CN1302334A - 逆转录病毒传递系统 - Google Patents

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Abstract

描述了一种能够转导靶位点的逆转录病毒传递系统。此该逆转录病毒传递系统包括编码至少部分被膜蛋白的第一核苷酸序列;和一个或多个可来源于逆转录病毒、保证逆转录病毒传递系统对靶位点的转导的核苷酸序列;其中第一核苷酸序列至少与其它核苷酸序列之一是异源的;并且第一核苷酸序列编码能够识别靶位点的狂犬病毒G蛋白的至少一部分或其突变体,变体,衍生物或片段。

Description

逆转录病毒传递系统
本发明涉及一种传递系统，尤其是，本发明涉及到一种能传递目的核苷酸序列(下文缩写成NOI)或者甚至是大量的NOI到目的位点的逆转录病毒载体。
更具体而言，本发明涉及一种用于基因治疗的逆转录病毒载体。
基因治疗包括以下任一种或多种：在一个或多个靶位点如靶细胞中添加、取代、缺失、补充、操作一个或多个核苷酸序列。假如靶位点是靶细胞，那么这种细胞也许是组织或器官的一部分。关于基因治疗的一般教导可参见《分子生物学》(Ed Robert Meyers Pub VCH，如556-558页)。
作为更进一步的例子，基因治疗也提供一种手段来实现以下的任一种或多种效果：一段核苷酸序列如一个基因能被应用到取代或补充一个缺陷基因；一个致病基因或基因产物能被除去；一个新的基因可以被添加以创造一个有利的表型；细胞能被在分子水平上操作以治疗癌症(Schmidt-Wolf and Schmidt-Wolf,1994 Annals of Hematology69:273-279)或其它情况疾病--如免疫病，心血管病，神经性疾病，炎症或感染疾患；抗原能被操作和/或导入以引起免疫应答反应--如遗传接种。
近年来，逆转录病毒已被建议用于基因治疗。本质上逆转录病毒是生活周期不同于裂解病毒的RNA病毒。关于这一点，当一种逆转录病毒感染一种细胞时，它的基因组被转变成DNA形式。换言之，逆转录病毒是一种感染实体，该感染实体通过DNA中间进行复制。有关逆转录病毒感染的更详细描述见后。
有许多逆转录病毒，其实例包括：鼠白血病病毒(MLV)，人免疫缺损病毒(HIV)，马感染性贫血病毒(EIAV)，鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)，Rous氏肉瘤病毒(RSV)，藤浪氏肉瘤病毒(FUSV)，Moloney氏鼠白血病病毒(Mo-MSV),FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV),Moloney氏鼠肉瘤病毒(Mo-MSV),Abelson氏鼠白血病病毒(A-MLV)，禽髓细胞组织增生病毒-29(MC-29)和禽成红细胞增多症病毒(AEV)。
逆转录病毒的详细列表可以在Colfin等中找到(“逆转录病毒”1997冷泉港实验室编辑出版：JM Colfin,SM Haghes,HE Varmus页758-763)
关于一些逆转录病毒的基因组结构的详细描述可以在现有技术中找到，例如，关于HIV的详细描述可以从NCBI基因库中找到(即基因组入藏号Afo33819)。
所有的逆转录病毒含有gag、pol、env三个主要的编码域，它们编码必需的病毒粒子蛋白。然而，逆转录病毒可被广义地划分为两大类即“简单的”和“复杂的”。通过它们的基因组结构可显著地区分这些类别。简单的逆转录病毒常常只携带这些基本的信息。相反，复杂的逆转录病毒也编码来源于多样化剪接信息的额外调节蛋白。
逆转录病毒进一步可以细分为七个群。这些群中的5个是有致癌潜力的逆转录病毒。剩下的两群是慢病毒和泡沫病毒。这些逆转录病毒的综述发表于“逆转录病毒”(1997冷泉港实验室出版社，编辑：JMCoffin SM Hughes,HE Varmus页1-25)。
除人类T细胞白血病病毒-牛白血病病毒(HIV-BLV)外，所有的致癌逆转录病毒都是简单的逆转录病毒。HTLV,BLV和慢病毒及泡沫病毒是复杂逆转录病毒。一些研究最充分的逆转录病毒是Rous氏肉瘤病毒(RSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)和鼠白血病病毒(MLV)及人类T细胞白血病病毒(HTLV)。
慢病毒群甚至可被细分为“灵长动物类”和“非灵长动物类”慢病毒。灵长动物类慢病毒的实例包括人类免疫缺损病毒(HIV)及猿免疫缺损病毒(SIV)，其中HIV为人类自身免疫缺损综合征(AIDS)的病原因子。非灵长类动物慢病毒群包括原型“慢病毒”绵羊髓鞘脱落病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)，马感染性贫血病毒(EIAV)和最近被描述的猫免疫缺损病毒(FIV)及牛免疫缺损病毒(BIV)。
慢病毒家族与其它类型的逆转录病毒的关键区别在于慢病毒有能力感染分裂和非分裂细胞(Lewis等1992 EMBO J.11:3053-3058，Lewis and Emerman 1994“病毒学杂志”68:510-516)。相反，其它的逆转录病毒如MLV不能感染非分裂细胞如组成肌肉、大脑、肺和肝组织的细胞。
在感染的过程中，逆转录病毒首先吸咐到特定细胞表面受体上。一旦进入可感病的宿主细胞，然后逆转录病毒的RNA基因组通过亲本病毒携带进的病毒编码的逆转录酶复制成DNA。这种DNA被转运到宿主细胞核，随即整合进宿主基因组。在这一时期，其一般被称为前病毒。前病毒在细胞分裂期间在宿主染色体组中是稳定的并象其它细胞蛋白一样被转录。前病毒编码形成更多病毒所需要的蛋白和包装机构，所形成的病毒能以有时称为“出芽”的过程离开细胞。
象已说明的一样，每一种逆转录病毒基因组包括gag、pol、env基因，它们编码病毒粒子蛋白和酶。这些基因位于长末端重复序列(LTR)的两侧。长末端重复序列(LTR)负责前病毒的整合和转录。它们也作为增强子-启动子序列。换言之，长末端重复序列能控制病毒基因的表达。通过位于病毒基因组5’端的psi序列的效能使逆转录病毒RNA被包囊。
长末端重复序列本身是能被划分成三个元件的相同序列，它们分别叫做U3、R和U5。U3来自于RNA 3’末端的独特序列。R来自于RNA两端的重复序列，U5来自于RNA 5’末端的独特序列。不同逆转录病毒之间的三个元件的大小可显著不同。
为了容易理解，一个简单的显示长末端重复序列、gag、pol和env的基本特征的逆转录病毒基因组的通用图谱(不按比例)被显示于图6。
对于病毒的基因组，转录起始位点在长末端重复序列左边的U3与R之间的范围(如图6所示)，且Poly(A)添加的位点(终端)是在长末端重复序列右边的R与U5之间的边界(如图6所示)。U3含有大多数前病毒转录控制元件，包括启应答于细胞和在某些情况下应答于病毒转录激活代表的启动子和多个增强子序列。一些逆转录病毒含tat,rev,tax和rex中的一种或多种基因，这些基因编码涉及到基因表达的调控的蛋白。
关于结构基因gag、pol和env、gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag蛋白水解成成熟的蛋白MA(基质)，CA(衣壳)，NC(核衣壳)。基因pol编码逆转录酶(RT)，该酶包括两种DNA聚合酶，和伴随的RnaseH活性及整合酶(IN)，介导基因组的复制。基因env编码病毒粒子的表面糖蛋白及跨膜蛋白，它们形成一种复合物，该复合物专一性地与细胞受体蛋白相互作用。这种作用最后导致病毒膜与细胞膜融合。
逆转录病毒的被膜糖蛋白复合物包括两种多肽：一种外部的糖基化的亲水多肽(SU)和一种跨膜蛋白(TM)。在病毒粒子的表面上它们一起形成一种寡聚物的“隆起”或“隆起的刺突”。这两种多肽由env基因编码并以多聚蛋白的前体形式合成，这种前体在转运至细胞表面的过程中被水解切断成两部分。尽管末切断的Env蛋白能结合到受体上，但这种自身的切断事件对于激活蛋白的潜在的融合是必需的，这种融合对于病毒进入宿主细胞是必需的。典型的SU和TM蛋白都在多个位点被糖基化。但是在一些病毒中，以MLV为例，TM不被糖基化。
尽管SU和TM蛋白对于被膜病毒粒子的装配不一定是必需的，但它们在进入过程中起着重要作用。因而SU域结合至在靶细胞表面的受体分子--常是一种专一受体分子。这种结合事件被相信是激活了TM蛋白诱导膜融合的潜力，此后病毒和细胞膜融合。在一些病毒特别是MLV中，一种导致TM的胞质尾的较短部分的除去的断裂事件被认为在揭示蛋白的完全融合活性中起着关键作用(Brody等1994，“病毒学杂志”68:4620-4627 Rein等1994“病毒学杂志”68:1773-1781)。这种远离TM跨膜部分的胞质“尾”保留在病毒膜内侧，并且在不同的逆转录病毒中它的长度显著不同。
SU/受体相互作用的专一性能限定逆转录病毒的宿主范围和组织趋性。在某些情况下，这种专一性可限制重组逆转录病毒载体的转导潜力。由于这种原因，许多基因治疗试验已用MLV进行。已知一种含有叫做4070A的被膜蛋白的特定MLV是一种兼嗜性病毒，并且由于它的被膜蛋白“停靠”人和鼠之间保守的磷酸转运蛋白使得它也能感染人类细胞。由于这种转运蛋白是广泛存在的，所以这些病毒能感染许多细胞类型。但在某种情况下，尤其是从安全的角度出发，专一性地靶向限制细胞也许是有益的。为此，几个研究组已构建了一种小鼠亲嗜性逆转录病毒以专一性地感染特定人细胞，该病毒不象它的兼嗜性近亲，通常仅感染小鼠细胞。用促红细胞生成素区段取代被膜蛋白的一个片段产生一种重组逆转录病毒，其能专一性地结合表面表达有促红细胞生成素受体的人细胞，如红细胞前体(Maulik and Patel 1997 MolecularBiotechnoloy:Therapeufic Applications and Strategies 1997Wiley--Liss Inc页45).
