EP0682712A1 - Vecteurs exprimant un interferon humain pour le traitement du sida - Google Patents

Vecteurs exprimant un interferon humain pour le traitement du sida

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EP0682712A1
EP0682712A1 EP95903830A EP95903830A EP0682712A1 EP 0682712 A1 EP0682712 A1 EP 0682712A1 EP 95903830 A EP95903830 A EP 95903830A EP 95903830 A EP95903830 A EP 95903830A EP 0682712 A1 EP0682712 A1 EP 0682712A1
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EP
European Patent Office
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vector
hiv
cassette
cell
ifn
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95903830A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Majid Mehtali
Philippe Leissner
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Transgene SA
Original Assignee
Transgene SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Transgene SA filed Critical Transgene SA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
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    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the subject of the present invention is a cassette comprising a DNA sequence coding for a human IFN, the expression of which is placed under the control of elements which can be regulated by the human immunodeficiency virus (HIV).
  • HIV human immunodeficiency virus
  • HIV the etiological agent of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome)
  • T helper T lymphocytes
  • the disease progresses to a deficit in cellular immunity, which makes sick individuals particularly susceptible to opportunistic infections. So far, no treatment has proven completely satisfactory despite the multiple efforts invested in the development of new antiviral molecules.
  • HIV is a retrovirus belonging to the lentivirus family. Its genetic material, consisting of an RNA molecule, is packaged in a capsid of a protein nature, itself surrounded by a viral envelope.
  • structural genes gag, pol and env
  • capsid proteins gag, pol and env
  • the HIV genome includes regulatory genes that control viral replication. Among these The latter include the tat and rev genes coding for the TAT and REV proteins respectively.
  • the TAT protein has a trans-activating role in the expression of all of the HIV genes (Arya et al., 1985, Science, 229, 69-73). It seems that TAT intervenes on both a transcriptional and post-transcriptional level. It interacts specifically with a short nucleotide sequence, designated TAR sequence (for Trans-activation Responsive Region), and located at the 5 'end of the genome and viral transcripts (position +1 to +80; +1 representing the site of initiation of transcription) (Rosen et al., 1985, Cell, 41, 813-823).
  • TAR sequence for Trans-activation Responsive Region
  • the REV protein promotes the transport of messenger RNA (mRNA) coding for structural proteins to the cytoplasm, for translation.
  • REV specifically recognizes an RRE sequence (for REV Responsive Element) on mRNAs. This is localized in the env gene near another sequence called CRS (Cis-acting Repression Sequence), involved in the nuclear retention of mRNA carrying it. It is assumed that the binding of the REV protein at its RRE target sequence has the effect of counterbalancing the inhibitory effect of CRS on the passage of large viral mRNAs to the cytoplasm.
  • the sequences essential for the transcription of viral genes are located at the two ends of the genome at the level of LTRs (Long Terminal Repeat). While the 5 'LTR contains the promoter sequences as well as the TAR sequences, the 3' LTR includes the sequences involved in the termination of transcription.
  • LTRs Long Terminal Repeat
  • IFNs interferons
  • the synthesis of cellular (endogenous) IFNs is suppressed in cells infected with HIV. This repression prevents cells infected with HIV and surrounding cells from defending themselves effectively against viral infection (Mark, 1992, AIDS Res. Hum. Retrovirus, 8, 199-207).
  • the aim of the present invention is to propose different vectors for expression of human IFN which can be regulated by the TAT and / or REV proteins of HIV. This approach takes advantage of the replication characteristics of the HIV virus.
  • the subject of the present invention is an expression cassette comprising at least one DNA sequence coding for a human IFN, placed under the control of clements capable of ensuring its expression in a mammalian cell, characterized in that that said elements are regulable by the human immunodeficiency virus (HIV).
  • HAV human immunodeficiency virus
  • a DNA sequence in use in the present invention can encode a human IFN of the u, p or y type. These may be the sequences disclosed in the prior art and in particular in Shaw et al. (1983, Nucleic Acid Res., 11, 555-573) for IFN ⁇ , Higashi et al. (1983, J. Biol. Chem., 258, 9522-9529) for the TFN ⁇ and Gray et al. (1982, Nature, 295, 503-508) for IFN ⁇ . These sequences can be isolated from the gene or cDNA. By sequence coding for a human IFN is also understood to denote a sequence coding for an analog of an IFN.
  • analog is meant a molecule which would have an amino acid sequence slightly different from a native IFN but which would retain most of the antiviral function.
  • an analog can be obtained by deletion, substitution and / or addition of one or more amino acids of the native protein or of a fragment thereof. Those skilled in the art know the techniques which allow these modifications to be made without abolishing the biological function of the protein.
  • the elements ensuring the expression of a DNA sequence in use in the context of the present invention are the conventional elements allowing the transcription of the DNA sequence into mRNA and the translation of the latter into protein, such as for example a promoter and the translation initiation and termination codons.
  • a cassette according to the invention comprises sequences which can be regulated by the HIV virus.
  • a promoter is chosen which is functional in a mammalian cell and, preferably, in a human cell. It can come from any eukaryotic gene or from a viral genome and be of ubiquitous or regulable nature, in particular in response to certain tissue-specific or event-specific cellular signals. The choice of promoter is very wide and within the reach of those skilled in the art. However, the promoter of the murine PGK (PhosphoGlycerate kinase) and ⁇ -actin genes or the SV40 promoter (Simian Virus 40) will advantageously be used. According to a particularly preferred mode, the sequences regulable by HIV consist of a TAR and / or RRE / CRS type sequence.
  • a TAR-like sequence interacts with the TAT protein to activate the expression of genes under its control.
  • an RRE / CRS type sequence interacts with the REV protein to promote the transport of mRNAs in the cytoplasm. It is indicated that it naturally contains a splice acceptor site.
  • these sequences may be slightly different from the native TAR and RRE / CRS sequences (as published by Wain-Hobson et al., 1985, Cell, 40, 9-17), provided however d '' be able to interact with viral TAT and REV proteins.
  • TAR type sequence Being a TAR type sequence, it is inserted 3 'to the promoter and, most preferably, in position +1 (+1 being the site of initiation of transcription).
  • the 5 'HIV LTR which naturally includes a functional promoter in cells mammal followed by the TAR sequence (in position +1 to +80). It is also possible to use a portion of it, which comprises the minimal promoter sequences (Spl sequences, CAAT box and TATA box) and the TAR sequence.
  • a 200 bp fragment corresponding to the 3 'end of the LTR and extending from positions -120 to +80 of the viral genome is designated by the name of mini LTR.
  • a cassette according to the invention comprises a conventional promoter and an RRE / CRS type sequence capable of interacting with the viral protein REV of HIV.
  • the mRNAs will be blocked in the nucleus under the action of CRS.
  • the RRE / CRS sequence is introduced 3 'to the DNA sequence coding for an IFN.
  • the expression of a DNA sequence used in the present invention can be subjected to double regulation by TAT and REV, which makes it possible to circumvent the problems of escape from expression observed commonly. with certain promoters.
  • an expression cassette according to the invention can comprise a TAR type sequence and an RRE / CRS type sequence; so that in the event of escape of the expression, the few mRNAs produced will remain blocked in the nucleus. Only the penetration of HIV and the synthesis of the viral proteins TAT and REV can trigger the synthesis of IFN.
  • an expression cassette according to the invention may, in addition, contain other elements contributing to the expression of the DNA sequence coding for IFN, in particular, an intron, suitable splicing signals and elements transcription termination (polyadenylation signal). The choice and location of these elements is within the reach of the skilled person.
  • cassette comprising from 5 'to 3':
  • the 5 'HIV LTR a DNA sequence encoding an IFN and the polyadenylation signal of SV40
  • the HIV mini LTR a DNA sequence encoding an IFN and the polyadenylation signal of SV40
  • the PGK promoter the TAR sequence, a DNA sequence coding for an IFN and the polyadenylation signal of SV40;
  • SV40 promoter a DNA sequence coding for an IFN, the RRE / CRS sequence and the polyadenylation signal of SV40;
  • the HIV mini LTR a DNA sequence coding for an IFN, the RRE / CRS sequence and the polyadenylation signal of SV40; and.
  • the invention also extends to vectors comprising an expression cassette according to the invention.
  • vectors comprising an expression cassette according to the invention.
  • vectors are well known to those skilled in the art, as are the methods for constructing and propagating them.
  • viral vectors derived from retroviruses, herpes virus, adenovirus or viruses associated with adenovirus will be used.
  • synthetic vectors can also be used.
