JP2024520185A - インビトロでの初代ヒト筋幹細胞(衛星細胞)における遺伝子修復のための方法および遺伝子修復されたヒト筋幹細胞 - Google Patents
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Abstract
本発明は、インビトロでの初代ヒト筋幹細胞(衛星細胞)における遺伝子修復のための方法に関する。該方法は、一遺伝子性筋肉疾患を有する少なくとも1人の患者から採取された単離された筋線維含有組織試料の試料を提供する工程であって、上記一遺伝子性筋肉疾患は、少なくとも1つの筋肉タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子における少なくとも1つの変異によって引き起こされる、工程と、上記筋線維含有組織試料から初代幹細胞を単離し培養する工程と、CRISPR/Casベースのツールを使用する遺伝子編集によって、上記少なくとも1つの変異を標的にした改変により、上記培養された初代幹細胞において上記少なくとも1つの筋肉タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子における上記少なくとも1つの変異を修正する工程と、を含む。本発明はまた、そのような方法において得られる遺伝子修復されたヒト筋幹細胞にも関する。【選択図】なし
Description
本発明は、インビトロ/エクスビボでの初代ヒト筋幹細胞(衛星細胞)における遺伝子修復のための方法、および、前記方法を使用して得られる遺伝子修復されたヒト筋幹細胞に関する。
筋線維は、出生前および出生後の発達において、筋芽細胞と呼ばれる筋前駆細胞の融合により形成される有糸分裂後核を有する合胞体構造である。骨格筋は、全ての線維を取り囲む基底膜と筋線維膜(サルコレマ)との間に位置する組織特異性幹細胞のプールである(非特許文献1)、衛星細胞とも呼ばれる筋幹細胞(MuSC)から再生できる。健康な筋肉では、衛星細胞は休止状態にあるか細胞周期がゆっくりである。重度の損傷に反応して活性化されると、衛星細胞は、広範囲にわたって増殖し、損傷した筋線維と融合したり互いと融合したりして新たな筋線維を生成する多数の筋芽細胞を生じる(非特許文献2)。骨格筋の再生は衛星細胞なしでは起こり得ない。筋ジストロフィー(MD)患者は常に組織の変性に苦しんでおり、それにより衛星細胞が常に活性化され、衛星細胞の枯渇、再生不全、および脂肪や結合組織による筋肉の置換が引き起こされる(非特許文献3)。
しっかり定義された高度に筋原性の細胞集団を用いる細胞置換療法は、MD患者にとって安全かつ長期の治療の道のりとなり得るであろうが、MuSCは少なく、従来からエクスビボで操作することは困難である。加えて、骨格筋は体内において最も豊富な組織であり、MD患者のための細胞置換療法を開発することは非常に困難である。
MDのための細胞置換療法に使用する新たな筋細胞を産生するために、様々な方法が開発されてきた。筋芽細胞またはメソアンジオブラストの同種移植は今のところ臨床的有用性を生み出すには至っていない。人工多能性幹細胞(iPSC)は健康な細胞の魅力的で無制限な源であり、これらを移植可能な筋前駆体様細胞に分化させるために、いくつかのプロトコルが存在する。しかし、iPSC由来の筋細胞は、患者への移植のための品質および安全基準を未だ満たしていない。全体として、同種移植は、免疫抑制や移植可能な細胞のクローキング(cloaking)を必要とし、更なるレベルの不確実性が加わり、iPSC由来筋細胞については未だ示されていない。
初代筋幹細胞(MuSC)の自家移植は、より予測可能であろう。
