CA2155568A1 - Vecteurs exprimant un interferon humain pour le traitement du sida - Google Patents
Vecteurs exprimant un interferon humain pour le traitement du sidaInfo
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Abstract
La présente invention concerne une cassette d'expression d'un gène IFN humain placé sous le contrôle d'éléments inductibles par le virus VIH. Elle couvre également un vecteur et une cellule comprenant ladite cassette ainsi que leur usage thérapeutique et une composition pharmaceutique pour le traitement ou la prévention des infections dues au VIH.
Description
2 ~ 8 ~WO 95/1678~ PCT/FR94/014S8 VECTEURS EXPRIMANT UN INTERFERON HUMAIN
POUR LE TRAITEMENT DU SIDA
La présente invention a pour objet une cassette comportant une séquence d'ADN
codant pour un IFN humain dont l'e,c~, ~ssion est placée sous le contrôle 15 d'éléments régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). La présente invention trouve une application intéressante dans le traitement ou la prévention des infections dues au VIH, notamment par thérapie génique.
Le VIH, agent étiologique du SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise), 20 infecte préférentiellement une sous-population de Iymphocytes T, (T helper) responsables de l'amplification de la réponse immunitaire. En conséquence, la maladie évolue vers un déficit de l'immunite cellulaire, ce qui rend les individus malades particulièrement sensibles aux infections opportunistes. Jusqu'à présent, aucun tr~it~ment ne s'est révélé totalement s~ticf~ic~nt malgré les multiples efforts 25 investis dans le développement de nouvelles molécules antivirales. Ces difficultés relèvent sans doute de la complexité particulière du virus VIH et de sa capacitéà réprimer les systèmes de défenses immunitaires dans les cellules infectées.
Le VIH est un rétrovirus appartenant à la famille des lentivirus. Son matériel 30 génétique, constitué d'une molécule d'ARN, est encapsidé dans une capside de nature protéique, elle-même entourée d'une enveloppe virale. Outre les gènes structuraux (gog, pol et e~v) codant respectivement pour les protéines de la capside, la réverse-transcriptase et la protéine d'enveloppe, le génome du VIH
comprend des genes régulateurs qui commandent la réplication virale. Parmi ces wo 95/16784 PCT/FRg4/01458 ~
21~5~
derniers, on peut citer les gènes tat et rev codant respectivement pour les protéines TAT et REV.
La protéine TAT a un rôle trans-activateur de l'expression de l'ensemble des gènes du VIH (Arya et al., 1985, Science, ~29, 69-73). Il semble que TAT intervient aussi bien à un niveau transcriptionnel que post-transcriptionnel. Elle interagit spécifiquement avec une courte séquence nucléotidique, désignée séquence TAR
(pour Trans-activation Responsive Region), et localisée à l'extrémité S' du génome et des transcrits viraux (position +l à +80; +I reprçsent~nt le site d'initiation de la transcription) (Rosen et al., 1985, Cell, 41, 813-823).
La protéine REV favorise le transport vers le cytoplasme des A~N messagers (ARNm) codant pour les protéines de structure, pour y être traduits. De son côté, REV reconnaît spécifiquement une séquence RRE (pour REV Responsive 1~ Element) sur les AE~Nm. Celle-ci est localisée dans le gène enV à proximité d'une autre séquence dite CRS (cis-acting Repression Sequence), impliquée dans la rétention nucléaire des AR~m la portant. On suppose que la fixation de la protéine REV au niveau de sa séquence cible RRE a pour effet de contreb~l~ncer l'effet inhibiteur de CRS sur le passage des grands ARNm viraux vers le 20 cytoplasme.
Les séquences essentielles à la transcription des gènes viraux sont localisées aux deux extrémités du génome au niveau des LTRs (Long Terminal Repeat). Alors que le LTR 5' contient les séquences promotrices ainsi que les séquences TAR, 2~ le LTR 3' comprend les séquences impliquées dans la terminaison de la transcription.
D'une manière générale, lorsqu'une cellule est infectée par un virus, elle secrète des interférons (IFNs) en réponse à l'infection virale. Il s'agit d'un groupe de30 protéines exerçant des ef~ets antiviraux et classifié en trois types a, ~ et y. S'il existe plus d'une vingtaine de sous-types d'IFN a, les IF~Ns ,B et y semblent uniques.
Paradoxalement, la synthèse des IF~Ns cellulaires (endogènes) est réprimée dans ~Wo 95/16784 21~ 5 6 ~ PCT/FRg~/01458 Ics cellules infecte~s p31' le vm Cene répression empeche les cellules infectéespar le VI~ et les cellules avoisinantes de se défendre efficacemenl contre l'in~ection viral~ (Mark, 199?, .'~IDS Res. Hun~. Retrovirus~ ~, 199-207).
On a ~ nt trouve que l'introduction dans une ~ellule d'un gène cod,mt pour un l~N humain (IFN exo~ène) dont l'expression est inductible par les protéines virales T~'l` etlou RE~, permet ~ la cellule génetiquelnent ll70difiée de se défendre dans un contexte infectieux. La presente invention a pour but de proposer différents vecteurs d'eA~r~a~,on d'JFN humain rc~ulables par les protéines TAT etlou REV du ~IH. Cette approche met à profit les caractéristiquesde réplic.~tion du ~irus Vl~ insi, en cas d'infectic)n, la synthèse des ~Ns cellulaires est inhib~e mais la synthèse des rFNs exo~enes est i~duite par le v~rus VIH lui même, reconstituant ainsi un système de défense efficace à son encontre,L'usage d'un système d'expression inductible évite les prol~lèmes de toxicité
cellulairc dans les cellules non ir fect~es.
C'est pourquoi la présente in~ention a pour objet une cassette d'expression eon~l)rellant au moins une séquence d'ADN codant pour un ~ humain, placée sous le comrôle des clcments capables d'~ssurer son e~;pression da}ls une cellule de rn~n~mif~re, caracteriscc ~n ce que lesdits cléments sont régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (~I).
Une séquence d'P,DN en usage dans la présentc invention, peut coder pour un IFN
humain de type a, p ou y. Il peut s'aOir des scquences divulguées dans l'alt 2S anterieur et nolamlllellt dans Sha w et al. (19~3, Nucleic Acid Res., Il, 555-~73) pour ~ , Hi~as}li Ct ~1. (1983, J. Biol. Chem., ~5~, 95~2-~529) pour IqFN~
et Gray et al. (19S2, Nature, ?95, ~03-50~) pour 1'IFNy. Ces séquences peuvent etre isolees du gène ou de l'ADl~c. Par séquence codant pour un IFN humain, on entend é~lem~nt dési~n~r une sequence codant pour un analo~uc d'un IFN. P~
"analo~u~", on en~end unc molecule qui aura;t une séquence en acides aminés lé~:rement différellte d'un I~N natif mais clui conserverait l'~ss~nti~l de la fonction antivirale. En prat;que, un tel analo~ue peut etre obtenu par délétion,substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acidc~ amines de la protéine native ou d'un fr2~ment de celle-ci. I.,'homme du métier connalt les techniq~les qui wo 95/16784 - PCT/FRg~/014~8 ~
permettent d'ef~ectuer ces modifications sans abolir la fonction biologique de la protéine.
Les éléments assurant l'expression d'une séquence d'ADN en usage dans le cadre de la présente invention, sont les éléments conventionnels permettant la transcription de la séquence d'ADN en ARNm et la traduction de ce dernier en protéine, comme par exemple un promoteur et les codons d'initiation et de terminaison de la traduction. En outre, une c~csette selon l'invention comprend des sequences régulables par le virus VIH.
D'une manière générale, on choisit un promoteur fonctionnel dans une cellule de ma,.,.l~irè,e et, de yl~:rélence~ dans une cellule humaine. Il peut être issu d'un gène eucaryote quelconque ou d'un génome viral et être de nature ubiquitaire ou régulable, notamment en réponse à certains signaux cellulaires tissu-spécifiquesou événement-spécifiques. Le choix du promoteur est très large et à la portée del'homme de l'art. Cependant, on aura avantageusement recours au promoteur des gènes murins PGK (PhosphoGlycérate kinase) et ,B-actine ou au promoteur SV40 (Simian Virus 40).
20 Selon un mode particulièrement préféré, les séquences régulables par le VIH sont constituées d'une séquence de type TAR et/ou RRE/CRS. Une séquence de type TAR interagit avec la protéine TAT pour activer l'expression des gènes sous son contrôle. De son côté, une séquence de type RRE/CRS interagit avec la protéine REV pour favoriser le transport des ARNm dans le cytoplasme. On indique qu'elle 2~ contient naturellement un site accepteur d'épissage. Conformement aux buts poursuivis par la présente invention, ces séquences peuvent être légèrement différentes des séquences TAR et RRE/CRS natives (telle que publiées par Wain-Hobson et al., 1985, Cell, ~0, 9-17), à condition toutefois d'être capables d'interagir avec les protéines TAT et REV virales.
S'agissant d'une séquence de type TAR, celle-ci est insérée en 3' du promoteur et, de manière tout à fait préférée, en position +l (+I étant le site d'initiation de la transcription). Dans ce contexte, il peut être avantageux d'avoir recours au LTR5' du VlH qui comprend naturellement un promoteur fonctionnel dans les cellules ~ WO 95/16784 2 i 5 ~ PCT/FR94/01458 -de mammifere suivi de la séquence TAR (en position +1 à +80). On peut egalement mettre en oeuvre une portion de celui-ci, qui comprend les séquences promotrices minimales (séquences Sp l, CAAT box et TATA box) et la séquence TAR. On désigne sous le nom de mini LTR un fragment de 200 pb correspondant ., ~ à l'extrémité 3' du LTR et s'étendant des positions -120 à +80 du génome viral.
Selon une autre approche, une cassette selon l'invention comprend un promoteur conventionnel et une séquence de type RRE/CRS capable d'interagir avec la protéine virale REV du VIH. Ainsi, dans une cellule non infectée, les ARNm lo seront bloqués dans le noyau sous l'action de CRS. Par contre, dès l'infection virale et la synthèse de REV, ils seront transportés dans le cytoplasme où ils seront traduits en IFN. De manière préférée, la séquence RRE/CRS est introduite en 3' de la séquence d'ADN codant pour un IFN.
1~ Selon une autre variante, on peut soumettre l'expression d'une séquence d'ADNen usage dans la présente invention, à une double régulation par TAT et REV, ce qui permet de contourner les problèmes d'échappement de l'expression observés couramment avec certains promoteurs. Dans ce cas, une cassette d'expression selon l'invention, peut comprendre une séquence de type TAR et une séquence de 20 type RRE/CRS; de sorte qu'en cas d'échappement de l'expression, les quelques ARNm produits resteront bloqués dans le noyau. Seule la pénétration du VIH et la synthèse des protéines virales TAT et REV pourront déclencher la synthèse d'IFN.