除了gag、pol和env基因之外，复杂的逆转录病毒也含有编码附属或辅助蛋白的“附属”基因。附属或辅助蛋白被定义为除通常的复制或结构基因gag pol和env编码的蛋白外由附属基因编码的那些蛋白。这些附属蛋白不同于那些涉及到基因表达调控的蛋白，如那些由tat、rev、tax和rex编码的蛋白。附属基因的实例包括vif、vpr、vpx、vpu和nef中的一个或多个，这些附属基因能在例如HIV中找到(参见例如，页802和803，Retroviruses Ed Coffin et al Pub CSHL 1997)。非必需附属蛋白可在特殊的细胞类型中发挥功能，提供至少部分重复地由细胞蛋白提供的功能。一般，附属基因位于pol和env之间，刚好位于env的下游，包括LTR的U3区或env的重叠部分或两者。
复杂的逆转录病毒已自然演进了调控机制，其利用病毒编码的转录激活物以及细胞转录因子。这些反式作用的病毒蛋白可用作由LTR指导的RNA转录的激活物。慢病毒的转录反式激活物由病毒的tat基因编码。Tat蛋白结合至一个稳定的RNA茎-环二级结构，该结构称之TAR，它的一个功能是表观上优化Tat蛋白定位于反式激活转录。
如前所述，逆转录病毒已被建议作为一种传递系统(其它表达方式如传递工具或传递载体)用于转移NOI或大量的NOI至一个或多个目的位点。这种转移可发生在体外，来自体内或在体内或其组合。当用于这种方式时，逆转录病毒一般称作逆转录病毒载体或重组逆转录病毒载体。逆转录病毒载体已被利用来研究逆转录病毒生活周期的不同方面，包括受体使用，逆转录及RNA包装(有关综述见Miller 1992 Curr TopMicrobiel Immunol 158:1-24)。
在用于基因治疗的一个典型的重组逆转录病毒载体中，至少部分的一个或多个gag、pol和env蛋白编码区可以从病毒中除去。这使得逆转录病毒载体复制缺馅。为了使生成的病毒能整合它的基因组到宿主细胞的基因组去，除去的部分甚至可以用NOI取代，但是，其中这种修改过的病毒基因组由于结构蛋白的缺乏而不能自我复制。当整合进宿主基因组时，NOI的表达导致例如治疗效应的产生。因此，转移NOI至目标部位一般通过以下方式完成：使NOI整合进重组病毒载体；将修饰过的病毒载体包装进病毒粒子外壳；并且使其转导目标部位如靶细胞或靶细胞群。
通过用包装或辅助细胞系和重组载体的结合，可以繁殖和分离大量的逆转录病毒载体(如制备适合的逆转录病毒载体的效价)，以用于随后的目标部位转导。
在一些情况下，繁殖和分离可能需要逆转录病毒gag、pol和env基因的分离并使它们分别引入宿主细胞，以产生一种“包装细胞系”。这种包装细胞系产生包装逆转录DNA所需要的蛋白，但由于psi区域的缺乏导致它不能引起衣壳化。但是，当携带NOI的重组载体和psi区域被引进包装细胞系时，助蛋白能包装psi-阳性重组载体以产重组病毒原种。这种重组病毒原种能被用于感染细胞以导入NOI进细胞的基因组。这种基因组缺乏所有形成病毒蛋白的必需基因的重组病毒只能感染而不能繁殖。因此NOI被导入宿主细胞基因组而没有生成有潜在危害的逆转录病毒。可用的包装系的摘要发表于“逆转录病毒”(1997冷泉港实验室出版社，编辑JM Coffin,SM Hughes,HE Varmus 499页)。
但是这种技术在某种意义上说是有问题的，即效价水平不总是在满意水平。然而，逆转录病毒包装细胞系的设计已发展到解决了辅助病毒的早期设计中经常遇到的辅助病毒的自发产生的问题。由于同源重组极容易进行，所以减少或消除载体和辅助者基因组之间的同源性已减少了辅助病毒产生的问题。
最近，包装细胞已经得到发展，其中的gag,pol和env病毒基因的编码区携带于单独的表达质粒上被独立转染进包装细胞系中，使得野生型病毒的产生需要三次重组。这个策略有时被称为三质粒转染法(Soneoka et al 1995 Nucl.Acids Res.23-628)。
当载体正在被改进时，瞬时转染也可用来测量载体的产量。关于这一点，瞬时转染避免了生成稳定生产载体的细胞系所需的较长时间，并且若载体或逆转录病毒的包装成分对细胞有毒可以利用瞬时转染。用于生产逆转录病毒载体的典型组成部分包括：编码Gag/Pol蛋白的质粒，编码Env蛋白的质粒及含有一个NOI的质粒。载体的生产涉及瞬时转染一个或更多的这些组成部分到含有其它所需成分的细胞中去。如果载体编码毒素基因或者干扰宿主细胞复制的基因，如细胞周期的抑制剂或诱导细胞凋亡的基因，产生能稳定生产载体的细胞系可能会比较困难。但在细胞死亡之前，瞬时转染可用于生产这种载体。同时，利用瞬时转染，已经发展了一些细胞系，其所产生的载体的效价与从稳定的载体生产细胞系获得的水平相当(Pear et al,1993 PNAS 90:8392-8396)。
鉴于一些HIV蛋白的毒性使得产生稳定的基于HIV的包装细胞相对困难，通常HIV载体通过载体和辅助病毒的瞬时转染来制得。有些研究者甚至已经用水泡性口炎病毒(VSV)的Env蛋白置换了HIV的Env蛋白。水泡性口炎病毒(VSV)的Env蛋白的插入提高了载体的浓度，如具有5×105效价(浓缩后为108)的HIV/VSV-G载体已通过瞬时转染得以生产(Naldini et al1996 Science 272:263-267)。因此HIV载体的瞬时转染可能为高效价载体的生产提供了一个有用的策略(Yeee,et al1994,PNAS 91:9564-9568)。然而，这种方法的一个缺陷就是VSV-G蛋白对细胞是相当有毒的。
用异源的env基因取代env基因是一种叫作假型化(Psendotyping)技术或策略的实例。假型化不是一种新现象，在WO-A-98/05759,WO-A-98/05754,WO-A-97/17457,WO-A-96/09400,WO-A-91/00047及Mebatsion et al1997 Cell 90,841-847中均可找到许多实例。
假型化具有一个或更多的优点。例如，就慢病毒载体来说，基于HIV的载体，其env基因产物会限制这些载体仅侵染表达CD4蛋白的细胞。但是如果这些载体中的env基因被其它RNA病毒的env序列取代，那么它们就有一个更广的侵染谱(Verma和Somia 1997 Nature 389:239-242)。如刚才所述并作为一个实例，研究者们已经用水泡性口炎病毒的糖蛋白假型化了一种基于HIV的载体(Verma和Somia 1997同上)。
同样，作为一个例子，逆转录病毒Env蛋白的相对易破坏性可能限制了浓缩逆转录病毒载体的潜力，并且浓缩病毒可能会导致较低的病毒回收率。在某种程度上通过用更加稳定的VSV-G蛋白取代逆转录病毒Env蛋白可以克服这一问题，这种VSV-G蛋白允许更加有效的浓缩而得到更好的产率(Naldini et al1996,Science 272:263-267)。
然而，利用VSV-G蛋白的假型化并不总是理想的。这是因为VSV-G蛋白是细胞毒性的(Chen et al1996,Proc.Natl.Acad.Sci.1005及此文中的引用文献)。
因此，需要找到没有毒性且能用于逆转录病毒假型化的其它蛋白。
因此，本发明试图提供一种改进的逆转录病毒载体。
根据本发明的第一个方面，提供了一种能够转导靶位点的逆转录病毒传递系统，其中此逆转录病毒传递系统包括一段至少编码部分被膜蛋白的第一核苷酸序列，及一个或更多其它从逆转录病毒衍生而来的核苷酸序列以确保通过逆转病毒传递系统的靶位点的转导；其中，第一核苷酸序列至少与其它核苷酸序列中的一个是异源的，并且第一核苷酸序列至少编码部分的可以识别靶位点的狂犬病毒G蛋白或其突变体，变体，衍生物或片段。
本发明的逆转录病毒传递系统能包含一实体，或者说，本发明的逆转录病毒传递系统包含很多实体，它们共同组合提供了本发明的逆转录病毒传递系统。这些病毒传递系统包括但不限于在Savard et al1997，“病毒学杂志”71(5):4111-4117；Feng et al1997,Nat Biotechnol15(9):866-870；及英国专利申请9720465.5中描述的疱疹病毒和腺病毒的实例。
“可衍生的”一词用其通常的意义，意思为：此序列无需非得从逆转录病毒得来，而可从它衍生而来。作为一个例子，此序列可以通过合成或者重组DNA技术制备。
根据本发明的第二个方面，提供了根据本发明的病毒粒子，此病毒粒子可从本发明的逆转录传递系统获得。
根据本发明的第三个方面，提供一种逆转录病毒载体，其中此逆转录病毒载体是根据本发明第一方面的逆转录病毒传递系统或可由它而得到。
根据本发明的第四个方面，提供一种用根据本发明的逆转录病毒传递系统或者根据本发明的病毒粒子或者根据本发明的逆转录病毒载体转导的细胞。
根据本发明的第五个方面，提供一种用于药物的根据本发明的逆转录病毒传递系统或者根据本发明的病毒粒子或者根据本发明的逆转录病毒载体。
根据本发明的第六个方面，提供根据本发明的逆转录病毒传递系统或者根据本发明的病毒粒子或者根据本发明的病毒载体在制备传递NOI至所需靶位点的药物组合物。
根据本发明的第七个方面，提供一种方法，包括让一种细胞与根据本发明的逆转录病毒传递系统或者根据本发明的病毒粒子或者根据本发明的逆转录病毒载体接触。
根据本发明的第八个方面，提供一种载体以制备根据本发明的逆转录病毒传递系统或者根据本发明的病毒粒子或者根据本发明的逆转录病毒载体，其中此载体包含一段核苷酸序列，该序列至少编码狂犬病毒G蛋白或者其突变体，变体，衍生物或片段的部分。
根据本发明的第九个方面，提供一种质粒以制备根据本发明的逆转录病毒传递系统或者根据本发明的病毒粒子，或者根据本发明的逆转录病毒载体，其中此质粒包含一段核苷酸序列，至少编码狂犬病毒G蛋白或者其突变体，变体，衍生物或片段的部分。
根据本发明的第十个方面，提供许多种质粒，其中至少有一个质粒是根据本发明的质粒，并且其中至少有一个另外的质粒包含一个或更多的从一种逆转录病毒衍生而来的核苷酸序列。