  • vectors defective for replication, and in particular retroviral vectors are particularly preferred.
  • a cassette according to the invention is positioned in reverse orientation relative to the LTRs of the retroviral vector, in order to position the promoters in the opposite direction to avoid interference.
  • a vector according to the invention can, in addition, comprise a gene encoding for a selection marker, such as, for example, the neomycin and puromycin acetyl transferase genes conferring resistance to the antibiotics G418 and puromycin.
  • the invention also covers the viruses and viral vector particles obtained by transfection of the vector according to the invention, in an encapsidation cell line, in particular amphotropic, producing the structural proteins of the virus in question.
  • the invention also relates to a eukaryotic cell comprising, an expression cassette or a vector according to the invention. These can be introduced either in vitro into a cell taken from the patient or directly in vivo.
  • the cell is advantageously a human cell and, preferably, a cell of the hematopoietic line (stem cells or primary lymphocytes).
  • the invention also relates to the therapeutic use of an expression cassette, a vector or a cell according to the invention, for the manufacture of a medicament intended for the prevention or treatment of viral infections and, in particular, HIV infections.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising, as a therapeutic or prophylactic agent, an expression cassette, a vector or a cell according to the invention, in combination with a vehicle which is acceptable from a pharmaceutical point of view.
  • a pharmaceutical composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner.
  • a therapeutically effective amount of such a therapeutic or prophylactic agent is combined with an acceptable carrier, diluent or adjuvant. It can be administered by any conventional route used in the field of art. Administration can take place in a single or repeated dose after a certain interval of interval.
  • the amount to be administered will be chosen according to various criteria, in particular the route of administration, the patient, the state of the disease and the duration of treatment.
  • a pharmaceutical composition according to the invention contains 10 3 to 10 14 pfu (range forming unit), advantageously from 10 5 to 10 13 pfu, preferably from 10 6 to 10 12 pfu and, most preferably, from 10 7 to 10 10 pfu of viral vector particles.
  • the invention relates to a method of treatment of viral infections, and in particular to HIV, according to which a therapeutically effective amount of an expression cassette, a vector or a cell according to the invention is administered. to a patient in need of such treatment.
  • a therapeutically effective amount of an expression cassette, a vector or a cell according to the invention is administered.
  • they can be administered directly in vivo, for example by the intravenous route.
  • a somatic gene therapy protocol which consists in taking bone marrow stem cells or lymphocytes from the peripheral blood of a patient, transfecting them with a vector according to the invention, cultivating them in vitro according to the techniques of art and administer them to the patient.
  • FIG. 1 shows schematically the vector pTG4313 allowing the expression of a DNA sequence coding for IFN ⁇ under the control of the HIV LTR.
  • FIG. 2 represents the vector pTG4344 co-expressing the IFN ⁇ gene and the puromycin selection gene.
  • FIG. 3 schematizes the retroviral vector pTG4379 for the transfer of an IFN gene and its expression inducible by TAT.
  • FIG. 4 shows the evolution of the infection in U937 cells infected with HIV III B and transfected with the expression vectors of IFN ⁇ ( ⁇ ), ⁇ ( ⁇ ) and ⁇ ( ⁇ ), compared to the control untransfected cells ( ⁇ ).
  • FIG. 5 illustrates the retroviral vector pTG6324 comprising the expression cassettes of IFN ⁇ (under the control of the HIV mini LTR) and of the neo selection gene (under the control of the retroviral LTR 5 ′).
  • FIG. 6 illustrates the evolution of the infection in human CD8-PBLs transduced by the vector pTG6327 ( ⁇ ) then infected with the HIV III B virus, compared with the non-transduced cells ( ⁇ ).
  • the human genes coding for the ⁇ and ⁇ IFNs were cloned by PCR (Polymerase Chain Reaction) from the genomic DNA of lymphoid cells, for example CEM-A3 cells (derived from a CEM line available at ATCC under number CCLl 19). Such banks are commercially available. Amplification of DNA fragments by PCR can be carried out using commercial kits according to the manufacturer's specifications or according to the technology described in PCR Protocols-A (edited by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Académie Press Inc) using primers complementary to the published sequences.
  • the human gene coding for IFN ⁇ is obtained from pTG1 1 described in the French patent application published under the number 2.583.429.
  • protruding 5 ′ restriction sites can be converted into blunt sites by treatment with the large Klenow fragment of the DNA polymerase of E. coli while the protruding 3 'sites are treated with T4 polymerase.
  • EXAMPLE 1 Construction of Inducible Interferon Expression Vectors by the TAT protein of HIV and in which the selection gene consists of the puromycin gene.
  • vectors in which the expression of the IFN ⁇ , ⁇ , and ⁇ genes is placed under the control of the HIV 5 'LTR.
  • These vectors were constructed from the vector pTG1322 described in Mehtali (1992, AIDS and Human Retroviruses, 8, 1959-1965) comprising a heterologous gene placed under the control of the HIV 5 'LTR (corresponding XhoI-HindIII fragment of 725 bp at positions -645 to +80 of the HIV genome).
  • This vector also carries the intron and the polyadenylation signal of the SV40 virus. It is digested with HindIII treated with Klenow and then digested with SmaI.
  • pTG4314 is obtained by inserting the SmaI-EcoRV fragment carrying the IFN ⁇ gene into pTG1322 obtained as above.
  • PTG4315 is generated by insertion of the ⁇ FN ⁇ gene in the form of an HpaI-PvuII fragment between the same pTG 1322 sites.
  • a selection gene conferring resistance to puromycin (puromycin R) in the form of a 1.2 kb BamHI-BglII treated Klenow fragment is introduced into the EcoRI site of these various IFN expression vectors. .
  • This fragment contains the SV40 virus early promoter, the puromycin R gene and the SV40 polyadenylation signal.
  • the vectors pTG4344 (represented in FIG. 2), pTG4345 and pTG4346, are obtained, which allow the co-expression of the puromycin R selection gene and of the IFN ⁇ , ⁇ or ⁇ gene respectively.
  • the vector at the base of the constructs is pLXSP which is derived from pLXSN (Miller and Rossman, 1989, Biotechniques, 7, 980-988) after replacement of the gene for neomycin selection by the puromycin R gene and the 3 'LTR of MSV (Myelo Sarcoma Virus) by the 3' LTR of MPSV (Myelo Proliferative Sarcoma Virus).
  • a 200 bp ScaI-HindIII fragment corresponding to the mini LTR (position -120 to +80) is isolated from the HIV genome, which is then introduced upstream of each of the IFNs genes. Then, at 3 ′, genes are introduced, the polyadenylation signal of SV40.
  • the vector thus obtained is digested with BglII, treated with Klenow.
  • the fragment comprising the expression cassette "mini LTR - IFN - polyadenylation signal" is introduced between the HpaI-BglII sites of the retroviral vector pTG4056.
  • the clones in which this fragment is positioned in reverse orientation with respect to the 5 'and 3' LTRs are selected.
  • pTG4056 originates from pLXSP following the deletion of the SV40-puromycin R promoter expression block and the reinsertion of the puromycin R gene in the correct orientation to be placed under the control of the 5 'LTR.
  • the retroviral vectors pTG4392, pTG4391 and pTG4379 ( Figure 3) allowing the transfer and the expression of the sequences coding respectively for the IFNs ⁇ , ⁇ and ⁇ . They can be transfected into an amphotropic packaging cell line, for example the line PA317 (Miller et al., 1986, Mol. Cell., Biol. 6, 2895-2902), Gp Env. Am (Markowitz et al., 1988, Virology, 167, 400-406) or PG13 (Miller et al., 1991, J. Virol, 65, 2220-2224).
  • the transfected cells are placed in a selective medium (puromycin 6 ⁇ g / ml). Resistant cells are isolated, which will form lines producing amphotropic particles capable of infecting human cells, from which a viral stock can be built up which can be used in anti-AIDS gene therapy.
  • the TAR sequence (corresponding to nucleotides +1 to +80 of the HIV genome) is generated by chemical synthesis. Then, the double stranded oligonucleotide thus obtained is introduced by insertional mutagenesis in position +1 of the murine PGK promoter, the sequence of which is published in Adra et al. (1987, Gene, 60, 65-74).
  • the fragment comprising the sequence coding for human IFN ⁇ , ⁇ or ⁇ is inserted downstream of the TAR sequence, followed by the polyadenylation signal of SV40.
  • each IFN ⁇ , ⁇ or ⁇ sequence corresponds to a retroviral vector.
  • an amphotropic packaging line producing each type of viral particles is established.