2~ Par ailleurs une cassette d'expression selon l'invention peut, en outre, contenir d'autres éléments contribuant à l'expression de la séquence d'ADN codant pour IFN, notamment, un intron, des signaux d'épissage adéquates et des éléments de terminaison de la transcription (signal de polyadénylation). Le choix et la localisation de ces éléments est à la portée de l'homme du métier.
A titre d'exemples préférés, on peut citer une cassette comprenant de 5' vers 3':
( I ) Le LTR 5' du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadénylation de SV40;
WO 95116784 PCT/FR9-1/01458 ~
21~ 6~
.
(2) Le mini LTR du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadénylation de SV40;
POUR LE TRAITEMENT DU SIDA
La présente invention a pour objet une cassette comportant une séquence d'ADN
codant pour un IFN humain dont l'e,c~, ~ssion est placée sous le contrôle 15 d'éléments régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). La présente invention trouve une application intéressante dans le traitement ou la prévention des infections dues au VIH, notamment par thérapie génique.
Le VIH, agent étiologique du SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise), 20 infecte préférentiellement une sous-population de Iymphocytes T, (T helper) responsables de l'amplification de la réponse immunitaire. En conséquence, la maladie évolue vers un déficit de l'immunite cellulaire, ce qui rend les individus malades particulièrement sensibles aux infections opportunistes. Jusqu'à présent, aucun tr~it~ment ne s'est révélé totalement s~ticf~ic~nt malgré les multiples efforts 25 investis dans le développement de nouvelles molécules antivirales. Ces difficultés relèvent sans doute de la complexité particulière du virus VIH et de sa capacitéà réprimer les systèmes de défenses immunitaires dans les cellules infectées.
Le VIH est un rétrovirus appartenant à la famille des lentivirus. Son matériel 30 génétique, constitué d'une molécule d'ARN, est encapsidé dans une capside de nature protéique, elle-même entourée d'une enveloppe virale. Outre les gènes structuraux (gog, pol et e~v) codant respectivement pour les protéines de la capside, la réverse-transcriptase et la protéine d'enveloppe, le génome du VIH
comprend des genes régulateurs qui commandent la réplication virale. Parmi ces wo 95/16784 PCT/FRg4/01458 ~
21~5~
derniers, on peut citer les gènes tat et rev codant respectivement pour les protéines TAT et REV.
La protéine TAT a un rôle trans-activateur de l'expression de l'ensemble des gènes du VIH (Arya et al., 1985, Science, ~29, 69-73). Il semble que TAT intervient aussi bien à un niveau transcriptionnel que post-transcriptionnel. Elle interagit spécifiquement avec une courte séquence nucléotidique, désignée séquence TAR
(pour Trans-activation Responsive Region), et localisée à l'extrémité S' du génome et des transcrits viraux (position +l à +80; +I reprçsent~nt le site d'initiation de la transcription) (Rosen et al., 1985, Cell, 41, 813-823).
La protéine REV favorise le transport vers le cytoplasme des A~N messagers (ARNm) codant pour les protéines de structure, pour y être traduits. De son côté, REV reconnaît spécifiquement une séquence RRE (pour REV Responsive 1~ Element) sur les AE~Nm. Celle-ci est localisée dans le gène enV à proximité d'une autre séquence dite CRS (cis-acting Repression Sequence), impliquée dans la rétention nucléaire des AR~m la portant. On suppose que la fixation de la protéine REV au niveau de sa séquence cible RRE a pour effet de contreb~l~ncer l'effet inhibiteur de CRS sur le passage des grands ARNm viraux vers le 20 cytoplasme.
Les séquences essentielles à la transcription des gènes viraux sont localisées aux deux extrémités du génome au niveau des LTRs (Long Terminal Repeat). Alors que le LTR 5' contient les séquences promotrices ainsi que les séquences TAR, 2~ le LTR 3' comprend les séquences impliquées dans la terminaison de la transcription.
D'une manière générale, lorsqu'une cellule est infectée par un virus, elle secrète des interférons (IFNs) en réponse à l'infection virale. Il s'agit d'un groupe de30 protéines exerçant des ef~ets antiviraux et classifié en trois types a, ~ et y. S'il existe plus d'une vingtaine de sous-types d'IFN a, les IF~Ns ,B et y semblent uniques.
Paradoxalement, la synthèse des IF~Ns cellulaires (endogènes) est réprimée dans ~Wo 95/16784 21~ 5 6 ~ PCT/FRg~/01458 Ics cellules infecte~s p31' le vm Cene répression empeche les cellules infectéespar le VI~ et les cellules avoisinantes de se défendre efficacemenl contre l'in~ection viral~ (Mark, 199?, .'~IDS Res. Hun~. Retrovirus~ ~, 199-207).
On a ~ nt trouve que l'introduction dans une ~ellule d'un gène cod,mt pour un l~N humain (IFN exo~ène) dont l'expression est inductible par les protéines virales T~'l` etlou RE~, permet ~ la cellule génetiquelnent ll70difiée de se défendre dans un contexte infectieux. La presente invention a pour but de proposer différents vecteurs d'eA~r~a~,on d'JFN humain rc~ulables par les protéines TAT etlou REV du ~IH. Cette approche met à profit les caractéristiquesde réplic.~tion du ~irus Vl~ insi, en cas d'infectic)n, la synthèse des ~Ns cellulaires est inhib~e mais la synthèse des rFNs exo~enes est i~duite par le v~rus VIH lui même, reconstituant ainsi un système de défense efficace à son encontre,L'usage d'un système d'expression inductible évite les prol~lèmes de toxicité
cellulairc dans les cellules non ir fect~es.
C'est pourquoi la présente in~ention a pour objet une cassette d'expression eon~l)rellant au moins une séquence d'ADN codant pour un ~ humain, placée sous le comrôle des clcments capables d'~ssurer son e~;pression da}ls une cellule de rn~n~mif~re, caracteriscc ~n ce que lesdits cléments sont régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (~I).
Une séquence d'P,DN en usage dans la présentc invention, peut coder pour un IFN
humain de type a, p ou y. Il peut s'aOir des scquences divulguées dans l'alt 2S anterieur et nolamlllellt dans Sha w et al. (19~3, Nucleic Acid Res., Il, 555-~73) pour ~ , Hi~as}li Ct ~1. (1983, J. Biol. Chem., ~5~, 95~2-~529) pour IqFN~
et Gray et al. (19S2, Nature, ?95, ~03-50~) pour 1'IFNy. Ces séquences peuvent etre isolees du gène ou de l'ADl~c. Par séquence codant pour un IFN humain, on entend é~lem~nt dési~n~r une sequence codant pour un analo~uc d'un IFN. P~
"analo~u~", on en~end unc molecule qui aura;t une séquence en acides aminés lé~:rement différellte d'un I~N natif mais clui conserverait l'~ss~nti~l de la fonction antivirale. En prat;que, un tel analo~ue peut etre obtenu par délétion,substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acidc~ amines de la protéine native ou d'un fr2~ment de celle-ci. I.,'homme du métier connalt les techniq~les qui wo 95/16784 - PCT/FRg~/014~8 ~
permettent d'ef~ectuer ces modifications sans abolir la fonction biologique de la protéine.
Les éléments assurant l'expression d'une séquence d'ADN en usage dans le cadre de la présente invention, sont les éléments conventionnels permettant la transcription de la séquence d'ADN en ARNm et la traduction de ce dernier en protéine, comme par exemple un promoteur et les codons d'initiation et de terminaison de la traduction. En outre, une c~csette selon l'invention comprend des sequences régulables par le virus VIH.
D'une manière générale, on choisit un promoteur fonctionnel dans une cellule de ma,.,.l~irè,e et, de yl~:rélence~ dans une cellule humaine. Il peut être issu d'un gène eucaryote quelconque ou d'un génome viral et être de nature ubiquitaire ou régulable, notamment en réponse à certains signaux cellulaires tissu-spécifiquesou événement-spécifiques. Le choix du promoteur est très large et à la portée del'homme de l'art. Cependant, on aura avantageusement recours au promoteur des gènes murins PGK (PhosphoGlycérate kinase) et ,B-actine ou au promoteur SV40 (Simian Virus 40).
20 Selon un mode particulièrement préféré, les séquences régulables par le VIH sont constituées d'une séquence de type TAR et/ou RRE/CRS. Une séquence de type TAR interagit avec la protéine TAT pour activer l'expression des gènes sous son contrôle. De son côté, une séquence de type RRE/CRS interagit avec la protéine REV pour favoriser le transport des ARNm dans le cytoplasme. On indique qu'elle 2~ contient naturellement un site accepteur d'épissage. Conformement aux buts poursuivis par la présente invention, ces séquences peuvent être légèrement différentes des séquences TAR et RRE/CRS natives (telle que publiées par Wain-Hobson et al., 1985, Cell, ~0, 9-17), à condition toutefois d'être capables d'interagir avec les protéines TAT et REV virales.
S'agissant d'une séquence de type TAR, celle-ci est insérée en 3' du promoteur et, de manière tout à fait préférée, en position +l (+I étant le site d'initiation de la transcription). Dans ce contexte, il peut être avantageux d'avoir recours au LTR5' du VlH qui comprend naturellement un promoteur fonctionnel dans les cellules ~ WO 95/16784 2 i 5 ~ PCT/FR94/01458 -de mammifere suivi de la séquence TAR (en position +1 à +80). On peut egalement mettre en oeuvre une portion de celui-ci, qui comprend les séquences promotrices minimales (séquences Sp l, CAAT box et TATA box) et la séquence TAR. On désigne sous le nom de mini LTR un fragment de 200 pb correspondant ., ~ à l'extrémité 3' du LTR et s'étendant des positions -120 à +80 du génome viral.
Selon une autre approche, une cassette selon l'invention comprend un promoteur conventionnel et une séquence de type RRE/CRS capable d'interagir avec la protéine virale REV du VIH. Ainsi, dans une cellule non infectée, les ARNm lo seront bloqués dans le noyau sous l'action de CRS. Par contre, dès l'infection virale et la synthèse de REV, ils seront transportés dans le cytoplasme où ils seront traduits en IFN. De manière préférée, la séquence RRE/CRS est introduite en 3' de la séquence d'ADN codant pour un IFN.
