou cellules selon l'invention permettant l'expression d'un IFN de type différent, par exemple un 'FNaetunIFN13.
L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes.
La figure 1 schématise le vecteur pTG4313 permettant l'expression d'une séquence d'ADN codant pour l'IFN a sous le contrôle du LTR du VIH.
La figure 2 représente le vecteur pTG4344 co-exprimant le gène IFN a et le gène de sélection puromycine.
La figure 3 schématise le vecteur rétroviral pTG4379 pour le transfert d'un gène IFN et son expression inductible par TAT.
La figure 4 montre l'évolution de l'infection dans des cellules U937 infectées par le
VIH III B et transfectées par les vecteurs d'expression de l'IFN a (O), ss () et y (o), comparée au témoin cellules non transfectées (n).
EXEMPLES
Toutes les opérations de clonage détaillées ci-après, sont effectuées selon les techniques classiques de biologie moléculaire (Maniatis et al., 1989, Laboratory
Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Ces étapes
sont réalisées dans la souche Escherichia coli (E. coli) 5K ou 1106.
Les gènes humains codant pour les IFNs a et ss ont été clonés par PCR (Polymerase
Chain Reaction) à partir de l'ADN génomique de cellules lymphoïdes, par exemple de cellules CEM-A3 (dérivées d'une lignée CEM disponible à l'ATCC sous le numéro CCL1 19). De telles banques sont disponibles dans le commerce. L'amplification de fragments d'ADN par PCR peut être effectuée à l'aide de kits commerciaux selon les spécifications du fabricant ou selon la technologie décrite dans PCR Protocols-A (edited by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Press Inc). Le gène humain codant pour llIFN y est obtenu du pTGl I décrit dans la demande de brevet français publiée sous le numéro 2.583.429. Des sites de restriction appropriés ont été introduits en amont et en aval de l'ATG initiateur et du codon stop des différents gènes IFN afin de pouvoir faciliter les étapes de clonage ultérieures. D'autre part, les sites de restriction protubérants en 5' peuvent être convertis en sites francs par traitement par le grand fragment Klenow de l'ADN polymerase d'E. coli alors que les sites protubérants en 3' sont traités par la T4 polymérase.
EXEMPLE 1 : Construction de vecteurs d'expression de l'interféron inductibles par la protéine TAT du VIH.
A. Vecteurs non viraux d'expression de l'lFNsous le contrôle du promoteur du
VIH.
On décrit la construction de vecteurs dans lesquels l'expression des gènes IFN a, B, et y est placée sous le contrôle du LTR 5' du VIH. Ces vecteurs ont été construits à partir du vecteur pTG1322 décrit dans Mehtali (1992, AIDS and Human
Retroviruses, 8, 1959-1965) comprenant un gène hétérologue placé sous le contrôle du LTR 5' du VIH (fragment XhoI-HindIII de 725 pb correspondant aux positions -645 à +80 du génome VIH). Ce vecteur porte également l'intron et le signal de polyadénylation du virus SV40. Il est digéré par HinalII traité à la Klenow puis digéré par SmaI.
On introduit dans pTG1322 ainsi traité, le gène IFN a sous forme d'un fragment délimité par les sites SmaI et EcoRI traité à la Klenow et on génère pTG43 13 (Figure 1). pTG43 14 est obtenu par insertion du fragment SmaI-EcoRV portant le gène IFN
ss dans pTG1322 obtenu comme précédemment. On génère pTG4315 par insertion du
gène IFN y sous forme d'un fragment HpaI-PvuII entre les mêmes sites de pTG1322.
On introduit dans le site EcoRI de ces différents vecteurs d'expression d'un IFN, un
gène de sélection conférant la résistance à la puromycine (puromycine R) sous forme
d'un fragment de 1,2 kb BamHI-BglII traité à la Klenow. Ce fragment comporte le
promoteur précoce du virus SV40, le gène puromycine R et le signal de polyadénylation de SV40. On obtient les vecteurs pTG4344 (représenté à la Figure 2),
pTG4345 et pTG4346, qui permettent la co-expression du gène de sélection puromycine R et respectivement du gène IFN a, ss ou y.
