CA2155568A1

CA2155568A1 - Human interferon expression vectors for treating aids

Info

Publication number: CA2155568A1
Application number: CA002155568A
Authority: CA
Inventors: Majid Mehtali; Philippe Leissner
Original assignee: Individual
Current assignee: Transgene SA
Priority date: 1993-12-13
Filing date: 1994-12-13
Publication date: 1995-06-22
Also published as: EP0682712A1; WO1995016784A1; FR2713657B1; FR2713657A1; SG49230A1; JPH08506970A; AU1275195A

Abstract

A cassette for the expression of a human IFN gene placed under the control of HIV virus-inducible elements, a vector and a cell containing said cassette, therapeutical uses thereof, and a pharmaceutical composition for treating or preventing HIV-related infections, are disclosed.

Description

2 ~ 8 ~WO 95/1678~ PCT/FR94/014S8 VECTEURS EXPRIMANT UN INTERFERON HUMAIN
POUR LE TRAITEMENT DU SIDA

La présente invention a pour objet une cassette comportant une séquence d'ADN
codant pour un IFN humain dont l'e,c~, ~ssion est placée sous le contrôle 15 d'éléments régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH). La présente invention trouve une application intéressante dans le traitement ou la prévention des infections dues au VIH, notamment par thérapie génique.

Le VIH, agent étiologique du SIDA (syndrome d'immunodéficience acquise), 20 infecte préférentiellement une sous-population de Iymphocytes T, (T helper) responsables de l'amplification de la réponse immunitaire. En conséquence, la maladie évolue vers un déficit de l'immunite cellulaire, ce qui rend les individus malades particulièrement sensibles aux infections opportunistes. Jusqu'à présent, aucun tr~it~ment ne s'est révélé totalement s~ticf~ic~nt malgré les multiples efforts 25 investis dans le développement de nouvelles molécules antivirales. Ces difficultés relèvent sans doute de la complexité particulière du virus VIH et de sa capacitéà réprimer les systèmes de défenses immunitaires dans les cellules infectées.

Le VIH est un rétrovirus appartenant à la famille des lentivirus. Son matériel 30 génétique, constitué d'une molécule d'ARN, est encapsidé dans une capside de nature protéique, elle-même entourée d'une enveloppe virale. Outre les gènes structuraux (gog, pol et e~v) codant respectivement pour les protéines de la capside, la réverse-transcriptase et la protéine d'enveloppe, le génome du VIH
comprend des genes régulateurs qui commandent la réplication virale. Parmi ces wo 95/16784 PCT/FRg4/01458 ~
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derniers, on peut citer les gènes tat et rev codant respectivement pour les protéines TAT et REV.

La protéine TAT a un rôle trans-activateur de l'expression de l'ensemble des gènes du VIH (Arya et al., 1985, Science, ~29, 69-73). Il semble que TAT intervient aussi bien à un niveau transcriptionnel que post-transcriptionnel. Elle interagit spécifiquement avec une courte séquence nucléotidique, désignée séquence TAR
(pour Trans-activation Responsive Region), et localisée à l'extrémité S' du génome et des transcrits viraux (position +l à +80; +I reprçsent~nt le site d'initiation de la transcription) (Rosen et al., 1985, Cell, 41, 813-823).

La protéine REV favorise le transport vers le cytoplasme des A~N messagers (ARNm) codant pour les protéines de structure, pour y être traduits. De son côté, REV reconnaît spécifiquement une séquence RRE (pour REV Responsive 1~ Element) sur les AE~Nm. Celle-ci est localisée dans le gène enV à proximité d'une autre séquence dite CRS (cis-acting Repression Sequence), impliquée dans la rétention nucléaire des AR~m la portant. On suppose que la fixation de la protéine REV au niveau de sa séquence cible RRE a pour effet de contreb~l~ncer l'effet inhibiteur de CRS sur le passage des grands ARNm viraux vers le 20 cytoplasme.

Les séquences essentielles à la transcription des gènes viraux sont localisées aux deux extrémités du génome au niveau des LTRs (Long Terminal Repeat). Alors que le LTR 5' contient les séquences promotrices ainsi que les séquences TAR, 2~ le LTR 3' comprend les séquences impliquées dans la terminaison de la transcription.

D'une manière générale, lorsqu'une cellule est infectée par un virus, elle secrète des interférons (IFNs) en réponse à l'infection virale. Il s'agit d'un groupe de30 protéines exerçant des ef~ets antiviraux et classifié en trois types a, ~ et y. S'il existe plus d'une vingtaine de sous-types d'IFN a, les IF~Ns ,B et y semblent uniques.

Paradoxalement, la synthèse des IF~Ns cellulaires (endogènes) est réprimée dans ~Wo 95/16784 21~ 5 6 ~ PCT/FRg~/01458 Ics cellules infecte~s p31' le vm Cene répression empeche les cellules infectéespar le VI~ et les cellules avoisinantes de se défendre efficacemenl contre l'in~ection viral~ (Mark, 199?, .'~IDS Res. Hun~. Retrovirus~ ~, 199-207).

On a ~ nt trouve que l'introduction dans une ~ellule d'un gène cod,mt pour un l~N humain (IFN exo~ène) dont l'expression est inductible par les protéines virales T~'l` etlou RE~, permet ~ la cellule génetiquelnent ll70difiée de se défendre dans un contexte infectieux. La presente invention a pour but de proposer différents vecteurs d'eA~r~a~,on d'JFN humain rc~ulables par les protéines TAT etlou REV du ~IH. Cette approche met à profit les caractéristiquesde réplic.~tion du ~irus Vl~ insi, en cas d'infectic)n, la synthèse des ~Ns cellulaires est inhib~e mais la synthèse des rFNs exo~enes est i~duite par le v~rus VIH lui même, reconstituant ainsi un système de défense efficace à son encontre,L'usage d'un système d'expression inductible évite les prol~lèmes de toxicité
cellulairc dans les cellules non ir fect~es.

C'est pourquoi la présente in~ention a pour objet une cassette d'expression eon~l)rellant au moins une séquence d'ADN codant pour un ~ humain, placée sous le comrôle des clcments capables d'~ssurer son e~;pression da}ls une cellule de rn~n~mif~re, caracteriscc ~n ce que lesdits cléments sont régulables par le virus de l'immunodéficience humaine (~I).

Une séquence d'P,DN en usage dans la présentc invention, peut coder pour un IFN
humain de type a, p ou y. Il peut s'aOir des scquences divulguées dans l'alt 2S anterieur et nolamlllellt dans Sha w et al. (19~3, Nucleic Acid Res., Il, 555-~73) pour ~ , Hi~as}li Ct ~1. (1983, J. Biol. Chem., ~5~, 95~2-~529) pour IqFN~
et Gray et al. (19S2, Nature, ?95, ~03-50~) pour 1'IFNy. Ces séquences peuvent etre isolees du gène ou de l'ADl~c. Par séquence codant pour un IFN humain, on entend é~lem~nt dési~n~r une sequence codant pour un analo~uc d'un IFN. P~
"analo~u~", on en~end unc molecule qui aura;t une séquence en acides aminés lé~:rement différellte d'un I~N natif mais clui conserverait l'~ss~nti~l de la fonction antivirale. En prat;que, un tel analo~ue peut etre obtenu par délétion,substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acidc~ amines de la protéine native ou d'un fr2~ment de celle-ci. I.,'homme du métier connalt les techniq~les qui wo 95/16784 - PCT/FRg~/014~8 ~

permettent d'ef~ectuer ces modifications sans abolir la fonction biologique de la protéine.

Les éléments assurant l'expression d'une séquence d'ADN en usage dans le cadre de la présente invention, sont les éléments conventionnels permettant la transcription de la séquence d'ADN en ARNm et la traduction de ce dernier en protéine, comme par exemple un promoteur et les codons d'initiation et de terminaison de la traduction. En outre, une c~csette selon l'invention comprend des sequences régulables par le virus VIH.

D'une manière générale, on choisit un promoteur fonctionnel dans une cellule de ma,.,.l~irè,e et, de yl~:rélence~ dans une cellule humaine. Il peut être issu d'un gène eucaryote quelconque ou d'un génome viral et être de nature ubiquitaire ou régulable, notamment en réponse à certains signaux cellulaires tissu-spécifiquesou événement-spécifiques. Le choix du promoteur est très large et à la portée del'homme de l'art. Cependant, on aura avantageusement recours au promoteur des gènes murins PGK (PhosphoGlycérate kinase) et ,B-actine ou au promoteur SV40 (Simian Virus 40).

20 Selon un mode particulièrement préféré, les séquences régulables par le VIH sont constituées d'une séquence de type TAR et/ou RRE/CRS. Une séquence de type TAR interagit avec la protéine TAT pour activer l'expression des gènes sous son contrôle. De son côté, une séquence de type RRE/CRS interagit avec la protéine REV pour favoriser le transport des ARNm dans le cytoplasme. On indique qu'elle 2~ contient naturellement un site accepteur d'épissage. Conformement aux buts poursuivis par la présente invention, ces séquences peuvent être légèrement différentes des séquences TAR et RRE/CRS natives (telle que publiées par Wain-Hobson et al., 1985, Cell, ~0, 9-17), à condition toutefois d'être capables d'interagir avec les protéines TAT et REV virales.
S'agissant d'une séquence de type TAR, celle-ci est insérée en 3' du promoteur et, de manière tout à fait préférée, en position +l (+I étant le site d'initiation de la transcription). Dans ce contexte, il peut être avantageux d'avoir recours au LTR5' du VlH qui comprend naturellement un promoteur fonctionnel dans les cellules ~ WO 95/16784 2 i 5 ~ PCT/FR94/01458 -de mammifere suivi de la séquence TAR (en position +1 à +80). On peut egalement mettre en oeuvre une portion de celui-ci, qui comprend les séquences promotrices minimales (séquences Sp l, CAAT box et TATA box) et la séquence TAR. On désigne sous le nom de mini LTR un fragment de 200 pb correspondant ., ~ à l'extrémité 3' du LTR et s'étendant des positions -120 à +80 du génome viral.