根据本发明的第十一个方面，提供狂犬病毒G蛋白假型化一种逆转录病毒或逆转录病毒载体或逆转录病毒粒子的用途，从而影响此逆转录病毒或逆转录病毒载体或逆转录病毒粒子的感染谱。
根据本发明的第十二个方面，提供狂犬病毒G蛋白假型化一种逆转录病毒或逆转录病毒载体或逆转录病毒粒子的用途，从而影响该逆转录病毒或逆转录病毒载体或逆转导病毒粒子的宿主范围和/或细胞嗜性。
根据本发明的第十三个方面，提供一种用狂犬病毒G蛋白假型化的一种逆转录病毒或逆转录病毒载体或逆转录病毒粒子。
根据本发明的第十四个方面，提供一种包括有异源env区域的逆转录病毒传递系统，其中此异源的env区域至少包含部分编码狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列。
根据本发明的第十五个方面，提供一种包括有异源env区域的逆转录病毒传递系统，其中此异源的env区域包含编码狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列。
优选，第一核苷酸序列编码全部的狂犬病毒G蛋白或其突变体，变体，衍生物或片段。
优选，至少其它核苷酸序列之一是从一种慢病毒或一种致癌逆转录病毒衍生而来。
优选，其它核苷酸序列是从一种慢病毒或一种致癌逆转录衍生而来。
优选，其它核苷酸序列从MLV、HIV或EIAV衍生而来。
优选，此逆转录病毒传递系统至少包括一个NOI。
优选，此NOI有一种治疗效应或者编码一种有治疗效应的蛋白。
优选，靶位点是一个细胞。
因此，本发明提供一种有异源被膜蛋白的逆转录病毒载体。此逆转录病毒载体在基因治疗中是有用的。
本发明的一个重要方面就是用一种编码狂犬病毒蛋白，尤其是狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列来假型化一种逆转录病毒和/或者一种基于此病毒或由此病毒衍生的逆转录病毒载体。此处，“假型化”一词的意思是：将来源于其它病毒的一种蛋白整合进一部分env基因，或者取代一部分env基因，或者取代病毒基因组中或者病毒载体中全部的env基因。
有关狂犬病毒G蛋白及它的突变体的教导可从以下文献获得：Roseet al.,1982“病毒学杂志”43:361-364,Hanham et al.,1993“病毒学杂志”67,530-542,Tuffereau et al.,1998“病毒学杂志”72,1085-1091,Kucera et al.,1985 J.Virol 55,158-162,Dietzscholdet al.,1983 PNAS 80,70-74,Seif et al.,1985“病毒学杂志”53,926-934,Coulon et al.,1998“病毒学杂志”72,273-278,Tuffereauet al.,1998“病毒学杂志”72,1085-10910,Burger et al.,1991“普通病毒学杂志”72.359-367,Gaudin et al1995“病毒学杂志”69,5528-5534,Benmansour et al1991“病毒学杂志”65,4198-4203,Luoet al1998“微生物免疫学”42,187-193,Coll 1997“病毒学纪事”142,2089-2097,Luo et al1997“病毒研究”51,35-41,Luo et al1998“微生物免疫学”42,187-193,Coll 1995“病毒学纪事”140,827-851,Tuchiya et al1992“病毒研究”25,1-13,Morimoto et al1992“病毒学”189,203-216,Gaudin et al 1992“病毒学”187,627-632,Whittet al1991“病毒学”185,681-688,Dietzschold et al1978“普通病毒学杂志”40,131-139,Dietzschold et al1978 Dev Biol Stand 40,45-55,Dietzschold et al1977“病毒学杂志”23,286-293,and Otvoset al1994“生物化学与生物物理学报”1224,68-76。一种狂犬病毒G蛋白也可参见EP-A-0445625.
使用本发明的狂犬病毒G蛋白提供了载体，这些载体可在体内优先转导狂犬病毒优先感染的靶细胞。这特别包括体内的神经元靶细胞。作为一种以神经元为靶的载体，从一种狂犬病病原毒株如ERA来的狂犬病毒G蛋白可能特别有效。另一方面，狂犬病毒G蛋白在体外具有很广的靶细胞范围，包括几乎所有的已试验过的哺乳动物及鸟的细胞类型(Seganti et al.,1990“病毒学纪事”34,155-163；Fields et al.,1996 Fields Virology,Third Edition,Vol.2,Lippincott-RavenPublishers Philadelphia,New York)。很可能将会发现其具有传递感染其它目的细胞类型的能力。因此，使用本发明的狂犬病毒G蛋白可以提供在体外及体内能转导广泛的不同细胞类型的载体。狂犬病毒在体内及体外的不同嗜性，被认为是缘于狂犬病毒结合一系列受体的能力，这些受体中的一些仅在体外有活性。
另外，根据本发明的假型化载体粒子的嗜性可以通过一种胞外域修饰的突变狂犬病毒G蛋白来改变。狂犬病毒G蛋白具有可被突变以限制其靶细胞范围的优点。在体内，靶细胞对狂犬病毒的吸收被认为是由乙酰胆碱受体(AchR)介导的，但也可能是其体内结合的其它受体所介导的(Hanham et a l..,1993“病毒学杂志”67,530-542；Tuffereauet al.,1998“病毒学杂志”72,1085-1091)。狂犬病毒G蛋白抗原位点Ⅲ处的突变对病毒嗜性的影响已作了研究。这个区域被认为与病毒和乙酰胆碱受体的结合无关(Kucera et al.,1985“病毒学杂志”55,158-162；Dietzschold et al.,1983 Proc Natl Acad Sci 80,70-74；Seif et al.,1985“病毒学杂志”53,926-934；Coulon et al.,1998“病毒学杂志”,72,273-278；Tuffereau et al.,1998“病毒学杂志”72,1085-10910)。例如成熟蛋白中第333位精氨酸(Arg)转换为谷氨酰胺的突变可用来在体内将病毒的进入限制在嗅觉和外周神经元中，而减少了其向中枢神经系统的传播。那些病毒原来是能够象野生病毒那样侵入运动神经元和感觉神经元的，然而跨神经元的传递没有发生(Coclloin et al.,1989，“病毒学杂志”63,3550-3554)。第330位氨基酸突变的病毒能被进一步减毒，并且在肌内注射接种后，不能感染运动神经元或感觉神经元(Coulon et al.,1998“病毒学杂志”72,273-228)。
另外，可以使用来源于实验室传代的狂犬病毒毒株的狂犬病毒G蛋白。这些能用于筛选嗜性的改变。这些毒株包括以下：
Genbank入藏号   狂犬病毒株
 J02293U52947U27214U27215U27216U52946M32751   ERACOSRVNY516NY771FLA125SHBRVHEP-Flury
作为例子，ERA毒株是一种狂犬病的病原毒株并且来源于此毒株的狂犬病毒G蛋白能被用于转导神经元细胞。来源于ERA毒株的狂犬病毒G蛋白的序列在GenBank数据库中(进入号J 02293)。此蛋白具有一种19个氨基酸的信号肽，并且成熟蛋白是从以翻译起始点甲硫氨酸计第20位的赖氨酸残基开始的。HEP-Flury毒株含有成熟蛋白第333位精氨酸转换为谷氨酰胺的突变，此突变与其致病性的降低相关，并且可以用于限制其病毒被膜的嗜性。
一种狂犬病毒G蛋白的实例如SEQ ID NO.2所示，其编码序列如SEQ ID NO.1所提供。本发明包含这些序列的变体，同源体或衍生物。
论及本发明优选酶的氨基酸序列时，“变体”、“同源体”或“片段”包括自序列或向序列取代、变异、修饰、置换、缺失或添加一个(或更多)氨基酸，使产生的蛋白具有G蛋白的活性和/或G蛋白的特征或轮廓，优选至少有如SEQ ID No.2所示G蛋白的相同生物活性。特别是“同源物”一词包括结构和/或功能的同源性。至于序列的同源性，优选地至少75％，更优选至少85％，更优选至少90％同源于SEQ ID No.2所示序列。更优选至少95％，更优选至少98％同源于SEQ ID No.2所示序列。
论及本发明优选酶的核苷酸序列时，“变体”、“同源体”或“片段”包括自序列或向序列取代、变异、修饰、置换、缺失或添加一个(或更多)核苷酸，使产生的核苷酸序列编码或能够编码具有G蛋白活性和/或G蛋白特征或轮廓的蛋白，优选至少是与SEQ ID No.1所编码的G蛋白有相同生物学活性的蛋白。尤其是，“同源体”一词，包括结构和/或功能的同源性，使产生的核苷酸序列编码或能够编码具有G蛋白活性和/或G蛋白特性或轮廓的蛋白。至于序列的同源性，优选地至少75％，更优选至少为85％，更优选至少90％同源于SEQ ID No.1所示的序列。更优选至少95％，更优选至少98％同源于SEQ ID No.1所示的序列。
尤其是在此所用的“同源性”一词可能等同于“同一性”。相对的序列同源性(也就是序列同一性)能通过可商购的计算机程序来确定，这些程序能计算两个或更多个序列的百分同源性。这种计算机程序的一个典型的实例就是CLUSTAL。
“变体”、“同源体”或“片段”与序列的等位变异是同义的。
“变体”也包括与能与此处提供的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。优选“变体”包括与以下序列互补的序列，这些序列能在严紧条件(例如，65℃和0.1SSC(1×SCC=0.15M NaCl,0.015柠檬酸钠pH7.0)下与此处所提供的核苷酸序列杂交。