  • the preceding example is reproduced with the following variant:
  • the synthetic TAR sequence is introduced in position +1 of the rat ⁇ -actin promoter, the sequence of which is described in Nudel et al., (1983, Nucleic Acids Res., 11, 1759 -1771)
  • the HIV mini LTR is isolated from the viral genome after ScaI-HindIII digestion, inserted into any plasmid to be treated as a SmaI-HindIII fragment and then cloned between the same sites of the vector pTG2359.
  • the latter corresponds to the cloning of the polyadenylation site of the SV40 virus in the plasmid p Bluescript KS (Stratagene).
  • PTG4347 is obtained in which a SmaI-HpaI fragment carrying the sequences coding for IFN ⁇ is introduced, after digestion with BalI
  • the "mini LTR-IFN ⁇ -polyA SV40" expression cassette is purified from vector pTG4355 obtained in the previous step in the form of a BamHI-BglII fragment, which is cloned in the BamHI site. of pTG6320 to give pTG6324 ( Figure 5).
  • the latter therefore includes the MSV LTR directing the expression of the neo selection gene, followed by the cassette "mini LTR - IFN ⁇ - polyA SV40" positioned in reverse orientation in order to avoid interference phenomena between the promoters and finally the MPSV retroviral 3 'LTR.
  • pTG6320 comes from pLXSP following the detection of the expression cassette of the puromycin gene and replacement by the neomycin gene (Colbère - Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol., 150, 1 - 14).
  • the cloning strategy is quite similar to what is described above.
  • the vector pTG631 1 comes from the insertion of a SmaI-HpaI fragment carrying the sequence coding for IFN ⁇ in the BalI site of pTG4347.
  • the retroviral vector pTG6328 is obtained by cloning the purified BamHI.-BglII fragment from pTG631 1 into the vector pTG6320 previously digested with BamHI. This is the equivalent of pTG6324 with the difference that it carries the IFN ⁇ gene in place of the IFN ⁇ gene.
  • the SmaI-HindIII fragment carrying the HIV mini LTR is inserted between the same sites of pTG4356, to generate pTG6312.
  • the vector pTG4356 corresponds to the vector pTG2359 into which the IFN ⁇ gene (SmaI-EcoRV fragment) has been cloned (site BalI).
  • site BalI the expression cassette for lTFN ⁇ is purified from pTG6312 after digestion with BamHI and BglII and then subcloned into the BamHI site of pTG6320 to give pTG6327.
  • Stocks of infectious viral particles can be prepared from each of the above vectors pTG6324, pTG6327 and pTG6328. To do this, these the latter are transfected in a conventional manner into an ecotropic packaging line, for example the GP + E 86 line (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120-1124). 48 h after transfection, the cells are cultured in a selective medium (G418 1 mg / ml).
  • the mixture of clones resistant to G418 is maintained for 3 additional days in a selective medium.
  • the culture supernatant is harvested to conventionally infect an amphotropic packaging line such as line PA3 17. After selection, the lines thus obtained will constitute the cells producing infectious viral particles allowing the transfer and expression of the various IFNs in as part of human gene therapy.
  • pHMG-TAT is a vector for expression of the native TAT protein and results from the cloning of the sequence coding for this in the vector pHMG (Mehtali et al., 1990, Gene, 91, 179-184).
  • a good clone producing virions titrating 5 ⁇ 10 to 10 pfu / ml is selected after infection of murine NIH-3T3 cells (ATCC CRL 1658) with an aliquot of culture supernatant of the clone. We check its ability to produce IFN as indicated above. A clonal dilution is again carried out from the previous clones in order to generate subclones. We select for each of them a good subclone producer of virions and IFN after titration and assay of IFN.
  • EXAMPLE 3 Construction of expression vectors of a human IFN inducible by the HIV REV protein.
  • a retroviral vector is described by insertion into the vector pLXSP and in the reverse orientation with respect to the LTRs, of an expression cassette comprising from 5 'to 3': - the promoter of the SV40 virus;
  • the latter is isolated from the genome of HIV-1 isolate Lai in the form of a BglII-BamHI fragment (extending from nucleotides 7178 to 8032 of the sequence as published by Wain-Hobson et al., Supra). This fragment can be treated with Klenow before being introduced into an adequate restriction site; and
  • EXAMPLE 4 Construction of expression vectors of a human IFN inducible by the TAT and REV proteins of HIV.
  • the BamHI-BglII fragment treated with Klenow and carrying the HIV RRE / CRS sequence is inserted into the vectors pTG4392, pTG4391 and pTG4379 between the sequence coding for one of the IFNs and the polyadenylation signal of SV40.
  • the vectors thus obtained can be modified by the insertion of a splicing donor site between the HIV LTR and the IFN gene. As before, it is possible to generate an amphotropic line producing infectious particles corresponding to each of the vectors thus obtained.
  • EXAMPLE 5 Resistance to viral infection of cell lines transfected with TAT-inducible IFN expression vectors.
  • the experiments described below are carried out in cell lines naturally infected with HIV, such as: - the U937 line (ATCC CRL 1593) derived from human monocytes; and - the CEM-A3 line derived from CD4 + human lymphocyte cells (ATCC CCL1 19).
  • the cells are cultured according to the supplier's recommendations and transfected by electroporation of at least 20 ⁇ g of DNA using appropriate equipment (Puiser Biorad gene, voltage 210V, capacitance 960 ⁇ F).
  • pTG4314 is co-electropore into U937 cells (2 ⁇ 10 7 cells) with the vector pLXSP in a DNA concentration ratio of 20: 1.
  • the cells are returned to culture at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 and the following day, placed in a selective medium (puromycin 0.5 ⁇ g / ml).
  • Antibiotic resistant cells are selected. Their resistance to infection is tested by infecting them with an HIV preparation at a high TCID 50 (at least 1000).
  • the TCID 50 is determined according to the method described in Reed et al., (1938, Am. J. Hyg., 27, 493-497), on cell lines that can be infected with HIV, such as CEM cells. It corresponds to the dose at which 50% of the cells are infected and 50% are not. It is checked for each batch of HIV used.
  • a fraction of the electroporated U937 cell culture corresponding to approximately 10 6 cells, is removed and centrifuged at low speed. After washing, the cell pellet is taken up in 200 ⁇ l of culture medium in the absence of serum. Then the cells are treated with different dilutions of the viral preparation. The infection is allowed to continue for 1 hour at 37 ° C.
  • the cells are then washed twice in culture medium and cultured in 5 ml of the same medium, supplemented with 10% of FCS (fetal calf serum).
  • FCS fetal calf serum
  • the medium is renewed 2 or 3 times a week.
  • the spread of the virus is evaluated by measuring the reverse transcriptase activity at regular intervals. in the culture supernatant according to the method described in Spire et al. (1985, Lancet, i, 188-189).
  • the presence and localization of the viral protein gp120 is evaluated by immunofluorescence using an anti-gp120 antibody (obtained from serum from seropositive patients). It is found that in the cells expressing IFN, the protein gp120 is in intracellular form, whereas it should be sub-membrane, in order to allow the budding of the viral particles. Taken together, these results indicate that IFN acts at the late stages of the viral cycle and probably at the level of virion assembly.
  • EXAMPLE 7 Method of treatment of AIDS by gene therapy.
  • - CD4 + lymphocytes from peripheral blood which can be collected in particular by leukopheresis
  • - hematopoietic stem cells CD34 + which can be obtained from '' a bone marrow or peripheral blood sample (mobilization by chemotherapy or by action of hematopoietic growth factors).
  • the patient is subjected to a blood sample or leukopheresis. After eliminating the red blood cells, the mononuclear cells are isolated by centrifugation on Ficoll and cultured according to the techniques of the art. First, we get rid of the cells adhering to the plastic of the culture flasks. The cell suspension is recovered and cultured in flasks coated with anti-CD8 antibodies (Immunotech) in order to eliminate the CD8 + cells. The cell suspension thus obtained is mainly composed of CD4 + lymphocytes. Of course, the other enrichment techniques can also be used.
  • the growth factors that can be used for this purpose are varied. As an indication, one can cite a mixture of anti-human CD3 antibodies (Immunotech, about 10 ng / ml) and IL-2 (Cetus; 100 U / ml) or PHA (phytohemagglutidine, Sigma, at a concentration about 5 ⁇ g / ml) and IL-2.
  • the cells are transduced by the retroviral vector.
  • Different methodologies are applicable: - co-culture of CD4 + cells and amphotropic producing cells of examples 1 to 4.