Selon une autre approche, une cassette selon l'invention comprend un promoteur conventionnel et une séquence de type RRE/CRS capable d'interagir avec la protéine virale REV du VIH. Ainsi, dans une cellule non infectée, les ARNm lo seront bloqués dans le noyau sous l'action de CRS. Par contre, dès l'infection virale et la synthèse de REV, ils seront transportés dans le cytoplasme où ils seront traduits en IFN. De manière préférée, la séquence RRE/CRS est introduite en 3' de la séquence d'ADN codant pour un IFN.

1~ Selon une autre variante, on peut soumettre l'expression d'une séquence d'ADNen usage dans la présente invention, à une double régulation par TAT et REV, ce qui permet de contourner les problèmes d'échappement de l'expression observés couramment avec certains promoteurs. Dans ce cas, une cassette d'expression selon l'invention, peut comprendre une séquence de type TAR et une séquence de 20 type RRE/CRS; de sorte qu'en cas d'échappement de l'expression, les quelques ARNm produits resteront bloqués dans le noyau. Seule la pénétration du VIH et la synthèse des protéines virales TAT et REV pourront déclencher la synthèse d'IFN.

2~ Par ailleurs une cassette d'expression selon l'invention peut, en outre, contenir d'autres éléments contribuant à l'expression de la séquence d'ADN codant pour IFN, notamment, un intron, des signaux d'épissage adéquates et des éléments de terminaison de la transcription (signal de polyadénylation). Le choix et la localisation de ces éléments est à la portée de l'homme du métier.
A titre d'exemples préférés, on peut citer une cassette comprenant de 5' vers 3':

( I ) Le LTR 5' du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadénylation de SV40;

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(2) Le mini LTR du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadénylation de SV40; 2 ~ 8 ~ WO 95/1678 ~ PCT / FR94 / 014S8 VECTORS EXPRESSING HUMAN INTERFERON
FOR THE TREATMENT OF AIDS

The subject of the present invention is a cassette comprising a DNA sequence coding for a human IFN whose e, c ~, ~ ssion is placed under control 15 of elements regulatable by the human immunodeficiency virus (HIV). The present invention finds an interesting application in the treatment or prevention of HIV infections, including through gene therapy.

HIV, the etiological agent of AIDS (acquired immunodeficiency syndrome), 20 preferentially infects a subpopulation of T lymphocytes (T helper) responsible for enhancing the immune response. Consequently, the disease progresses to a deficit in cellular immunity, which makes individuals patients particularly susceptible to opportunistic infections. Until now, no tr ~ it ~ ment has turned out completely sic ~ ~ ic ~ nt despite multiple efforts 25 invested in the development of new antiviral molecules. These difficulties probably relate to the particular complexity of the HIV virus and its ability to suppress the immune defense systems in infected cells.

HIV is a retrovirus belonging to the lentivirus family. His material 30 genetic, consisting of an RNA molecule, is packaged in a capsid of protein in nature, itself surrounded by a viral envelope. Besides the genes structural (gog, pol and e ~ v) respectively coding for the proteins of the capsid, reverse transcriptase and envelope protein, the HIV genome includes regulatory genes that control viral replication. Among these wo 95/16784 PCT / FRg4 / 01458 ~
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last, we can cite the tat and rev genes respectively coding for proteins TAT and REV.

The TAT protein has a trans-activating role in the expression of all genes of HIV (Arya et al., 1985, Science, ~ 29, 69-73). TAT appears to be intervening both at a transcriptional and post-transcriptional level. She interacts specifically with a short nucleotide sequence, designated TAR sequence (for Trans-activation Responsive Region), and located at the S 'end of the genome and viral transcripts (position + l to +80; + I represent ~ nt the initiation site of transcription) (Rosen et al., 1985, Cell, 41, 813-823).

The REV protein promotes the transport to the cytoplasm of A ~ N messengers (MRNA) coding for structural proteins, to be translated there. For its part, REV specifically recognizes an RRE sequence (for REV Responsive 1 ~ Element) on AE ~ Nm. This is located in the enV gene near a another sequence known as CRS (cis-acting Repression Sequence), involved in the nuclear retention of AR ~ m carrying it. It is assumed that fixing the REV protein at its RRE target sequence has the effect of ~ l ~ ncer the inhibitory effect of CRS on the passage of large viral mRNAs to the 20 cytoplasm.

The essential sequences for the transcription of viral genes are localized at two ends of the genome at the LTRs (Long Terminal Repeat). So that the 5 ′ LTR contains the promoter sequences as well as the TAR sequences, 2 ~ the LTR 3 'includes the sequences involved in the termination of the transcription.

Generally, when a cell is infected with a virus, it secretes interferons (IFNs) in response to viral infection. It is a group of 30 proteins exerting antiviral effects and classified into three types a, ~ and y. If he exist more than twenty subtypes of IFN a, IF ~ Ns, B and y seem unique.

Paradoxically, the synthesis of cellular (endogenous) IF ~ Ns is suppressed in ~ Wo 95/16784 21 ~ 5 6 ~ PCT / FRg ~ / 01458 These infected cells ~ s p31 'the vm This repression prevents cells infected with VI ~ and neighboring cells from defending themselves effectively against ~ viral inection ~ (Mark, 199 ?,. ~ IDS Res. Hun ~. Retrovirus ~ ~, 199-207).

We have ~ nt found that the introduction into a ~ ellule of a cod, mt gene for a human l ~ N (exo ~ ene IFN) whose expression is inducible by proteins viral T ~ 'l` etlou RE ~, allows ~ the specified ll70 genetic cell to defend in an infectious context. The object of the present invention is to propose different vectors of eA ~ r ~ a ~, or of human JFN rc ~ ulables by TAT etlou REV proteins of ~ IH. This approach takes advantage of the characteristics of replication.
cells is inhibited but the synthesis of exo-ene rFNs is induced by the virus HIV itself, thus reconstituting an effective defense system against it, The use of an inducible expression system avoids prol ~ lemes of toxicity cellulairc in the non ir fect ~ es cells.

This is why the present in ~ ention relates to an expression cassette eon ~ l) rellant at least one DNA sequence coding for a ~ human, placed under the control of clcments capable of ~ ssuring its e ~ pressure in a cell of rn ~ n ~ mif ~ re, caracteriscc ~ n that said elements are regulated by the virus human immunodeficiency (~ I).

A sequence of P, DN in use in the present invention, can encode an IFN
human type a, p or y. There may be sequences disclosed in the alt 2S earlier and nolamlllellt in Sha w et al. (19 ~ 3, Nucleic Acid Res., Il, 555- ~ 73) for ~, Hi ~ as} li Ct ~ 1. (1983, J. Biol. Chem., ~ 5 ~, 95 ~ 2- ~ 529) for IqFN ~
and Gray et al. (19S2, Nature,? 95, ~ 03-50 ~) for IFNy. These sequences can be isolated from the gene or ADl ~ c. By sequence coding for a human IFN, we hear é ~ lem ~ nt desi ~ n ~ r a sequence coding for an analog ~ uc of an IFN. P ~
"analo ~ u ~", we have ~ end unc molecule which will have; t an amino acid sequence lé ~: quite different from a native I ~ N but clui would keep the ~ ss ~ nti ~ l of the antiviral function. In practice; that such an analog ~ ue can be obtained by deletion, substitution and / or addition of one or more acidc ~ amines of the native protein or a fr2 ~ ment thereof. I., a person skilled in the art knows the techniques which wo 95/16784 - PCT / FRg ~ / 014 ~ 8 ~

allow these modifications to be effected without abolishing the biological function of the protein.

Elements ensuring the expression of a DNA sequence in use in the context of the present invention, are the conventional elements allowing the transcription of the DNA sequence into mRNA and the translation of the latter into protein, such as a promoter and the initiation codons and translation completed. In addition, a c ~ csette according to the invention comprises sequences regulatable by the HIV virus.

In general, a functional promoter is chosen in a cell of ma,.,. l ~ irè, e and, de yl ~: rélence ~ in a human cell. It can come from a gene any eukaryotic or viral genome and be ubiquitous in nature or regulable, especially in response to certain tissue-specific or event-specific cellular signals. The choice of promoter is very wide and within the reach of those skilled in the art. However, the promoter of the murine PGK (PhosphoGlycerate kinase) and, B-actin or SV40 promoter genes (Simian Virus 40).

According to a particularly preferred mode, the sequences which can be regulated by HIV are consisting of a TAR and / or RRE / CRS type sequence. A type sequence TAR interacts with the TAT protein to activate the expression of genes under its control. For its part, an RRE / CRS type sequence interacts with the protein REV to promote the transport of mRNAs in the cytoplasm. It is said that it 2 ~ naturally contains a splice acceptor site. Consistent with goals continued by the present invention, these sequences may be slightly different from native TAR and RRE / CRS sequences (as published by Wain-Hobson et al., 1985, Cell, ~ 0, 9-17), provided, however, that they are capable to interact with the viral TAT and REV proteins.
Being a TAR type sequence, this is inserted 3 'to the promoter and, very preferably, in position + l (+ I being the site of initiation of the transcription). In this context, it may be advantageous to have recourse to the LTR5 'of the VlH which naturally includes a promoter functional in the cells ~ WO 95/16784 2 i 5 ~ PCT / FR94 / 01458 -mammal followed by the TAR sequence (in position +1 to +80). We can also implement a portion of it, which includes the sequences minimal promoters (Sp l sequences, CAAT box and TATA box) and the sequence TAR. A 200 bp fragment corresponding to the name of mini LTR is designated.
., ~ at the 3 'end of the LTR and extending from positions -120 to +80 of the viral genome.

According to another approach, a cassette according to the invention comprises a promoter conventional and an RRE / CRS type sequence capable of interacting with the HIV REV viral protein. So in an uninfected cell, mRNAs lo will be blocked in the nucleus under the action of CRS. By cons, from infection viral and REV synthesis, they will be transported to the cytoplasm where they will be translated into IFN. Preferably, the RRE / CRS sequence is introduced 3 'to the DNA sequence coding for an IFN.

