JP2005528912A - 幹細胞におけるスプライセオソーム介在rnaトランススプライシング - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、幹細胞における標的スプライセオソーム介在トランススプライシングによって新規な核酸分子を作製するための方法および組成物を提供する。本発明の組成物は、プレトランススプライシング分子(PTM)を発現するように遺伝子操作された幹細胞を含み、このPTMは標的前駆体メッセンジャーRNA分子(標的プレmRNA)と相互作用して、新規なキメラRNA分子(キメラRNA)の形成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するようにデザインされる。特に、本発明の幹細胞は、幹細胞が分化するとき該細胞内で発現される特異的な標的プレmRNAと相互作用して、遺伝的障害の原因となる遺伝子欠損の修正をもたらすPTMを発現するように遺伝子操作される。本発明の方法は、対象のPTMをコードすることができる核酸分子を幹細胞内に導入し、続いてPTMで改変された幹細胞を宿主に移植することを包含する。幹細胞が分化するとき標的プレmRNAが発現され、それによりトランススプライシング反応用の基質が提供される。本発明は、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質(CFTR)のプレmRNAと相互作用することができるPTMをコードする核酸分子を、初代ヒト表面気道前駆細胞内に成功裏に導入して発現させたことに基づいている。本発明の方法および組成物は、いくつか名を挙げると、嚢胞性繊維症、血友病、鎌状赤血球貧血、テイ-サックス病、サラセミア、多発性嚢胞腎、筋ジストロフィーなど、様々な障害と関連した遺伝子欠損を修正するために使用することができる。
ヒトゲノムの塩基配列解析をはじめとする最近の分子生物学の進歩は、疾患の遺伝的基礎に関する価値ある情報を提供してきた。遺伝子治療は、遺伝的障害が核酸分子のレベルで修正しうるという前提に基づくものである。遺伝子治療を用いることに伴う努力目標には、安全、特異的、かつ効率的な方法で遺伝物質を患者の適切な細胞に送達するための有効なアプローチの開発が含まれる。
本発明は、スプライセオソーム介在標的トランススプライシングにより幹細胞において新規な核酸分子を発現させるための組成物および方法に関する。特に、本発明の組成物は、特定の標的プレmRNA分子(以後「標的プレmRNA」という)と相互作用しかつ新規なキメラRNA分子(以後「キメラRNA」という)の形成をもたらすスプライセオソームトランススプライシング反応を媒介するようにデザインされた、プレトランススプライシング分子(以後「PTM」という)を発現するように遺伝子操作された幹細胞を含む。本発明は、初代ヒト表面気道前駆細胞における嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質(CFTR)の標的プレmRNAの、成功を収めた標的トランススプライシングに基づいている。
図1.異なるトランススプライシング反応の模式図。(a)標的5’スプライス部位とPTMの3’スプライス部位との間のトランススプライシング反応、(b)標的3’スプライス部位とPTMの5’スプライス部位との間のトランススプライシング反応、および(c)PTMが3’スプライス部位と5’スプライス部位の両方を保持する二重トランススプライシング反応による内部エキソンの置換。BD、結合ドメイン;BP、分岐点配列;PPT、ポリピリミジン管;ss、スプライス部位。
皮とで類似していたが、上皮の高さはRV.CFTRPTM-24感染異種移植片においてわずかに低かった。このことは、PTM-24構築物からの毒性が低いものの存在することを裏付けている。
本発明は、プレトランススプライシング分子(PTM)をコードしうる核酸分子を含む遺伝子操作された幹細胞を含んでなる組成物、ならびに遺伝子欠損を修正するようにデザインされた新規核酸分子を生成するための前記細胞の使用に関する。幹細胞内で発現されるPTMは、(i)幹細胞内で発現された特定の標的プレmRNAと特異的に結合するようにデザインされた1以上の標的結合ドメイン、および(ii)分岐点と3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域および/または5’スプライス供与部位を含んでなる。3’スプライス領域はピリミジン管をさらに含んでいてもよい。加えて、本発明のPTMは、翻訳可能なタンパク質産物をコードするもののような任意のヌクレオチド配列、およびRNAスプライス部位を標的結合ドメインから分離する1以上のスペーサー領域を含むように操作することもできる。
本発明は、標的トランススプライシングにより新規なキメラ核酸分子を生成するのに用いる組成物を提供する。本発明のPTMは、(i)分化する幹細胞内で発現された特定の標的プレmRNAにPTMの結合をターゲッティングする1以上の標的結合ドメイン、および(ii)分岐点と3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域および/または5’スプライス供与部位を含んでなる。3’スプライス領域はピリミジン管をさらに含んでいてもよい。本発明のPTMはまた、(a)RNAスプライス部位を標的結合ドメインから分離する1以上のスペーサー領域、(b)ミニイントロン配列、(c)ISAR(イントロンスプライシングアクチベーターおよびリプレッサー)コンセンサス結合部位、および/または(d)リボザイム配列を含むことができる。
5’断片配列:
Gtagttcttttgttcttcactattaagaacttaatttggtgtccatgtctctttttttttctagtttgtagtgctggaaggtatttttggagaaattcttacatgagcattaggagaatgtatgggtgtagtgtcttgtataatagaaattgttccactgataatttactctagttttttatttcctcatattattttcagtggctttttcttccacatctttatattttgcaccacattcaacactgtagcggccgc;
3’断片配列:
Ccaactatctgaatcatgtgccccttctctgtgaacctctatcataatacttgtcacactgtattgtaattgtctcttttactttcccttgtatcttttgtgcatagcagagtacctgaaacaggaagtattttaaatattttgaatcaaatgagttaatagaatctttacaaataagaatatacacttctgcttaggatgataattggaggcaagtgaatcctgagcgtgatttgataatgacctaataatgatgggttttatttccag。
PTMをコードする核酸分子を作製する場合、該核酸分子の発現ベクターへのクローニングには当技術分野で公知のクローニング技術を用いることができる。使用できる当技術分野で一般に知られている組換えDNA技術の方法は、Ausubelら(編), 1993, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY;およびKriegler, 1990, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記載されている。
本発明の組成物および方法は特定の遺伝子欠損を修正するために使用することができる。具体的には、二重トランススプライシング反応、3’エキソン置換および/または5’エキソン置換を含めた標的トランススプライシングを用いることにより、トランケートされているかまたは突然変異型表現型をもたらす点突然変異を含んでいる特定の転写産物を修復または修正することが可能である。本発明のPTMは、標的転写産物を特定の突然変異の上流もしくは下流で、または未熟3’停止コドンの上流で切断し、突然変異を含む転写産物の部分を機能性配列で置換するトランススプライシングによりその突然変異型転写産物を修正するようにデザインされる。
図2は、気道幹細胞でのCFTR幹細胞再構成を評価するために使用した全体的なプロトコルを表している。LacZまたはCFTRを発現するレトロウイルスを初代気道上皮細胞に形質導入した。トランスジーン発現はサザンブロット分析またはX-gal染色(一般には、10〜20%の細胞が染色される)により評価した。次に、初代細胞をヒト気管支異種移植片に播種して5〜6週間培養して再構成させた。その後、異種移植片気道上皮をCFTRまたはLacZトランスジーン発現について評価した。
異種移植片上皮とで類似していたが、上皮の高さはRV.CFTRPTM-24感染異種移植片においてわずかに低かった。このことは、PTM-24構築物からの毒性が低いものの存在することを裏付けている。これらの知見は、RV.CFTRPTM-24感染をRV.CBLacZ感染と比較したときのベクターゲノムのわずかな安定性の低下を実証するTaq-Man PCRのデータと一致している。これらのデータは、CFTRのSMART送達が気道幹細胞での高レベルの異所性CFTR発現に伴って生じる毒性を軽減しうることを示している。この毒性は気道幹細胞の分化・増殖能の低下と関連しているようである。
ΔF508/ΔF508肺幹細胞におけるトランススプライシングによるCFTRの条件修復および発現。CF患者由来の初代ヒト表面気道上皮(SAE)細胞にCFTR修正用PTMまたはLacZのいずれかをコードするレトロウイルスを形質導入する。形質導入した細胞は、in vivo気道再構成異種移植片モデルにおいてそれらの増殖能および生存能を試験する。各送達遺伝子(CFTR-PTMまたはLacZ)についての形質導入初代細胞の割合を、再構成された異種移植片気管支上皮に存在するトランスジーン陽性クローンの数と比較する。lacZまたはCFTRを形質導入した初代細胞による成体ヒト気管支異種移植片の再構成に続いて、移植の5週間後に、(i)CFTR塩素イオンチャンネル活性、(ii)組織化学的染色を用いたLacZトランスジーン発現、(iii)免疫組織化学を用いたCFTRトランスジーン発現、および(iv) in situハイブリダイゼーションを用いたトランスジーン由来LacZおよびPTM CFTR mRNA、について異種移植片を評価する。
Claims (40)
- 核酸分子を含んでなる幹細胞であって、該核酸分子が、
a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域;
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、該核酸分子は幹細胞または分化する幹細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記幹細胞。 - 核酸分子を含んでなる幹細胞であって、該核酸分子が、
a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 3’スプライス受容部位;
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、該核酸分子は幹細胞または分化する幹細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記幹細胞。 - 核酸分子を含んでなる幹細胞であって、該核酸分子が、
a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 5’スプライス部位;