1~ Selon une autre variante, on peut soumettre l'expression d'une séquence d'ADNen usage dans la présente invention, à une double régulation par TAT et REV, ce qui permet de contourner les problèmes d'échappement de l'expression observés couramment avec certains promoteurs. Dans ce cas, une cassette d'expression selon l'invention, peut comprendre une séquence de type TAR et une séquence de 20 type RRE/CRS; de sorte qu'en cas d'échappement de l'expression, les quelques ARNm produits resteront bloqués dans le noyau. Seule la pénétration du VIH et la synthèse des protéines virales TAT et REV pourront déclencher la synthèse d'IFN.
2~ Par ailleurs une cassette d'expression selon l'invention peut, en outre, contenir d'autres éléments contribuant à l'expression de la séquence d'ADN codant pour IFN, notamment, un intron, des signaux d'épissage adéquates et des éléments de terminaison de la transcription (signal de polyadénylation). Le choix et la localisation de ces éléments est à la portée de l'homme du métier.
A titre d'exemples préférés, on peut citer une cassette comprenant de 5' vers 3':
( I ) Le LTR 5' du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadénylation de SV40;
WO 95116784 PCT/FR9-1/01458 ~
21~ 6~
.
(2) Le mini LTR du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadénylation de SV40;
(3) Le promoteur PGK, la séquence TAR, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadenylation de SV40;
(4) Le promoteur ,~-actine, la séquence TAR, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadénylation de SV40;
(5) Le promoteur SV40, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40;
(6) Le LTR ~' du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40;
(7) Le mini LTR du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40; et.
20 (8) Le mini LTR du VIH, un site donneur d'épissage (du gène gag du VIH), une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV 40.
L'invention s'étend également aux vecteurs comprenant une cassette d'e~pl-es~ion25 selon l'invention. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme de l'art, ainsi que les methodes pour les construire et les propager. On aura avantageusement recours à des vecteurs viraux derivés des rétrovirus, virus de l'herpès, adénovirus ou virus associés à l'adénovirus. Bien entendu on peut également employer des vecteurs synthetiques. Dans le cadre de l'invention, les vecteurs défectifs pour la 30 réplication, et notamment les vecteurs rétroviraux, sont particulièrement préférés.
Selon un mode de réalisation avantageux, une cassette selon l'invention est positionnée en orientation réverse par rapport aux LTRs du vecteur rétroviral, afin de positionner les promoteurs en sens inverse pour éviter les interférences. Bien entendu, un vecteur selon l'invention peut, en outre, comprendre un gène codant WO 95/16784 ~ i 6 ~ PCT/FR94/01458 pour un marqueur de sélection, comme par exemple, les gènes néomycine et puromycine acétyl transfërase conférant une résistance aux antibiotiques G418 etpuromycine. L'invention couvre également les virus et particules de vecteur viral obtenus par transfection du vecteur selon l'invention, dans une lignée cellulaire s d'encapsidation, notamment amphotrope, produisant les protéines structurales du virus en cause.
L'invention a également trait à une cellule eucaryote comprenant, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Ces derniers peuvent être introduits lO soit i~ vitro dans une cellule prélevée du patient soit directement in vivo. La cellule est avantageusement une cellule humaine et, de manière préférée, une cellule de la lignée hématopoïétique (cellules souches ou lymphocytes primaires).
L'invention concerne également l'usage thérapeutique d'une cassette d'expression, s d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention, pour la fabrication d'un medicament destiné à la prévention ou au traitement des infections virales et, en particulier, des infections dues au VIH.
L'invention s'adresse é~alement à une composition pharmaceutique comprenant 20 à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique une cassette d'expression, unvecteur ou une cellule selon l'invention, en association avec un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière 2s conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace d'un tel agent thérapeutique ou prophylactique à un support, un diluantou un adjuvant acceptable. Elle peut être a~lministrée par n'importe quelle voieconventionnelle en us.age dans le domaine de l'art. L'~dminictration peut avoir lieu en dose unique ou répétée après un certain délai d'intervalle. La quantité à
30 administrer sera choisie en fonction de différents critères, en particulier la voie d'administration, le patient, I'état d'évolution de la maladie et la durée du traitement. A titre indicatif, une composition pharmaceutique selon l'invention contient de 103 à 10~ ufp (unité formant des plages), avantageusement de 105 à
1013ufp, de p~érél~nce de 106 à 10l2 ufp et, de manière tout à fait préférée, de 107 wo 95/16784 21 ~ 5 ~ ~ ~ PCT/FR9 ltO1458 ~
à 101 ufp de particules de vecteur viral.
Par ailleurs, I'invention concerne une méthode de traitement des infections virales et, notamment à V~H, selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquements e~lcace, d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement. Selon un premier protocole thérapeutique, on peut les administrer directement i~7 ~ivo, par exemple par voie intraveineuse. On préférera adopter un protocole de thérapie génique somatique qui consiste à prélever des cellules souches de moelle osseuse ou des Iymphocytes 10 du sang périphérique d'un patient, de les transfecter avec un vecteur selon l'invention, de les cultiver m vitro selon les techniques de l'art et de les ~minictrer au patient. A titre indicatif, il peut être avantageux d'employer 106 à 10I cellules par kg, de préférence 107 à 109 et, de manière préférée 5 x I07 à 5 x 1o8.
s Naturellement, ce protocole peut être sujet à de nombreuses variantes. En particulier, il peut être avantageux de combiner au moins deux cassettes, vecteurs ou cellules selon l'invention permettant l'expression d'un IFN de types différents, par exemple un IFNa et un IFN~.
20 L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes.
La figure I schematise le vecteur pTG43 13 permettant l'expression d'une séquence d'ADN codant pour l'IFNa sous le contrôle du LTR du VIH.
La figure 2 représente le vecteur pTG4344 co-exprimant le gène IFNa et le gène de sélection puromycine.
La figure 3 schématise le vecteur rétroviral pTG4379 pour le transfert d'un gèneIFN et son expression inductible par TAT.
La figure 4 montre l'évolution de l'infection dans des cellules U937 infectées par le VIH III B et transfectées par les vecteurs d'expression de l'IFNa (o), ~ (-) et y (O), comparée au témoin cellules non transfectées (~
~Wo 95/1678~ 2 ~ ~ ~ 5 ~ 8 PCT/FR94/01458 La fi~ure 5 illustre le vecteur rétroviral pTG6324 comprenant les cassettes d'expression de l'lFNa (sous le contrôle du mini LTR du VIH) et du gène de selection ~l~;o (sous le contrôle du LTR 5' rétroviral).
La figure 6 illustre l'evolution de l'infection dans des PBL humains CD8-transduits par le vecteur pTG6327 (~) puis infectés par le virus VIH III B, comparée aux cellules non transduites (-).
EXEMPLES
Toutes les opérations de clonage détaillées ci-après, sont effectuées selon les techniques classiques de biologie moléculaire (Maniatis et al., 1989, LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Ces etapes sont réalisées dans la souche l~;scherichia coli (E. coli) 5K, XLl-Blue ou 1 106.
Les genes humains codant pour les rFNs a et ,~ ont été clonés par PCR
(Polymerase Chain Reaction) à partir de l'ADN génomique de cellules Iymphoïdes, par exemple de cellules CEM-A3 (dérivées d'une lignée CEM
20 disponible à l'ATCC sous le numéro CCLI 19). De telles banques sont disponibles dans le commerce. L'amplification de fragments d'ADN par PCR peut être efl~ectuee à l'aide de kits commerciaux selon les spécifications du fabricant ouselon la technologie décrite dans PCR Protocols-A (edited by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Press Inc) à l'aide d'amorces complémentaires aux 2~ séquences publiées. Le gène humain codant pour l'IFNy est obtenu du pTGI I
décrit dans la demande de brevet français publiée sous le numéro 2.583.429. Des sites de restriction appropriés ont été introduits en amont et en aval de l'ATG
initiateur et du codon stop des différents gènes IFN afin de pouvoir faciliter les étapes de clona~ge ultérieures. D'autre part, les sites de restriction protubérants en 30 5' peuvent être convertis en sites francs par traitement par le grand fragment Klenow de l'ADN polymerase d'L;: coli alors que les sites protubérants en 3' sont traites par la T4 polymérase.
EXEMPLE 1: Construction de vecteurs d'expression de l'interféron inductibles WO 95/16784 ~ I ~ 5 ~ 6 8 PCT/FRg~/01458 ~
par la protéine TAT du VIH et dans lesquels le ~ène de sélection çst çonstitué par le gène puromvcine.
A. Vec~e1n .s ~70~7 ~i/mlx d ~expJ essio~7 cle / IFN SOIIS le contrôle dll promotezlr dz~
VIH.
On décrit la construction de vecteurs dans lesquels l'expression des gènes IFNa,~, et y est placée sous le contrôle du LTR 5' du VIH. Ces vecteurs ont été
construits à partir du vecteur pTG1322 décrit dans Mehtali (1992, AIDS and Human Retroviruses, S, 1959-1965) comprenant un gène hétérologue placé sous le controle du LTR 5' du VIH (fragment X7toI-~ 7dlII de 725 pb correspondant aux positions -645 à +80 du génome VIH). Ce vecteur porte également l'intron et le signal de polyadénylation du virus SV40. Il est digéré par Hi~ldlII traité à la Klenow puis digéré par SmaI.
On introduit dans pTG1322 ainsi traité, le gène IFNa sous forme d'un fragment délimité par les sites Sn7al et EcoRI traité à la Klenow et on génère pTG4313 (Figure 1). pTG4314 est obtenu par insertion du fragment SntaI-EcoRV portant le gène IFN,B dans pTG 1322 obtenu comme précédemment. On génère pTG4315 20 par insertion du gène ~FNy sous forme d'un fragment HpaI-PvtlII entre les mêmes sites de pTG1322.
On introduit dans le site EcoRI de ces différents vecteurs d'expression d'un IFN, un gène de sélection confërant la résistance à la puromycine (puromycine R) sous2~ forme d'un fragment de 1,2 kb Ban7HI-Bgl~I traité à la Klenow. Ce fragment comporte le promoteur precoce du virus SV40, le gène puromycine R et le signal de polyadénylation de SV40. On obtient les vecteurs pTG4344 (représenté à la Figure 2), pTG4345 et pTG4346, qui permettent la co-expression du gène de sélection puromycine R et respectivement du gène IFNc~, ~ ou y.
B. Vec~eto rétroviralpo1tr le tra~7sfert et l'expressio~l des gè~?es IFN.
Le vecteur à la base des constructions est le pLXSP qui dérive de pLXSN (Miller et Rossman, 1989, Biotechniques, 7, 980-988) après remplacement du gène de WO 95/16784 ~ PCT/FR94/01458 sélection néomycine par le gène puromycine R et du LTR 3' de MSV (Myelo Sarcoma Virus) par le LTR 3' du MPSV (Myelo Proliferative Sarcoma Virus).