1 ~ According to another variant, the expression of a DNA sequence in use in the present invention can be subjected to double regulation by TAT and REV, this which helps to bypass the expression escape problems observed commonly with certain promoters. In this case, an expression cassette according to the invention, can comprise a TAR type sequence and a sequence of 20 type RRE / CRS; so that if the expression is escaped, the few MRNA products will remain blocked in the nucleus. Only the penetration of HIV and synthesis of viral proteins TAT and REV may trigger synthesis from IFN.

2 ~ Furthermore, an expression cassette according to the invention can, in addition, contain other elements contributing to the expression of the DNA sequence coding for IFN, in particular, an intron, adequate splicing signals and elements of termination of transcription (polyadenylation signal). The choice and the localization of these elements is within the reach of the skilled person.
As preferred examples, there may be mentioned a cassette comprising from 5 'to 3':

(I) The 5 'HIV LTR, a DNA sequence coding for an IFN and the signal polyadenylation of SV40;

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.

(2) The HIV mini LTR, a DNA sequence encoding an IFN and the signal polyadenylation of SV40;

(3) Le promoteur PGK, la séquence TAR, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadenylation de SV40; (3) The PGK promoter, the TAR sequence, a DNA sequence coding for a IFN and the polyadenylation signal of SV40;

(4) Le promoteur ,~-actine, la séquence TAR, une séquence d'ADN codant pour un IFN et le signal de polyadénylation de SV40; (4) The promoter, ~ -actin, the TAR sequence, a DNA sequence coding for an IFN and the polyadenylation signal of SV40;

(5) Le promoteur SV40, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40; (5) The SV40 promoter, a DNA sequence coding for an IFN, the sequence RRE / CRS and the SV40 polyadenylation signal;

(6) Le LTR ~' du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40; (6) The HIV LTR ~ ', a DNA sequence coding for an IFN, the sequence RRE / CRS and the SV40 polyadenylation signal;

(7) Le mini LTR du VIH, une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV40; et.

20 (8) Le mini LTR du VIH, un site donneur d'épissage (du gène gag du VIH), une séquence d'ADN codant pour un IFN, la séquence RRE/CRS et le signal de polyadénylation de SV 40.

L'invention s'étend également aux vecteurs comprenant une cassette d'e~pl-es~ion25 selon l'invention. De tels vecteurs sont bien connus de l'homme de l'art, ainsi que les methodes pour les construire et les propager. On aura avantageusement recours à des vecteurs viraux derivés des rétrovirus, virus de l'herpès, adénovirus ou virus associés à l'adénovirus. Bien entendu on peut également employer des vecteurs synthetiques. Dans le cadre de l'invention, les vecteurs défectifs pour la 30 réplication, et notamment les vecteurs rétroviraux, sont particulièrement préférés.
Selon un mode de réalisation avantageux, une cassette selon l'invention est positionnée en orientation réverse par rapport aux LTRs du vecteur rétroviral, afin de positionner les promoteurs en sens inverse pour éviter les interférences. Bien entendu, un vecteur selon l'invention peut, en outre, comprendre un gène codant WO 95/16784 ~ i 6 ~ PCT/FR94/01458 pour un marqueur de sélection, comme par exemple, les gènes néomycine et puromycine acétyl transfërase conférant une résistance aux antibiotiques G418 etpuromycine. L'invention couvre également les virus et particules de vecteur viral obtenus par transfection du vecteur selon l'invention, dans une lignée cellulaire s d'encapsidation, notamment amphotrope, produisant les protéines structurales du virus en cause.

L'invention a également trait à une cellule eucaryote comprenant, une cassette d'expression ou un vecteur selon l'invention. Ces derniers peuvent être introduits lO soit i~ vitro dans une cellule prélevée du patient soit directement in vivo. La cellule est avantageusement une cellule humaine et, de manière préférée, une cellule de la lignée hématopoïétique (cellules souches ou lymphocytes primaires).

L'invention concerne également l'usage thérapeutique d'une cassette d'expression, s d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention, pour la fabrication d'un medicament destiné à la prévention ou au traitement des infections virales et, en particulier, des infections dues au VIH.

L'invention s'adresse é~alement à une composition pharmaceutique comprenant 20 à titre d'agent thérapeutique ou prophylactique une cassette d'expression, unvecteur ou une cellule selon l'invention, en association avec un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique.

Une composition pharmaceutique selon l'invention peut être fabriquée de manière 2s conventionnelle. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace d'un tel agent thérapeutique ou prophylactique à un support, un diluantou un adjuvant acceptable. Elle peut être a~lministrée par n'importe quelle voieconventionnelle en us.age dans le domaine de l'art. L'~dminictration peut avoir lieu en dose unique ou répétée après un certain délai d'intervalle. La quantité à
30 administrer sera choisie en fonction de différents critères, en particulier la voie d'administration, le patient, I'état d'évolution de la maladie et la durée du traitement. A titre indicatif, une composition pharmaceutique selon l'invention contient de 103 à 10~ ufp (unité formant des plages), avantageusement de 105 à
1013ufp, de p~érél~nce de 106 à 10l2 ufp et, de manière tout à fait préférée, de 107 wo 95/16784 21 ~ 5 ~ ~ ~ PCT/FR9 ltO1458 ~

à 101 ufp de particules de vecteur viral.

Par ailleurs, I'invention concerne une méthode de traitement des infections virales et, notamment à V~H, selon laquelle on administre une quantité thérapeutiquements e~lcace, d'une cassette d'expression, d'un vecteur ou d'une cellule selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement. Selon un premier protocole thérapeutique, on peut les administrer directement i~7 ~ivo, par exemple par voie intraveineuse. On préférera adopter un protocole de thérapie génique somatique qui consiste à prélever des cellules souches de moelle osseuse ou des Iymphocytes 10 du sang périphérique d'un patient, de les transfecter avec un vecteur selon l'invention, de les cultiver m vitro selon les techniques de l'art et de les ~minictrer au patient. A titre indicatif, il peut être avantageux d'employer 106 à 10I cellules par kg, de préférence 107 à 109 et, de manière préférée 5 x I07 à 5 x 1o8.

s Naturellement, ce protocole peut être sujet à de nombreuses variantes. En particulier, il peut être avantageux de combiner au moins deux cassettes, vecteurs ou cellules selon l'invention permettant l'expression d'un IFN de types différents, par exemple un IFNa et un IFN~.

20 L'invention est illustrée ci-après par référence aux figures suivantes.

La figure I schematise le vecteur pTG43 13 permettant l'expression d'une séquence d'ADN codant pour l'IFNa sous le contrôle du LTR du VIH.

La figure 2 représente le vecteur pTG4344 co-exprimant le gène IFNa et le gène de sélection puromycine.

La figure 3 schématise le vecteur rétroviral pTG4379 pour le transfert d'un gèneIFN et son expression inductible par TAT.
La figure 4 montre l'évolution de l'infection dans des cellules U937 infectées par le VIH III B et transfectées par les vecteurs d'expression de l'IFNa (o), ~ (-) et y (O), comparée au témoin cellules non transfectées (~

~Wo 95/1678~ 2 ~ ~ ~ 5 ~ 8 PCT/FR94/01458 La fi~ure 5 illustre le vecteur rétroviral pTG6324 comprenant les cassettes d'expression de l'lFNa (sous le contrôle du mini LTR du VIH) et du gène de selection ~l~;o (sous le contrôle du LTR 5' rétroviral).

La figure 6 illustre l'evolution de l'infection dans des PBL humains CD8-transduits par le vecteur pTG6327 (~) puis infectés par le virus VIH III B, comparée aux cellules non transduites (-).

EXEMPLES

Toutes les opérations de clonage détaillées ci-après, sont effectuées selon les techniques classiques de biologie moléculaire (Maniatis et al., 1989, LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Ces etapes sont réalisées dans la souche l~;scherichia coli (E. coli) 5K, XLl-Blue ou 1 106.

Les genes humains codant pour les rFNs a et ,~ ont été clonés par PCR
(Polymerase Chain Reaction) à partir de l'ADN génomique de cellules Iymphoïdes, par exemple de cellules CEM-A3 (dérivées d'une lignée CEM
20 disponible à l'ATCC sous le numéro CCLI 19). De telles banques sont disponibles dans le commerce. L'amplification de fragments d'ADN par PCR peut être efl~ectuee à l'aide de kits commerciaux selon les spécifications du fabricant ouselon la technologie décrite dans PCR Protocols-A (edited by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Press Inc) à l'aide d'amorces complémentaires aux 2~ séquences publiées. Le gène humain codant pour l'IFNy est obtenu du pTGI I
décrit dans la demande de brevet français publiée sous le numéro 2.583.429. Des sites de restriction appropriés ont été introduits en amont et en aval de l'ATG
initiateur et du codon stop des différents gènes IFN afin de pouvoir faciliter les étapes de clona~ge ultérieures. D'autre part, les sites de restriction protubérants en 30 5' peuvent être convertis en sites francs par traitement par le grand fragment Klenow de l'ADN polymerase d'L;: coli alors que les sites protubérants en 3' sont traites par la T4 polymérase.

EXEMPLE 1: Construction de vecteurs d'expression de l'interféron inductibles WO 95/16784 ~ I ~ 5 ~ 6 8 PCT/FRg~/01458 ~

par la protéine TAT du VIH et dans lesquels le ~ène de sélection çst çonstitué par le gène puromvcine.

A. Vec~e1n .s ~70~7 ~i/mlx d ~expJ essio~7 cle / IFN SOIIS le contrôle dll promotezlr dz~
VIH.

On décrit la construction de vecteurs dans lesquels l'expression des gènes IFNa,~, et y est placée sous le contrôle du LTR 5' du VIH. Ces vecteurs ont été
construits à partir du vecteur pTG1322 décrit dans Mehtali (1992, AIDS and Human Retroviruses, S, 1959-1965) comprenant un gène hétérologue placé sous le controle du LTR 5' du VIH (fragment X7toI-~ 7dlII de 725 pb correspondant aux positions -645 à +80 du génome VIH). Ce vecteur porte également l'intron et le signal de polyadénylation du virus SV40. Il est digéré par Hi~ldlII traité à la Klenow puis digéré par SmaI.