本发明也包括能与此处所提供的核苷酸序列杂交的序列(包括此处所提供核苷酸序列的互补序列)。优选，本发明包括能在严紧条件下(例如，65℃和0.1 SSC)与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列，与此处所提供核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括此处所提供序列的互补序列)。
与VSV糖蛋白相比较，应用狂犬病毒糖蛋白的一个主要的优点就是，由于狂犬病疫苗的广泛应用，对狂犬病毒对人和其它动物的毒性有详细的了解。尤其是有关应用从作为人类疫苗的金丝雀痘病毒重组体表达的糖蛋白的1期临床实验已经有报道(Fries et a1.,1996 Vaccine14,428-434)。这些研究得出结论是：此疫苗用于人类是安全的。
本发明的逆转录病毒载体对于在体内或体外传递一个或更多NOI进入细胞是有用的，尤其是有治疗性活性的NOI的传递。一个或更多所选的NOI可以整合到载体基因组中而在靶细胞中表达。此NOI可以有一个或更多的它们自己的表达控制序列，或者它们的表达可以被载体的LTR所控制。为了此NOI的合适表达，这些LTR中或之间可能包括一个启动子，它在一定条件或一定细胞型中优先激活。此NOI可能是有义序列或反义序列。而且，如果有很多NOI，那么那些NOI可能是有义序列或反应序列或者是它们的组合体。
本发明逆转录病毒载体的基因组可能通常包含有5’末端和3’末端LTR，一个或更多NOI，此NOI含有治疗活性的基因和/或标记基因，或一个或多个NOI的适合的插入位点，以及能使基因组在生产细胞中包装成载体粒子的包装信号。其中甚至含有合适的引物结合位点和整合位点，以允许载体RNA到DNA的反转录，及原病毒DNA整合进入靶细胞基因组。在优选方案中，此逆转录病毒载体粒子具有一个逆转录系统(相容性逆转录和引物结合位点)和一个整合系统(相容性整合酶和整合位点)。
因此，根据本发明，使控制病毒基因组或逆转录病毒载体的核苷酸序列成为可能，从而使病毒的基因由一个或更多的NOI来取代或补充。这些NOI也可以是任何一个或更多的选择基因，标记基因及治疗基因。许多不同的选择性标记已经成功地应用于逆转录病毒载体。这些不同的标记在《逆转录病毒》(1997,Cold Spring Harbour Laboratory PressEds:J M Coffin SM Hughes,HE,Varmas页444)一书中有综述，包括以下(但不局限于这些)：细菌的新霉素和潮霉素磷酸转移酶基因，它们分别提供对G418和潮霉素的抗性；一种突变的小鼠二氢叶酸还原酶基因，其提供对氨甲蝶呤的抗性；细菌的gpt基因，此基因能使细胞在含有霉酚酸、黄嘌呤、氨基蝶呤的培养基上生长；细菌的hisD基因，此基因能使细胞在没有组氨酸而含有组氨醇的培养基上生长；多药物抗性基因(mdz)，此基因提供对许多药物的抗性；以及嘌呤霉素或腐草霉素抗性的细菌基因。所有的这些标记都是显性选择标记，并允许对表达这些基因的细胞进行化学选择。
根据本发明，此NOI可以是一个治疗基因--从这个意义上讲此基因本身可能产生一种治疗效应或者它编码一个能产生治疗效应的产物。
治疗性NOI的非限制性的实例包括编码以下因子的基因：肿瘤抑制子蛋白，细胞因子，抗病毒蛋白，免疫调节分子，抗体，工程免疫球蛋白类似分子，融合蛋白，激素，膜蛋白，血管活性蛋白或多肽，生长因子，核酶，反义RNA，酶类，前体药物，例如前体药物激活酶类，细胞毒性物质及酶抑制剂。
前体药物的实例包括但不限于这些：表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(与碱性磷酸酶共用)，5-氟胞嘧啶(与胞嘧啶脱氨酶共用)；阿霉素-N-对羟基苯氧基乙酰胺(与青霉素V酰胺酶共用)，对-N-双(2-氯乙基)氨基苯甲酰基谷氨酸(与羧肽酶G2共用)；头孢菌素氮芥氨基甲酸盐(与β-内酰胺酶共用)，SR4233(与p450还原酶共用)；9-(1,3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤(与HSV胸苷激酶共用)，芥子前体药物和硝基还原酶及环磷酰胺或异环磷酰胺(与细胞色素P450)。
可以治疗的疾病包括但不仅限于这些：癌症，心脏病，中风，神经退行性疾病，关节炎，病毒感染，细菌感染，寄生虫的感染，免疫系统疾病，病毒感染，肿瘤、血凝病，及遗传性疾病--如慢性肉芽肿，自毁容貌综合症，帕金森氏症，肺气肿，苯丙酮尿症，镰刀状细胞贫血，α-地中海贫血，β-地中海贫血，戈谢病。
应用逆转录病毒载体进行基因治疗的靶细胞包括但不仅限于这些：造血细胞(包括单核细胞，巨噬细胞，淋巴细胞，粒细胞，或任何这些细胞的祖细胞)，内皮细胞，肿瘤细胞，基质细胞，星形细胞，或胶质细胞，肌肉细胞，上皮细胞，神经元，成纤维细胞，肝细胞，星形细胞和肺细胞。
在本发明的逆转录病毒载体中，一个或更多的NOI能在病毒LTR的转录控制之下。或者，增强子-启动子元件的组合能够存在以实现表达的更高水平。这些启动子-增强子元件优选是有很强的活性或能够在靶细胞中被强烈诱导的。一种强活性启动子-增强子组合的实例就是，人巨细胞病毒(HCMV)的主要中早期(MIE)启动子/增强子组合。此启动子-增强子组合在活性上可能是组织或时序限制的。合适的组织限制性启动子-增强子组合的实例就是那些在肿瘤细胞中有高度活性的组合，象来自于MUCl基因或CEA基因的启动子-增强子组合。
组织缺氧或局部缺血可调节性表达可能在某些条件下也特别有用。在很大范围的不同细胞类型中，组织缺氧是基因表达的一个强有力的调节因素，并且通过低氧可诱导转录因子活性的诱导来起作用，例如低氧可诱导因子-1(HIF-1)(Wang和Semenza 1993 PNAS(USA)90:430)，其结合到同源DNA识别位点上，也就是不同基因启动子的低氧应答元件(HRES)上。来自小鼠磷酸甘油酸激酶-1(PGK-1)基因HRE的多聚体形式已被用来控制人纤维肉瘤细胞应答于体外或实体瘤内的低氧的标记基因和治疗基因的表达(Firth et al1994，PNAS 91(14):6496-6500；Dachs et al1997 Nature Med 5:515)。或者，葡萄糖缺乏在肿瘤的局部缺血区域也存在，这种现象能被用来激活特别是在肿瘤细胞中异源基因的表达。一个已知被葡萄糖缺乏特异性激活的grp 78基因启动子截短的632碱基对的序列，已被研究表明在鼠体内肿瘤中能驱动一种报告基因的高水平表达(Gazit et al1995 Cancer Res.55:1660)。
接下来用于基因治疗的本发明逆转录病毒载体的基因组优选含有作为载体起到有效功能所必需的最小的逆转录病毒材料。这样的目的是为NOI的整合提供空间，及为了安全的原因。逆转录病毒载体的基因组优选复制缺陷的，这种缺陷缘于编码一个或更多结构(或包装)成分的功能基因的缺失，这些成分由gag-pol和env基因编码。这些病毒粒子生产所需的成分的缺乏，在生产细胞中通过反式方式来提供。基因组中病毒结构成分的缺乏同样意味着针对在靶细胞中表达的病毒蛋白的不良免疫反应被降低或消除。而且，在渴望体内应用的条件下，可能的感染病毒粒子的重建优选被避免了。因此，病毒的结构成分优选尽最大可能地从基因中去除掉，以降低任何成功重组的可能。
本发明中的逆转录病毒载体粒子一般在一种合适的生产细胞中产生。生产细胞通常是哺乳动物细胞但也可能是其它细胞如昆虫细胞。一种生产细胞可能是含有一个通常整合于其基因组的病毒结构基因的包装细胞。为了生产具感染性的，复制缺陷性的载体粒子，此包装细胞然后被编码载体基因组的核酸转染。或者，生产细胞可用编码载体基因组的核酸序列和结构成分共转染，和/或用存在于一个或多个表达载体如质粒、腺病毒载体、疱疹病毒载体上的核酸序列共转染，或使用任何其它已知的将功能DNA导入靶细胞的方法。
根据本发明的高度优选的方案，我们惊奇地发现来自狂犬病毒的被膜蛋白，即狂犬病毒G蛋白，能有效地假型化很多不同的逆转录病毒载体。这些载体不仅包括构建自鼠致癌逆转录病毒的，例如MLV的载体，还包括构建自灵长类动物慢病毒例如HIV病毒的载体，及构建自非灵长类动物慢病毒例如马传染性贫血病毒(EIAV)的载体。
在一个方案中，本发明的载体是从一个慢病毒构建或是衍生而来。这就有一个优点，就是此载体可能能够转导分裂细胞和非分裂细胞。
因此，本发明优选的假型化逆转录病毒载体是慢病毒载体，如HIV或EIAV载体，这些载体有上面所提及的优点。特别是假型化的狂犬病毒G蛋白慢病毒载体具有狂犬病毒靶细胞范围，能够转导中枢神经系统的非分裂细胞如神经元。
本发明的发现是令人惊讶的。在这个方面，尽管狂犬病和VSV都属于杆状病毒科(这是一个包含5个不同种类亚群的科)，但它们(也就是VSV和狂犬病毒)是在不同的亚群。而且，狂犬病毒G蛋白与VSV-G只有很小的同源性(Rose et al.,1982“病毒学杂志”43:361-364)。狂犬病毒G蛋白的胞质区为大约44氨基酸，较VSV-G的胞质区长得多，VSV-G的胞质区为28至31个氨基酸。因此，发现狂犬病毒G蛋白能假型化MLV是出乎意料的。而且还表明切短HIV-1 144个氨基酸的胞质尾是MLV粒子有效假型化所必需的(Mammano et al.,1997“病毒学杂志”71:3341-3345)。狂犬病毒G蛋白另外还能假型化其它逆转录病毒如慢病毒群中的病毒也同样使人惊讶。
因此，一方面本发明提供了用狂犬病毒G蛋白假型化的逆转录病毒载体粒子。
另一方面，本发明提供了一个逆转录病毒载体的生产系统，这个系统包含编码狂犬病毒G蛋白的核酸序列，编码逆转录病毒载体基因组的核酸序列，和可选的一个或更多编码产生含有有此基因组的感染性逆转录病毒粒子所需包装成分的核酸序列。