ヒト筋肉生検検体からMuSCを単離し大幅に増殖させることができること、および、MuSCは異種移植モデルにおいてインビボでの再生能を維持することが、以前に示されている(非特許文献4)。MD患者にMuSCを自家セッティングで使用するには、再移植前に遺伝子欠陥を修正する必要がある。遺伝子修正された筋幹細胞は、健康な(「野生型」)筋幹細胞に非常に類似しているであろうが同一ではない。形式的には、このことは、LMNAに変異を有する塩基編集ヒト線維芽細胞において実証されている(非特許文献5)。患者から採取した健康なMuSCは存在しないため(なぜなら全員が遺伝子欠陥を有するため)、治療という意味では遺伝子修復が必要である。
筋ジストロフィー(MD)は、重度の筋肉衰弱に至る40超の一遺伝子性の疾患である。現在のところ、根治的治療法はない。骨格筋は、筋幹細胞と、その筋前駆細胞の子孫である筋芽細胞とから再生できる。
MDには、現在のところ処置法や治療法はない。しかし、これを変えようとする多くの活動がある。企業や研究グループは解決策に集中的に取り組んでいる。エクソンスキッピング戦略、すなわちAAVベクターにパッケージされたcDNAを使用する遺伝子置換アプローチ、が一部のMDに対して臨床試験段階にある。MDに対する細胞ベースの治療は現実的であり、おそらく間もなく利用可能となるであろう(非特許文献6)。細胞ベースの治療アプローチは、個々の免疫学的マーカーを欠く「万能ドナー細胞」、または、「遺伝子修復され」て患者へ移植される自家細胞、のいずれかに頼ることができる。
CRISPR/Casシステムによれば、ゲノムの定義された領域を標的とすることが、前例のない精度で比較的容易となり得る。RNA-ガイドエンドヌクレアーゼとしてCas9が最初に記述されて以来、多数の定向進化および変異誘発アプローチにより、強化された特異性を有するCas酵素が生み出され、オンターゲット対オフターゲット編集プロファイルに関して安全性が高まった。加えて、改変Cas9-融合タンパク質様の塩基エディターおよびプライムエディターにより、細胞のDNA修復経路、細胞周期フェーズ、または外来性DNA鋳型に依存することなくゲノムの高精度な書き換えが可能になった。一例は、アデニン塩基エディター(ABE)であり、これは、Cas9のRNAガイドDNA結合能を進化したtRNAアデノシンデアミナーゼの酵素活性と組み合わせることによって、標的ゲノム遺伝子座のAヌクレオチドをGヌクレオチドに変換する。
Chemmelloら(非特許文献7)は、筋ジストロフィーを矯正するためのCRISPR/Casシステムの適用について概説している。様々な戦略が記載されている。A)ダブルカット筋編集(myoediting)によるエクソン欠失:ここでは、変異したエクソンが切除されて切断型ではあるが機能的なジストロフィンが得られる。この戦略は、欠失を許容するジストロフィンの領域をコードするエクソンを欠失させるのに効果的である。しかし、エクソン欠失は、外来性DNAの組み込みまたは切断部位における異常なスプライシングを含む、多様かつ予測不可能なゲノム改変を引き起こし得る。B)正しいORFを復元するためのシングルカット筋編集によるエクソンスキッピングおよびエクソンリフレーミング:ゲノムにおいてシングルカットを生成するために1つのsgRNAのみが使用される。sgRNAは、フレーム外エクソンのイントロン―エクソン領域のごく近傍のゲノム配列を標的とし、1つのDSBを産生するように設計される。ゲノムを改変することなくアンチセンスオリゴヌクレオチドでエクソンスキッピングを誘導する別の戦略が存在し、安全である可能性がある。しかし、この戦略は、DMDのような遺伝子における定義されたタイプの変異を有する患者のサブセットの治療にしか使用できず、1つまたは数個のエクソンを除去することが理論的には有利であるが、定期的な投与が必要である。C)点変異を修正するためのヌクレオチド筋編集:これは、部位特異的一塩基置換を可能にする。
Chemmelloらはまた、CRISPR遺伝子編集システムのための可能なインビボでの送達法の概要を示している。これには、人工ナノ粒子、筋肉前駆体生着、およびAAV送達が含まれる。