On introduit dans pTG1322 ainsi traité, le gène IFNa sous forme d'un fragment délimité par les sites Sn7al et EcoRI traité à la Klenow et on génère pTG4313 (Figure 1). pTG4314 est obtenu par insertion du fragment SntaI-EcoRV portant le gène IFN,B dans pTG 1322 obtenu comme précédemment. On génère pTG4315 20 par insertion du gène ~FNy sous forme d'un fragment HpaI-PvtlII entre les mêmes sites de pTG1322.

On introduit dans le site EcoRI de ces différents vecteurs d'expression d'un IFN, un gène de sélection confërant la résistance à la puromycine (puromycine R) sous2~ forme d'un fragment de 1,2 kb Ban7HI-Bgl~I traité à la Klenow. Ce fragment comporte le promoteur precoce du virus SV40, le gène puromycine R et le signal de polyadénylation de SV40. On obtient les vecteurs pTG4344 (représenté à la Figure 2), pTG4345 et pTG4346, qui permettent la co-expression du gène de sélection puromycine R et respectivement du gène IFNc~, ~ ou y.
B. Vec~eto rétroviralpo1tr le tra~7sfert et l'expressio~l des gè~?es IFN.

Le vecteur à la base des constructions est le pLXSP qui dérive de pLXSN (Miller et Rossman, 1989, Biotechniques, 7, 980-988) après remplacement du gène de WO 95/16784 ~ PCT/FR94/01458 sélection néomycine par le gène puromycine R et du LTR 3' de MSV (Myelo Sarcoma Virus) par le LTR 3' du MPSV (Myelo Proliferative Sarcoma Virus).

On isole du génome du VIH un fragment ScaI-~Ii )clIII de 200 pb correspondant au mini LTR (position - 120 à +80), qui est ensuite introduit en amont de chacundes gènes IFNs. Puis on introduit en 3' des gènes, le signal de polyadénylation du SV40. Le vecteur ainsi obtenu est digéré par Bgf~I, traité à la Klenow. Le fragment comportant la cassette d'expression "mini LTR - IFN - signal de polyadénylation" est introduit entre les sites HpaI-BgllI du vecteur rétroviral lo pTG4056. On selectionne les clones dans lesquels ce fragment est positionné en orientation réverse par rapport aux LTRs 5' et 3'. pTG4056 provient du pLXSP à
la suite de la délétion du bloc d'expression promoteur SV40-puromycine R et la réinsertion du gène puromycine R dans l'orientation correcte pour être placé sous le contrôle du LTR 5'.
1~
On obtient les vecteurs rétroviraux pTG4392, pTG4391 et pTG4~79 (Figure 3) permettant le transfert et l'expression des séquences codant respectivement pourles IFNs a, ,~ et y. Ils peuvent être transfectés dans une lignée cellulaire d'encapsidation amphotrope, par exemple la lignée PA317 (Miller et al., 1986, Mol. Cell., Biol. 6, 2895-2902), Gp Env. Am (Markowitz et al., 1988, Virology, 167, 400-406) ou PG13 (Miller et al., 1991, J. Virol, 6~, 2220-2224). Le jour suivant, les cellules transfectées sont placees en milieu sélectif (puromycine 6~lg/ml). On isole les cellules résistantes qui constitueront des lignées productrices de particules amphotropes capables d'infecter les cellules humaines, à partir 2~ desquelles on peut constituer un stock viral susceptible d'être utilisé en thérapie génique anti SIDA.

C. Vectem s r églllable.s pa~ TA T da~ls lesq1/els l'expre.ssio~l de l 'IrN es~ dirigée pa~ ?1~7 p~ on70tel/r ellca~yote.
I . Promoteur PGK murin.

La sequence TAR (correspondant aux nucléotides + I à +80 du génome du VIH) est générée par synthèse chimique. Puis, I'oligonucléotide double brin ainsi obtenu wo 95/16784 PCT/FRg4/014~8 ~
~ ~5~68 12-est introduit par mutagénèse insertionnelle en position +1 du promoteur PGK
murin, dont la séquence est publiee dans Adra et al. (1987, Gene, 60, 65-74). Oninsère en aval de la séquence TAR, le fragment comportant la séquence codant pour l'IFN humain a, ~ ou y suivie du signal de polyadénylation de SV40.

Enfin, la cassette d'expression "promoteur PGK-TAR-IFN-polyA" est introduite dans le vecteur rétroviral pLXSP. Bien entendu à chaque séquence IFNa, ~ ou y correspond un vecteur rétroviral. Comme précédemment, on établit une lignée d'encapsidation amphotrope productrice de chaque type de particules virales.

2. Promoteur ~-actine murin.

L'exemple précédent est reproduit avec la variante suivante:

l s La sequence synthétique TAR est introduite en position +l du promoteur ~-actine de rat dont la séquence est décrite dans Nudel et al., (1983, Nucleic Acids Res., ll, 1759-1771) EXEMPLE 2: Construction de vecteurs d'expression d'un IFN humain 20 inductibles par la protéine TAT du VIH et dans lesquels le ~ène de sélection est constitué par le ~ène néomycine et établissement de li~nées amphotropes correspondantes.

A. C0~7.5~tllCtiO~I ~,JI( pTG632~ polm l'exp~essio~7 de l'IFNa.
2~
En premier lieu, le mini LTR du VIH est isolé du génome viral après digestion ScaI - Hil~dIII, inséré dans un plasmide quelconque pour être resorti sous formed'un fragment Smc7I-Hi~7dIII puis cloné entre les mêmes sites du vecteur pTG2359.
Ce dernier correspond au clonage du site de polyadénylation du virus SV40 dans 30 le plasmide p Biuescript KS (Stratagène). On obtient pTG4347 dans lequel on introduit, après digestion par BnlI, un fragment SmoI-HpaI portant les séquencescodant pour l'IFNa.

Enfin, la cassette d'expression "mini LTR-IFNa-polyA SV40" est purifiée du WO 95116784 ~ 1 5 S ~ ~ 8 PCT/~R94/014~8 vecteur pTG4355 obtenu a l'étape précédente sous forme d'un fragment BamHI-Bg/II, qui est cloné dans le site BamH~ de pTG6320 pour donner pTG6324 (Figure S). Ce dernier comprend donc le LTR du MSV dirigeant l'expression du gène de selection ~7~;0 suivi de la cassette "mini LTR - IFNa - polyA SV40" positionnée en orientation réverse afin d'éviter les phénomènes d'interférence entre les promoteurs et enfin le LTR 3' rétroviral du MPSV. A titre indicatif, pTG6320 provient du pLXSP à la suite de la dététion de la cassette d'expression du gène puromycine et remplacement par le gène néomycine (Colbère - Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol., l~n, 1-14).

B. C0~7slr7rclio~7 ~1~ pTG63~S pOIII I expressio~ ~ I IFNy.

La stratégie de clonage est tout a fait similaire à ce qui est décrit ci-dessus. Le vecteur pTG6311 provient de l'insertion d'un fragment SmaI-HpnI portant la séquence codant pour l'IFNy dans le site Ba/I du pTG4347. Puis, on obtient le vecteur rétroviral pTG6328 en clonant le fragment Ban~HI-Bg/II purifié du pTG6311 dans le vecteur pTG6320 préalablement digéré par BamHI. Celui-ci est l'équivalent de pTG6324 à la différence qu'il porte le gène IFNy à la place du gène IFNa.
C. Co~lstrllctio~l dl~ vect~ c;trovilalpTG6327poln l'explessio~7 de lIFNp.

Le fragment .SntaI-Hi~fllI portant le mini LTR VIH est inséré entre les mêmes sites de pTG43S6, pour générer pTG6312. Le vecteur pTG4356 correspond au 2~ vecteur pTG2359 dans lequel on a cloné (site Ba/I) le gène IFN ,~ (fragment SnlaI-EcoRV). Comme précédemment, la cassette d'expression de l'IFN~ est purifiée de pTG6312 après digestion par Ban1HI et Bg/II puis sous-clonée dans lesite Bnn1HI de pTG6320 pour donner pTG6327.

30 D. ~;~abliss~n7e~ le /ig~-~;es an7phot7 opes po~lr la prodllction de parlic~lles virales infectiellse.s~

On peut preparer des stocks de particules virales infectieuses à partir de chacun des vecteurs précédents pTG6324, pTG6327 et pTG6328. Pour ce faire, ces WO 95/16784 PCT/ElR9 1/014;~8 21 ~5s~6~ 14 -derniers sont transfectés de manière classique dans une lignée d'encapsidation ecotrope, par exemple la li ~née GP + E 86 (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120- 1124). 48 h apres la transfection, les cellules sont cultivées en milieu sélectif (G418 I mg/ml).
-Le mélange de clones résistants au G418 est maintenu pendant 3 jourssupplémentaires en milieu sélectif. Le surnageant de culture est récolté pour infecter de façon conventionnelle, une lignée d'encapsidation amphotrope comme la lignée PA317. Après sélection, les lignées ainsi obtenues constitueront les 10 cellules productrices de particules virales infectieuses permettant le transfert et l'expression des différents IFNs dans le cadre d'une thérapie génique humaine.

Leur capacité à produire un IFN actif peut être évaluée dans les surnageants de culture par la méthode décrite dans The Interferon System (W.E. Stewart, 1979, 1~ Ed: Springer-Verlag Wien, New York). Ce test de fonctionnalité, lorsqu'il esteffectué sur les cellules générées à l'étape précédente, donne un niveau faible d'lFN dans les trois cas. Par contre, lorsque les cellules sont transfectées de manière transitoire par le plasmide pHMG-TAT, le niveau mesuré est élévé et atteint quelques centaines d'unité par ml. pHMG-TAT est un vecteur d'expression 20 de la protéine TAT native et résulte du clonage de la séquence codant pour celle-ci dans le vecteur pHMG (Mehtali et al., 1990, Gene, 91, 179-184).