B. Vecteur rétroviral pour le transfert et l'expression des gènes IFN.
Le vecteur à la base des constructions est le pLXSP qui dérive de pLXSN (Miller et
Rossman, 1989, Biotechniques, 7, 980-988) après remplacement du gène de sélection néomycine par le gène puromycine R et du LTR 3' de MSV (Myelo Sarcoma Virus) par le LTR 3' du MPSV (Myelo Proliferative Sarcoma Virus).
On isole du génome du VIH un fragment ScaI-HindIII de 200 pb correspondant au mini LTR (position -120 à +80), qui est ensuite introduit en amont de chacun des gènes IFNs. Puis on introduit en 3' des gènes, le signal de polyadénylation du SV40.
Le vecteur ainsi obtenu est digéré par BglII, traité à la Klenow. Le fragment comportant la cassette d'expression "mini-LTR-IFN-signal de polyadénylation" est introduit entre les sites HpaI-BglII du vecteur rétroviral pTG4056. On sélectionne les clones dans lesquels ce fragment est positionné en orientation réverse par rapport aux
LTRs 5' et 3'. pTG4056 provient du pLXSP à la suite de la délétion du bloc d'expression promoteur SV40-puromycine R et la réinsertion du gène puromycine R dans l'orientation correcte pour être placé sous le contrôle du LTR 5'.
On obtient les vecteurs rétroviraux pTG4392, pTG4391 et pTG4379 (Figure 3) permettant le transfert et l'expression des séquences codant respectivement pour les
IFNs a, ss et y. Ils peuvent être transfectés dans une lignée cellulaire d'encapsidation amphotrope, par exemple la lignée PA317 (Miller et al., 1986, Mol. Cell., Biol. 6, 2895-2902) ou Gp Env. Am (Markowitz et al., 1988, Virology, 167, 400406). Le jour suivant, les cellules transfectées sont placées en milieu sélectif (puromycine 6 pg/ml). On isole les cellules résistantes qui constitueront des lignées productrices de particules amphotropes capables d'infecter les cellules humaines, à partir desquelles on peut constituer un stock viral susceptible d'être utilisé en thérapie génique anti SIDA.
C. Vecteurs réglables par TA T dans lesquels l'expression de l'IFN est dirigée par
un promoteur eucaryote.
1. Promoteur PGK murin.
La séquence TAR (correspondant aux nucléotides +1 à +80 du génome du VIH) est générée par synthèse chimique. Puis, I'oligonucléotide double brin ainsi obtenu est introduit par mutagénèse insertionnelle en position + 1 du promoteur PGK murin, dont la séquence est publiée dans Adra et al. (1987, Gene, 60, 65-74). On insère en aval de la séquence TAR, le fragment comportant la séquence codant pour l'IFN humain a, ss ou y suivie du signal de polyadénylation de SV40.
Enfin, la cassette d'expression "promoteur PGK-TAR-IFN-polyA" est introduite dans le vecteur rétroviral pLXSP. Bien entendu à chaque séquence IFN a, ss ou y correspond un vecteur rétroviral. Comme précédemment, on établit une lignée d'encapsidation amphotrope productrice de chaque type de particules virales.
2. Promoteur ss-actine murin.
L'exemple précédent est reproduit avec la variante suivante:
La séquence synthétique TAR est introduite en position +1 du promoteur ss-actine de rat dont la séquence est décrite dans Nudel et al., (1983, Nucleic Acids Res., I1, 1759-1771)
EXEMPLE 2 : Construction de vecteurs d'expression d'un IFN humain inductibles par la protéine REV du VIH.