アデノ随伴ウイルスベクター(AAV)を使用するインビボでの遺伝子補充療法は、ある程度の大きさまでの遺伝子には適しているかもしれない。しかし、外来的に提供されたコード配列は、スプライシングまたは時空間発現の点で生理学的に制御されておらず、挿入変異誘発のリスクがある。AAVを介したCRISPR/Cas9の筋肉への直接の送達は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー(DMD)マウスや大型動物モデルにおいて非常に効率的なインビボ遺伝子編集を可能にし、非常に大きな割合の筋核に到達し永久に修復する可能性がある。AAV送達による筋肉内でのインビボアデニン塩基編集(ABE)がDMDマウスモデルにおいて達成されている。しかし、実質的な変性、脂肪線維置換、および筋幹細胞の枯渇が起こる前に行わなければ、疾患の過程はいずれの治療によっても元に戻らない可能性がある。
加えて、多くの人が、AAV、Cas9、または他のCasタンパク質に対する既存の抗体を有しており、これにより、これらのいずれかのインビボでの送達が妨害される。既存の免疫を有さない患者であっても、(遺伝子補充療法のための)AAVまたは(インビボ遺伝子編集のための)AAV-Cas9の反復投与は、最初の投与によってトリガされたウイルスまたは細菌Cas9タンパク質に対する適応免疫のために不可能であろう。これは、AAVベクターを用いる遺伝子補充療法にとって特に決定的であり得る。なぜならば、骨格筋組織は、(ジストロフィー筋肉におけるよりずっと速い)一定のターンオーバーを有しているため、AAVゲノムが徐々に失われることによって長期の導入遺伝子の発現が妨げられるからである。AAV全身投与の毒性もまた、筋細管ミオパチーの臨床試験において、肝臓関連の有害事象による3人の患者の死亡を引き起こした。脊髄性筋萎縮症(SMA)とDMDを対象とした他の2つの治験では、AAVに対する免疫応答から有害事象が生じた。
実際、AAVを介したCRISPR/Cas9送達後の持続的なCas9発現は、イヌにおいて、筋肉の炎症ならびに抗Cas9体液性免疫応答および細胞性免疫応答を誘発することが示されている。これは、Cas9に特異的であるようであり、大型哺乳類におけるAAV-CRISPR療法の重大な障壁となる可能性がある(非特許文献8)
トランスポゾンまたは組み込みウイルスベクター等を介した治療用導入遺伝子の非標的な挿入は、挿入部位が制御されないため、挿入変異誘発のリスクがある。また、ゲノム組み込みプロセスのために必要な、導入遺伝子の前後に隣接する外来性配列が付加される。
インビボ遺伝子編集介入は、マウスおよびイヌ(非特許文献9)ならびにブタ(非特許文献10)の筋線維内の有糸分裂後の筋核における遺伝子欠陥の修復に成功しているが、MuSCに到達して修復することは、インビボでの遺伝子編集機構を送達するアプローチにとって、依然として大きな課題である。更に、筋ジストロフィーでは、骨格筋が脂肪および結合組織に徐々に置換されていき、特にMuSCの枯渇によって再生能を失っていくことがよく知られている。したがって、骨格筋のターンオーバーが速いため、特に筋ジストロフィーでは、インビボ遺伝子編集は長期的な治療効果が得られない可能性がある。したがって、持続的な健康な筋肉の恒常性には健康なMuSCのプールが必要である。
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以上からわかるように、筋細胞および組織の遺伝子修復のための現在利用可能なアプローチは未だ限られている。
したがって、上記のような欠点を有することなく、細胞置換療法に使用できる筋細胞の遺伝子修復のための代替アプローチが必要とされている。筋ジストロフィー患者の自家初代筋幹細胞の遺伝子修復のための効果的な方法を提供することは、特に有利であろう。
この目的は、請求項1の特徴を有する方法によって解決される。
したがって、初代ヒト筋幹細胞(衛星細胞)における遺伝子修復のためのエクスビボ(インビトロ)方法が提供され、前記方法は:
一遺伝子性筋肉疾患を有する少なくとも1人の患者から採取された単離された筋線維含有組織検体の試料を提供する工程であって、前記一遺伝子性筋肉疾患は、少なくとも1つの筋肉タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子における少なくとも1つの変異によって引き起こされる、工程と、
前記筋線維含有組織試料から初代筋幹細胞を単離し培養する工程と、
CRISPR/Casベースのツールを使用する遺伝子編集によって、前記少なくとも1つの変異を標的にした改変(targeted modification)により、前記培養された初代筋幹細胞において少なくとも1つの筋肉タンパク質をコードする前記少なくとも1つの遺伝子における前記少なくとも1つの変異を修正する工程と、
を含み、
前記CRISPR/Casベースの遺伝子編集ツールは、少なくとも1つのDNAおよび/またはRNAベースのキャリア、特にプラスミド、非組み込みウイルスベクター、mRNA、またはタンパク質によって前記培養された初代筋幹細胞へ送達される、
方法。
一遺伝子性筋肉疾患を有する少なくとも1人の患者から採取された単離された筋線維含有組織検体の試料を提供する工程であって、前記一遺伝子性筋肉疾患は、少なくとも1つの筋肉タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子における少なくとも1つの変異によって引き起こされる、工程と、
前記筋線維含有組織試料から初代筋幹細胞を単離し培養する工程と、
CRISPR/Casベースのツールを使用する遺伝子編集によって、前記少なくとも1つの変異を標的にした改変(targeted modification)により、前記培養された初代筋幹細胞において少なくとも1つの筋肉タンパク質をコードする前記少なくとも1つの遺伝子における前記少なくとも1つの変異を修正する工程と、
を含み、
前記CRISPR/Casベースの遺伝子編集ツールは、少なくとも1つのDNAおよび/またはRNAベースのキャリア、特にプラスミド、非組み込みウイルスベクター、mRNA、またはタンパク質によって前記培養された初代筋幹細胞へ送達される、
方法。
CRISPR/Casベースの、特にCRISPR/Cas9ベースの遺伝子/塩基編集技術による本標的治療方法は、以前に記述された方法(特許文献1)に従って単離され採取される、再生能を有する初代ヒト筋芽細胞を使用する。この方法によって採取された初代ヒト筋芽細胞は、純度が98%超であるため、遺伝子編集に利用可能である。
トランスポザーゼシステム(特許文献1)を使用して初代ヒト筋芽細胞に対して以前に行われた遺伝子送達研究もまた、単離された初代ヒト筋幹細胞は、一般に遺伝子操作の影響を受けやすいことを示した。しかし、トランスポザーゼを介した遺伝子挿入は非標的性(non-target)であり、したがって部位特異的変異のための好ましい送達ツールではない。
これに対して、現在のCRISPR/Casベースのツールを使用することによって、特異的変異を修正することができ、再生能を有する遺伝子編集された初代ヒト筋芽細胞が提供される。
これは予想外であった。特に、過去には、ヒト筋幹細胞は、トランスフェクトできない、および/または、あまり効率的に遺伝子操作することはできない、と一般に考えられていた。これは、治療のためにヒト筋幹細胞を使用するアプローチの妨げになるであろう。なぜなら、例えばiPS細胞とは異なり、初代MuSCは、例えば自家移植片用に十分な数の細胞を産生するために、1つの遺伝子修復されたクローンから増殖させることができないからである。これは、集団レベルで所望の編集を施した十分に高いパーセンテージの細胞を得ることが不可欠であることを意味する。これらの理由により、初代ヒトMuSCにおける遺伝子編集はこれまで試みられなかった。
Margら(非特許文献11)では、リポフェクタミンとGFPをコードするプラスミドベクターとで非効率にトランスフェクトされた緑色筋細胞はごくわずかであったことが示されている。これらの結果から、標的遺伝子修正が、いくつかの標的遺伝子座/変異について90%を超える効率で、初代エクスビボ増殖済みヒトMuSCを修正できることは予測できなかった。