Par ailleurs, il peut être intéressant d'isoler des clones producteurs. Ceci est réalisé
classiquement par la technique de dilution clonale (0,3 cellule par puit). On 2~ sélectionne un clone bon producteur de virions titrant 5x lo6 à 107 ufp/ml après infection des cellules murines NIH-3T3 (ATCC CRL 1658) par une aliquote de surnageant de culture du clone. On vérifie sa capacité à produire de l'IFN commeindiqué précédemment. On effectue à nouveau une dilution clonale à partir des clones précédents afin de générer des sous-clones. On sélectionne pour chacun 30 d'entre eux un sous clone bon producteur de virions et d'IFN après titration et dosage de l'IFN.

Les sous-clones sont congelés avant utilisation dans un but de thérapie génique.

~ WO 9~/16784 21 ~i ~ 5 613 PCT~R94/01458 EXEMPLE 3: Constmction de vecteurs d'expression d'un IFN humain inductibles par la protéine REV du VIH.

On decrit un vecteur rétroviral par insertion dans le vecteur pLXSP et dans s l'orientation réverse par rapport aux LTRs, d'une cassette d'expression comprenant de 5' vers 3' :

- le promoteur du virus SV40;
- la séquence d'ADN codant pour l'IFN humain a, ~ ou y;
- la séquence RRE/CRS. Cette dernière est isolée du génome du VIH-I
isolat Lai sous forme d'un fragment BglII-BamHI (s'étendant des nucléotides 7178 à 8032 de la séquence telle que publiée par Wain-Hobson et al., s~.~/p~n) Ce fragment peut être traité par la Klenow avant d'être introduit dans un site de restriction adéquat; et - le signal de polyadénylation de SV40.

Comme précédemment, on peut constituer des stocks viraux après transfection dans une lignée d'encapsidation amphotrope.

20 EXEMPLE 4: Construction de vecteurs d'expression d'un rFN humain inductibles par les protéines TAT et REV du VIH.

On insère dans les vecteurs pTG4392, pTG439 1 et pTG4379 le fragment BQmH1 BglII traité à la Klenow et porteur de la séquence RRE/CRS du VIH entre la 2s séquence codant pour un des IFNs et le signal de polyadénylation de SV40.

De plus, les vecteurs ainsi obtenus peuvent être modifiés par l'insertion d'un site donneur d'épissage entre le LTR du VIH et le gène IFN.

30 Comme precédemment, on peut générer une lignée amphotrope productrice de particules infectieuses correspondant à chacun des vecteurs ainsi obtenus.

EXEMPLE 5: Résistance à l'infection virale des li~nées cellulaires transfectées par les vecteurs d'expression de l'IFN inductibles par TAT.

WO 95/16784 PCT/FR94/01458 ~

2~ 8 - 16-Les expérimentations ci-après decrites sont effectuées dans des lignées cellulaires naturellement infectables par le VIH, comme:

- la lignée U937 (ATCC CRL1593) dérivée de monocytes hllm~in~; et - la lignée CEM-A3 dérivée de cellules Iymphocytaires humaines CD4+
(ATCC CCLI 19).

10 En pratique, les cellules sont cultivées selon les recommandations du fournisseur et transfectées par électroporation d'au moins 20 ,ug d'ADN à l'aide d'un appareillage approprié (Gene Pulser Biorad, voltage 21 0V, capacitance 960,uF).

Dans une première expérience, on co-électropore dans les cellules U937 (2x107 I s cellules) le pTG43 14 avec le vecteur pLXSP dans un rapport de concentration en ADN 20:1. Les cellules sont remises en culture à 37C en présence de 5 % de CO, et le jour suivant, placées en milieu sélectif (puromycine 0,5 llg/ml). On sélectionne les cellules résistantes à l'antibiotique.

20 On teste leur résistance à l'infection en les infectant par une préparation de VIH
à une TCID50 élevée (au moins 1000). La TCID50 est déterminée selon la méthode décrite dans Reed et al., (193g, Am. J. Hyg., 27, 493-497), sur lignées cellulaires infectables par le VIH, comme les cellules CEM. Elle correspond à la dose à
laquelle S0 % des cellules sont infectées et 50 % ne le sont pas. Elle est vérifiée 2s pour chaque lot de VIH employé.

Pour ce faire, on prélève une fraction de la culture cellulaire U937 électroporée, correspondant à environ 106 cellules, que l'on centrifuge à basse vitesse. Aprèslavage, le culot cellulaire est repris dans 200 ~ll de milieu de culture en absence 30 de serum. Puis les cellules sont traitées par différentes dilutions de la préparation virale. On laisse l'infection se poursuivre I heure à 37C.

Les cellules sont ensuite lavées 2 fois dans du milieu de culture et mises en culture dans 5 ml du même milieu, complémenté avec 10 % de SVF (sérum de veau 3~ foetal). Le milieu est renouvelé 2 ou 3 fois par semaine. La propagation du virus est évaluée par mesure de l'activité réverse-transcriptase à intervalles réguliers 21 5~
~ WO 95/16784 PCT/FR94/01458 - dans le surnageant de culture selon la méthode décrite dans Spire et al. (1985, Lancet, i, 188-189).

On observe une diminution significative Gusqu'à 85 %) de l'activité réverse-5 transcriptase sur 14 jours post-infection par rapport aux cellules U937 témoin non électroporée avec un vecteur d'expression de l'interféron.

L'expérience est répétée cette fois avec des cellules U93 7 initialement électroporées avec le pTG4344, pTG43~5 ou pTG4346. Dans les trois cas, on 10 observe une diminution encore supérieure de l'activité réverse-transcriptase sur 21 jours post-infection par rapport au témoin cellules non électroporées. (Figure 4).

EXElvlPLE 6: Mécanisme moléculaire de la résistance à l'infection VIH.

L'analyse est effectuee sur les cellules U937 électroporée et infectée i~7 vitro par le VIH (exemple 5).

On recherche tout d'abord la présence du génome du VIH dans une pl~pal~ion 20 d'ADN génomique cellulaire. Ceci est réalisé par PCR à l'aide d'amorces adéquates permettant l'amplif!cation d'un fragment du gène gag viral. La présence d'une bande d'amplification de taille attendue indique que l'expression de l'IFN n'interfère pas avec l'intégration du génome du VIH sous forme provirale dans les ch~omosomes cellulaires.
2s Il a également été possible de détecter la présence des ARNm codant pour les produits du gène gag par la technique de reverse-transcription PCR (mêmes amorces que précédemment). Ceci laisse supposer que l'expression de l'IFN n'a pas d'effet notable sur la transcription des séquences provirales.
Enfin, on évalue la présence et la localisation de la protéine virale gpl20 par immunofluorescence à l'aide d'un anticorps anti-gpl20 (obtenu de sérum de patients séropositifs). On constate que dans les cellules exprimant l'IF~, la protéine gpl20 est sous forme intracellulaire, alors qu'elle devrait être sous-membranaire, afin de3s permettre le bourgeonnement des particules virales.

wo 95/16784 PCT~g~/01458 2~ 8 18-Dans leur ensemble, ces résultats indiquent que l'IF~ agit au niveau des étapes tardives du cycle viral et probablement au niveau de l'assemblage des virions.

EXEMPLE 7 Méthode de traitement du SIDA par thérapie ~énique.
-Dans le cadre d'une thérapie génique appliquee à l'homme, deux types de cellulescibles peuvent être envisagés:

- les Iymphocytes CD4+ du sang périphérique qui peuvent être collectés o notamment par leucophérèse, et - les cellules souches hématopoïétiques CD34+ qui peuvent être obtenues d'un prélèvement de moëlle osseuse ou du sang périphérique (mobilisation par chimiotherapie ou par action de facteurs de croissance hématopoïétiques).
1~
A. Pro~ocole appliqllable allx cellules CW+

Le patient est soumis à un prélèvement de sang ou à une leucophérèse. Après avoir éliminé les globules rouges, les cellules mononuclées sont isolées par centrifugation sur Ficoll et cultivees selon les techniques de l'art. Dans un premier temps, on se debarasse des cellules adhérentes au plastique des flasques de culture. La suspension cellulaire est recupéree et cultivée dans des flasques revêties d'anticorps anti-CD8 (Immunotech) afin d'éliminer les cellules CD8+. La suspension cellulaire ainsi obtenue est composee majoritairement de Iymphocytes CD4+. Bien entendll, les 2~ autres techniques d'enrichissement peuvent également être employées.

Ceux-ci sont stimulés dans le but d'induire la division cellulaire avant d'effectuer la transduction retrovirale. Les facteurs de croissance pouvant être mis en oeuvre à cet ef~et sont varies. A titre indicatif, on peut citer un mélange d'anticorps anti CD3 humain (Immunotech, environ 10 ng/ml) et d'IL-2 (Cetus; 100 Ulml) ou encore de PHA (phytohemagglutidine, Sigma, à une concentration d'environ 5 ~lg/ml) et d'IL-2.

Après 72 heures de culture dans ces conditions, les cellules sont tr~ncduites par le vecteur rétroviral. Différentes méthodologies sont applicables:
3~ ..
- co-culture des cellules CD4+ et des cellules productrices amphotropes des _ wo 95/16784 PCTIFR94/014~8 ~ 2 1 ~

- exemples I à 4.

- co-culture des 2 types cellulaires, les cellules CD4+ étant déposées dans les puits de culture et les cellules productrices dans un Transwell (Costar) s - infection des cellules CD4+ avec une aliquote de surnageant de culture des cellules productrices selon une m.o.i. (multiplicité d'infection) de préférence comprise entre I et 5.

o Généralement la transduction est réalisée en présence de sulfate de protamine (à une concentration d'environ S ~,lg/ml) pour favoriser l'attachement du virus à la surface cellulaire.

Le jour suivant, la culture cellulaire est passée en milieu sélectif (puromycine dans I S le cadre des vecteurs de l'exemple I ou G4 18 dans le cadre des vecteurs de l'exemple 2) et poursuivie pendant 7 à 8 jours jusqu'à obtenir le nombre de cellules appropriées.
On indique qu'il peut être avantageux d'employer le milieu AIM V (Gibco BRL) complémenté par de la L-glutamine (2 mM) et de llL-2 (100 U/ml) et dépourvu de sérum.
La capacite de ces cellules à inhiber la réplication du VIH est testée i~ vitro. Elles sont infectées par le VIH-I IIIB à une m.o.i. de lo-2 selon la méthodologie classique dans le domaine de l'art. Après lavage et remise en culture, la propagation du virus est évaluée par mesure de l'activité réverse-transcriptase dans le surnageant de2~ culture (Figure 6). Celle-ci se situe à un niveau très bas pendant au moins 20 jours de culture A titre comparatif, dans le cas des cellules non transduites, l'activité
réverse-transcriptase augmente très fortement jusqu'à atteindre un maximum dès le troisième jour de culture et est rapidement suivie de la mort cellulaire.