On isole du génome du VIH un fragment ScaI-~Ii )clIII de 200 pb correspondant au mini LTR (position - 120 à +80), qui est ensuite introduit en amont de chacundes gènes IFNs. Puis on introduit en 3' des gènes, le signal de polyadénylation du SV40. Le vecteur ainsi obtenu est digéré par Bgf~I, traité à la Klenow. Le fragment comportant la cassette d'expression "mini LTR - IFN - signal de polyadénylation" est introduit entre les sites HpaI-BgllI du vecteur rétroviral lo pTG4056. On selectionne les clones dans lesquels ce fragment est positionné en orientation réverse par rapport aux LTRs 5' et 3'. pTG4056 provient du pLXSP à
la suite de la délétion du bloc d'expression promoteur SV40-puromycine R et la réinsertion du gène puromycine R dans l'orientation correcte pour être placé sous le contrôle du LTR 5'.
1~
On obtient les vecteurs rétroviraux pTG4392, pTG4391 et pTG4~79 (Figure 3) permettant le transfert et l'expression des séquences codant respectivement pourles IFNs a, ,~ et y. Ils peuvent être transfectés dans une lignée cellulaire d'encapsidation amphotrope, par exemple la lignée PA317 (Miller et al., 1986, Mol. Cell., Biol. 6, 2895-2902), Gp Env. Am (Markowitz et al., 1988, Virology, 167, 400-406) ou PG13 (Miller et al., 1991, J. Virol, 6~, 2220-2224). Le jour suivant, les cellules transfectées sont placees en milieu sélectif (puromycine 6~lg/ml). On isole les cellules résistantes qui constitueront des lignées productrices de particules amphotropes capables d'infecter les cellules humaines, à partir 2~ desquelles on peut constituer un stock viral susceptible d'être utilisé en thérapie génique anti SIDA.
C. Vectem s r églllable.s pa~ TA T da~ls lesq1/els l'expre.ssio~l de l 'IrN es~ dirigée pa~ ?1~7 p~ on70tel/r ellca~yote.
I . Promoteur PGK murin.
La sequence TAR (correspondant aux nucléotides + I à +80 du génome du VIH) est générée par synthèse chimique. Puis, I'oligonucléotide double brin ainsi obtenu wo 95/16784 PCT/FRg4/014~8 ~
~ ~5~68 12-est introduit par mutagénèse insertionnelle en position +1 du promoteur PGK
murin, dont la séquence est publiee dans Adra et al. (1987, Gene, 60, 65-74). Oninsère en aval de la séquence TAR, le fragment comportant la séquence codant pour l'IFN humain a, ~ ou y suivie du signal de polyadénylation de SV40.
Enfin, la cassette d'expression "promoteur PGK-TAR-IFN-polyA" est introduite dans le vecteur rétroviral pLXSP. Bien entendu à chaque séquence IFNa, ~ ou y correspond un vecteur rétroviral. Comme précédemment, on établit une lignée d'encapsidation amphotrope productrice de chaque type de particules virales.
2. Promoteur ~-actine murin.
L'exemple précédent est reproduit avec la variante suivante:
l s La sequence synthétique TAR est introduite en position +l du promoteur ~-actine de rat dont la séquence est décrite dans Nudel et al., (1983, Nucleic Acids Res., ll, 1759-1771) EXEMPLE 2: Construction de vecteurs d'expression d'un IFN humain 20 inductibles par la protéine TAT du VIH et dans lesquels le ~ène de sélection est constitué par le ~ène néomycine et établissement de li~nées amphotropes correspondantes.
A. C0~7.5~tllCtiO~I ~,JI( pTG632~ polm l'exp~essio~7 de l'IFNa.
2~
En premier lieu, le mini LTR du VIH est isolé du génome viral après digestion ScaI - Hil~dIII, inséré dans un plasmide quelconque pour être resorti sous formed'un fragment Smc7I-Hi~7dIII puis cloné entre les mêmes sites du vecteur pTG2359.
Ce dernier correspond au clonage du site de polyadénylation du virus SV40 dans 30 le plasmide p Biuescript KS (Stratagène). On obtient pTG4347 dans lequel on introduit, après digestion par BnlI, un fragment SmoI-HpaI portant les séquencescodant pour l'IFNa.
Enfin, la cassette d'expression "mini LTR-IFNa-polyA SV40" est purifiée du WO 95116784 ~ 1 5 S ~ ~ 8 PCT/~R94/014~8 vecteur pTG4355 obtenu a l'étape précédente sous forme d'un fragment BamHI-Bg/II, qui est cloné dans le site BamH~ de pTG6320 pour donner pTG6324 (Figure S). Ce dernier comprend donc le LTR du MSV dirigeant l'expression du gène de selection ~7~;0 suivi de la cassette "mini LTR - IFNa - polyA SV40" positionnée en orientation réverse afin d'éviter les phénomènes d'interférence entre les promoteurs et enfin le LTR 3' rétroviral du MPSV. A titre indicatif, pTG6320 provient du pLXSP à la suite de la dététion de la cassette d'expression du gène puromycine et remplacement par le gène néomycine (Colbère - Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol., l~n, 1-14).
B. C0~7slr7rclio~7 ~1~ pTG63~S pOIII I expressio~ ~ I IFNy.
La stratégie de clonage est tout a fait similaire à ce qui est décrit ci-dessus. Le vecteur pTG6311 provient de l'insertion d'un fragment SmaI-HpnI portant la séquence codant pour l'IFNy dans le site Ba/I du pTG4347. Puis, on obtient le vecteur rétroviral pTG6328 en clonant le fragment Ban~HI-Bg/II purifié du pTG6311 dans le vecteur pTG6320 préalablement digéré par BamHI. Celui-ci est l'équivalent de pTG6324 à la différence qu'il porte le gène IFNy à la place du gène IFNa.
C. Co~lstrllctio~l dl~ vect~ c;trovilalpTG6327poln l'explessio~7 de lIFNp.
Le fragment .SntaI-Hi~fllI portant le mini LTR VIH est inséré entre les mêmes sites de pTG43S6, pour générer pTG6312. Le vecteur pTG4356 correspond au 2~ vecteur pTG2359 dans lequel on a cloné (site Ba/I) le gène IFN ,~ (fragment SnlaI-EcoRV). Comme précédemment, la cassette d'expression de l'IFN~ est purifiée de pTG6312 après digestion par Ban1HI et Bg/II puis sous-clonée dans lesite Bnn1HI de pTG6320 pour donner pTG6327.
30 D. ~;~abliss~n7e~ le /ig~-~;es an7phot7 opes po~lr la prodllction de parlic~lles virales infectiellse.s~
On peut preparer des stocks de particules virales infectieuses à partir de chacun des vecteurs précédents pTG6324, pTG6327 et pTG6328. Pour ce faire, ces WO 95/16784 PCT/ElR9 1/014;~8 21 ~5s~6~ 14 -derniers sont transfectés de manière classique dans une lignée d'encapsidation ecotrope, par exemple la li ~née GP + E 86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120- 1124). 48 h apres la transfection, les cellules sont cultivées en milieu sélectif (G418 I mg/ml).
-Le mélange de clones résistants au G418 est maintenu pendant 3 jourssupplémentaires en milieu sélectif. Le surnageant de culture est récolté pour infecter de façon conventionnelle, une lignée d'encapsidation amphotrope comme la lignée PA317. Après sélection, les lignées ainsi obtenues constitueront les 10 cellules productrices de particules virales infectieuses permettant le transfert et l'expression des différents IFNs dans le cadre d'une thérapie génique humaine.
Leur capacité à produire un IFN actif peut être évaluée dans les surnageants de culture par la méthode décrite dans The Interferon System (W.E. Stewart, 1979, 1~ Ed: Springer-Verlag Wien, New York). Ce test de fonctionnalité, lorsqu'il esteffectué sur les cellules générées à l'étape précédente, donne un niveau faible d'lFN dans les trois cas. Par contre, lorsque les cellules sont transfectées de manière transitoire par le plasmide pHMG-TAT, le niveau mesuré est élévé et atteint quelques centaines d'unité par ml. pHMG-TAT est un vecteur d'expression 20 de la protéine TAT native et résulte du clonage de la séquence codant pour celle-ci dans le vecteur pHMG (Mehtali et al., 1990, Gene, 91, 179-184).
Par ailleurs, il peut être intéressant d'isoler des clones producteurs. Ceci est réalisé
classiquement par la technique de dilution clonale (0,3 cellule par puit). On 2~ sélectionne un clone bon producteur de virions titrant 5x lo6 à 107 ufp/ml après infection des cellules murines NIH-3T3 (ATCC CRL 1658) par une aliquote de surnageant de culture du clone. On vérifie sa capacité à produire de l'IFN commeindiqué précédemment. On effectue à nouveau une dilution clonale à partir des clones précédents afin de générer des sous-clones. On sélectionne pour chacun 30 d'entre eux un sous clone bon producteur de virions et d'IFN après titration et dosage de l'IFN.
Les sous-clones sont congelés avant utilisation dans un but de thérapie génique.
~ WO 9~/16784 21 ~i ~ 5 613 PCT~R94/01458 EXEMPLE 3: Constmction de vecteurs d'expression d'un IFN humain inductibles par la protéine REV du VIH.
On decrit un vecteur rétroviral par insertion dans le vecteur pLXSP et dans s l'orientation réverse par rapport aux LTRs, d'une cassette d'expression comprenant de 5' vers 3' :
- le promoteur du virus SV40;
- la séquence d'ADN codant pour l'IFN humain a, ~ ou y;
- la séquence RRE/CRS. Cette dernière est isolée du génome du VIH-I
isolat Lai sous forme d'un fragment BglII-BamHI (s'étendant des nucléotides 7178 à 8032 de la séquence telle que publiée par Wain-Hobson et al., s~.~/p~n) Ce fragment peut être traité par la Klenow avant d'être introduit dans un site de restriction adéquat; et - le signal de polyadénylation de SV40.
Comme précédemment, on peut constituer des stocks viraux après transfection dans une lignée d'encapsidation amphotrope.
20 EXEMPLE 4: Construction de vecteurs d'expression d'un rFN humain inductibles par les protéines TAT et REV du VIH.
On insère dans les vecteurs pTG4392, pTG439 1 et pTG4379 le fragment BQmH1 BglII traité à la Klenow et porteur de la séquence RRE/CRS du VIH entre la 2s séquence codant pour un des IFNs et le signal de polyadénylation de SV40.
De plus, les vecteurs ainsi obtenus peuvent être modifiés par l'insertion d'un site donneur d'épissage entre le LTR du VIH et le gène IFN.