Chemelloら(非特許文献12)は、Zhuら(非特許文献13)によって示されたように、筋肉前駆細胞がCRISPRゲノム編集により修正された後、筋肉内注射によってmdxマウスの筋肉に生着されたことに、言及している。ここで、Cas9は、アデノウイルスを使用してジストロフィーマウスからエクスビボでMuSCへ送達された。しかし、マウスMuSCの編集効率は低いようであり(図2E)、正確な定量化は示されていない。更に、前記アプローチには、生着効率が低いこと、および長期の再構築能を有する筋幹細胞を生成できないことが含まれる。
これに対して、ここで、プラスミドベースのトランスフェクションを使用した、集団レベルでのヒト初代MuSCにおける非常に効率的な標的ゲノム編集が初めて示される。本方法では、トランスフェクトされた細胞を選択するためのFACSに基づく高濃度化工程で90%超の編集されたMuSCと、この高濃度化工程を用いない40~60%効率の編集が得られる。ヒト初代MuSCは、エクスビボでの遺伝子編集機構(mRNAヌクレオフェクション)を送達する様々な方法を使用して、非常に高い効率で遺伝子編集され得ることが、示される。この方法は、臨床的翻訳の意味でずっと進化したものであり、遺伝子編集された細胞を高濃度化するために選択マーカーを使用する必要がない。
部位特異的な方法で遺伝子編集する技術により表現型の欠陥が治療的に対処された移植された自家筋芽細胞は、病的表現型が全体的又は部分的に回復された新たな筋肉組織を構築することができる。
更に、これらの細胞は、筋肉恒常性と再生を長期に持続させる筋幹細胞でレシピエント筋肉を再構築することができる。エクスビボでそのような標的遺伝子操作を受けた初代ヒトMuSCが、その再生特性を保持し、移植後にインビボで新たな筋線維を構築するだけでなく幹細胞コンパートメントを再構成することもできる、ということは明らかではなかった。
本方法には、いくつかの利点がある。すなわち、この細胞は、当該細胞が免疫拒絶反応や有害な免疫反応をトリガする可能性が低い、自家セッティングにおいて適用できる。編集された細胞は、新たな筋線維を産生する能力を維持しインビボでの筋幹細胞プールを再構築するので、1回の投与で長期にわたる持続的な治療効果を得るには十分である可能性が高い。骨格筋組織は腫瘍を発生する傾向が非常に低く、筋幹細胞および筋芽細胞も同様である。編集された細胞は、再移植の前にオフターゲットイベントおよびバイオセーフティプロファイルを徹底的にチェックすることができる。したがって、これらの細胞は、計算可能な小さなリスクで自家セッティングにおいて移植可能である。
本発明の一実施形態において、一遺伝子性筋肉疾患は、以下のうちの1つを含む:全ての型の肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)、特にLGMD1/D型、LGMD2/R型(非特許文献14)と、全てのX連鎖性筋ジストロフィー(エメリー・ドレイフス型MD、デュシェンヌ型MD、ベッカー型MD)と、反復伸長(すなわち、筋緊張性ジストロフィー1型および2型)または反復欠失(顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー)変異によって引き起こされる全てのMDとを含む、筋ジストロフィー(MD)。非常に稀な疾患であるPax7ミオパチー(非特許文献15)およびVCPミオパチーも含まれる。
1つの筋肉タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子における少なくとも1つの遺伝子変異は、欠失、挿入、点変異、反復伸長、または反復欠失、特に欠失または点変異、であり得ることを、理解されたい。好ましい実施形態において、一遺伝子性疾患のみが、各アレルに1つの変異を有すると考えられる。変異は、同じ(ホモ接合性)であっても異なって(複合ヘテロ接合性)いてもよい。