  • - co-culture of the 2 cell types, the CD4 + cells being deposited in the culture wells and the producer cells in a Transwell (Costar) - infection of the CD4 + cells with an aliquot of culture supernatant of the producer cells according to an ego (multiplicity of infection) preferably between 1 and 5.
  • the transduction is carried out in the presence of protamine sulphate (at a concentration of approximately 5 ⁇ g / ml) to promote the attachment of the virus to the cell surface .
  • the cell culture is passed through a selective medium (puromycin in the context of the vectors of Example 1 or G418 in the context of the vectors of Example 2) and continued for 7 to 8 days until the number is obtained. of appropriate cells. It is indicated that it may be advantageous to use the AIM V medium (Gibco BRL) supplemented with L-glutamine (2 mM) and IL-2 (100 U / ml) and devoid of serum.
  • a selective medium puromycin in the context of the vectors of Example 1 or G418 in the context of the vectors of Example 2
  • the stages of purification of the CD34 cells are as follows: - isolation of the mononuclear cells from the peripheral blood or bone marrow sample by Ficoll centrifugation, - depletion of adherent cells, and - capture of CD34 + cells by culture in flasks coated with anti-CD34 antibody (Immunotech) or in the presence of beads coated with this antibody.
  • the suspended cells are eliminated and the adherent cells are recovered after action, for example, of papain.
  • the CD34 + cells thus obtained are stimulated by various growth factors to place them in the division cycle and thus promote retroviral infection.
  • a mixture of IL-3 (approximately 10 ng / ml), IL-6 (approximately 50 U / ml) and SCF (Stem cell factor, approximately 50 U / ml) can be used for this purpose.
  • the culture medium for 48 hours before carrying out the transduction according to the protocol indicated above. These factors are commercially available.
  • the cells are then re-administered to the patient.

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Abstract

La présente invention concerne une cassette d'expression d'un gène IFN humain placé sous le contrôle d'éléments inductibles par le virus VIH. Elle couvre également un vecteur et une cellule comprenant ladite cassette ainsi que leur usage thérapeutique et une composition pharmaceutique pour le traitement ou la prévention des infections dues au VIH.

Description

VECTEURS EXPRIMANT UN INTERFERON HUMAIN
POUR LE TRAITEMENT DU SIDA
La présente invention a pour objet une cassette comportant une séquence d'ADN codant pour un IFN humain dont l'expression est placée sous le contrôle d'éléments régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). La présente invention trouve une application intéressante dans le traitement ou la prévention des infections dues au VIH, notamment par thérapie génique.
Le VIH, agent étiologique du SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise), infecte préférentiellement une sous-population de lymphocytes T, (T helper) responsables de l'amplification de la réponse immunitaire. En conséquence, la maladie évolue vers un déficit de l'immunité cellulaire, ce qui rend les individus malades particulièrement sensibles aux infections opportunistes. Jusqu'à présent, aucun traitement ne s'est révélé totalement satisfaisant malgré les multiples efforts investis dans le développement de nouvelles molécules antivirales. Ces difficultés relèvent sans doute de la complexité particulière du virus VIH et de sa capacité à réprimer les systèmes de défenses immunitaires dans les cellules infectées.
Le VIH est un rétrovirus appartenant à la famille des lentivirus. Son matériel génétique, constitué d'une molécule d'ARN, est encapsidé dans une capside de nature protéique, elle-même entourée d'une enveloppe virale. Outre les gènes structuraux (gag, pol et env) codant respectivement pour les protéines de la capside, la réverse-transcriptase et la protéine d'enveloppe, le génome du VIH comprend des gènes régulateurs qui commandent la réplication virale. Parmi ces derniers, on peut citer les gènes tat et rev codant respectivement pour les protéines TAT et REV.
La protéine TAT a un rôle trans-activateur de l'expression de l'ensemble des gènes du VIH (Arya et al., 1985, Science, 229, 69-73). Il semble que TAT intervient aussi bien à un niveau transcriptionnel que post-transcriptionnel. Elle interagit spécifiquement avec une courte séquence nucléotidique, désignée séquence TAR (pour Trans-activation Responsive Région), et localisée à l'extrémité 5' du génome et des transcrits viraux (position +1 à +80 ; +1 représentant le site d'initiation de la transcription) (Rosen et al., 1985, Cell, 41, 813-823).
La protéine REV favorise le transport vers le cytoplasme des ARN messagers (ARNm) codant pour les protéines de structure, pour y être traduits. De son côté, REV reconnaît spécifiquement une séquence RRE (pour REV Responsive Elément) sur les ARNm. Celle-ci est localisée dans le gène env à proximité d'une autre séquence dite CRS (Cis-acting Repression Séquence), impliquée dans la rétention nucléaire des ARNm la portant. On suppose que la fixation de la protéine REV au niveau de sa séquence cible RRE a pour effet de contrebalancer l'effet inhibiteur de CRS sur le passage des grands ARNm viraux vers le cytoplasme.
Les séquences essentielles à la transcription des gènes viraux sont localisées aux deux extrémités du génome au niveau des LTRs (Long Terminal Repeat). Alors que le LTR 5' contient les séquences promotrices ainsi que les séquences TAR, le LTR 3' comprend les séquences impliquées dans la terminaison de la transcription.
D'une manière générale, lorsqu'une cellule est infectée par un virus, elle secrète des interférons (IFNs) en réponse à l'infection virale. Il s'agit d'un groupe de protéines exerçant des effets antiviraux et classifié en trois types α, β et γ. S'il existe plus d'une vingtaine de sous-types d'IFN α, les IFNs β et γ semblent uniques.
Paradoxalement, la synthèse des IFNs cellulaires (endogènes) est réprimée dans les cellules infectées par le VIH. Cette répression empêche les cellules infectées par le VIH et les cellules avoisinantes de se défendre efficacement contre l'infection virale (Mark, 1992, AIDS Res. Hum. Retrovirus, 8, 199-207). On a maintenant trouvé que l'introduction dans une cellule d'un gène codant pour un IFN humain (IFN exogène) dont l'expression est inductible par les protéines virales TAT et/ou REV, permet à la cellule génétiquement modifiée de se défendre dans un contexte infectieux. La présente invention a pour but de proposer différents vecteurs d'expression d'IFN humain régulables par les protémes TAT et/ou REV du VIH. Cette approche met à profit les caractéristiques de réplication du virus VIH. Ainsi, en cas d'infection, la synthèse des IFNs cellulaires est inhibée mais la synthèse des IFNs exogènes est induite par le virus VIH lui même, reconstituant ainsi un système de défense efficace à son encontre. L'usage d'un système d'expression inductible évite les problèmes de toxicité cellulaire dans les cellules non infectées.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet une cassette d'expression comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour un IFN humain, placée sous le contrôle des cléments capables d'assurer son expression dans une cellule de mammifère, caractérisée en ce que lesdits éléments sont régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH).
Une séquence d'ADN en usage dans la présente invention, peut coder pour un IFN humain de type u, p ou y. Il peut s'agir des séquences divulguées dans l'art antérieur et notamment dans Shaw et al. (1983, Nucleic Acid Res., 11, 555-573) pour l'IFNα, Higashi et al. (1983, J. Biol. Chem., 258, 9522-9529) pour l'TFNβ et Gray et al. (1982, Nature, 295, 503-508) pour l'IFNγ. Ces séquences peuvent être isolées du gène ou de l'ADNc. Par séquence codant pour un IFN humain, on entend également désigner une séquence codant pour un analogue d'un IFN. Par "analogue", on entend une molécule qui aurait une séquence en acides aminés légèrement différente d'un IFN natif mais qui conserverait l'essentiel de la fonction antivirale. En pratique, un tel analogue peut être obtenu par délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés de la protéine native ou d'un fragment de celle-ci. L'homme du métier connaît les techniques qui permettent d'effectuer ces modifications sans abolir la fonction biologique de la protéine.
Les éléments assurant l'expression d'une séquence d'ADN en usage dans le cadre de la présente invention, sont les éléments conventionnels permettant la transcription de la séquence d'ADN en ARNm et la traduction de ce dernier en protéine, comme par exemple un promoteur et les codons d'initiation et de terminaison de la traduction. En outre, une cassette selon l'invention comprend des séquences régulables par le virus VIH.