30 Comme precédemment, on peut générer une lignée amphotrope productrice de particules infectieuses correspondant à chacun des vecteurs ainsi obtenus.
EXEMPLE 5: Résistance à l'infection virale des li~nées cellulaires transfectées par les vecteurs d'expression de l'IFN inductibles par TAT.
WO 95/16784 PCT/FR94/01458 ~
2~ 8 - 16-Les expérimentations ci-après decrites sont effectuées dans des lignées cellulaires naturellement infectables par le VIH, comme:
- la lignée U937 (ATCC CRL1593) dérivée de monocytes hllm~in~; et - la lignée CEM-A3 dérivée de cellules Iymphocytaires humaines CD4+
(ATCC CCLI 19).
10 En pratique, les cellules sont cultivées selon les recommandations du fournisseur et transfectées par électroporation d'au moins 20 ,ug d'ADN à l'aide d'un appareillage approprié (Gene Pulser Biorad, voltage 21 0V, capacitance 960,uF).
Dans une première expérience, on co-électropore dans les cellules U937 (2x107 I s cellules) le pTG43 14 avec le vecteur pLXSP dans un rapport de concentration en ADN 20:1. Les cellules sont remises en culture à 37C en présence de 5 % de CO, et le jour suivant, placées en milieu sélectif (puromycine 0,5 llg/ml). On sélectionne les cellules résistantes à l'antibiotique.
20 On teste leur résistance à l'infection en les infectant par une préparation de VIH
à une TCID50 élevée (au moins 1000). La TCID50 est déterminée selon la méthode décrite dans Reed et al., (193g, Am. J. Hyg., 27, 493-497), sur lignées cellulaires infectables par le VIH, comme les cellules CEM. Elle correspond à la dose à
laquelle S0 % des cellules sont infectées et 50 % ne le sont pas. Elle est vérifiée 2s pour chaque lot de VIH employé.
Pour ce faire, on prélève une fraction de la culture cellulaire U937 électroporée, correspondant à environ 106 cellules, que l'on centrifuge à basse vitesse. Aprèslavage, le culot cellulaire est repris dans 200 ~ll de milieu de culture en absence 30 de serum. Puis les cellules sont traitées par différentes dilutions de la préparation virale. On laisse l'infection se poursuivre I heure à 37C.
Les cellules sont ensuite lavées 2 fois dans du milieu de culture et mises en culture dans 5 ml du même milieu, complémenté avec 10 % de SVF (sérum de veau 3~ foetal). Le milieu est renouvelé 2 ou 3 fois par semaine. La propagation du virus est évaluée par mesure de l'activité réverse-transcriptase à intervalles réguliers 21 5~
~ WO 95/16784 PCT/FR94/01458 - dans le surnageant de culture selon la méthode décrite dans Spire et al. (1985, Lancet, i, 188-189).
On observe une diminution significative Gusqu'à 85 %) de l'activité réverse-5 transcriptase sur 14 jours post-infection par rapport aux cellules U937 témoin non électroporée avec un vecteur d'expression de l'interféron.
L'expérience est répétée cette fois avec des cellules U93 7 initialement électroporées avec le pTG4344, pTG43~5 ou pTG4346. Dans les trois cas, on 10 observe une diminution encore supérieure de l'activité réverse-transcriptase sur 21 jours post-infection par rapport au témoin cellules non électroporées. (Figure 4).
EXElvlPLE 6: Mécanisme moléculaire de la résistance à l'infection VIH.
L'analyse est effectuee sur les cellules U937 électroporée et infectée i~7 vitro par le VIH (exemple 5).
On recherche tout d'abord la présence du génome du VIH dans une pl~pal~ion 20 d'ADN génomique cellulaire. Ceci est réalisé par PCR à l'aide d'amorces adéquates permettant l'amplif!cation d'un fragment du gène gag viral. La présence d'une bande d'amplification de taille attendue indique que l'expression de l'IFN n'interfère pas avec l'intégration du génome du VIH sous forme provirale dans les ch~omosomes cellulaires.
2s Il a également été possible de détecter la présence des ARNm codant pour les produits du gène gag par la technique de reverse-transcription PCR (mêmes amorces que précédemment). Ceci laisse supposer que l'expression de l'IFN n'a pas d'effet notable sur la transcription des séquences provirales.
Enfin, on évalue la présence et la localisation de la protéine virale gpl20 par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps anti-gpl20 (obtenu de sérum de patients séropositifs). On constate que dans les cellules exprimant l'IF~, la protéine gpl20 est sous forme intracellulaire, alors qu'elle devrait être sous-membranaire, afin de3s permettre le bourgeonnement des particules virales.
wo 95/16784 PCT~g~/01458 2~ 8 18-Dans leur ensemble, ces résultats indiquent que l'IF~ agit au niveau des étapes tardives du cycle viral et probablement au niveau de l'assemblage des virions.
EXEMPLE 7 Méthode de traitement du SIDA par thérapie ~énique.
-Dans le cadre d'une thérapie génique appliquee à l'homme, deux types de cellulescibles peuvent être envisagés:
- les Iymphocytes CD4+ du sang périphérique qui peuvent être collectés o notamment par leucophérèse, et - les cellules souches hématopoïétiques CD34+ qui peuvent être obtenues d'un prélèvement de moëlle osseuse ou du sang périphérique (mobilisation par chimiotherapie ou par action de facteurs de croissance hématopoïétiques).
1~
A. Pro~ocole appliqllable allx cellules CW+
Le patient est soumis à un prélèvement de sang ou à une leucophérèse. Après avoir éliminé les globules rouges, les cellules mononuclées sont isolées par centrifugation sur Ficoll et cultivees selon les techniques de l'art. Dans un premier temps, on se debarasse des cellules adhérentes au plastique des flasques de culture. La suspension cellulaire est recupéree et cultivée dans des flasques revêties d'anticorps anti-CD8 (Immunotech) afin d'éliminer les cellules CD8+. La suspension cellulaire ainsi obtenue est composee majoritairement de Iymphocytes CD4+. Bien entendll, les 2~ autres techniques d'enrichissement peuvent également être employées.
Ceux-ci sont stimulés dans le but d'induire la division cellulaire avant d'effectuer la transduction retrovirale. Les facteurs de croissance pouvant être mis en oeuvre à cet ef~et sont varies. A titre indicatif, on peut citer un mélange d'anticorps anti CD3 humain (Immunotech, environ 10 ng/ml) et d'IL-2 (Cetus; 100 Ulml) ou encore de PHA (phytohemagglutidine, Sigma, à une concentration d'environ 5 ~lg/ml) et d'IL-2.
Après 72 heures de culture dans ces conditions, les cellules sont tr~ncduites par le vecteur rétroviral. Différentes méthodologies sont applicables:
3~ ..
- co-culture des cellules CD4+ et des cellules productrices amphotropes des _ wo 95/16784 PCTIFR94/014~8 ~ 2 1 ~
- exemples I à 4.
- co-culture des 2 types cellulaires, les cellules CD4+ étant déposées dans les puits de culture et les cellules productrices dans un Transwell (Costar) s - infection des cellules CD4+ avec une aliquote de surnageant de culture des cellules productrices selon une m.o.i. (multiplicité d'infection) de préférence comprise entre I et 5.
o Généralement la transduction est réalisée en présence de sulfate de protamine (à une concentration d'environ S ~,lg/ml) pour favoriser l'attachement du virus à la surface cellulaire.
Le jour suivant, la culture cellulaire est passée en milieu sélectif (puromycine dans I S le cadre des vecteurs de l'exemple I ou G4 18 dans le cadre des vecteurs de l'exemple 2) et poursuivie pendant 7 à 8 jours jusqu'à obtenir le nombre de cellules appropriées.
On indique qu'il peut être avantageux d'employer le milieu AIM V (Gibco BRL) complémenté par de la L-glutamine (2 mM) et de llL-2 (100 U/ml) et dépourvu de sérum.
La capacite de ces cellules à inhiber la réplication du VIH est testée i~ vitro. Elles sont infectées par le VIH-I IIIB à une m.o.i. de lo-2 selon la méthodologie classique dans le domaine de l'art. Après lavage et remise en culture, la propagation du virus est évaluée par mesure de l'activité réverse-transcriptase dans le surnageant de2~ culture (Figure 6). Celle-ci se situe à un niveau très bas pendant au moins 20 jours de culture A titre comparatif, dans le cas des cellules non transduites, l'activité
réverse-transcriptase augmente très fortement jusqu'à atteindre un maximum dès le troisième jour de culture et est rapidement suivie de la mort cellulaire.
30 B. Protocole app/icable a71x cell~lles CD3~+.
Les étapes de la purification des cellules CD34 sont les suivantes:
- isolement des cellules mononuclées du prélèvement de sang périphérique ou de 3~ moëlle osseuse par centrifugation Ficoll, ~155~S8 - déplétion des cellules adherentes, et - capture des cellules CD34+ par culture dans des flasques recouvertes d'anticorps anti-CD34 (lmmunotech) ou en présence de billes revêtues de cet anticorps. On élimine les cellules en suspension et on récupère les cellules adhérentes après action, par exemple, de papaïne.
Comme précédemment, les cellules CD34+ ainsi obtenues sont stimulées par divers facteurs de croissance pour les placer en cycle de division et ainsi favoriser l'infection rétrovirale. On peut utiliser à cet effet un mélange d'IL-3 (environ 10 ng/ml), d'IL-6 (à environ S0 U/ml) et de SCF (Stem cell factor, environ 50 U/ml) incorporé dans le milieu de culture pendant 48 heures avant d'effectuer la transduction selon le protocole indiqué précédemment. Ces facteurs sont disponibles commercialement.
Les cellules sont ensuite réadministrées au patient.
20 (8) Le mini LTR du VIH, un site donneur d'épissage (du gène gag du VIH), une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV 40.
L'invention s'étend également aux vecteurs comprenant une cassette d'e~pl-es~ion25 selon l'invention. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme de l'art, ainsi que les methodes pour les construire et les propager. On aura avantageusement recours à des vecteurs viraux derivés des rétrovirus, virus de l'herpès, adénovirus ou virus associés à l'adénovirus. Bien entendu on peut également employer des vecteurs synthetiques. Dans le cadre de l'invention, les vecteurs défectifs pour la 30 réplication, et notamment les vecteurs rétroviraux, sont particulièrement préférés.