30 B. Protocole app/icable a71x cell~lles CD3~+.

Les étapes de la purification des cellules CD34 sont les suivantes:

- isolement des cellules mononuclées du prélèvement de sang périphérique ou de 3~ moëlle osseuse par centrifugation Ficoll, ~155~S8 - déplétion des cellules adherentes, et - capture des cellules CD34+ par culture dans des flasques recouvertes d'anticorps anti-CD34 (lmmunotech) ou en présence de billes revêtues de cet anticorps. On élimine les cellules en suspension et on récupère les cellules adhérentes après action, par exemple, de papaïne.

Comme précédemment, les cellules CD34+ ainsi obtenues sont stimulées par divers facteurs de croissance pour les placer en cycle de division et ainsi favoriser l'infection rétrovirale. On peut utiliser à cet effet un mélange d'IL-3 (environ 10 ng/ml), d'IL-6 (à environ S0 U/ml) et de SCF (Stem cell factor, environ 50 U/ml) incorporé dans le milieu de culture pendant 48 heures avant d'effectuer la transduction selon le protocole indiqué précédemment. Ces facteurs sont disponibles commercialement.
Les cellules sont ensuite réadministrées au patient. (7) The HIV mini LTR, a DNA sequence coding for an IFN, the sequence RRE / CRS and the SV40 polyadenylation signal; and.

(8) The HIV mini LTR, a splice donor site (of the HIV gag gene), a DNA sequence encoding an IFN, the RRE / CRS sequence and the signal polyadenylation of SV 40.

The invention also extends to vectors comprising a cassette of e ~ pl-es ~ ion25 according to the invention. Such vectors are well known to those skilled in the art, as well as the methods to build and propagate them. We will advantageously have recourse to viral vectors derived from retroviruses, herpes virus, adenovirus or virus associated with adenovirus. Of course we can also use vectors synthetics. In the context of the invention, the defective vectors for the Replication, and in particular retroviral vectors, are particularly preferred.
According to an advantageous embodiment, a cassette according to the invention is positioned in reverse orientation relative to the LTRs of the retroviral vector, so to position the promoters in the opposite direction to avoid interference. Good understood, a vector according to the invention can, in addition, comprise a gene coding WO 95/16784 ~ i 6 ~ PCT / FR94 / 01458 for a selection marker, such as, for example, the neomycin and puromycin acetyl transferase conferring resistance to antibiotics G418 and puromycin. The invention also covers viruses and viral vector particles.
obtained by transfection of the vector according to the invention, in a cell line s of encapsidation, in particular amphotropic, producing the structural proteins of virus involved.

The invention also relates to a eukaryotic cell comprising, a cassette of expression or a vector according to the invention. These can be entered lO either i ~ vitro in a cell taken from the patient or directly in vivo. The cell is advantageously a human cell and, preferably, a hematopoietic cell (stem cells or primary lymphocytes).

The invention also relates to the therapeutic use of an expression cassette, s of a vector or a cell according to the invention, for the manufacture of a medication for the prevention or treatment of viral infections and, in particular especially HIV infections.

The invention is also directed to a pharmaceutical composition comprising As a therapeutic or prophylactic agent, an expression cassette, a vector or a cell according to the invention, in combination with a vehicle acceptable from a pharmaceutical point of view.

A pharmaceutical composition according to the invention can be manufactured so 2s conventional. In particular, we associate a quantity therapeutically effective of such a therapeutic or prophylactic agent to a support, an acceptable diluent or adjuvant. It can be administered by any conventional usage in the field of art. Administration can take place as a single or repeated dose after a certain interval. The amount to 30 to administer will be chosen according to different criteria, in particular the route administration, the patient, the progress of the disease and the duration of treatment. As an indication, a pharmaceutical composition according to the invention contains from 103 to 10 ~ pfu (unit forming areas), advantageously from 105 to 1013ufp, from p ~ erel ~ nce from 106 to 10l2 ufp and, most preferably, from 107 wo 95/16784 21 ~ 5 ~ ~ ~ PCT / FR9 ltO1458 ~

to 101 pfu of viral vector particles.

Furthermore, the invention relates to a method of treatment of viral infections and, in particular at V ~ H, according to which a therapeutic amount is administered e ~ lcace, an expression cassette, a vector or a cell according to the invention to a patient in need of such treatment. According to a first protocol therapeutic, they can be administered directly i ~ 7 ~ ivo, for example by intravenous. We would prefer to adopt a somatic gene therapy protocol which consists of collecting bone marrow stem cells or lymphocytes 10 of a patient's peripheral blood, transfect them with a vector according to the invention, to cultivate them in vitro according to the techniques of the art and to minify them to the patient. As an indication, it may be advantageous to use 106 to 10I cells per kg, preferably 107 to 109 and preferably 5 x 107 to 5 x 10 8.

s Of course, this protocol can be subject to many variations. In particular, it may be advantageous to combine at least two cassettes, vectors or cells according to the invention allowing the expression of an IFN of different types, for example an IFNa and an IFN ~.

The invention is illustrated below with reference to the following figures.

Figure I shows the vector pTG43 13 allowing the expression of a DNA sequence coding for IFNa under the control of HIV LTR.

FIG. 2 represents the vector pTG4344 co-expressing the IFNa gene and the gene puromycin selection.

FIG. 3 diagrams the retroviral vector pTG4379 for the transfer of an IFN gene and its expression inducible by TAT.
FIG. 4 shows the evolution of the infection in U937 cells infected with HIV III B and transfected with IFNa expression vectors (o), ~ (-) and y (O), compared to the non-transfected cell control (~

~ Wo 95/1678 ~ 2 ~ ~ ~ 5 ~ 8 PCT / FR94 / 01458 Figure 5 illustrates the retroviral vector pTG6324 comprising the cassettes of expression of IFNa (under the control of the mini LTR of HIV) and of the gene selection ~ l ~; o (under the control of LTR 5 'retroviral).

Figure 6 illustrates the course of infection in human CD8- PBLs transduced by the vector pTG6327 (~) then infected with the HIV III B virus, compared to non-transduced cells (-).

EXAMPLES

All the cloning operations detailed below are carried out according to the classical techniques of molecular biology (Maniatis et al., 1989, LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). These stages are carried out in the strain l; scherichia coli (E. coli) 5K, XLl-Blue or 1,106.

Human genes coding for rFNs a and, ~ were cloned by PCR
(Polymerase Chain Reaction) from the genomic DNA of cells Iymphoids, for example CEM-A3 cells (derived from a CEM line 20 available from ATCC under number CCLI 19). Such banks are available in trade. Amplification of DNA fragments by PCR can be carried out using commercial kits according to the manufacturer's specifications or according to the technology described in PCR Protocols-A (edited by Innis, Gelfand, Sninsky and White, Academic Press Inc) using primers complementary to 2 ~ published sequences. The human gene coding for IFNy is obtained from pTGI I
described in the French patent application published under the number 2.583.429. Of appropriate restriction sites have been introduced upstream and downstream of the ATG
initiator and stop codon of the various IFN genes in order to be able to facilitate later clona ~ ge steps. On the other hand, the protruding restriction sites in 30 5 'can be converted into free sites by treatment with the large fragment Klenow of L; DNA polymerase: coli while the protruding 3 'sites are treated with T4 polymerase.

EXAMPLE 1 Construction of Inducible Interferon Expression Vectors WO 95/16784 ~ I ~ 5 ~ 6 8 PCT / FRg ~ / 01458 ~

by the TAT protein of HIV and in which the ~ ene of selection is constituted by the puromvcine gene.

A. Vec ~ e1n .s ~ 70 ~ 7 ~ i / mlx d ~ expJ essio ~ 7 cle / IFN BE control dll promotezlr dz ~
HIV.

The construction of vectors is described in which the expression of the IFNa, ~, and genes there is placed under the control of the 5 'HIV LTR. These vectors were constructed from the vector pTG1322 described in Mehtali (1992, AIDS and Human Retroviruses, S, 1959-1965) comprising a heterologous gene placed under control of the HIV 5 ′ LTR (fragment X7toI- ~ 7dlII of 725 bp corresponding at positions -645 to +80 of the HIV genome). This vector also carries the intron and the SV40 virus polyadenylation signal. It is digested with Hi ~ ldlII treated with Klenow then digested by SmaI.

Is introduced into pTG1322 thus treated, the IFNa gene in the form of a fragment delimited by the Sn7al and EcoRI sites treated with Klenow and we generate pTG4313 (Figure 1). pTG4314 is obtained by insertion of the SntaI-EcoRV fragment carrying the IFN, B gene in pTG 1322 obtained as above. We generate pTG4315 By insertion of the ~ FNy gene in the form of an HpaI-PvtlII fragment between the same pTG1322 sites.

These different vectors for expression of an IFN are introduced into the EcoRI site, a selection gene conferring resistance to puromycin (puromycin R) in 2 ~ form of a 1.2 kb fragment Ban7HI-Bgl ~ I treated with Klenow. This fragment contains the SV40 early promoter, the puromycin R gene and the signal polyadenylation of SV40. We obtain the vectors pTG4344 (shown in the Figure 2), pTG4345 and pTG4346, which allow the co-expression of the gene selection puromycin R and respectively of the IFNc ~, ~ or y gene.
B. Vec ~ eto retroviralpo1tr tra ~ 7sfert and expressio ~ l gè ~? Es IFN.