D'une manière générale, on choisit un promoteur fonctionnel dans une cellule de mammifère et, de préférence, dans une cellule humaine. Il peut être issu d'un gène eucaryote quelconque ou d'un génome viral et être de nature ubiquitaire ou régulable, notamment en réponse à certains signaux cellulaires tissu-spécifiques ou événement-spécifiques. Le choix du promoteur est très large et à la portée de l'homme de l'art. Cependant, on aura avantageusement recours au promoteur des gènes murins PGK (PhosphoGlycérate kinase) et β-actine ou au promoteur SV40 (Simian Virus 40). Selon un mode particulièrement préféré, les séquences régulables par le VIH sont constituées d'une séquence de type TAR et/ou RRE/CRS. Une séquence de type TAR interagit avec la protéine TAT pour activer l'expression des gènes sous son contrôle. De son côté, une séquence de type RRE/CRS interagit avec la protéine REV pour favoriser le transport des ARNm dans le cytoplasme. On indique qu'elle contient naturellement un site accepteur d'epissage. Conformément aux buts poursuivis par la présente invention, ces séquences peuvent être légèrement différentes des séquences TAR et RRE/CRS natives (telle que publiées par Wain-Hobson et al., 1985, Cell, 40, 9-17), à condition toutefois d'être capables d'interagir avec les protéines TAT et REV virales.
S'agissant d'une séquence de type TAR, celle-ci est insérée en 3' du promoteur et, de manière tout à fait préférée, en position +1 (+1 étant le site d'initiation de la transcription). Dans ce contexte, il peut être avantageux d'avoir recours au LTR 5' du VIH qui comprend naturellement un promoteur fonctionnel dans les cellules de mammifère suivi de la séquence TAR (en position +1 à +80). On peut également mettre en oeuvre une portion de celui-ci, qui comprend les séquences promotrices minimales (séquences Spl, CAAT box et TATA box) et la séquence TAR. On désigne sous le nom de mini LTR un fragment de 200 pb correspondant à l'extrémité 3' du LTR et s'étendant des positions -120 à +80 du génome viral.
Selon une autre approche, une cassette selon l'invention comprend un promoteur conventionnel et une séquence de type RRE/CRS capable d'interagir avec la protéine virale REV du VIH. Ainsi, dans une cellule non infectée, les ARNm seront bloqués dans le noyau sous l'action de CRS. Par contre, dès l'infection virale et la synthèse de REV, ils seront transportés dans le cytoplasme où ils seront traduits en IFN. De manière préférée, la séquence RRE/CRS est introduite en 3' de la séquence d'ADN codant pour un IFN. Selon une autre variante, on peut soumettre l'expression d'une séquence d'ADN en usage dans la présente invention, à une double régulation par TAT et REV, ce qui permet de contourner les problèmes d'échappement de l'expression observés couramment avec certains promoteurs. Dans ce cas, une cassette d'expression selon l'invention, peut comprendre une séquence de type TAR et une séquence de type RRE/CRS; de sorte qu'en cas d'échappement de l'expression, les quelques ARNm produits resteront bloqués dans le noyau. Seule la pénétration du VIH et la synthèse des protéines virales TAT et REV pourront déclencher la synthèse d'IFN. Par ailleurs une cassette d'expression selon l'invention peut, en outre, contenir d'autres éléments contribuant à l'expression de la séquence d'ADN codant pour IFN, notamment, un intron, des signaux d'epissage adéquates et des éléments de terminaison de la transcription (signal de polyadénylation). Le choix et la localisation de ces éléments est à la portée de l'homme du métier.
A titre d'exemples préférés, on peut citer une cassette comprenant de 5' vers 3' :
( 1) Le LTR 5' du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadénylation de SV40 ; (2) Le mini LTR du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadénylation de SV40 ; (3) Le promoteur PGK, la séquence TAR, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadénylation de SV40 ;
(4) Le promoteur β-actine, la séquence TAR, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadénylation de SV40 ;
(5) Le promoteur SV40, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40 ;
(6) Le LTR 5' du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40 ;
(7) Le mini LTR du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40 ; et. (8) Le mini LTR du VIH, un site donneur d'epissage (du gène gag du VIH), une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV 40.
L'invention s'étend également aux vecteurs comprenant une cassette d'expression selon l'invention. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme de l'art, ainsi que les méthodes pour les construire et les propager. On aura avantageusement recours à des vecteurs viraux dérivés des rétrovirus, virus de l'herpès, adénovirus ou virus associés à l'adénovirus. Bien entendu on peut également employer des vecteurs synthétiques. Dans le cadre de l'invention, les vecteurs défectifs pour la réplication, et notamment les vecteurs rétroviraux, sont particulièrement préférés. Selon un mode de réalisation avantageux, une cassette selon l'invention est positionnée en orientation réverse par rapport aux LTRs du vecteur rétroviral, afin de positionner les promoteurs en sens inverse pour éviter les interférences. Bien entendu, un vecteur selon l'invention peut, en outre, comprendre un gène codant pour un marqueur de sélection, comme par exemple, les gènes néomycine et puromycine acétyl transférase conférant une résistance aux antibiotiques G418 et puromycine. L'invention couvre également les virus et particules de vecteur viral obtenus par transfection du vecteur selon l'invention, dans une lignée cellulaire d'encapsidation, notamment amphotrope, produisant les protéines structurales du virus en cause
L'invention a également trait à une cellule eucaryote comprenant, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Ces derniers peuvent être introduits soit in vitro dans une cellule prélevée du patient soit directement in vivo. La cellule est avantageusement une cellule humaine et, de manière préférée, une cellule de la lignée hématopoïétique (cellules souches ou lymphocytes primaires).
L'invention concerne également l'usage thérapeutique d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des infections virales et, en particulier, des infections dues au VIH.
L'invention s'adresse également à une composition pharmaceutique comprenant à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique une cassette d'expression, un vecteur ou une cellule selon l'invention, en association avec un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle. En particulier, on associe une quantité therapeutiquement efficace d'un tel agent thérapeutique ou prophylactique à un support, un diluant ou un adjuvant acceptable. Elle peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine de l'art. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée après un certain délai d'intervalle. La quantité à administrer sera choisie en fonction de différents critères, en particulier la voie d'administration, le patient, l'état d'évolution de la maladie et la durée du traitement A titre indicatif, une composition pharmaceutique selon l'invention contient de 103 à 1014 ufp (unité formant des plages), avantageusement de 105 à 1013 ufp, de préférence de 106 à 1012 ufp et, de manière tout à fait préférée, de 107 à 1010 ufp de particules de vecteur viral.
Par ailleurs, l'invention concerne une méthode de traitement des infections virales et, notamment à VIH, selon laquelle on administre une quantité therapeutiquement efficace, d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement. Selon un premier protocole thérapeutique, on peut les administrer directement in vivo, par exemple par voie intraveineuse. On préférera adopter un protocole de thérapie génique somatique qui consiste à prélever des cellules souches de moelle osseuse ou des lymphocytes du sang périphérique d'un patient, de les transfecter avec un vecteur selon l'invention, de les cultiver in vitro selon les techniques de l'art et de les administrer au patient. A titre indicatif, il peut être avantageux d'employer 106 à 1010 cellules par kg, de préférence 107 à 109 et, de manière préférée 5 × 107 à 5 × 108. Naturellement, ce protocole peut être sujet à de nombreuses variantes. En particulier, il peut être avantageux de combiner au moins deux cassettes, vecteurs ou cellules selon l'invention permettant l'expression d'un IFN de types différents, par exemple un IFNα et un IFNβ. L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes.
La figure 1 schématise le vecteur pTG4313 permettant l'expression d'une séquence d'ADN codant pour l'IFNα sous le contrôle du LTR du VIH. La figure 2 représente le vecteur pTG4344 co-exprimant le gène IFNα et le gène de sélection puromycine.
La figure 3 schématise le vecteur rétroviral pTG4379 pour le transfert d'un gène IFN et son expression inductible par TAT.
La figure 4 montre l'évolution de l'infection dans des cellules U937 infectées par le VIH III B et transfectées par les vecteurs d'expression de l'IFNα (□), β (♦) et γ (◊), comparée au témoin cellules non transfectées (■). La figure 5 illustre le vecteur rétroviral pTG6324 comprenant les cassettes d'expression de l'IFNα (sous le contrôle du mini LTR du VIH) et du gène de sélection néo (sous le contrôle du LTR 5' rétroviral). La figure 6 illustre l'évolution de l'infection dans des PBL humains CD8- transduits par le vecteur pTG6327 (Δ) puis infectés par le virus VIH III B, comparée aux cellules non transduites (♦).
EXEMPLES
Toutes les opérations de clonage détaillées ci-après, sont effectuées selon les techniques classiques de biologie moléculaire (Maniatis et al., 1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Ces étapes sont réalisées dans la souche Escherichia coli (E. coli) 5K, XL1-Blue ou 1 106.