第三方面，本发明提供了狂犬病毒G蛋白改变逆转录病毒载体靶细胞范围的用途。
另一方面，本发明提供了一种生产逆转录病毒载体颗粒的方法，此载体粒子的被膜含有狂犬病毒G蛋白，此方法包括提供如此处所述，存在于一种生产细胞中的逆转录病毒载体生产系统，置生产细胞于适合载体粒子成分表达及载体粒子生产的条件下，以及从上清液中收获载体粒子。
又一方面，本发明提供一种用NOI转导靶细胞的方法，此方法包含按其中所述将细胞与逆转录病毒载体粒子接触，在允许载体吸附并进入到细胞的条件下，用NOI转导靶细胞使得NOI进入靶细胞的基因组。
根据本发明，在载体的被膜中除了狂犬病毒的G蛋白外，还可能有一种或更多的其它被膜蛋白。例如这可能包括一种逆转录病毒本身的被膜蛋白。除了假型化蛋白外，还利用一个本病本身的被膜蛋白能够有利于被膜的稳定和/或功能，甚至还可以扩大此载体的感染范围。
本发明还为个体的基因治疗提供了药物组合物，其中此组合物包含治疗有效量的逆转录病毒载体。此药物组合物可以作为人用或兽用。一般，医生将确定最适合某一个体的实际剂量，并且此实际剂量将随年龄、体重及具体病人的反应来确定。
这种组合物可以可选地包括一种可药用的载体，稀释剂，赋形剂或佐剂。药物载体、赋形剂或稀释剂可以根据希望的用药途径和标准的制药实践来选择。此药物组合物除了含有载体、赋形剂或稀释剂之外，也可以含有任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂及辅助或增加病毒进入靶位点的其它载体物质(如脂质传递系统)。
合适时，此药物组合物能通过以下任何一种或更多的方式来给药：吸入，以栓剂或阴道药栓的形式，以洗剂、溶液、乳剂、药膏或撒粉的形式局部用药，使用皮肤用贴片，以含如淀粉或乳糖等赋形剂的片剂形式，或以含香味剂或生色剂的酏剂、溶液或悬浮液的形式口服，或者可用不经肠道的注射，如海绵窦内注射、静脉注射、肌肉注射或皮下注射。不经肠道给药时，此组合物最好以无菌水溶液的形式使用，此水溶液可以含有其它的物质，如足够的盐类或单糖类，以便此水溶液与血液等渗。用经口或舌下的给药方式，此药物组合物可以以片剂或锭剂来给药，这些片剂或锭剂可以按常规方式配制。
因此，总言之，本发明涉及的是具有异源被膜蛋白的一种逆转录病毒载体，尤其是一种狂犬病毒G蛋白。本发明还涉及生产其被膜含有狂犬病毒G蛋白的逆转录病毒载体的逆转录病毒载体生产系统，以及载体和系统的生产方法，以及有关载体和系统使用的方法。
现在仅用实例的方式并参照附图叙述本发明，其中：
图1：显示一个质粒图谱；
图2：显示一个凝胶照片；
图3：显示一组图解示意图；
图4：显示一个图；
图5：显示两个图；及
图6：显示一个图解示意图。
实施例1：表达狂犬病毒G蛋白载体的生产和使用的其它载体的详细说明。
通过将来源于pSG5rabgp(Burger et al1991“普通病毒学杂志”72:359-367)的1.7 kb BglⅡ狂犬病毒G片段克隆至pSA91(图1)来构建狂犬病毒G的表达载体，pSA91是pGW1HG(Soneoka et al1995Nuel Acids Res 23:628-633)的衍生质粒，通过BamHⅠ消化除去gpt基因并重新连接而获得。这种构建体pSA91RbG允许狂犬病毒G从人巨细胞病毒(HCMV)即时早期基因启动子-增强子表达。该质粒与pONY3(详细构建见后)和pONY2.1nlsLacZ(详细构建见后)一起转染进293T细胞，使用Soneoka et al1995(ibid)描述的方法，用Western印迹证实在转染细胞中狂犬病毒G的表达。一个VSV-G表达质粒被用作负对照，该质粒中用VSV-G基因代替pSA91中的狂犬病毒G基因在HCMV的控制下表达。用PBS洗转染细胞，在含1mM新配制的PMSF的RIPA缓冲液中裂解，并用BCA蛋白测定试剂盒，按其详细操作说明测定总蛋白浓度。50ug的细胞裂解物在10％的SDS/PAGE上电泳。凝胶被电转印到immobilon膜上(Millipore公司)。用1∶3000稀释的抗狂犬病毒G蛋白的小鼠单克隆抗体17D2和1∶1000稀释的连接有抗小鼠IgG的兔过氧化物酶(Vector Laboratories,Peterboroug UK)进行Western印迹分析。用ECL试剂盒(Amersham International,UK)通过化学发光法进行测定。在用pSA91RbG转染的细胞中明显存在一个与报道的狂犬病毒G蛋白大小相当的64KD带(图2)。
在所有的以下的实例中，如前描述的(Soneoke et al1995,ibid)三质粒转染方法被用作生成假型化载体。在这些实验中使用的质粒如下：pHITⅢ和pHIT60分别表示含有大肠大菌LacZ标记基因和MLV gag-pol基因的MLV载体(Soneoka et al,1995)。pH32和pGP-RRE3是相应的HIV载体成分(Kim et al 1998“病毒学杂志”72:811-816)。pONY2.1nlsLacZ和pONY3是相应的EIAV载体成分(英国专利申请9727135.7)。这些载体的重要特征，包括EIAV载体的特征显示于图3。
在图3中使用的缩写和标记描述如下
 CMVSV4 0LTRRU3ΔU3U5ψtatrevRREenvΔenvgagΔgagpolvifpAlacZneo 人类巨细胞病毒即时-早期增强子/启动子区域猿病毒40增强子和早期启动子区域长末端重复LTR的重复区域LTR的3’主要独有序列一种不完全的U3序列LTR的5’主要独有序列基因组包装信号调节蛋白调节蛋白rev应答元件编码被膜蛋白的基因含有缺失的env基因，使得一种平截蛋白被产生衣壳蛋白的编码区域含有缺失的gag区域，使得一系列不完全的衣壳蛋白被产生编码酶蛋白的区域病毒感染因子聚腺苷化信号编码β-半乳糖苷酶的基因编码新霉素磷酸转移酶的基因
EIAV载体的构建如下。
由如Payne et al(1994,J.Gen.Virol.75:425-9)描述的一个感染性前病毒克隆pSPEIAV19被用作开始点。通过从编码被膜蛋白的质粒区域的5835-6571 HindⅢ片段的缺失构建质粒pSPEIAVΔH。通过插入EIAV LTR至pBluescriptⅡ KS+(Stratagene)构建一个基因组质粒载体，EIAV LTR是用PCR从pSPEIAV19扩增的。然后将pSPEIAVΔH的MluⅠ/MluⅠ(216/814)片段插入LTR/Bluescript质粒中形成pONY2。此外，缺失掉pol(1901/4949)内的BglⅡ/NcoⅠ片段，并在该位置插入由HCMV IE增强子/启动子驱动的核内定位的β-半乳糖苷酶基因。该质粒称为pONY2.1nlsLacZ.。
通过插入来源于pONY2ΔH的MluⅠ/MluⅠ片段到哺乳动物表达质粒pCI-neo(Promego)中形成一个编码gagpol基因的EIAV质粒(pONY3)，使gag-pol蛋白从HCMV IE增强子/启动子表达。
Gag-pol表达载体 含LacZ的载体 病毒载体类型
 pHIT60  pHITⅢ  MLV
 pGP-RRE1  pH3Z  HIV
 pONY3  pONY2.1nlsLacZ  EIAV
实施例2：用狂犬病毒G蛋白假型化逆转录病毒载体
如前描述的(Soneoka et al1995)三种质粒的转染方法被用作生成假型化载体。在开始的实验中，在6孔的组织培养皿的孔中，10μgpSA91RbG与10μg gag-pol表达质粒和表达大肠杆菌lacZ基因的逆转录病毒载体进行共转染。用VSV-G假型化的实验被用作这些实验的正对照，其中10μg的pRY67代替pSA91中的狂犬病毒G,pRY67是一种VSV-G表达质粒，其中VSV-G在人巨细胞病毒启动子/增强子的控制下表达。
在人肾细胞系293T中(如在Soneoka et al1995中描述的)中进行转染，以生产载体病毒粒子。转染后36小时收获培养上清液，并用0.45mm孔径的过滤器(Millipore)过滤。
与狂犬病在体内的神经元专一性相比，狂犬病毒的实验室毒株在体外能与广泛的细胞系相互作用(Reagan and Wunner 1985“病毒学纪事”84:277-282)。因此对两个细胞系作为以狂犬病毒G假型化的逆转录病毒载体的靶细胞进行了评价，它们分别是幼仓鼠肾细胞系BHK21细胞和狗黑素瘤细胞系D17细胞。
细胞在感染前一天接种至6孔组织培养皿中，接种量为3×105Cells/孔。通过用适当的质粒转染293T细胞制备病毒上清液，即将上述的假型化EIAV,HIV-1和MLV载体加入到这些细胞中。在转导时，Polybrene(8ug/ml)被加入到每孔1ml的培养上清液中。感染12小时后，用新鲜培养基置换培养上清液。为了测定病毒效价，在感染后48小时，洗涤、固定和染色细胞。
用pSA91RbG和pRV67与所有三种逆转录病毒载体构建体转染时，我们能观察到D17细胞的β-半乳糖苷酶阳性克隆。不用pSA91RbG或pRV67转染则没有β-半乳糖苷酶阳性克隆，说明被膜对转导发生是必需的。若用BHK21细胞感染，仅能在MLV假型体中观察到β-半乳糖苷酶阳性克隆，而在EIAV和HIV假型体中观察不到。这种不能产生β-半乳糖苷酶阳性克隆的原因可能是因为在这种细胞类型中结合后封闭EIAV和HIV-1。这些结果证实狂犬病毒G能假型化EIAV,HIV和MLV载体。
通过比较这些假型化载体的病毒效价研究了假型化的效率。从β-半乳糖苷酶阳性克隆的数目来估计病毒的效价(表1)。
表1含有狂犬病毒G蛋白的假型化逆转录病毒载体的相对效率
    病毒成分 基于以下细胞估计每ml中转导粒子的数目D17    BHK-21
逆转录病毒载体 相应的质粒构建体 Gag-pol表达质粒 被膜表达质粒 产生的假型化载体