Selon un mode de réalisation avantageux, une cassette selon l'invention est positionnée en orientation réverse par rapport aux LTRs du vecteur rétroviral, afin de positionner les promoteurs en sens inverse pour éviter les interférences. Bien entendu, un vecteur selon l'invention peut, en outre, comprendre un gène codant WO 95/16784 ~ i 6 ~ PCT/FR94/01458 pour un marqueur de sélection, comme par exemple, les gènes néomycine et puromycine acétyl transfërase conférant une résistance aux antibiotiques G418 etpuromycine. L'invention couvre également les virus et particules de vecteur viral obtenus par transfection du vecteur selon l'invention, dans une lignée cellulaire s d'encapsidation, notamment amphotrope, produisant les protéines structurales du virus en cause.
L'invention a également trait à une cellule eucaryote comprenant, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Ces derniers peuvent être introduits lO soit i~ vitro dans une cellule prélevée du patient soit directement in vivo. La cellule est avantageusement une cellule humaine et, de manière préférée, une cellule de la lignée hématopoïétique (cellules souches ou lymphocytes primaires).
L'invention concerne également l'usage thérapeutique d'une cassette d'expression, s d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention, pour la fabrication d'un medicament destiné à la prévention ou au traitement des infections virales et, en particulier, des infections dues au VIH.
L'invention s'adresse é~alement à une composition pharmaceutique comprenant 20 à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique une cassette d'expression, unvecteur ou une cellule selon l'invention, en association avec un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière 2s conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace d'un tel agent thérapeutique ou prophylactique à un support, un diluantou un adjuvant acceptable. Elle peut être a~lministrée par n'importe quelle voieconventionnelle en us.age dans le domaine de l'art. L'~dminictration peut avoir lieu en dose unique ou répétée après un certain délai d'intervalle. La quantité à
30 administrer sera choisie en fonction de différents critères, en particulier la voie d'administration, le patient, I'état d'évolution de la maladie et la durée du traitement. A titre indicatif, une composition pharmaceutique selon l'invention contient de 103 à 10~ ufp (unité formant des plages), avantageusement de 105 à
1013ufp, de p~érél~nce de 106 à 10l2 ufp et, de manière tout à fait préférée, de 107 wo 95/16784 21 ~ 5 ~ ~ ~ PCT/FR9 ltO1458 ~
à 101 ufp de particules de vecteur viral.
Par ailleurs, I'invention concerne une méthode de traitement des infections virales et, notamment à V~H, selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquements e~lcace, d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement. Selon un premier protocole thérapeutique, on peut les administrer directement i~7 ~ivo, par exemple par voie intraveineuse. On préférera adopter un protocole de thérapie génique somatique qui consiste à prélever des cellules souches de moelle osseuse ou des Iymphocytes 10 du sang périphérique d'un patient, de les transfecter avec un vecteur selon l'invention, de les cultiver m vitro selon les techniques de l'art et de les ~minictrer au patient. A titre indicatif, il peut être avantageux d'employer 106 à 10I cellules par kg, de préférence 107 à 109 et, de manière préférée 5 x I07 à 5 x 1o8.
s Naturellement, ce protocole peut être sujet à de nombreuses variantes. En particulier, il peut être avantageux de combiner au moins deux cassettes, vecteurs ou cellules selon l'invention permettant l'expression d'un IFN de types différents, par exemple un IFNa et un IFN~.
20 L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes.
La figure I schematise le vecteur pTG43 13 permettant l'expression d'une séquence d'ADN codant pour l'IFNa sous le contrôle du LTR du VIH.
La figure 2 représente le vecteur pTG4344 co-exprimant le gène IFNa et le gène de sélection puromycine.
La figure 3 schématise le vecteur rétroviral pTG4379 pour le transfert d'un gèneIFN et son expression inductible par TAT.
La figure 4 montre l'évolution de l'infection dans des cellules U937 infectées par le VIH III B et transfectées par les vecteurs d'expression de l'IFNa (o), ~ (-) et y (O), comparée au témoin cellules non transfectées (~
~Wo 95/1678~ 2 ~ ~ ~ 5 ~ 8 PCT/FR94/01458 La fi~ure 5 illustre le vecteur rétroviral pTG6324 comprenant les cassettes d'expression de l'lFNa (sous le contrôle du mini LTR du VIH) et du gène de selection ~l~;o (sous le contrôle du LTR 5' rétroviral).
La figure 6 illustre l'evolution de l'infection dans des PBL humains CD8-transduits par le vecteur pTG6327 (~) puis infectés par le virus VIH III B, comparée aux cellules non transduites (-).
EXEMPLES
Toutes les opérations de clonage détaillées ci-après, sont effectuées selon les techniques classiques de biologie moléculaire (Maniatis et al., 1989, LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Ces etapes sont réalisées dans la souche l~;scherichia coli (E. coli) 5K, XLl-Blue ou 1 106.
Les genes humains codant pour les rFNs a et ,~ ont été clonés par PCR
(Polymerase Chain Reaction) à partir de l'ADN génomique de cellules Iymphoïdes, par exemple de cellules CEM-A3 (dérivées d'une lignée CEM
20 disponible à l'ATCC sous le numéro CCLI 19). De telles banques sont disponibles dans le commerce. L'amplification de fragments d'ADN par PCR peut être efl~ectuee à l'aide de kits commerciaux selon les spécifications du fabricant ouselon la technologie décrite dans PCR Protocols-A (edited by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Press Inc) à l'aide d'amorces complémentaires aux 2~ séquences publiées. Le gène humain codant pour l'IFNy est obtenu du pTGI I
décrit dans la demande de brevet français publiée sous le numéro 2.583.429. Des sites de restriction appropriés ont été introduits en amont et en aval de l'ATG
initiateur et du codon stop des différents gènes IFN afin de pouvoir faciliter les étapes de clona~ge ultérieures. D'autre part, les sites de restriction protubérants en 30 5' peuvent être convertis en sites francs par traitement par le grand fragment Klenow de l'ADN polymerase d'L;: coli alors que les sites protubérants en 3' sont traites par la T4 polymérase.
EXEMPLE 1: Construction de vecteurs d'expression de l'interféron inductibles WO 95/16784 ~ I ~ 5 ~ 6 8 PCT/FRg~/01458 ~
par la protéine TAT du VIH et dans lesquels le ~ène de sélection çst çonstitué par le gène puromvcine.
A. Vec~e1n .s ~70~7 ~i/mlx d ~expJ essio~7 cle / IFN SOIIS le contrôle dll promotezlr dz~
VIH.
On décrit la construction de vecteurs dans lesquels l'expression des gènes IFNa,~, et y est placée sous le contrôle du LTR 5' du VIH. Ces vecteurs ont été
construits à partir du vecteur pTG1322 décrit dans Mehtali (1992, AIDS and Human Retroviruses, S, 1959-1965) comprenant un gène hétérologue placé sous le controle du LTR 5' du VIH (fragment X7toI-~ 7dlII de 725 pb correspondant aux positions -645 à +80 du génome VIH). Ce vecteur porte également l'intron et le signal de polyadénylation du virus SV40. Il est digéré par Hi~ldlII traité à la Klenow puis digéré par SmaI.
On introduit dans pTG1322 ainsi traité, le gène IFNa sous forme d'un fragment délimité par les sites Sn7al et EcoRI traité à la Klenow et on génère pTG4313 (Figure 1). pTG4314 est obtenu par insertion du fragment SntaI-EcoRV portant le gène IFN,B dans pTG 1322 obtenu comme précédemment. On génère pTG4315 20 par insertion du gène ~FNy sous forme d'un fragment HpaI-PvtlII entre les mêmes sites de pTG1322.
On introduit dans le site EcoRI de ces différents vecteurs d'expression d'un IFN, un gène de sélection confërant la résistance à la puromycine (puromycine R) sous2~ forme d'un fragment de 1,2 kb Ban7HI-Bgl~I traité à la Klenow. Ce fragment comporte le promoteur precoce du virus SV40, le gène puromycine R et le signal de polyadénylation de SV40. On obtient les vecteurs pTG4344 (représenté à la Figure 2), pTG4345 et pTG4346, qui permettent la co-expression du gène de sélection puromycine R et respectivement du gène IFNc~, ~ ou y.
B. Vec~eto rétroviralpo1tr le tra~7sfert et l'expressio~l des gè~?es IFN.
Le vecteur à la base des constructions est le pLXSP qui dérive de pLXSN (Miller et Rossman, 1989, Biotechniques, 7, 980-988) après remplacement du gène de WO 95/16784 ~ PCT/FR94/01458 sélection néomycine par le gène puromycine R et du LTR 3' de MSV (Myelo Sarcoma Virus) par le LTR 3' du MPSV (Myelo Proliferative Sarcoma Virus).
On isole du génome du VIH un fragment ScaI-~Ii )clIII de 200 pb correspondant au mini LTR (position - 120 à +80), qui est ensuite introduit en amont de chacundes gènes IFNs. Puis on introduit en 3' des gènes, le signal de polyadénylation du SV40. Le vecteur ainsi obtenu est digéré par Bgf~I, traité à la Klenow. Le fragment comportant la cassette d'expression "mini LTR - IFN - signal de polyadénylation" est introduit entre les sites HpaI-BgllI du vecteur rétroviral lo pTG4056. On selectionne les clones dans lesquels ce fragment est positionné en orientation réverse par rapport aux LTRs 5' et 3'. pTG4056 provient du pLXSP à
la suite de la délétion du bloc d'expression promoteur SV40-puromycine R et la réinsertion du gène puromycine R dans l'orientation correcte pour être placé sous le contrôle du LTR 5'.
1~
On obtient les vecteurs rétroviraux pTG4392, pTG4391 et pTG4~79 (Figure 3) permettant le transfert et l'expression des séquences codant respectivement pourles IFNs a, ,~ et y. Ils peuvent être transfectés dans une lignée cellulaire d'encapsidation amphotrope, par exemple la lignée PA317 (Miller et al., 1986, Mol. Cell., Biol. 6, 2895-2902), Gp Env. Am (Markowitz et al., 1988, Virology, 167, 400-406) ou PG13 (Miller et al., 1991, J. Virol, 6~, 2220-2224). Le jour suivant, les cellules transfectées sont placees en milieu sélectif (puromycine 6~lg/ml). On isole les cellules résistantes qui constitueront des lignées productrices de particules amphotropes capables d'infecter les cellules humaines, à partir 2~ desquelles on peut constituer un stock viral susceptible d'être utilisé en thérapie génique anti SIDA.
C. Vectem s r églllable.s pa~ TA T da~ls lesq1/els l'expre.ssio~l de l 'IrN es~ dirigée pa~ ?1~7 p~ on70tel/r ellca~yote.
I . Promoteur PGK murin.