Les gènes humains codant pour les IFNs α et β ont été clones par PCR (Polymerase Chain Reaction) à partir de l'ADN génomique de cellules lymphoïdes, par exemple de cellules CEM-A3 (dérivées d'une lignée CEM disponible à l'ATCC sous le numéro CCLl 19). De telles banques sont disponibles dans le commerce. L'amplification de fragments d'ADN par PCR peut être effectuée à l'aide de kits commerciaux selon les spécifications du fabricant ou selon la technologie décrite dans PCR Protocols-A (edited by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Académie Press Inc) à l'aide d'amorces complémentaires aux séquences publiées. Le gène humain codant pour l'IFNγ est obtenu du pTG1 1 décrit dans la demande de brevet français publiée sous le numéro 2.583.429. Des sites de restriction appropriés ont été introduits en amont et en aval de l'ATG initiateur et du codon stop des différents gènes IFN afin de pouvoir faciliter les étapes de clonage ultérieures. D'autre part, les sites de restriction protubérants en 5' peuvent être convertis en sites francs par traitement par le grand fragment Klenow de l'ADN polymerase d'E. coli alors que les sites protubérants en 3' sont traités par la T4 polymérase.
EXEMPLE 1 : Construction de vecteurs d'expression de l'interféron inductibles par la protéine TAT du VIH et dans lesquels le gène de sélection est constitué par le gène puromycine.
A. Vecteurs non viraux d'expression de l'IFN sous le contrôle du promoteur du VIH.
On décrit la construction de vecteurs dans lesquels l'expression des gènes IFNα, β, et γ est placée sous le contrôle du LTR 5' du VIH. Ces vecteurs ont été construits à partir du vecteur pTG1322 décrit dans Mehtali (1992, AIDS and Human Retroviruses, 8, 1959-1965) comprenant un gène hétérologue placé sous le contrôle du LTR 5' du VIH (fragment XhoI-HindIII de 725 pb correspondant aux positions -645 à +80 du génome VIH). Ce vecteur porte également l'intron et le signal de polyadénylation du virus SV40. Il est digéré par HindIII traité à la Klenow puis digéré par SmaI.
On introduit dans pTG1322 ainsi traité, le gène IFNα sous forme d'un fragment délimité par les sites SmaI et EcoRI traité à la Klenow et on génère pTG4313 (Figure 1). pTG4314 est obtenu par insertion du fragment SmaI-EcoRV portant le gène IFNβ dans pTG1322 obtenu comme précédemment. On génère pTG4315 par insertion du gène ΕFNγ sous forme d'un fragment HpaI-PvuII entre les mêmes sites de pTG 1322.
On introduit dans le site EcoRI de ces différents vecteurs d'expression d'un IFN, un gène de sélection conférant la résistance à la puromycine (puromycine R) sous forme d'un fragment de 1 ,2 kb BamHI-BglII traité à la Klenow. Ce fragment comporte le promoteur précoce du virus SV40, le gène puromycine R et le signal de polyadénylation de SV40. On obtient les vecteurs pTG4344 (représenté à la Figure 2), pTG4345 et pTG4346, qui permettent la co-expression du gène de sélection puromycine R et respectivement du gène IFNα, β ou γ.
B. Vecteur rétroviral pour le transfert et l'expression des gènes IFN.
Le vecteur à la base des constructions est le pLXSP qui dérive de pLXSN (Miller et Rossman, 1989, Biotechniques, 7, 980-988) après remplacement du gène de sélection néomycine par le gène puromycine R et du LTR 3' de MSV (Myelo Sarcoma Virus) par le LTR 3' du MPSV (Myelo Proliferative Sarcoma Virus).
On isole du génome du VIH un fragment ScaI-HindIII de 200 pb correspondant au mini LTR (position -120 à +80), qui est ensuite introduit en amont de chacun des gènes IFNs. Puis on introduit en 3' des gènes, le signal de polyadénylation du SV40. Le vecteur ainsi obtenu est digéré par BglII, traité à la Klenow. Le fragment comportant la cassette d'expression "mini LTR - IFN - signal de polyadénylation" est introduit entre les sites HpaI-BglII du vecteur rétroviral pTG4056. On sélectionne les clones dans lesquels ce fragment est positionné en orientation réverse par rapport aux LTRs 5' et 3'. pTG4056 provient du pLXSP à la suite de la délétion du bloc d'expression promoteur SV40-puromycine R et la réinsertion du gène puromycine R dans l'orientation correcte pour être placé sous le contrôle du LTR 5'.
On obtient les vecteurs rétroviraux pTG4392, pTG4391 et pTG4379 (Figure 3) permettant le transfert et l'expression des séquences codant respectivement pour les IFNs α, β et γ. Ils peuvent être transfectés dans une lignée cellulaire d'encapsidation amphotrope, par exemple la lignée PA317 (Miller et al., 1986, Mol. Cell., Biol. 6, 2895-2902), Gp Env. Am (Markowitz et al., 1988, Virology, 167, 400-406) ou PG13 (Miller et al., 1991, J. Virol, 65, 2220-2224). Le jour suivant, les cellules transfectées sont placées en milieu sélectif (puromycine 6 μg/ml). On isole les cellules résistantes qui constitueront des lignées productrices de particules amphotropes capables d'infecter les cellules humaines, à partir desquelles on peut constituer un stock viral susceptible d'être utilisé en thérapie génique anti SIDA.
C. Vecteurs régulables par TA T dans lesquels l'expression de l'IFN est dirigée par un promoteur eucaryote.
1. Promoteur PGK murin.
La séquence TAR (correspondant aux nucléotides +1 à +80 du génome du VIH) est générée par synthèse chimique. Puis, l'oligonucléotide double brin ainsi obtenu est introduit par mutagénèse insertionnelle en position +1 du promoteur PGK murin, dont la séquence est publiée dans Adra et al. ( 1987, Gène, 60, 65-74). On insère en aval de la séquence TAR, le fragment comportant la séquence codant pour l'IFN humain α, β ou γ suivie du signal de polyadénylation de SV40.
Enfin, la cassette d'expression "promoteur PGK-TAR-IFN-polyA" est introduite dans le vecteur rétroviral pLXSP. Bien entendu à chaque séquence IFNα, β ou γ correspond un vecteur rétroviral. Comme précédemment, on établit une lignée d'encapsidation amphotrope productrice de chaque type de particules virales.
2. Promoteur β-actine murin.
L'exemple précédent est reproduit avec la variante suivante : La séquence synthétique TAR est introduite en position +1 du promoteur β-actine de rat dont la séquence est décrite dans Nudel et al., (1983, Nucleic Acids Res., 11, 1759-1771 )
EXEMPLE 2 : Construction de vecteurs d'expression d'un IFN humain inductibles par la protéine TAT du VIH et dans lesquels le gène de sélection est constitué par le gène néomycine et établissement de lignées amphotropes correspondantes.
A. Construction du pTG6324 pour l'expression de l'IFN α.
En premier lieu, le mini LTR du VIH est isolé du génome viral après digestion ScaI - HindIII, inséré dans un plasmide quelconque pour être resorti sous forme d'un fragment SmaI-HindIII puis clone entre les mêmes sites du vecteur pTG2359. Ce dernier correspond au clonage du site de polyadénylation du virus SV40 dans le plasmide p Bluescript KS (Stratagene). On obtient pTG4347 dans lequel on introduit, après digestion par BalI, un fragment SmaI-HpaI portant les séquences codant pour l'IFNα
Enfin, la cassette d'expression "mini LTR-IFNα-polyA SV40" est purifiée du vecteur pTG4355 obtenu à l'étape précédente sous forme d'un fragment BamHl-BglII, qui est clone dans le site BamHl. de pTG6320 pour donner pTG6324 (Figure 5). Ce dernier comprend donc le LTR du MSV dirigeant l'expression du gène de sélection néo, suivi de la cassette "mini LTR - IFNα - polyA SV40" positionnée en orientation réverse afin d'éviter les phénomènes d'interférence entre les promoteurs et enfin le LTR 3' rétroviral du MPSV. A titre indicatif, pTG6320 provient du pLXSP à la suite de la dététion de la cassette d'expression du gène puromycine et remplacement par le gène néomycine (Colbère - Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol., 150, 1 - 14).