上述したように、エクスビボでの初代体性幹細胞および前駆細胞における正確かつ効率的な遺伝子修復は、遺伝子編集のためのCRISPR/Casベースのツールの急速な発展により、ますます現実味を帯びてきている。その中のいくつかは、細胞DNA修復経路の選択に依存しない。
前記CRISPR/Casベースのツール、特にCRISPR/Cas9ベースのツール、は、以下の遺伝子編集アプローチのうちの少なくとも1つのために使用され得る:塩基編集、特にアデニン塩基編集(ABE)、シチジン塩基編集(CBE)、C-to-G塩基編集(CGBE)、グリコシラーゼ塩基編集(GBE)、プライム編集、非相同末端結合(NHEJ)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)、および/または相同性指向修復(HDR)。
塩基エディターはDNAまたはRNAにおける正確な一塩基変換を可能にするRNAプログラム可能デアミナーゼである。塩基エディターは二本鎖DNA切断を作らないので、挿入、欠失、転座、および他の大規模な染色体再編成を含む、望ましくない編集副産物の形成を最小限に抑える。
アデニン塩基編集(ABE)は、DNA二本鎖切断を誘発することなく、アデニンのグアニンヌクレオチドへの正確な標的変換を可能にする(非特許文献16)。ABEは、Cas9が標的部位に結合することによって生じる一本鎖DNAバブル上でアデニンをイノシンに変換するアデニンデアミナーゼ酵素(TadA)と融合した触媒作用の低下したCas9から構成される。イノシンはその後グアニンに置換される。デアミナーゼにアクセスできるように、標的アデニンは、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)から定義された距離、いわゆるABE活性ウィンドウ、に位置していなければならない。その予測可能な結果、高精度、および低減されたオフターゲット効果(20,21)ゆえに、ABEは安全な遺伝子編集ツールである。
シトシン塩基エディター(CBEまたはBE)は、ヒトゲノムのT-AからC-Gへの点変異の効率的でプログラム可能な復帰を可能にする。BEは、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤(UGI)の1つ(BE3)または2つ(BE4)のモノマーに繋がれたCas9(D10Aニッカーゼ)の障害型と融合したシチジンデアミナーゼから構成される。このBEの構造は、ウラシル中間体の形成を通じて、ヒトゲノムDNAのC-G塩基対をT-A塩基対に変換することを可能にする。
より最近では、エフェクタードメイン(デアミナーゼ)がCas9と融合していない塩基エディター(Pin-point(商標))が開発されている。その代わりに、エフェクターはgRNAに含まれるRNAアプタマーの同族リガンドに融合され、それによりCas9/gRNA複合体へのエフェクターのリクルートが容易になる(非特許文献17)。
非相同末端結合(NHEJ)は、(例えば、Cas9の切断によって生じる)DNAの二本鎖切断(DSB)を修復し、しばしば、修復部位に小さな挿入および/または欠失(インデル)を導入する。
相同性指向修復(HDR)経路は、標的部位と相同性のある領域を有する提供されたDNA鋳型を使用する。したがって、所望の変更の生成が可能となる。
より具体的な実施形態では、少なくとも1つの変異は、以下の遺伝子のうちの少なくとも1つに位置する:ラミンA/CをコードするLMNA、カルパイン3をコードするCAPN3、ジスフェリンをコードするDYSF、α-サルコグリカンをコードするSGCA、バロシン含有タンパク質をコードするVCP、ペアードボックス7をコードするPAX7、神経細胞接着分子1をコードするNCAM1、ジストロフィンをコードするDMD。
α-サルコグリカンは50kDaの膜貫通タンパク質であり、サルコグリカン複合体およびジストロフィン関連タンパク質複合体(DAPC)の一部である。DAPCは機械的ストレスから筋線維を保護し、その機能不全は様々な形態の筋ジストロフィー(MD)につながる。