On décrit un vecteur rétroviral par insertion dans le vecteur pLXSP et dans l'orientation réverse par rapport aux LTRs, d'une cassette d'expression comprenant de 5' vers 3':
- le promoteur du virus Su40;
- la séquence d'ADN codant pour l'IFN humain a, ss ou y;
- la séquence RRE/CRS. Cette dernière est isolée du génome du VIH-1
isolat Lai sous forme d'un fragment BglII-BamHI (s'étendant des
nucléotides 7178 à 8032 de la séquence telle que publiée par Wain
Hobson et al., stoppa). Ce fragment peut être traité par la Klenow avant
d'être introduit dans un site de restriction adéquat; et
- le signal de polyadénylation de SV40.
Comme précédemment, on peut constituer des stocks viraux après transfection dans une lignée d'encapsidation amphotrope.
EXEMPLE 3 : Construction de vecteurs d'expression d'un IFN humain inductibles par les protéines TAT et REV du VIH.
On insère dans les vecteurs pTG4392, pTG4391 et pTG4379 le fragment BamHI, BgllI traité à la Klenow et porteur de la séquence RRE/CRS du VIH entre la séquence codant pour un des IFNs et le signal de polyadénylation de SV40.
De plus, les vecteurs ainsi obtenus peuvent être modifiés par l'insertion d'un site donneur d'épissage entre le LTR du VIH et le gène IFN.
Comme précédemment, on peut générer une lignée amphotrope productrice de particules infectieuses correspondant à chacun des vecteurs ainsi obtenus.
EXEMPLE 4 : Résistance à l'infection virale des lignées cellulaires transfectées par les vecteurs d'expression de l'IFN inductibles par TAT.
Les expérimentations ci-après décrites sont effectuées dans des lignées cellulaires naturellement infectables par le VIH, comme: - la lignée U937 (ATCC CRL1593) dérivée de monocytes humains; et - la lignée CEM-A3 dérivée de cellules lymphocytaires humaines CD4+ (ATCC CCL 119).
En pratique, les cellules sont cultivées selon les recommandations du fournisseur et transfectées par électroporation d'au moins 201lg d'ADN à l'aide d'un appareillage approprié (Gene Pulser Biorad, voltage 210V, capacitance 960,uF).
Dans une première expérience, on co-électropore dans les cellules U937 (2X107 cellules) le pTG4314 avec le vecteur pLXSP dans un rapport de concentration en
ADN 20:1. Les cellules sont remises en culture à 37"C en présence de 5% de CO2 et le jour suivant, placées en milieu sélectif (puromycine 0,511g/ml). On sélectionne les cellules résistantes à l'antibiotique.
On teste leur résistance à l'infection en les infectant par une préparation de VIH à une
TCID50 élevée (au moins 50). La TCID50 est déterminée selon la méthode décrite dans Reed et al., (1938, Am. J. Hyg., 27, 493-497), sur lignées cellulaires infectables par le VIH, comme les cellules CEM. Elle correspond à la dose à laquelle 50% des cellules sont infectées et 50% ne le sont pas. Elle est vérifiée pour chaque lot de VIH employé.
Pour ce faire, on prélève une fraction de la culture cellulaire U937 électroporée, correspondant à environ 106 cellules, que l'on centrifuge à basse vitesse. Après lavage, le culot cellulaire est repris dans 200C11 de milieu de culture en absence de sérum. Puis les cellules sont traitées par différentes dilutions de la préparation virale
On laisse l'infection se poursuivre 1 heure à 37"C.
Les cellules sont ensuite lavées 2 fois dans du milieu de culture et mises en culture dans 5 ml du même milieu, complémenté avec 10% de SVF (sérum de veau foetal).
Le milieu est renouvelé 2 ou 3 fois par semaine. La propagation du virus est évaluée par mesure de l'activité réverse-transcriptase à intervalles réguliers dans le surnageant de culture selon la méthode décrite dans Spire et al. (1985, Lancet, i, 188-189).
On observe une diminution significative (jusqu'à 85%) de l'activité réversetranscriptase sur 14 jours post-infection par rapport aux cellules U937 témoin non électroporée avec un vecteur d'expression de l'interféron.