B. Construction du pTG6328 pour l'expression de l'IFNγ.
La stratégie de clonage est tout à fait similaire à ce qui est décrit ci-dessus. Le vecteur pTG631 1 provient de l'insertion d'un fragment SmaI-HpaI portant la séquence codant pour l'IFNγ dans le site BalI du pTG4347. Puis, on obtient le vecteur rétroviral pTG6328 en clonant le fragment BamHI.-BglII purifié du pTG631 1 dans le vecteur pTG6320 préalablement digéré par BamHI. Celui-ci est l'équivalent de pTG6324 à la différence qu'il porte le gène IFNγ à la place du gène IFNα.
C. Construction du vecteur rétroviral pTG6327 pour l'expression de I'IFNβ.
Le fragment SmaI-HindIII portant le mini LTR VIH est inséré entre les mêmes sites de pTG4356, pour générer pTG6312. Le vecteur pTG4356 correspond au vecteur pTG2359 dans lequel on a clone (site BalI) le gène IFN β (fragment SmaI-EcoRV). Comme précédemment, la cassette d'expression de lTFNβ est purifiée de pTG6312 après digestion par BamHI et BglIl puis sous-clonée dans le site BamHI de pTG6320 pour donner pTG6327. D. Etablissement de lignées amphotropes pour la production de particules virales infectieuses
On peut préparer des stocks de particules virales infectieuses à partir de chacun des vecteurs précédents pTG6324, pTG6327 et pTG6328. Pour ce faire, ces derniers sont transfectés de manière classique dans une lignée d'encapsidation ecotrope, par exemple la lignée GP + E 86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1 120-1 124). 48 h après la transfection, les cellules sont cultivées en milieu sélectif (G418 1 mg/ml).
Le mélange de clones résistants au G418 est maintenu pendant 3 jours supplémentaires en milieu sélectif. Le surnageant de culture est récolté pour infecter de façon conventionnelle, une lignée d'encapsidation amphotrope comme la lignée PA3 17. Après sélection, les lignées ainsi obtenues constitueront les cellules productrices de particules virales infectieuses permettant le transfert et l'expression des différents IFNs dans le cadre d'une thérapie génique humaine.
Leur capacité à produire un IFN actif peut être évaluée dans les surnageants de culture par la méthode décrite dans The Interferon System (W.E. Stewart, 1979, Ed : Springer-Verlag Wien, New York). Ce test de fonctionnalité, lorsqu'il est effectué sur les cellules générées à l'étape précédente, donne un niveau faible d'IFN dans les trois cas. Par contre, lorsque les cellules sont transfectées de manière transitoire par le plasmide pHMG-TAT, le niveau mesuré est élevé et atteint quelques centaines d'unité par ml. pHMG-TAT est un vecteur d'expression de la protéine TAT native et résulte du clonage de la séquence codant pour celleci dans le vecteur pHMG (Mehtali et al., 1990, Gène, 91, 179-184).
Par ailleurs, il peut être intéressant d'isoler des clones producteurs. Ceci est réalisé classiquement par la technique de dilution clonale (0,3 cellule par puit). On sélectionne un clone bon producteur de virions titrant 5× 10 à 10 ufp/ml après infection des cellules murines NIH-3T3 (ATCC CRL 1658) par une aliquote de surnageant de culture du clone. On vérifie sa capacité à produire de l'IFN comme indiqué précédemment. On effectue à nouveau une dilution clonale à partir des clones précédents afin de générer des sous-clones. On sélectionne pour chacun d'entre eux un sous clone bon producteur de virions et d'IFN après titration et dosage de l'IFN.
Les sous-clones sont congelés avant utilisation dans un but de thérapie génique. EXEMPLE 3 : Construction de vecteurs d'expression d'un IFN humain inductibles par la protéine REV du VIH.
On décrit un vecteur rétroviral par insertion dans le vecteur pLXSP et dans l'orientation réverse par rapport aux LTRs, d'une cassette d'expression comprenant de 5' vers 3' : - le promoteur du virus SV40 ;
- la séquence d'ADN codant pour l'IFN humain α, β ou γ ;
- la séquence RRE/CRS. Cette dernière est isolée du génome du VIH-1 isolat Lai sous forme d'un fragment BglII-BamHI (s'étendant des nucléotides 7178 à 8032 de la séquence telle que publiée par Wain- Hobson et al., supra). Ce fragment peut être traité par la Klenow avant d'être introduit dans un site de restriction adéquat ; et
- le signal de polyadénylation de SV40.
Comme précédemment, on peut constituer des stocks viraux après transfection dans une lignée d'encapsidation amphotrope. EXEMPLE 4 : Construction de vecteurs d'expression d'un IFN humain inductibles par les protéines TAT et REV du VIH.
On insère dans les vecteurs pTG4392, pTG4391 et pTG4379 le fragment BamHI-BglII traité à la Klenow et porteur de la séquence RRE/CRS du VIH entre la séquence codant pour un des IFNs et le signal de polyadénylation de SV40.
De plus, les vecteurs ainsi obtenus peuvent être modifiés par l'insertion d'un site donneur d'epissage entre le LTR du VIH et le gène IFN. Comme précédemment, on peut générer une lignée amphotrope productrice de particules infectieuses correspondant à chacun des vecteurs ainsi obtenus.
EXEMPLE 5 : Résistance à l'infection virale des lignées cellulaires transfectées par les vecteurs d'expression de l'IFN inductibles par TAT. Les expérimentations ci-après décrites sont effectuées dans des lignées cellulaires naturellement infectables par le VIH, comme : - la lignée U937 (ATCC CRL 1593) dérivée de monocytes humains ; et - la lignée CEM-A3 dérivée de cellules lymphocytaires humaines CD4+ (ATCC CCL1 19) . En pratique, les cellules sont cultivées selon les recommandations du fournisseur et transfectées par électroporation d'au moins 20 μg d'ADN à l'aide d'un appareillage approprié (Gène Puiser Biorad, voltage 210V, capacitance 960μF).
Dans une première expérience, on co-électropore dans les cellules U937 (2×107 cellules) le pTG4314 avec le vecteur pLXSP dans un rapport de concentration en ADN 20: 1. Les cellules sont remises en culture à 37°C en présence de 5 % de CO2 et le jour suivant, placées en milieu sélectif (puromycine 0,5 μg/ml). On sélectionne les cellules résistantes à l'antibiotique. On teste leur résistance à l'infection en les infectant par une préparation de VIH à une TCID50 élevée (au moins 1000). La TCID50 est déterminée selon la méthode décrite dans Reed et al., (1938, Am. J. Hyg., 27, 493-497), sur lignées cellulaires infectables par le VIH, comme les cellules CEM. Elle correspond à la dose à laquelle 50 % des cellules sont infectées et 50 % ne le sont pas. Elle est vérifiée pour chaque lot de VIH employé.
Pour ce faire, on prélève une fraction de la culture cellulaire U937 électroporée, correspondant à environ 106 cellules, que l'on centrifuge à basse vitesse. Après lavage, le culot cellulaire est repris dans 200 μl de milieu de culture en absence de sérum. Puis les cellules sont traitées par différentes dilutions de la préparation virale. On laisse l'infection se poursuivre 1 heure à 37°C.
Les cellules sont ensuite lavées 2 fois dans du milieu de culture et mises en culture dans 5 ml du même milieu, complémenté avec 10 % de SVF (sérum de veau foetal). Le milieu est renouvelé 2 ou 3 fois par semaine. La propagation du virus est évaluée par mesure de l'activité réverse-transcriptase à intervalles réguliers dans le surnageant de culture selon la méthode décrite dans Spire et al. (1985, Lancet, i, 188- 189).
On observe une diminution significative (jusqu'à 85 %) de l'activité réverse-transcriptase sur 14 jours post-infection par rapport aux cellules U937 témoin non électroporée avec un vecteur d'expression de l'interféron.
L'expérience est répétée cette fois avec des cellules U937 initialement électroporées avec le pTG4344, pTG4345 ou pTG4346. Dans les trois cas, on observe une diminution encore supérieure de l'activité réverse-transcriptase sur 21 jours post-infection par rapport au témoin cellules non électroporées. (Figure 4).
EXEMPLE 6 : Mécanisme moléculaire de la résistance à l'infection VIH.
L'analyse est effectuée sur les cellules U937 électroporée et infectée in vitro par le VIH (exemple 5).
On recherche tout d'abord la présence du génome du VIH dans une préparation d'ADN génomique cellulaire. Ceci est réalisé par PCR à l'aide d'amorces adéquates permettant l'amplification d'un fragment du gène gag viral. La présence d'une bande d'amplification de taille attendue indique que l'expression de l'IFN n'interfère pas avec l'intégration du génome du VIH sous forme provirale dans les chromosomes cellulaires.