 1EIAV  pONY2.1nlsLacZ  pONY3  pRV67  EIAV-VSVG  8.4×104 ＜101
 2EIAV  pONY2.1nlsLacZ  pONY3  pSA91RbG  EIAV-RbG  3.2×104 ＜101
 3HIV  pH4Z  pGP-RRE1  pRV67  HIV-VSVG  3.0×104 ＜101
 4HIV  pH4Z  PGP-RRE1  pSA91Rb G  HIV-RbG  6.4×103 ＜101
 5MLV  pHIT111  pHIT60  pRV67  MLV-VSVG  6.3×106 4.8×106
 6MLV  pHIT111  pHIT60  pSA91Rb G  MLV-RbG  1.6×106 7.8×106
 7Mock ＜101 ＜101
在两个试验细胞系中用狂犬病毒G假型化的MLV的病毒效价与观察到的VSV-G假型体相当(在BHK21中，VSV-G与狂犬病毒G各自为4.8×106和7.8×106；在D17细胞中VSV-G和狂犬病毒G各自为6.3×106和1.6×106)。
在D17细胞中，用VSV-G和狂犬病毒G假型化EIAV和HIV-1得到相似结果。用VSV-G和狂犬病毒G假型化的载体的EIAV病毒效价分别为8.4×104和3.2×104。在HIV-1中，用VSV-G和狂犬病毒G假型化的病毒效价分别为3.4×104和6.4×103。这些结果说明狂犬病毒G在用三种逆转录病毒载体假型化中如VSV-G一样有效。
我们的结果说明狂犬病毒G能假型化逆转录载体EIAV,HIV-1和MLV，产生与用VSV-G假型化相当的高效价。
实施例3-含有改变氨基酸333的狂犬病毒G蛋白的生产和表征
在pSA91RbG中，狂犬病毒糖蛋白基因的编码序列被用重叠PCR改造，使得所产生的蛋白在333位具有谷氨酰胺而不是精氨酸。这一改变被报导在狂犬病毒中引起减毒作用和改变细胞嗜性。用作诱变的引物如下：正向引物5’GATGCTCACTACAAGTCAGTCCAGACTTGGAATGAGA3TCCTCCC反向引物5’GGGAGGATCTCATTCCAAGTCTGGACTGACTTGTAGT3GAGCATC
这一改造片段作为SphⅠ BglⅡ片段被重新引入pSA91Rg中，产生的质粒是pSA91RM。从这种载体产生的改造的狂犬病毒G蛋白假型化MLV粒子的能力被测试。如Soneoka et al1995描述的将该质粒与pHIT60和pHI111一起转染进293T细胞，pSA91Rg被用作正对照。如前所述收集这些转染的上清液，且通过其转导BHK-21或鼠成神经细胞瘤细胞系C-1300克隆NA的能力来评估两种被膜假型化MLV粒子的能力(表2)。
表2含有改变的氨基酸333的狂犬病毒G蛋白假型化MLV粒子的能力的表正
    病毒成分 基于以下细胞每ml中转导粒子的数目BHK21  C-1300
逆转录病毒载体 相应的质粒构建体 gag-pol表达质粒 被膜表达质粒 产生的假型化载体
 1MLV  pHIT111  pHIT60  pSA91RbG  MLV-RbG  4.2×106 6.1×106
 2MLV  pHIT111  pHIT60  pSA91RM  MLV-RMG  3.1×105 7.2×106
 3Mock      -       -      -      - ＜1 ＜101
尽管用改造的狂犬病毒G蛋白在一般用于生产狂犬病毒疫苗的BHK-21细胞上获得的效价低于野生型的，但是在C-1300细胞上两种被膜蛋白获得的效价相当。这些结果说明改造的蛋白能有效地假型化MLV粒子。
实施例4-狂犬病毒G假型化的逆转录病毒载体的效价优化
对其他两种成分滴定了添加到3质粒转染系统中的pSA91RbG DNA的量以便测定最佳病毒效价。
在该实验中，使用CaPO4沉淀法用质粒pSA91RbG,pHIT111和pHIT60转染COS-1细胞。后两种质粒等量(8ug/转染/35mm皿)，而pSA91RbG的量依次减少。转染36小时后收获转染上清液，且在HT1080细胞上测定存在的转导粒子数目。结果显示于图4。与其它质粒相比pSA91RbG DNA的量减少8倍产生了最高效价。总效价比在例1中从293T细胞获得的低。
对产生基于EIAV的载体需要的两种成分也进行了pSA91RbG的滴定。在这种情况中，用含有8ug编码gag/pol(pONY3)质粒和8ug表达编码β-半乳糖苷酶(pONY2.1inLacZ)的EIAV载体的质粒通过CaPO4沉淀转染293T细胞。如上添加不同量的pSA91RbG或pRY67以分别提供用狂犬病毒G或VSV-G假型化的载体。转染36小时后收获转染上清液，并在D17细胞上测定存在的转导粒子数目。结果显示于图5。与其他质粒相比pSA91RbG DNA的量减少2-4倍产生了最高效价。当用和其他两种质粒等量的pRV67时，没有观察到效价的明显减少。
这些结果表明，通过调整狂犬病毒G和在生产细胞中表达的载体成分的相对量来获得狂犬病毒G假型化的逆转录病毒载体的较高效价是可能的。
实施例5-狂犬病毒G假型化的逆转录病毒载体的浓缩
我们更进一步研究了用超速离心的方法(Burns et al1993 PNAS90:8033-8037)浓缩病毒上清液是否能增加病毒的效价，超速离心时，用VSV-G假型化的基于MLV的载体得到了每ml含有109转导粒子的病毒效价。如前所述(Soneoka et al.,1995)的三质粒转染方法被用来生成用狂犬病毒G或VSV-G假型化的粒子。转染36小时后收获转导粒子，超速离心浓缩并在D17细胞上滴定。48小时后，这些细胞进行β-半乳糖苷酶染色。取三次独立试验的效价的平均值并计算作为每ml半乳糖苷酶的生产单位。试验间的变异不超过10％。已经证明可以降低收获体积至130倍，而用两种被膜之一假型化的EIAV和MLV粒子的转导粒子没有明显降低。
表3浓缩对狂犬病毒G假型化逆转录病毒载体的影响
病毒成分 浓缩前的效价 浓缩后的效价 体积的降低倍数 效价的降低倍数 回收率％
逆转录病毒载体 相应的质粒构建体 Gag-pol表达质粒 被膜表达质粒 产生的假型化载体
EIAV  pONY2.1n1sLacZ  pONY3  pRV67  EIAV-VSVG  2.0×105 2.5×107 130  125  96
 EIAV  pONY2.1n1sLacZ  pONY3  pSA91RbG  EIAV-RbG  1.0×105 1.2×107 130  120  96
 EIAV  pONY2.1n1sLacZ  pONY3  Mock  1  1  130  N.A  N.A
 MLV  pHIT111  pHIT60  pRY67  MLV-VSVG  4.0×105 4.8×107 130  119  92
 MLV  pHIT111  pHIT60  pSA91RbG  MLV-RbG  3.5×105 4.5×107 130  128  98
 MLV  pHIT111  pHIT60  Mock ＜1 ＜1  130  N.A  N.A
这些结果表明用狂犬病毒G假型化的载体能用超速离心浓缩，使载体效价增加到与用VSV-G假型化的载体相当的效价。
这些特性和狂犬病毒G在体内对神经元细胞的专一性使得用狂犬病毒G假型化非常有吸引力，因为携带任何治疗基因的逆转录病毒载体容易靶向神经系统。
实施例6-狂犬病毒G假型体转导培养的人类靶细胞的能力的选择性
用人类神经和非神经源细胞系测定了用狂犬病毒G假型化的载体的细胞专一性。用VSV-G假型化的实验被用作阳性对照。由三种质粒转染制备的病毒上清液用来感染人类成神经细胞瘤细胞系IMR-32和人类T细胞系CEM-A。从β-半乳糖苷酶阳性克隆估计病毒效价(表4)  。
表4狂犬病假型化转导培养的人类靶细胞能力的选择性
    病毒成分 基于以下细胞每ml中转导粒子的数目IMR32    CEM-A
  逆转录病毒载体 相应的质粒构建体 Gag-pol表达质粒 被膜表达质粒 产生的假型化载体
1  MLV  pHIT111   pHIT60   pRV67  MLV-VSVG  4.9×103 7.3×102
2  MLV  pHIT111   pHIT60  pSA91RbG   MLV-RbG  3.1×105 1.7×101
  3  Mock      -        -     -       -     0     0
用狂犬病毒G和VSV-G假型化的MLV载体能感染IMR-32细胞。但用狂犬病毒G假型化的MLV载体产生的效价(3.1×105)是用VSV-G假型化的MLV载体(4.9×103)的100倍。在CEM-A细胞中，用狂犬病毒G假型化的MLV载体产生了1.7×101的低效价。这种低效率不是由于MLV没有能力转导这些细胞。证明这点的证据是当用VSV-G假型化的同样载体有比较高的效价(7.3×102)。
我们的结果说明不象VSV-G，狂犬病毒G假型体显示了它们转导人类靶细胞能力的选择性，在神经细胞系中的转导效率高于在T细胞系中的转导效率。
实施例7-狂犬病毒G假型体在体外(原代培养)和体内(大鼠/小鼠模式系统)转导脑细胞的能力。
有证据认为在体内狂犬病毒至少使用了两种不同的受体(Hanhamet al,1993“病毒学杂志”67:530-542；Tuffereau et al，“病毒学杂志”72:1085-1091)，这些受体中的一种可能是烟碱乙酰胆碱受体。在小鼠模式系统中，用野生型狂犬病毒(CVS毒株)和这种毒株的双突变(氨基酸330和333改变)详细地研究了它们感染的神经细胞的类型和在整个神经系统中病毒的传播(Coulou et al；1989“病毒学杂志”63:3550-3554；Lafay et al,1991“病毒学”183:320-330)。这些研究结果表明突变病毒的传播和范围与野生型相比较受到重大限制。