The vector at the base of the constructions is pLXSP which derives from pLXSN (Miller and Rossman, 1989, Biotechniques, 7, 980-988) after replacement of the gene for WO 95/16784 ~ PCT / FR94 / 01458 neomycin selection by puromycin R gene and 3 'LTR from MSV (Myelo Sarcoma Virus) by the 3 'LTR of MPSV (Myelo Proliferative Sarcoma Virus).

A 200 bp corresponding ScaI- ~ Ii) clIII fragment is isolated from the HIV genome to the mini LTR (position - 120 to +80), which is then introduced upstream of each of the IFNs genes. Then we introduce in 3 'genes, the polyadenylation signal of SV40. The vector thus obtained is digested with Bgf ~ I, treated with Klenow. The fragment containing the expression cassette "mini LTR - IFN - signal polyadenylation "is introduced between the HpaI-BgllI sites of the retroviral vector lo pTG4056. We select the clones in which this fragment is positioned in reverse orientation compared to 5 'and 3' LTRs. pTG4056 comes from the pLXSP at following the deletion of the SV40-puromycin R promoter expression block and the reinsertion of the puromycin R gene in the correct orientation to be placed under 5 'LTR control.
1 ~
We obtain the retroviral vectors pTG4392, pTG4391 and pTG4 ~ 79 (Figure 3) allowing the transfer and the expression of the sequences coding respectively for IFNs a,, ~ and y. They can be transfected into a cell line amphotropic packaging, for example the PA317 line (Miller et al., 1986, Mol. Cell., Biol. 6, 2895-2902), Gp Approx. Am (Markowitz et al., 1988, Virology, 167, 400-406) or PG13 (Miller et al., 1991, J. Virol, 6 ~, 2220-2224). The day next, the transfected cells are placed in a selective medium (puromycin 6 ~ lg / ml). We isolate the resistant cells which will constitute producing lines amphotropic particles capable of infecting human cells, from 2 ~ which one can build up a viral stock capable of being used in therapy anti AIDS gene.

C. Vectem sr églllable.s pa ~ TA T da ~ ls lesq1 / els the express.ssio ~ l of the IrN es ~ directed pa ~? 1 ~ 7 p ~ on70tel / r ellca ~ yote.
I. Murine PGK promoter.

The TAR sequence (corresponding to nucleotides + I to +80 of the HIV genome) is generated by chemical synthesis. Then, the double-stranded oligonucleotide thus obtained wo 95/16784 PCT / FRg4 / 014 ~ 8 ~
~ ~ 5 ~ 68 12-is introduced by insertional mutagenesis in position +1 of the PGK promoter murine, the sequence of which is published in Adra et al. (1987, Gene, 60, 65-74). One inserts downstream of the TAR sequence, the fragment comprising the sequence coding for human IFN a, ~ or y followed by the polyadenylation signal of SV40.

Finally, the expression cassette "PGK-TAR-IFN-polyA promoter" is introduced.
in the retroviral vector pLXSP. Of course at each IFNa sequence, ~ or y corresponds to a retroviral vector. As before, we establish a line amphotropic packaging producing each type of viral particle.

2. Promoter ~ murine actin.

The previous example is reproduced with the following variant:

ls The synthetic TAR sequence is introduced in position + l of the ~ -actin promoter rat whose sequence is described in Nudel et al., (1983, Nucleic Acids Res., ll, 1759-1771) EXAMPLE 2 Construction of expression vectors for a human IFN
20 inducible by the HIV TAT protein and in which the selection ene is consisting of the neomycin ~ ene and establishment of amphotropic lines corresponding.

A. C0 ~ 7.5 ~ tllCtiO ~ I ~, JI (pTG632 ~ polm the exp ~ essio ~ 7 of IFNa.
2 ~
First, the mini HIV LTR is isolated from the viral genome after digestion ScaI - Hil ~ dIII, inserted into any plasmid to be resorted to in the form of a Smc7I-Hi ~ 7dIII fragment then cloned between the same sites of the vector pTG2359.
The latter corresponds to the cloning of the polyadenylation site of the SV40 virus into The plasmid p Biuescript KS (Stratagene). We obtain pTG4347 in which we introduced, after digestion with BnlI, a SmoI-HpaI fragment carrying the sequences coding for IFNa.

Finally, the "mini LTR-IFNa-polyA SV40" expression cassette is purified from WO 95116784 ~ 1 5 S ~ ~ 8 PCT / ~ R94 / 014 ~ 8 vector pTG4355 obtained in the previous step in the form of a BamHI- fragment Bg / II, which is cloned into the BamH ~ site of pTG6320 to give pTG6324 (Figure S). The latter therefore includes the MSV LTR directing the expression of the selection ~ 7 ~; 0 followed by the cassette "mini LTR - IFNa - polyA SV40" positioned in reverse orientation in order to avoid interference phenomena between the promoters and finally the 3 'retroviral LTR of MPSV. As an indication, pTG6320 comes from pLXSP as a result of the detection of the gene expression cassette puromycin and replacement with the neomycin gene (Colbère - Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol., L ~ n, 1-14).

B. C0 ~ 7slr7rclio ~ 7 ~ 1 ~ pTG63 ~ S pOIII I expressio ~ ~ I IFNy.

The cloning strategy is quite similar to what is described above. The vector pTG6311 comes from the insertion of a SmaI-HpnI fragment carrying the sequence coding for IFNγ in the Ba / I site of pTG4347. Then we get the retroviral vector pTG6328 by cloning the purified Ban ~ HI-Bg / II fragment of pTG6311 in the vector pTG6320 previously digested with BamHI. It is the equivalent of pTG6324 with the difference that it carries the IFNy gene in place of the IFNa gene.
C. Co ~ lstrllctio ~ l dl ~ vect ~ c; trovilalpTG6327poln the explessio ~ 7 of lIFNp.

The .SntaI-Hi ~ fllI fragment carrying the mini HIV LTR is inserted between the same pTG43S6 sites, to generate pTG6312. The vector pTG4356 corresponds to 2 ~ vector pTG2359 into which the IFN gene has been cloned (site Ba / I), ~ (fragment SnlaI-EcoRV). As before, the IFN ~ expression cassette is purified from pTG6312 after digestion with Ban1HI and Bg / II then subcloned into the Bnn1HI site of pTG6320 to give pTG6327.

30 D. ~; ~ abliss ~ n7e ~ le / ig ~ - ~; es an7phot7 opes po ~ lr the prodllction of parlic ~ lles virales infectiellse.s ~

Stocks of infectious viral particles can be prepared from each of the above vectors pTG6324, pTG6327 and pTG6328. To do this, these WO 95/16784 PCT / ElR9 1/014; ~ 8 21 ~ 5s ~ 6 ~ 14 -the latter are transfected in a conventional manner into an packaging line ecotrope, for example the GP + E 86 line (Markowitz et al., 1988, J. Virol., 62, 1120-1124). 48 h after transfection, the cells are cultured in a selective medium (G418 I mg / ml).
-The mixture of clones resistant to G418 is maintained for 3 additional days in a selective medium. The culture supernatant is collected for conventionally infect an amphotropic packaging line such as the PA317 line. After selection, the lines thus obtained will constitute the 10 cells producing infectious viral particles allowing the transfer and the expression of the various IFNs in the context of human gene therapy.

Their ability to produce an active IFN can be assessed in the supernatants of culture by the method described in The Interferon System (WE Stewart, 1979, 1 ~ Ed: Springer-Verlag Wien, New York). This functionality test, when performed on the cells generated in the previous step, gives a low level in all three cases. On the other hand, when the cells are transfected with transiently by the plasmid pHMG-TAT, the level measured is raised and reaches a few hundred units per ml. pHMG-TAT is an expression vector 20 of the native TAT protein and results from the cloning of the sequence coding for it ci in the vector pHMG (Mehtali et al., 1990, Gene, 91, 179-184).

Furthermore, it may be advantageous to isolate producer clones. This is achieved conventionally by the clonal dilution technique (0.3 cells per well). We 2 ~ select a good clone producer of virions titrating 5x lo6 at 107 pfu / ml after NIH-3T3 murine cell infection (ATCC CRL 1658) with an aliquot of culture supernatant of the clone. We check its ability to produce IFN as indicated above. A clonal dilution is again carried out from the previous clones in order to generate subclones. We select for each 30 of them a good clone producer of virions and IFN after titration and IFN assay.

The subclones are frozen before use for the purpose of gene therapy.

~ WO 9 ~ / 16784 21 ~ i ~ 5 613 PCT ~ R94 / 01458 EXAMPLE 3 Construction of Human IFN Expression Vectors inducible by the HIV REV protein.

A retroviral vector is described by insertion into the vector pLXSP and into s the reverse orientation with respect to the LTRs, of an expression cassette comprising from 5 'to 3':

- the promoter of the SV40 virus;
- the DNA sequence coding for human IFN a, ~ or y;
- the RRE / CRS sequence. The latter is isolated from the HIV-I genome Lai isolate as a BglII-BamHI fragment (extending from nucleotides 7178 to 8032 of the sequence as published by Wain-Hobson et al., S ~. ~ / P ~ n) This fragment can be treated with Klenow before being introduced into an adequate restriction site; and - the polyadenylation signal of SV40.

As before, we can build up viral stocks after transfection in an amphotropic packaging line.

EXAMPLE 4 Construction of Inducible Human rFN Expression Vectors by the TAT and REV proteins of HIV.

The BQmH1 fragment is inserted into the vectors pTG4392, pTG439 1 and pTG4379 BglII treated with Klenow and carrying the RRE / CRS sequence of HIV between the 2s sequence coding for one of the IFNs and the SV40 polyadenylation signal.

In addition, the vectors thus obtained can be modified by the insertion of a site splice donor between the HIV LTR and the IFN gene.

30 As above, it is possible to generate an amphotropic line producing infectious particles corresponding to each of the vectors thus obtained.

EXAMPLE 5 Resistance to viral infection of transfected cell lines by TAT-inducible IFN expression vectors.

WO 95/16784 PCT / FR94 / 01458 ~

2 ~ 8 - 16-The experiments described below are carried out in cell lines naturally infectious with HIV, such as:

- the U937 line (ATCC CRL1593) derived from hllm ~ in ~ monocytes; and - the CEM-A3 line derived from human CD4 + lymphocyte cells (ATCC CCLI 19).