Il a également été possible de détecter la présence des ARNm codant pour les produits du gène gag par la technique de reverse-transcription PCR (mêmes amorces que précédemment). Ceci laisse supposer que l'expression de l'IFN n'a pas d'effet notable sur la transcription des séquences provirales.
Enfin, on évalue la présence et la localisation de la protéine virale gp120 par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps anti-gp120 (obtenu de sérum de patients séropositifs). On constate que dans les cellules exprimant l'IFN, la protéine gp120 est sous forme intracellulaire, alors qu'elle devrait être sous-membranaire, afin de permettre le bourgeonnement des particules virales. Dans leur ensemble, ces résultats indiquent que l'IFN agit au niveau des étapes tardives du cycle viral et probablement au niveau de l'assemblage des virions.
EXEMPLE 7 ; Méthode de traitement du SIDA par thérapie génique.
Dans le cadre d'une thérapie génique appliquée à l'homme, deux types de cellules cibles peuvent être envisagés : - les lymphocytes CD4+ du sang périphérique qui peuvent être collectés notamment par leucophérèse, et - les cellules souches hématopoïétiques CD34+ qui peuvent être obtenues d'un prélèvement de moëlle osseuse ou du sang périphérique (mobilisation par chimiothérapie ou par action de facteurs de croissance hématopoïétiques).
A. Protocole appliquable aux cellules CD4+
Le patient est soumis à un prélèvement de sang ou à une leucophérèse. Après avoir éliminé les globules rouges, les cellules mononuclées sont isolées par centrifugation sur Ficoll et cultivées selon les techniques de l'art. Dans un premier temps, on se débarasse des cellules adhérentes au plastique des flasques de culture. La suspension cellulaire est récupérée et cultivée dans des flasques revêties d'anticorps anti-CD8 (Immunotech) afin d'éliminer les cellules CD8+. La suspension cellulaire ainsi obtenue est composée majoritairement de lymphocytes CD4+. Bien entendu, les autres techniques d'enrichissement peuvent également être employées.
Ceux-ci sont stimulés dans le but d'induire la division cellulaire avant d'effectuer la transduction rétrovirale. Les facteurs de croissance pouvant être mis en oeuvre à cet effet sont variés. A titre indicatif, on peut citer un mélange d'anticorps anti CD3 humain (Immunotech, environ 10 ng/ml) et d'IL-2 (Cetus ; 100 U/ml) ou encore de PHA (phytohemagglutidine, Sigma, à une concentration d'environ 5 μg/ml) et d'IL-2.
Après 72 heures de culture dans ces conditions, les cellules sont transduites par le vecteur rétroviral. Différentes méthodologies sont applicables : - co-culture des cellules CD4+ et des cellules productrices amphotropes des exemples 1 à 4. - co-culture des 2 types cellulaires, les cellules CD4+ étant déposées dans les puits de culture et les cellules productrices dans un Transwell (Costar) - infection des cellules CD4+ avec une aliquote de surnageant de culture des cellules productrices selon une m.o.i. (multiplicité d'infection) de préférence comprise entre 1 et 5. Généralement la transduction est réalisée en présence de sulfate de protamine (à une concentration d'environ 5 μg/ml) pour favoriser l'attachement du virus à la surface cellulaire.
Le jour suivant, la culture cellulaire est passée en milieu sélectif (puromycine dans le cadre des vecteurs de l'exemple 1 ou G418 dans le cadre des vecteurs de l'exemple 2) et poursuivie pendant 7 à 8 jours jusqu'à obtenir le nombre de cellules appropriées. On indique qu'il peut être avantageux d'employer le milieu AIM V (Gibco BRL) complémenté par de la L-glutamine (2 mM) et de l'IL-2 (100 U/ml) et dépourvu de sérum.
La capacité de ces cellules à inhiber la réplication du VIH est testée in vitro. Elles sont infectées par le VIH-1 IIIB à une m.o.i. de 10-2 selon la méthodologie classique dans le domaine de l'art. Après lavage et remise en culture, la propagation du virus est évaluée par mesure de l'activité réverse-transcriptase dans le surnageant de culture (Figure 6). Celle-ci se situe à un niveau très bas pendant au moins 20 jours de culture. A titre comparatif, dans le cas des cellules non transduites, l'activité réverse-transcriptase augmente très fortement jusqu'à atteindre un maximum dès le troisième jour de culture et est rapidement suivie de la mort cellulaire. B. Protocole applicable aux cellules CD34+.
Les étapes de la purification des cellules CD34 sont les suivantes : - isolement des cellules mononuclées du prélèvement de sang périphérique ou de moëlle osseuse par centrifugation Ficoll, - déplétion des cellules adhérentes, et - capture des cellules CD34+ par culture dans des flasques recouvertes d'anticorps anti-CD34 (Immunotech) ou en présence de billes revêtues de cet anticorps. On élimine les cellules en suspension et on récupère les cellules adhérentes après action, par exemple, de papaïne.
Comme précédemment, les cellules CD34+ ainsi obtenues sont stimulées par divers facteurs de croissance pour les placer en cycle de division et ainsi favoriser l'infection rétrovirale. On peut utiliser à cet effet un mélange d'IL-3 (environ 10 ng/ml), d'IL-6 (à environ 50 U/ml) et de SCF (Stem cell factor, environ 50 U/ml) incorporé dans le milieu de culture pendant 48 heures avant d'effectuer la transduction selon le protocole indiqué précédemment. Ces facteurs sont disponibles commercialement. Les cellules sont ensuite réadministrées au patient.

Claims

Revendications
1. Une cassette comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour un IFN humain placée sous le contrôle des éléments capables d'assurer son expression dans une cellule de mammifère, caractérisée en ce que lesdits éléments sont régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH).
2. Une cassette selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'IFN est sélectionné parmi les IFNs humains de type α, β et γ.
3. Une cassette selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que les éléments capables d'assurer l'expression dans une cellule mammifère comprennent au moins un promoteur et une séquence de type TAR et/ou RRE/CRS.
4. Une cassette selon la revendication 3, caractérisée en ce que la séquence de type TAR est placée en 3' dudit promoteur.
5. Une cassette selon la revendication 3 ou 4, caractérisée en ce que la séquence de type RRE/CRS est placée en 3' de la séquence d'ADN codant pour un IFN humain.
6 Une cassette selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que le promoteur fonctionnel dans une cellule de mammifère est sélectionné parmi les promoteurs des gènes murins PGK et -actine, le LTR 5' du VIH et un fragment de celui ci (mini LTR).
7. Une cassette selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que les lesdits éléments comportent en outre un site donneur d'epissage.
8. Une cassette selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que lesdits éléments comprennent en outre un signal de polyadénylation.
9. Un vecteur comprenant une cassette selon l'une des revendications 1 à 8.
10. Un vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur rétroviral.
1 1. Un vecteur selon la revendication 10, caractérisé en ce que la cassette d'expression selon lune des revendications 1 à 8 est positionnée en orientation reverse par rapport aux LTRs dudit vecteur.
12. Un vecteur selon l'une des revendications 9 à 11, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un gène de sélection.
13. Un vecteur selon la revendication 12, caractérisé en ce que le gène de sélection confère la résistance à la puromycine ou la néomycine
14. Une cellule eucaryote comprenant une cassette selon l'une des revendications 1 à 8 ou un vecteur selon l'une des revendications 9 à 13.
15. Une cellule selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine de la lignée hématopoïétique.
16. Usage d'une cassette selon l'une des revendications 1 à S, d'un vecteur selon l'une des revendications 9 à 13 ou d'une cellule selon la revendication 14 ou 15, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des infections virales.
17 Usage selon la revendication 16, destiné à la prévention ou au traitement des infections dues au VIH.
18. Une composition pharmaceutique comprenant une quantité therapeutiquement efficace d'une cassette selon l'une des revendications 1 à 8, d'un vecteur selon l'une des revendications 9 à 13 ou d'une cellule selon la revendication 14 ou 15, en association avec un véhicule pharmaceuliquement acceptable.
19. Une composition pharmaceutique selon la revendication 18, caractérisée en ce qu'elle comprend de 103 à 10 4 pfu d'un vecteur selon lune des revendications 9 à 13.
20. Usage d'au moins deux cassettes selon l'une des revendications 1 à 8, vecteurs selon l'une des revendications 9 à 13 ou cellules selon la revendication 14 ou 15 exprimant chacun un IFN de type différent, pour une utilisation simultanée. séparée ou étalée dans le temps et destinée à la prévention ou au traitement des infections virales et , notamment, des infections dues au VIH.
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