为了测定用狂犬病毒G蛋白假型化的EIAV载体的趋性，采用了以下分析。成年雌性AO大鼠被麻醉并在纹状体或其它大脑区域趋触性地注射2×1μl的病毒原种。注射7或30天后，麻醉大鼠，并用4％的多聚甲醛灌流心脏。取出大脑，固定24小时，用30％的蔗糖饱和，并在冷冻切片机上切片(50μm)。切片用X-gal溶液染色3小时至过夜，固定标本在载玻片上并用光学显微镜分析。用三重标记免疫荧光法鉴定转导的具体细胞类型，使用对神经细胞元(NeuN或其它的)、星形细胞(GFAP)或少突细胞(Galc)特异性的抗体和β-半乳糖苷酶以及种特异性的第二抗体。用共聚焦显微镜分析转导的大脑区域的成像。
用于体外转导试验的原代神经元被置于大鼠胚胎培养物中，生长至完全分化为止。用4μg/ml的polybrene添加病毒载体5小时。两天后更换培养基并用X-gal染色或抗体进行表达的分析。
实施例8-狂犬病毒G假型化HIV-1载体的浓缩和用VSV-G和狂犬病毒被膜生产这种载体的比较。
实施例5说明，狂犬病毒G假型化EIAV载体能用如已报导的VSV-G假型化载体相同的方式通过超速离心进行有效浓缩。我们已经延长了这些观察，表明狂犬病毒G能被用于假型化HIV-1载体，这些粒子能通过超速离心进行有效浓缩，在D17细胞上获得的效价与用VSV-G假型化载体获得的效价相当。
如前所述(Soneoka et al.,1995)的三质粒转染方法被用于生成用狂犬病毒G或VSV-G假型化的粒子。用于该试验的HIV-1质粒pH4Z和pGP-RRE3已被Kim等描述(1998“病毒学杂志”72:811-816)。用于这种试验的成分比率，对于狂犬病毒G是gag/pol：基因组：被膜为1∶1∶1，对于VSV-G是gag/pol：基因组：被膜为1∶1∶0.5；这是用于COS1细胞的变化比率，因为我们发现293T细胞比COS细胞更抗狂犬病毒G蛋白的表达。转染后48小时收获转导粒子，通过超速离心浓缩并在D17细胞上滴定。48小时后，这些细胞进行β-半乳糖苷酶染色。这证实用两种被膜中的任一种假型化的HIV-1粒子收获物的效价可以增加大约100倍(表5)。用任一种被膜假型化的载体获得的效价并无明显差别。这些结果说明用狂犬病毒G假型化的载体能通过超速离心浓缩，使载体效价增加到与VSV-G假型化载体相当，并且在D17细胞上这两种被膜同样有效。
表5
制备物 LacZ克隆形成单位/0.5ml 平均效价/ml
浓缩前的狂犬病毒假型化HIV-1  3.4×105 4.1×105 7.5×106
浓缩后的狂犬病毒假型化HIV-1  3.5×108 3.3×108 3.6×108 6.9×108
浓缩前的VSV-G假型化HIV-1  3.7×106 4.0×106 7.7×106
浓缩后的VSV-G假型化HIV-1  4.8×108 4.6×108 3.9×108 8.9×108
讨论及概述
如前所述，逆转录病毒和来源于逆转录病毒的载体需要一种特殊的被膜蛋白，以有效地转导靶细胞。被膜蛋白在生产病毒或载体的细胞中表达并整合进病毒或载体粒子。逆转录病毒粒子由来源于gag基因的蛋白核心组成，该蛋白核心中包围有病毒RNA。然后该核心被包围在一种细胞膜部分中，其中含有来源于病毒env基因的一种被膜蛋白。被膜蛋白以前体的方式被生产，该前体能被加工成2个或3个单位。这些单位分别是表面蛋白(SU)，跨膜蛋白(TM)和胞质尾(Coffin 1992 in TheRetroviridae,Pleum Press,ed Levy)，表面蛋白完全在被膜的外部，跨膜蛋白与表面蛋白相互作用，包含有膜跨区域。在一些逆转录病毒中，一个小肽从跨膜蛋白中被除去。为了充当一种有效的被膜蛋白，有能力与靶细胞表面结合并介导病毒的进入，被膜蛋白不得不用精确的方式与靶细胞表面适当的受体作用，使得病毒粒子以适当的方式内化，以传递基因组至细胞的正确区域，在该区域进行生产性感染。
已经多次尝试用来源于一种病毒的被膜去包装不同的病毒，这一过程被称之为假型化。假型化的效率是高度可变的，似乎被被膜的胞质尾和病毒粒子的核心蛋白间的相互作用强烈地影响。被膜蛋白被吸收进出芽病毒粒子的过程现在所知甚少，但已知道这一过程是选择性的，因为大多数的细胞蛋白被逆转录病毒粒子排除(Hunter 1994 SeminVirol 5:71-83)，并且在一些逆转录病毒中，已经记录到在缺乏被膜蛋白的情况下发生的出芽(Einfeld 1996 Curr Top MicrobiolImmunel 214:133-176；Krausslich and Welker 1996 Curr TopMicrobiol Immunel 214:25-63)。在一些逆转录病毒中，有证据表明被膜蛋白的胞质域与病毒核心间进行精确的分子间相互作用。Januszesk；等(1997“病毒学杂志”71:3613-3619)已表明，鼠白细胞瘤病毒(MLV)的胞质尾少量的缺失或取代就强烈地抑制被膜蛋白进入病毒粒子。对HIV-1,Casson(1996 EMBO J 15:5783-5788)表明，HIV-1的基质蛋白与它的被膜蛋白的胞质域间直接相互作用。这种基质与被膜蛋白间的相互作用在被膜蛋白进入出芽的HIV病毒粒子中起着关键作用。这是由以下事实证实的，即如果绵羊髓鞘脱落病毒的gag多聚蛋白的基质域的氨基酸末端被等量的HIV-1基质域代替，绵羊髓鞘脱落病毒只能用HIV-1的被膜蛋白有效地假型化(Dorfman et al.,1994“病毒学杂志”68:1689-1696)。然而这种情况是复杂的，因为HIV-1 Env的截断对于Molony氏白血病病毒的有效假型化是必需的(Mammano et al 1997“病毒学杂志”71:334-3345)，而人类泡沫病毒被膜蛋白的截断会降低它假型化鼠白血病毒的能力(Lindemam etal.,1997“病毒学杂志”71:4815-4820)。也有环境因素作用于逆转录病毒核心和它的被膜蛋白的胞质尾部间的相互作用。在一些细胞系中，EIAV的传代延长导致糖蛋白的截断，表明宿主细胞因素可根据被膜蛋白的C-末端域对病毒进行选择(Rice et al.,1990 64:3770-3778)。
这些研究和许多其它工作者的研究表明，即使密切相关的逆转录病毒是否能相互假型化也是不可能预言的。此外，如果一种所给的被膜对一种特定病毒的假型化失败了，也不可能预测可能赋予假型化能力的分子改变。尽管假型化已经取得了一些成功，但显然受到病毒成分和异源被膜蛋白间的相容性要求的限制。
在逆转录病毒载体的构建中，需要改造天然病毒成具有不同靶细胞特异性的载体，以便能传递遗传物质至更广泛的或改变的细胞类型中去。完成这一方案的一种方式是通过改造病毒被膜蛋白以改变它的专一性。另一种方法是引进异源被膜蛋白至载体以代替或添加到病毒的天然被膜蛋白中。
MLV被膜蛋白具有假型化多种不同逆转录病毒的能力。来源于一种兼嗜性病毒的MLV被膜蛋白能转导广泛的细胞类型，包括人类细胞。但有时候可能不希望逆转录病毒载体能感染大量的细胞类型。
棒状病毒水泡性口炎病毒(VSV)的被膜糖蛋白(G)是另一种已经证实有能力假型化某些逆转录病毒的被膜蛋白。逆转录病毒MLV已被成功地假型化(Burns et al1993 Proc Natl Acad  Sci USA 90:8033-7)，并形成了一种与MLV的天然形式相比含有改变的宿主范围的载体。VSV-G假型化的载体已经证实不仅能感染哺乳动物细胞，而且能感染来源于鱼、爬行类动物和昆虫的细胞系(Burns et al 1993)。VSV-G蛋白也能假型化某些逆转录病毒是因为它的胞质尾能与逆转录病毒核心相互作用。VSV-G和MLV被膜蛋白都有短的胞质尾部，分别为28到31和32个氨基酸，长度非常相似。
提供非逆转录病毒假型化被膜如VSV-G蛋白的优点是载体粒子能被浓缩至高效价而不丧失感染性(Akkina et al；1996“病毒学杂志”.70:2581-5)。逆转录病毒被膜蛋白明显地不能抵抗超速离心过程中的剪切力，可能是因为它们是由两个非共价连接地亚单位组成的。通过离心亚单位间的相互作用也许被破坏。相比较而言，VSV糖蛋白是由单个单位组成。
因而假型化VSV-G蛋白提供了潜在的优点。但是，可能也需要与使用VSV-G蛋白获得的靶细胞专一性不同的靶细胞专一性。已经尝试通过改造蛋白中的靶位点而改变VSV-G的靶细胞范围。在1997年关于传递治疗基因的靶载体策略会议上(Cold Spring Harbor,USA)报导这些尝试是不成功的。因此需要改变逆转录病毒载体靶细胞范围的其它方法。
已经尝试用其它棒状病毒的被膜有效地假型化逆转录病毒。在1997年关于传递治疗基因的靶载体策略会议上(Cold Spring Harbor,USA)仅有的一篇报导(Reiser et al)声称狂犬病毒和Mokola氏病毒的糖蛋白能假型化HIV-1粒子，但是获得的效价远低于用VSV-G蛋白获得的效价。
本发明通过提供一种已经用狂犬病毒蛋白特别是狂犬病毒G蛋白假型化的逆转录病毒传递系统，希望克服这些问题。
以上说明书中提及的所有出版物在此引用作为参考。本发明所描述的方法和系统的不同修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的，而不会偏离本发明的范围和精神。尽管结合了具体的优选实施方案描述了本发明，但应该理解本发明不限于这些具体方案。实际上，本发明的权利要求书旨在包括本文所述的实施本发明的各种方式的修正，其对分子生物学及相关领域的技术人员来说显而易见的。