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、該核酸分子は幹細胞または分化する幹細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記幹細胞。 - 前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項1または2に記載の幹細胞。
- 3’スプライス領域がピリミジン管をさらに含んでなる、請求項1または2に記載の幹細胞。
- 前記核酸分子が5’スプライス部位の一方または両方の側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティー配列をさらに含んでなる、請求項1、2または3に記載の幹細胞。
- 前記核酸分子が3’スプライス領域の1以上の側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項1、2または3に記載の幹細胞。
- 前記核酸分子の標的プレmRNAへの結合が相補性、三重らせん形成またはタンパク質-核酸相互作用により媒介される、請求項1または2に記載の幹細胞。
- 標的プレmRNAへの前記ヌクレオチド配列のトランススプライシングが遺伝子欠損の修正をもたらす、請求項1または2に記載の幹細胞。
- 核酸分子を発現する組換えベクターを含む幹細胞であって、該核酸分子が、
a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域;
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、該核酸分子は幹細胞または分化する幹細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記幹細胞。 - 核酸分子を発現する組換えベクターを含む幹細胞であって、該核酸分子が、
a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 3’スプライス受容部位;
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、該核酸分子は幹細胞または分化する幹細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記幹細胞。 - 核酸分子を発現する組換えベクターを含む幹細胞であって、該核酸分子が、
a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 5’スプライス部位;
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、該核酸分子は幹細胞または分化する幹細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記幹細胞。 - 前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項10または11に記載の幹細胞。
- 3’スプライス領域がピリミジン管をさらに含んでなる、請求項10または11に記載の幹細胞。
- 前記核酸分子が3’スプライス領域および/または5’スプライス部位の1以上の側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項10、11または12に記載の幹細胞。
- 幹細胞または分化する幹細胞内でキメラRNA分子を生成する方法であって、
該細胞内で発現されたプレmRNAと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを、該核酸分子の一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライシングされて幹細胞または分化する幹細胞内でキメラRNAを形成する条件下で、接触させることを含んでなり、該核酸分子が、
a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域;
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなる、上記方法。 - 幹細胞または分化する幹細胞内でキメラRNA分子を生成する方法であって、
幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを、該核酸分子の一部が標的プレmRNAの一部にトランススプライシングされて幹細胞または分化する幹細胞内でキメラRNAを形成する条件下で、接触させることを含んでなり、該核酸分子が、
a) 該細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 3’スプライス受容部位;
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、該ヌクレオチド配列のトランススプライシングにより遺伝子欠損が修正される、上記方法。 - 幹細胞または分化する幹細胞内でキメラRNA分子を生成する方法であって、
幹細胞または分化する幹細胞内で発現された標的プレmRNAと、核スプライシング成分により認識される核酸分子とを、接触させることを含んでなり、該核酸分子が、
a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 5’スプライス部位;
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、該核酸分子は幹細胞または分化する幹細胞内の核スプライシング成分により認識されるものであり、該ヌクレオチド配列のトランススプライシングにより遺伝子欠損が修正される、上記方法。 - 前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項16または17に記載の方法。