La sequence TAR (correspondant aux nucléotides + I à +80 du génome du VIH) est générée par synthèse chimique. Puis, I'oligonucléotide double brin ainsi obtenu wo 95/16784 PCT/FRg4/014~8 ~
~ ~5~68 12-est introduit par mutagénèse insertionnelle en position +1 du promoteur PGK
murin, dont la séquence est publiee dans Adra et al. (1987, Gene, 60, 65-74). Oninsère en aval de la séquence TAR, le fragment comportant la séquence codant pour l'IFN humain a, ~ ou y suivie du signal de polyadénylation de SV40.
Enfin, la cassette d'expression "promoteur PGK-TAR-IFN-polyA" est introduite dans le vecteur rétroviral pLXSP. Bien entendu à chaque séquence IFNa, ~ ou y correspond un vecteur rétroviral. Comme précédemment, on établit une lignée d'encapsidation amphotrope productrice de chaque type de particules virales.
2. Promoteur ~-actine murin.
L'exemple précédent est reproduit avec la variante suivante:
l s La sequence synthétique TAR est introduite en position +l du promoteur ~-actine de rat dont la séquence est décrite dans Nudel et al., (1983, Nucleic Acids Res., ll, 1759-1771) EXEMPLE 2: Construction de vecteurs d'expression d'un IFN humain 20 inductibles par la protéine TAT du VIH et dans lesquels le ~ène de sélection est constitué par le ~ène néomycine et établissement de li~nées amphotropes correspondantes.
A. C0~7.5~tllCtiO~I ~,JI( pTG632~ polm l'exp~essio~7 de l'IFNa.
2~
En premier lieu, le mini LTR du VIH est isolé du génome viral après digestion ScaI - Hil~dIII, inséré dans un plasmide quelconque pour être resorti sous formed'un fragment Smc7I-Hi~7dIII puis cloné entre les mêmes sites du vecteur pTG2359.
Ce dernier correspond au clonage du site de polyadénylation du virus SV40 dans 30 le plasmide p Biuescript KS (Stratagène). On obtient pTG4347 dans lequel on introduit, après digestion par BnlI, un fragment SmoI-HpaI portant les séquencescodant pour l'IFNa.
Enfin, la cassette d'expression "mini LTR-IFNa-polyA SV40" est purifiée du WO 95116784 ~ 1 5 S ~ ~ 8 PCT/~R94/014~8 vecteur pTG4355 obtenu a l'étape précédente sous forme d'un fragment BamHI-Bg/II, qui est cloné dans le site BamH~ de pTG6320 pour donner pTG6324 (Figure S). Ce dernier comprend donc le LTR du MSV dirigeant l'expression du gène de selection ~7~;0 suivi de la cassette "mini LTR - IFNa - polyA SV40" positionnée en orientation réverse afin d'éviter les phénomènes d'interférence entre les promoteurs et enfin le LTR 3' rétroviral du MPSV. A titre indicatif, pTG6320 provient du pLXSP à la suite de la dététion de la cassette d'expression du gène puromycine et remplacement par le gène néomycine (Colbère - Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol., l~n, 1-14).
B. C0~7slr7rclio~7 ~1~ pTG63~S pOIII I expressio~ ~ I IFNy.
La stratégie de clonage est tout a fait similaire à ce qui est décrit ci-dessus. Le vecteur pTG6311 provient de l'insertion d'un fragment SmaI-HpnI portant la séquence codant pour l'IFNy dans le site Ba/I du pTG4347. Puis, on obtient le vecteur rétroviral pTG6328 en clonant le fragment Ban~HI-Bg/II purifié du pTG6311 dans le vecteur pTG6320 préalablement digéré par BamHI. Celui-ci est l'équivalent de pTG6324 à la différence qu'il porte le gène IFNy à la place du gène IFNa.
C. Co~lstrllctio~l dl~ vect~ c;trovilalpTG6327poln l'explessio~7 de lIFNp.
Le fragment .SntaI-Hi~fllI portant le mini LTR VIH est inséré entre les mêmes sites de pTG43S6, pour générer pTG6312. Le vecteur pTG4356 correspond au 2~ vecteur pTG2359 dans lequel on a cloné (site Ba/I) le gène IFN ,~ (fragment SnlaI-EcoRV). Comme précédemment, la cassette d'expression de l'IFN~ est purifiée de pTG6312 après digestion par Ban1HI et Bg/II puis sous-clonée dans lesite Bnn1HI de pTG6320 pour donner pTG6327.
30 D. ~;~abliss~n7e~ le /ig~-~;es an7phot7 opes po~lr la prodllction de parlic~lles virales infectiellse.s~
On peut preparer des stocks de particules virales infectieuses à partir de chacun des vecteurs précédents pTG6324, pTG6327 et pTG6328. Pour ce faire, ces WO 95/16784 PCT/ElR9 1/014;~8 21 ~5s~6~ 14 -derniers sont transfectés de manière classique dans une lignée d'encapsidation ecotrope, par exemple la li ~née GP + E 86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120- 1124). 48 h apres la transfection, les cellules sont cultivées en milieu sélectif (G418 I mg/ml).
-Le mélange de clones résistants au G418 est maintenu pendant 3 jourssupplémentaires en milieu sélectif. Le surnageant de culture est récolté pour infecter de façon conventionnelle, une lignée d'encapsidation amphotrope comme la lignée PA317. Après sélection, les lignées ainsi obtenues constitueront les 10 cellules productrices de particules virales infectieuses permettant le transfert et l'expression des différents IFNs dans le cadre d'une thérapie génique humaine.
Leur capacité à produire un IFN actif peut être évaluée dans les surnageants de culture par la méthode décrite dans The Interferon System (W.E. Stewart, 1979, 1~ Ed: Springer-Verlag Wien, New York). Ce test de fonctionnalité, lorsqu'il esteffectué sur les cellules générées à l'étape précédente, donne un niveau faible d'lFN dans les trois cas. Par contre, lorsque les cellules sont transfectées de manière transitoire par le plasmide pHMG-TAT, le niveau mesuré est élévé et atteint quelques centaines d'unité par ml. pHMG-TAT est un vecteur d'expression 20 de la protéine TAT native et résulte du clonage de la séquence codant pour celle-ci dans le vecteur pHMG (Mehtali et al., 1990, Gene, 91, 179-184).
Par ailleurs, il peut être intéressant d'isoler des clones producteurs. Ceci est réalisé
classiquement par la technique de dilution clonale (0,3 cellule par puit). On 2~ sélectionne un clone bon producteur de virions titrant 5x lo6 à 107 ufp/ml après infection des cellules murines NIH-3T3 (ATCC CRL 1658) par une aliquote de surnageant de culture du clone. On vérifie sa capacité à produire de l'IFN commeindiqué précédemment. On effectue à nouveau une dilution clonale à partir des clones précédents afin de générer des sous-clones. On sélectionne pour chacun 30 d'entre eux un sous clone bon producteur de virions et d'IFN après titration et dosage de l'IFN.
Les sous-clones sont congelés avant utilisation dans un but de thérapie génique.
~ WO 9~/16784 21 ~i ~ 5 613 PCT~R94/01458 EXEMPLE 3: Constmction de vecteurs d'expression d'un IFN humain inductibles par la protéine REV du VIH.
On decrit un vecteur rétroviral par insertion dans le vecteur pLXSP et dans s l'orientation réverse par rapport aux LTRs, d'une cassette d'expression comprenant de 5' vers 3' :
- le promoteur du virus SV40;
- la séquence d'ADN codant pour l'IFN humain a, ~ ou y;
- la séquence RRE/CRS. Cette dernière est isolée du génome du VIH-I
isolat Lai sous forme d'un fragment BglII-BamHI (s'étendant des nucléotides 7178 à 8032 de la séquence telle que publiée par Wain-Hobson et al., s~.~/p~n) Ce fragment peut être traité par la Klenow avant d'être introduit dans un site de restriction adéquat; et - le signal de polyadénylation de SV40.
Comme précédemment, on peut constituer des stocks viraux après transfection dans une lignée d'encapsidation amphotrope.
20 EXEMPLE 4: Construction de vecteurs d'expression d'un rFN humain inductibles par les protéines TAT et REV du VIH.
On insère dans les vecteurs pTG4392, pTG439 1 et pTG4379 le fragment BQmH1 BglII traité à la Klenow et porteur de la séquence RRE/CRS du VIH entre la 2s séquence codant pour un des IFNs et le signal de polyadénylation de SV40.
De plus, les vecteurs ainsi obtenus peuvent être modifiés par l'insertion d'un site donneur d'épissage entre le LTR du VIH et le gène IFN.
30 Comme precédemment, on peut générer une lignée amphotrope productrice de particules infectieuses correspondant à chacun des vecteurs ainsi obtenus.
EXEMPLE 5: Résistance à l'infection virale des li~nées cellulaires transfectées par les vecteurs d'expression de l'IFN inductibles par TAT.
WO 95/16784 PCT/FR94/01458 ~
2~ 8 - 16-Les expérimentations ci-après decrites sont effectuées dans des lignées cellulaires naturellement infectables par le VIH, comme:
- la lignée U937 (ATCC CRL1593) dérivée de monocytes hllm~in~; et - la lignée CEM-A3 dérivée de cellules Iymphocytaires humaines CD4+
(ATCC CCLI 19).
10 En pratique, les cellules sont cultivées selon les recommandations du fournisseur et transfectées par électroporation d'au moins 20 ,ug d'ADN à l'aide d'un appareillage approprié (Gene Pulser Biorad, voltage 21 0V, capacitance 960,uF).
Dans une première expérience, on co-électropore dans les cellules U937 (2x107 I s cellules) le pTG43 14 avec le vecteur pLXSP dans un rapport de concentration en ADN 20:1. Les cellules sont remises en culture à 37C en présence de 5 % de CO, et le jour suivant, placées en milieu sélectif (puromycine 0,5 llg/ml). On sélectionne les cellules résistantes à l'antibiotique.
20 On teste leur résistance à l'infection en les infectant par une préparation de VIH
à une TCID50 élevée (au moins 1000). La TCID50 est déterminée selon la méthode décrite dans Reed et al., (193g, Am. J. Hyg., 27, 493-497), sur lignées cellulaires infectables par le VIH, comme les cellules CEM. Elle correspond à la dose à
laquelle S0 % des cellules sont infectées et 50 % ne le sont pas. Elle est vérifiée 2s pour chaque lot de VIH employé.
Pour ce faire, on prélève une fraction de la culture cellulaire U937 électroporée, correspondant à environ 106 cellules, que l'on centrifuge à basse vitesse. Aprèslavage, le culot cellulaire est repris dans 200 ~ll de milieu de culture en absence 30 de serum. Puis les cellules sont traitées par différentes dilutions de la préparation virale. On laisse l'infection se poursuivre I heure à 37C.