序列表SEQ ID NO.1狂犬病毒毒株ERA的核苷酸序列Genbank：位置RAVGPLS，入藏号M384521   aggaaagatg gttcctcagg ctctcctgtt tgtacccctt ctggtttttc cattgtgttt61   tgggaaattc cctatttaca cgatactaga caagcttggt ccctggagcc cgattgacat121  acatcacctc agctgcccaa acaatttggt agtggaggac gaaggatgca ccaacctgtc181  agggttctcc tacatggaac ttaaagttgg atacatctta gccataaaaa tgaacgggtt241  cacttgcaca ggcgttgtga cggaggctga aacctacact aacttcgttg gttatgtcac301  aaccacgttc aaaagaaagc atttccgccc aacaccagat gcatgtagag ccgcgtacaa361  ctggaagatg gccggtgacc ccagatatga agagtctcta cacaatccgt accctgacta421  ccgctggctt cgaactgtaa aaaccaccaa ggagtctctc gttatcatat ctccaagtgt481  agcagatttg gacccatatg acagatccct tcactcgagg gtcttcccta gcgggaagtg541  ctcaggagta gcggtgtctt ctacctactg ctccactaac cacgattaca ccatttggat601  gcccgagaat ccgagactag ggatgtcttg tgacattttt accaatagta gagggaagag661  agcatccaaa gggagtgaga cttgcggctt tgtagatgaa agaggcctat ataagtcttt721  aaaaggagca tgcaaactca agttatgtgg agttctagga cttagactta tggatggaac781  atgggtcgcg atgcaaacat caaatgaaac caaatggtgc cctcccgatc agttggtgaa841  cctgcacgac tttcgctcag acgaaattga gcaccttgtt gtagaggagt tggtcaggaa901  gagagaggag tgtctggatg cactagagtc catcatgaca accaagtcag tgagtttcag961  acgtctcagt catttaagaa aacttgtccc tgggtttgga aaagcatata ccatattcaa1021 caagaccttg atggaagccg atgctcacta caagtcagtc agaacttgga atgagatcct1081 cccttcaaaa gggtgtttaa gagttggggg gaggtgtcat cctcatgtga acggggtgtt1141 tttcaatggt ataatattag gacctgacgg caatgtctta atcccagaga tgcaatcatc1201 cctcctccag caacatatgg agttgttgga atcctcggtt atcccccttg tgcaccccct1261 ggcagacccg tctaccgttt tcaaggacgg tgacgaggct gaggattttg ttgaagttca1321 ccttcccgat gtgcacaatc aggtctcagg agttgacttg ggtctcccga actgggggaa1381 gtatgtatta ctgagtgcag gggccctgac tgccttgatg ttgataattt tcctgatgac1441 atgttgtaga agagtcaatc gatcagaacc tacgcaacac aatctcagag ggacagggag1501 ggaggtgtca gtcactcccc aaagcgggaa gatcatatct tcatgggaat cacacaagag1561 tgggggtgag accagactgt gaggactggc cgtcctttca acgatccaag tcctgaagat1621 cacctcccct tggggggttc tttttaaaaaaSEQ ID NO.2狂犬病毒毒株ERA的氨基酸序列Genbank：位置RAVGPLS，入藏号M38452PID:g333574MVPQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTILDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYILAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYRWLRTVKTTKFSLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPSGKCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPDQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVRKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEILPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLESSVIPLVHPLADPSTVFKDGDEAEDFVEVHLPDVHNQVSGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCCRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESHKSGGETRL

Claims (23)

1．一种能转导一个靶位点的逆转录病毒传递系统，其中该逆转录病毒传递系统包括编码至少部分被膜蛋白的第一核苷酸序列；和一个或多个可来源于逆转录病毒、保证逆转录病毒传递系统对靶位点的转导的其它核苷酸序列；其中第一核苷酸序列至少与其它核苷酸序列之一是异源的；并且第一核苷酸序列编码能够识别靶位点的狂犬病毒G蛋白的至少一部分或其突变体，变体，衍生物或片段。
2．根据权利要求1的逆转录病毒传递系统，其中第一核苷酸序列编码全部的狂犬病毒G蛋白或其突变体，变体，衍生物或片段。
3．根据权利要求1或2的逆转录病毒传递系统，其中至少其它核苷酸序列之一可来源于一种慢病毒或一种致癌逆转录病毒。
4．根据前述任一权利要求的逆转录病毒传递系统，其中其它核苷酸序列可来源于一种慢病毒或一种致癌逆转录病毒。
5．根据前述任一权利要求的逆转录病毒传递系统，其中其它核苷酸序列可来源于MLV、HIV或EIAV。
6．根据前述任一权利要求的逆转录病毒传递系统，其中该逆转录病毒传递系统包括至少一个NOI。
7．根据权利要求6的逆转录病毒传递系统，其中NOI具有治疗效应或编码一种具有治疗效应的蛋白。
8．根据前述任一权利要求的逆转录病毒传递系统，其中靶位点是一种细胞。
9．根据前述任一权利要求的逆转录病毒传递系统可获得的病毒粒子。
10．一种逆转录病毒载体，其中逆转录病毒载体是权利要求1到8任一项的逆转录病毒传递系统或可由其获得。
11．用权利要求1-8任一项的逆转录病毒传递系统或权利要求9的病毒粒子或权利要求10的逆转录病毒载体转导的细胞。
12．权利要求1-8任一项的逆转录病毒传递系统或权利要求9的病毒粒子或权利要求10的逆转录病毒载体在医药中的用途。
13．权利要求1-8任一项的逆转录病毒传递系统或权利要求9的病毒粒子或权利要求10的逆转录病毒载体在制造一种药物组合物中的用途，所述组合物用以传递一种NOI至需要其的靶位点。
14．一种方法，包括让一种细胞与权利要求1-8任一项的逆转录病毒传递系统或权利要求9的病毒粒子或权利要求10的逆转录病毒载体接触。
15．一种载体，用以制备权利要求1-8任一项的逆转录病毒传递系统或权利要求9的病毒粒子或权利要求10的逆转录病毒载体，其中该载体包括一个核苷酸序列，其编码狂犬病毒G蛋白的至少一部分或其突变体，变体，衍生物或片段。
16．一种质粒，用以制备权利要求1-8任一项的逆转录病毒传递系统或权利要求9的病毒粒子或权利要求10的逆转录病毒载体，其中该质粒包括一个核苷酸序列，其编码狂犬病毒G蛋白的至少一部分或其突变体，变体，衍生物或片段。
17．多种质粒，其中至少一种质粒是权利要求16的质粒，且至少一种其他质粒包括一个或多个可来源于逆转录病毒的核苷酸序列。
18．狂犬病毒G蛋白假型化一种逆转录病毒或逆转录病毒载体或逆转录病毒粒子以影响该逆转录病毒或逆转录病毒载体或逆转录病粒子的感染谱的用途。
19．狂犬病毒G蛋白假型化一种逆转录病毒或逆转录病毒载体或逆转录病毒粒子以影响该逆转录病毒或逆转录病毒载体或逆转录病粒子的宿主范围和/或细胞嗜性的用途。
20．用狂犬病毒G蛋白假型化的逆转录病毒或逆转录病毒载体或逆转录病毒粒子。
21．一种逆转录病毒传递系统，包括一个异源env区，其中该异源env区包括编码狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列的至少一部分。
22．一种逆转录病毒传递系统，包括一段异源env区，其中该异源env区包括一个编码狂犬病毒G蛋白的核苷酸序列。
23．基本上如本文所述的假型化逆转录病毒或逆转录病毒载体或逆转录病毒粒子。
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