- 3’スプライス領域がピリミジン管をさらに含んでなる、請求項16または17に記載の方法。
- 前記核酸分子が3’スプライス領域および/または5’スプライス部位の1以上の側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項16、17または18に記載の方法。
- 標的プレmRNAへの前記ヌクレオチド配列のトランススプライシングが遺伝子欠損の修正をもたらす、請求項16に記載の方法。
- a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域;
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、幹細胞または分化する幹細胞内で核スプライシング成分により認識される、核酸分子。 - a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 3’スプライス受容部位;
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、幹細胞または分化する幹細胞内で核スプライシング成分により認識される、核酸分子。 - a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 5’スプライス部位;
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、幹細胞または分化する幹細胞内で核スプライシング成分により認識される、核酸分子。 - 前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項23または24に記載の核酸分子。
- 3’スプライス領域がピリミジン管をさらに含んでなる、請求項23または24に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子が3’スプライス領域および/または5’スプライス部位の1以上の側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項23、24または25に記載の核酸分子。
- 前記核酸分子の標的プレmRNAへの結合が相補性、三重らせん形成またはタンパク質-核酸相互作用により媒介される、請求項23に記載の核酸分子。
- 標的プレmRNAへの前記ヌクレオチド配列のトランススプライシングが遺伝子欠損の修正をもたらす、請求項23に記載の核酸分子。
- 核酸分子を発現する真核生物発現ベクターであって、該核酸分子が、
a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 分岐点および3’スプライス受容部位を含む3’スプライス領域;
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、該核酸分子は幹細胞または分化する幹細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記真核生物発現ベクター。 - 核酸分子を発現する真核生物発現ベクターであって、該核酸分子が、
a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 3’スプライス受容部位;
c) 3’スプライス領域を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、該核酸分子は幹細胞または分化する幹細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記真核生物発現ベクター。 - 核酸分子を発現する真核生物発現ベクターであって、該核酸分子が、
a) 幹細胞または分化する幹細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン;
b) 5’スプライス部位;
c) 5’スプライス部位を標的結合ドメインから分離するスペーサー領域;および
d) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列;
を含んでなり、該核酸分子は幹細胞または分化する幹細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記真核生物発現ベクター。 - 前記核酸分子が5’供与部位をさらに含んでなる、請求項31に記載のベクター。
- 前記核酸分子がピリミジン管をさらに含んでなる、請求項31に記載のベクター。
- 前記核酸分子が3’スプライス領域の1以上の側に結合する1以上の相補配列を含むセーフティーヌクレオチド配列をさらに含んでなる、請求項31、32または33に記載のベクター。
- ウイルスベクターである、請求項31、32または33に記載のベクター。
- 前記核酸分子の発現が哺乳動物特異的プロモーターにより制御される、請求項31、32または33に記載のベクター。
- 生理的に許容される担体および請求項23〜30のいずれか1項に記載の核酸分子を含んでなる組成物。
- 核酸分子を被験者に投与することを含んでなる被験者の遺伝子欠損を修正するための方法であって、該核酸分子が、
a) 細胞内で発現されたプレmRNAに該核酸分子の結合をターゲットする1以上の標的結合ドメイン、ただし、該プレmRNAは遺伝子欠損を含む遺伝子によりコードされるものであること;および
b) 標的プレmRNAにトランススプライシングされるヌクレオチド配列、ただし、該トランススプライシングは遺伝子欠損の修正をもたらすこと;
を含んでなり、該核酸分子は該細胞内の核スプライシング成分により認識されるものである、上記方法。
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