10 In practice, cells are cultured according to the supplier's recommendations and transfected by electroporation of at least 20 µg of DNA using a suitable equipment (Gene Pulser Biorad, voltage 21 0V, capacitance 960, uF).

In a first experiment, we co-electropore in U937 cells (2x107 I s cells) pTG43 14 with the vector pLXSP in a concentration ratio of DNA 20: 1. The cells are returned to culture at 37C in the presence of 5% CO, and the following day, placed in a selective medium (puromycin 0.5 llg / ml). We selects cells resistant to the antibiotic.

20 Their resistance to infection is tested by infecting them with an HIV preparation at a high TCID50 (at least 1000). TCID50 is determined according to the method described in Reed et al., (193g, Am. J. Hyg., 27, 493-497), on cell lines HIV-infected, such as CEM cells. It corresponds to the dose at which 50% of the cells are infected and 50% are not. It is verified 2s for each batch of HIV used.

To do this, a fraction of the electroporated U937 cell culture is taken, corresponding to approximately 106 cells, which are centrifuged at low speed. After washing, the cell pellet is taken up in 200 ~ ll of culture medium in the absence 30 of serum. Then the cells are treated with different dilutions of the preparation viral. The infection is allowed to continue for 1 hour at 37C.

The cells are then washed twice in culture medium and cultured in 5 ml of the same medium, supplemented with 10% FCS (calf serum 3 ~ fetal). The medium is renewed 2 or 3 times a week. Spread of the virus is evaluated by measuring reverse transcriptase activity at regular intervals 21 5 ~
~ WO 95/16784 PCT / FR94 / 01458 - in the culture supernatant according to the method described in Spire et al. (1985, Lancet, i, 188-189).

There is a significant decrease (up to 85%) in reverse activity-5 transcriptase over 14 days post-infection compared to non-control U937 cells electroporated with an interferon expression vector.

The experiment is repeated this time with U93 7 cells initially electroporated with pTG4344, pTG43 ~ 5 or pTG4346. In all three cases, 10 observes an even greater decrease in reverse transcriptase activity on 21 days post-infection compared to the non-electroporated cell control. (Figure 4).

EXElvlPLE 6: Molecular mechanism of resistance to HIV infection.

The analysis is carried out on U937 cells electroporated and infected i ~ 7 in vitro by HIV (example 5).

We first look for the presence of the HIV genome in a pl ~ pal ~ ion 20 of cellular genomic DNA. This is done by PCR using suitable primers allowing the amplification of a fragment of the viral gag gene. The presence of a band expected amplification indicates that expression of IFN does not interfere with the integration of the HIV genome in proviral form in ch ~ omosomes cellular.
2s It was also possible to detect the presence of the mRNAs encoding the gag gene products by the PCR reverse transcription technique (same primers than previously). This suggests that the expression of IFN has no effect notable on the transcription of the proviral sequences.
Finally, the presence and localization of the viral protein gpl20 is evaluated by immunofluorescence using an anti-gpl20 antibody (obtained from patient serum HIV positive). It is found that in the cells expressing IF ~, the protein gpl20 is in intracellular form, when it should be sub-membrane, in order to allow the budding of the viral particles.

wo 95/16784 PCT ~ g ~ / 01458 2 ~ 8 18-Taken together, these results indicate that the IF ~ acts at the stage level late in the viral cycle and probably in the assembly of virions.

EXAMPLE 7 Method of treatment of AIDS by enic therapy.
-In the context of gene therapy applied to humans, two types of target cells can be considered:

- CD4 + lymphocytes from peripheral blood which can be collected o in particular by leukopheresis, and - CD34 + hematopoietic stem cells which can be obtained from a removal of bone marrow or peripheral blood (mobilization by chemotherapy or by the action of hematopoietic growth factors).
1 ~
A. Applicable protocol for all CW + cells The patient is subjected to a blood sample or leukopheresis. After having eliminated red blood cells, mononuclear cells are isolated by centrifugation on Ficoll and cultivated according to the techniques of art. At first, we rid of cells adhering to the plastic of culture flasks. Suspension cell is recovered and cultured in flasks coated with anti-CD8 antibodies (Immunotech) to kill CD8 + cells. Cell suspension as well obtained is mainly composed of CD4 + lymphocytes. Of course, the 2 ~ other enrichment techniques can also be used.

These are stimulated in order to induce cell division before performing the retroviral transduction. The growth factors that can be used for this ef ~ and are varied. As an indication, one can cite a mixture of anti CD3 antibodies human (Immunotech, approximately 10 ng / ml) and IL-2 (Cetus; 100 Ulml) or PHA (phytohemagglutidine, Sigma, at a concentration of approximately 5 ~ lg / ml) and IL-2.

After 72 hours of culture under these conditions, the cells are tr ~ ncduites by the retroviral vector. Different methodologies are applicable:
3 ~ ..
- co-culture of CD4 + cells and amphotropic producing cells of _ wo 95/16784 PCTIFR94 / 014 ~ 8 ~ 2 1 ~

- examples I to 4.

- co-culture of the 2 cell types, the CD4 + cells being deposited in the wells cells and producer cells in a Transwell (Costar) s - infection of CD4 + cells with an aliquot of culture supernatant producing cells according to an ego (multiplicity of infection) preferably between I and 5.

o Generally the transduction is carried out in the presence of protamine sulfate (at a concentration of approximately S ~, lg / ml) to promote attachment of the virus to the surface cellular.

The next day, the cell culture is transferred to a selective medium (puromycin in IS the framework of the vectors of example I or G4 18 within the framework of the vectors of example 2) and continued for 7 to 8 days until the appropriate number of cells is obtained.
It is indicated that it may be advantageous to use the AIM V medium (Gibco BRL) supplemented with L-glutamine (2 mM) and llL-2 (100 U / ml) and free of serum.
The ability of these cells to inhibit HIV replication is tested in vitro. They are infected with HIV-I IIIB to a lo-2 ego according to the classical methodology in the field of art. After washing and re-cultivation, the spread of the virus is evaluated by measuring the reverse transcriptase activity in the supernatant of 2 ~ culture (Figure 6). This is at a very low level for at least 20 days culture For comparison, in the case of non-transduced cells, the activity reverse transcriptase increases very strongly until reaching a maximum from the third day of culture and is rapidly followed by cell death.

30 B. Protocol app / icable a71x cell ~ lles CD3 ~ +.

The steps for purifying CD34 cells are as follows:

- isolation of mononuclear cells from the peripheral blood sample or 3 ~ bone marrow by Ficoll centrifugation, ~ 155 ~ S8 - depletion of adherent cells, and - capture of CD34 + cells by culture in flasks coated with antibodies anti-CD34 (lmmunotech) or in the presence of beads coated with this antibody. We eliminates the cells in suspension and the adherent cells are recovered after action, for example, of papain.

As before, the CD34 + cells thus obtained are stimulated by various growth factors to place them in the division cycle and thus promote infection retroviral. A mixture of IL-3 (about 10 ng / ml) and IL-6 can be used for this purpose.
(at around S0 U / ml) and SCF (Stem cell factor, around 50 U / ml) incorporated in the culture medium for 48 hours before transducing according to the previously indicated protocol. These factors are commercially available.
The cells are then re-administered to the patient.

Claims

AMENDED CLAIMS

1. A cassette comprising at least one DNA sequence coding for an IFN
human placed under the control of the elements capable of ensuring its expression in a mammalian cell, characterized in that said elements comprise at least one promoter and one TAR-like sequence and/or RRE/CRS and are regulatable by the human immunodeficiency virus (HIV).

2. A cassette according to claim 1, characterized in that the IFN is selected from human IFNs of type .alpha., .beta. and .gamma..

3. A cassette according to one of claims 1 and 2, characterized in that the TAR-like sequence is placed 3' of said promoter.

4. A cassette according to one of claims 1 to 3, characterized in that the RRE/CRS type sequence is placed 3' to the DNA sequence coding for a human IFN.

5. A cassette according to one of claims 1 to 4, characterized in that the promoter functional in a mammalian cell is selected from promoters of the murine PGK and .beta.-actin genes, the HIV 5' LTR and a fragment of it (mini LTR).

6. A cassette according to one of claims 1 to 5, characterized in that said elements further comprise a splice donor site.

7. A cassette according to one of claims 1 to 6, characterized in that said elements further include a polyadenylation signal.

8. A vector comprising a cassette according to one of claims 1 to 7.

9. A vector according to claim 8, characterized in that it is a vector retroviral.

10. A vector according to claim 9, characterized in that the cassette of expression according to one of claims 1 to 7 is positioned in reverse orientation with respect to the LTRs of said vector.

11. A vector according to one of claims 8 to 10, characterized in that it further comprises a selection gene.

12. A vector according to claim 11, characterized in that the selection gene confers resistance to puromycin.

13. A eukaryotic cell comprising a cassette according to one of claims 1 to 7 or a vector according to one of claims 8 to 12.

14. A cell according to claim 13, characterized in that it is a human cell of the hematopoietic line.

15. Use of a cassette according to one of claims 1 to 7, of a vector according to one of claims 8 to 12 or of a cell according to one of claims 13 or 14, for the manufacture of a medicament intended for the prevention or treatment of HIV infections.

16. A pharmaceutical composition comprising a therapeutically effective use of a cassette according to one of claims 1 to 7, of a vector according to one of claims 8 to 12 or of a cell according to one of claims 13 or 14, in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.

17. A pharmaceutical composition according to claim 16, characterized in that it comprises from 103 to 1013 pfu of a vector according to one of the claims 8 to 12.

18. Product containing at least two cassettes according to one of claims 1 to 7, vectors according to one of claims 8 to 12 or cells according to one of claims 13 or 14 each expressing an IFN of a different type, such as combination product for simultaneous, separate or spread use in time in the prevention or treatment of HIV infections.

19. Use of at least two cassettes according to one of claims 1 to 7, vectors according to one of claims 8 to 12 or cells according to one of claims 13 or 14 each expressing an IFN of a different type, in simultaneous, separate or spread out use, intended to obtain a medicament for the prevention or treatment of infections due to HIV.