L'expérience est répétée cette fois avec des cellules U937 initialement électroporées avec le pTG4344, pTG4345 ou pTG4346. Dans les trois cas, on observe une diminution encore supérieure de l'activité réverse-transcriptase sur 21 jours postinfection par rapport au témoin cellules non électroporées. (Figure 4).

Claims (20)

  1. éléments sont régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH).
    expression dans une cellule de mammifère, caractérisée en ce que lesdits
    humain placée sous le contrôle des éléments capables d'assurer son
    Revendications 1. Une cassette comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour un IFN
  2. 2. Une cassette selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'IFN est
    sélectionné parmi les IFNs humains de type a, ss et y.
  3. 3. Une cassette selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les
    éléments capables d'assurer l'expression dans une cellule mammifère
    comprennent au moins un promoteur et une séquence de type TAR et/ou
    RRE/CRS.
  4. 4. Une cassette selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence de
    type TAR est placée en 3' dudit promoteur.
  5. 5. Une cassette selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que la séquence
    de type RRE/CRS est placée en 3' de la séquence d'ADN codant pour un
    IFN humain.
  6. 6. Une cassette selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le
    promoteur fonctionnel dans une cellule de mammifère est sélectionné parmi
    les promoteurs des gènes murins PGK et 13-actine, le LTR 5' du VIH et un
    fragment de celui ci (mini LTR).
  7. 7. Une cassette selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que les
    lesdits éléments comportent en outre un site donneur d'épissage.
  8. 8. Une cassette selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que
    lesdits éléments comprennent en outre un signal de polyadénylation.
  9. 9. Un vecteur comprenant une cassette selon l'une des revendications 1 à 8.
  10. 10. Un vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur
    rétroviral.
  11. 11. Un vecteur selon la revendication 10, caractérisé en ce que la cassette
    d'expression selon l'une des revendications 1 à 8 est positionnée en
    orientation réverse par rapport aux LTRs dudit vecteur.
  12. 12. Un vecteur selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il
    comprend en outre un gène de sélection.
  13. 13. Un vecteur selon la revendication 12, caractérisé en ce que le gène de
    sélection confère la résistance à la puromycine.
  14. 14. Une cellule eucaryote comprenant une cassette selon l'une des revendications
    1 à 8 ou un vecteur selon l'une des revendications 9 à 13.
  15. 15. Une cellule selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une
    cellule humaine de la lignée hématopoïétique.
  16. 16. Usage d'une cassette selon l'une des revendications 1 à 8, d'un vecteur selon
    l'une des revendications 9 à 13 ou d'une cellule selon la revendication 14 ou
    15, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au
    traitement des infections dues au VIH.
  17. 17. Une composition pharmaceutique comprenant une quantité
    thérapeutiquement efficace d'une cassette selon l'une des revendications 1 à
    8, d'un vecteur selon l'une des revendications 9 à 13 ou d'une cellule selon la
    revendication 14 ou 15, en association avec un véhicule pharmaceutiquement
    acceptable.
  18. 18. Une composition pharmaceutique selon la revendication 17, caractérisée en
    ce qu'elle comprend de 103 à 1013 pft d'un vecteur selon l'une des
    revendications 9 à 13.
  19. 19. Produit contenant au moins deux cassettes selon l'une des revendications 1 à 8,
    vecteurs selon l'une des revendications 9 à 13 ou cellules selon la
    revendication 14 ou 15 exprimant chacun un IFN de type différent, comme
    produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans
    le temps dans la prévention ou le traitement des infections dues au VIH.
  20. 20. Utilisation d'au moins deux cassettes selon l'une des revendications 1 à 8,
    vecteurs selon l'une des revendications 9 à 13 ou cellules selon la
    revendication 14 ou 15 exprimant chacun un IFN de type différent, en
    utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destinés à l'obtention
    d'un médicament pour la prévention ou le traitement des infections dues au
    VIH.
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