Les cellules sont ensuite lavées 2 fois dans du milieu de culture et mises en culture dans 5 ml du même milieu, complémenté avec 10 % de SVF (sérum de veau 3~ foetal). Le milieu est renouvelé 2 ou 3 fois par semaine. La propagation du virus est évaluée par mesure de l'activité réverse-transcriptase à intervalles réguliers 21 5~
~ WO 95/16784 PCT/FR94/01458 - dans le surnageant de culture selon la méthode décrite dans Spire et al. (1985, Lancet, i, 188-189).
On observe une diminution significative Gusqu'à 85 %) de l'activité réverse-5 transcriptase sur 14 jours post-infection par rapport aux cellules U937 témoin non électroporée avec un vecteur d'expression de l'interféron.
L'expérience est répétée cette fois avec des cellules U93 7 initialement électroporées avec le pTG4344, pTG43~5 ou pTG4346. Dans les trois cas, on 10 observe une diminution encore supérieure de l'activité réverse-transcriptase sur 21 jours post-infection par rapport au témoin cellules non électroporées. (Figure 4).
EXElvlPLE 6: Mécanisme moléculaire de la résistance à l'infection VIH.
L'analyse est effectuee sur les cellules U937 électroporée et infectée i~7 vitro par le VIH (exemple 5).
On recherche tout d'abord la présence du génome du VIH dans une pl~pal~ion 20 d'ADN génomique cellulaire. Ceci est réalisé par PCR à l'aide d'amorces adéquates permettant l'amplif!cation d'un fragment du gène gag viral. La présence d'une bande d'amplification de taille attendue indique que l'expression de l'IFN n'interfère pas avec l'intégration du génome du VIH sous forme provirale dans les ch~omosomes cellulaires.
2s Il a également été possible de détecter la présence des ARNm codant pour les produits du gène gag par la technique de reverse-transcription PCR (mêmes amorces que précédemment). Ceci laisse supposer que l'expression de l'IFN n'a pas d'effet notable sur la transcription des séquences provirales.
Enfin, on évalue la présence et la localisation de la protéine virale gpl20 par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps anti-gpl20 (obtenu de sérum de patients séropositifs). On constate que dans les cellules exprimant l'IF~, la protéine gpl20 est sous forme intracellulaire, alors qu'elle devrait être sous-membranaire, afin de3s permettre le bourgeonnement des particules virales.
wo 95/16784 PCT~g~/01458 2~ 8 18-Dans leur ensemble, ces résultats indiquent que l'IF~ agit au niveau des étapes tardives du cycle viral et probablement au niveau de l'assemblage des virions.
EXEMPLE 7 Méthode de traitement du SIDA par thérapie ~énique.
-Dans le cadre d'une thérapie génique appliquee à l'homme, deux types de cellulescibles peuvent être envisagés:
- les Iymphocytes CD4+ du sang périphérique qui peuvent être collectés o notamment par leucophérèse, et - les cellules souches hématopoïétiques CD34+ qui peuvent être obtenues d'un prélèvement de moëlle osseuse ou du sang périphérique (mobilisation par chimiotherapie ou par action de facteurs de croissance hématopoïétiques).
1~
A. Pro~ocole appliqllable allx cellules CW+
Le patient est soumis à un prélèvement de sang ou à une leucophérèse. Après avoir éliminé les globules rouges, les cellules mononuclées sont isolées par centrifugation sur Ficoll et cultivees selon les techniques de l'art. Dans un premier temps, on se debarasse des cellules adhérentes au plastique des flasques de culture. La suspension cellulaire est recupéree et cultivée dans des flasques revêties d'anticorps anti-CD8 (Immunotech) afin d'éliminer les cellules CD8+. La suspension cellulaire ainsi obtenue est composee majoritairement de Iymphocytes CD4+. Bien entendll, les 2~ autres techniques d'enrichissement peuvent également être employées.
Ceux-ci sont stimulés dans le but d'induire la division cellulaire avant d'effectuer la transduction retrovirale. Les facteurs de croissance pouvant être mis en oeuvre à cet ef~et sont varies. A titre indicatif, on peut citer un mélange d'anticorps anti CD3 humain (Immunotech, environ 10 ng/ml) et d'IL-2 (Cetus; 100 Ulml) ou encore de PHA (phytohemagglutidine, Sigma, à une concentration d'environ 5 ~lg/ml) et d'IL-2.
Après 72 heures de culture dans ces conditions, les cellules sont tr~ncduites par le vecteur rétroviral. Différentes méthodologies sont applicables:
3~ ..
- co-culture des cellules CD4+ et des cellules productrices amphotropes des _ wo 95/16784 PCTIFR94/014~8 ~ 2 1 ~
- exemples I à 4.
- co-culture des 2 types cellulaires, les cellules CD4+ étant déposées dans les puits de culture et les cellules productrices dans un Transwell (Costar) s - infection des cellules CD4+ avec une aliquote de surnageant de culture des cellules productrices selon une m.o.i. (multiplicité d'infection) de préférence comprise entre I et 5.
o Généralement la transduction est réalisée en présence de sulfate de protamine (à une concentration d'environ S ~,lg/ml) pour favoriser l'attachement du virus à la surface cellulaire.
Le jour suivant, la culture cellulaire est passée en milieu sélectif (puromycine dans I S le cadre des vecteurs de l'exemple I ou G4 18 dans le cadre des vecteurs de l'exemple 2) et poursuivie pendant 7 à 8 jours jusqu'à obtenir le nombre de cellules appropriées.
On indique qu'il peut être avantageux d'employer le milieu AIM V (Gibco BRL) complémenté par de la L-glutamine (2 mM) et de llL-2 (100 U/ml) et dépourvu de sérum.
La capacite de ces cellules à inhiber la réplication du VIH est testée i~ vitro. Elles sont infectées par le VIH-I IIIB à une m.o.i. de lo-2 selon la méthodologie classique dans le domaine de l'art. Après lavage et remise en culture, la propagation du virus est évaluée par mesure de l'activité réverse-transcriptase dans le surnageant de2~ culture (Figure 6). Celle-ci se situe à un niveau très bas pendant au moins 20 jours de culture A titre comparatif, dans le cas des cellules non transduites, l'activité
réverse-transcriptase augmente très fortement jusqu'à atteindre un maximum dès le troisième jour de culture et est rapidement suivie de la mort cellulaire.
30 B. Protocole app/icable a71x cell~lles CD3~+.
Les étapes de la purification des cellules CD34 sont les suivantes:
- isolement des cellules mononuclées du prélèvement de sang périphérique ou de 3~ moëlle osseuse par centrifugation Ficoll, ~155~S8 - déplétion des cellules adherentes, et - capture des cellules CD34+ par culture dans des flasques recouvertes d'anticorps anti-CD34 (lmmunotech) ou en présence de billes revêtues de cet anticorps. On élimine les cellules en suspension et on récupère les cellules adhérentes après action, par exemple, de papaïne.
Comme précédemment, les cellules CD34+ ainsi obtenues sont stimulées par divers facteurs de croissance pour les placer en cycle de division et ainsi favoriser l'infection rétrovirale. On peut utiliser à cet effet un mélange d'IL-3 (environ 10 ng/ml), d'IL-6 (à environ S0 U/ml) et de SCF (Stem cell factor, environ 50 U/ml) incorporé dans le milieu de culture pendant 48 heures avant d'effectuer la transduction selon le protocole indiqué précédemment. Ces facteurs sont disponibles commercialement.
Les cellules sont ensuite réadministrées au patient.
Claims (19)
1. Une cassette comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour un IFN
humain placée sous le contrôle des éléments capables d'assurer son expression dans une cellule de mammifère, caractérisée en ce que lesdits éléments comprennent au moins un promoteur et une séquence de type TAR et/ou RRE/CRS et sont régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH).
humain placée sous le contrôle des éléments capables d'assurer son expression dans une cellule de mammifère, caractérisée en ce que lesdits éléments comprennent au moins un promoteur et une séquence de type TAR et/ou RRE/CRS et sont régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH).
2. Une cassette selon la revendication 1, caractérisée en ce que l'IFN est sélectionné parmi les IFNs humains de type .alpha., .beta. et .gamma..
3. Une cassette selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisée en ce que la séquence de type TAR est placée en 3' dudit promoteur.
4. Une cassette selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que la séquence de type RRE/CRS est placée en 3' de la séquence d'ADN codant pour un IFN humain.
5. Une cassette selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le promoteur fonctionnel dans une cellule de mammifère est sélectionné parmi les promoteurs des genes murins PGK et .beta.-actine, le LTR 5' du VIH et un fragment de celui-ci (mini LTR).
6. Une cassette selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que lesdits éléments comportent en outre un site donneur d'épissage.
7. Une cassette selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que lesdits éléments comprennent en outre un signal de polyadénylation.
8. Un vecteur comprenant une cassette selon l'une des revendications 1 à 7.
9. Un vecteur selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur rétroviral.
10. Un vecteur selon la revendication 9, caractérisé en ce que la cassette d'expression selon l'une des revendications 1 à 7 est positionnée en orientationréverse par rapport aux LTRs dudit vecteur.
11. Un vecteur selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un gène de sélection.
12. Un vecteur selon la revendication 11, caractérisé en ce que le gène de sélection confère la résistance à la puromycine.
13. Une cellule eucaryote comprenant une cassette selon l'une des revendications 1 à 7 ou un vecteur selon l'une des revendications 8 à 12.
14. Une cellule selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule humaine de la lignée hématopoïétique.
15. Usage d'une cassette selon l'une des revendications 1 à 7, d'un vecteur selon l'une des revendications 8 à 12 ou d'une cellule selon l'une des revendications 13 ou 14, pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention ou au traitement des infections dues au VIH.
16. Une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'une cassette selon l'une des revendications 1 à 7, d'un vecteur selonl'une des revendications 8 à 12 ou d'une cellule selon l'une des revendications 13 ou 14, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
17. Une composition pharmaceutique selon la revendication 16, caractérisée en cequ'elle comprend de 103 à 1013 pfu d'un vecteur selon l'une des revendications 8 à 12.
18. Produit contenant au moins deux cassettes selon l'une des revendications 1 à 7, vecteurs selon l'une des revendications 8 à 12 ou cellules selon l'une des revendications 13 ou 14 exprimant chacun un IFN de type different, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps dans la prévention ou le traitement des infections dues au VIH.
19. Utilisation d'au moins deux cassettes selon l'une des revendications 1 à 7, vecteurs selon l'une des revendications 8 à 12 ou cellules selon l'une des revendications 13 ou 14 exprimant chacun un IFN de type différent, en utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps, destinés à l'obtention d'un médicament pour la prévention ou le traitement des infections dues au VIH.
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