α-サルコグリカンをコードするSGCAにおける機能喪失変異は、女児と男児が等しく罹患する、早発性、重症、かつ急速進行性の筋ジストロフィーである、肢帯型筋ジストロフィー2D/3Rを引き起こす。患者は、肢、呼吸筋、心臓に影響を及ぼす筋変性と萎縮に苦しむ。
SGCAは9個のコーディングエクソンを有し、横紋筋に発現する(2,3)。疾患を引き起こす変異は、規定された変異ホットスポットを有さずに、遺伝子の全長にわたって広がっている(4,5)。しかし、c.157G>Aのようないくつかの変異はより頻繁に報告されている(非特許文献18)。
一実施形態において、SGCA変異、特にc.157G>A変異、は、アデニン塩基編集(ABE)によって逆転または修復される。
古典的ラミノパチーは、核ラミナタンパク質ラミンA/CをコードするLMNA遺伝子における変異によって引き起こされる疾患を指す。
一実施形態において、LMNA変異、特にc.1366A>G変異、は、シトシン塩基編集(CBEまたはBE)によって逆転または修復される。
ジスフェリンをコードするDYSF遺伝子における変異は、主に臀部および臀部近傍の大腿筋、ふくらはぎの仮性肥大、肩の筋肉の衰弱を引き起こす。DYSFにおける変異の1つは、DYSFコード配列の4782位のGの欠失に基づくもので、これによりフレームシフトおよび中途終止コドン(premature stop codon)が誘発される。他のG>C置換は4つ下流の位置にある。
一実施形態において、DYSF変異、特にG欠失、は、CRISPR/Cas9誘導非相同末端結合(NHEJ)によって逆転または修復される。具体的には、+1A挿入が、DYSFリーディングフレームを復元し、中途終止コドンの除去をもたらす。
CAPN3によってコードされるタンパク質であるカルパイン3は、骨格筋に支配的に発現するシステインプロテアーゼである。CAPN3における変異は、治療法のない進行性の骨格筋障害であり世界で最も一般的な型のLGMDである、LGMD2Aを引き起こす。欠失CAPN3 c.550delAはエクソン4にフレームシフトを引き起こし、これにより、中途終止コドンが作成される。
一実施形態において、CAPN3変異、特にA欠失、は、CRISPR/Cas9誘導非相同末端結合(NHEJ)によって逆転または修復される。具体的には、+1A挿入が、リーディングフレームを復元し、中途終止コドンの除去をもたらす。CAPN3 c.550delAを逆転させるためのCAPN3のエクソン4における+1挿入は、修復がプラスミドベースであれば免除される。mRNAおよびタンパク質ベースの修復アプローチなどのその他の全てのアプローチが含まれる。
上述したように、CRISPR/Casベースの遺伝子編集ツールは、少なくとも1つのDNAおよび/またはRNAおよび/またはタンパク質ベースのキャリアによって、特にプラスミド、非組み込みウイルスベクター、組換えタンパク質、またはmRNAを送達系として用いて、ヒト初代筋幹細胞へ送達される。CRISPR/Casベースの遺伝子改変に必要な構成要素またはCasベースのタンパク質の合成のための情報を運ぶDNAまたはRNA送達系は、遺伝子欠陥を有する初代ヒト幹細胞に導入される。
したがって、送達の異なる態様は、以下のうちの1つまたは複数から構成され得る:
・Cas酵素/塩基エディター/プライムエディターの場合:DNA(例えば、プラスミドDNA、ミニサークルDNA)、mRNA、タンパク質、ウイルスベクター;
・シングルガイドRNAの場合:DNA(例えば、プラスミドDNA、ミニサークルDNA)、RNA、ウイルスベクター;
・相同性鋳型(HDRの場合)の場合:DNA(ssODNのような一本鎖でも、ミニサークルのプラスミドのような二本鎖でもよい)、ウイルスベクター(例えば、AAV)。
・Cas酵素/塩基エディター/プライムエディターの場合:DNA(例えば、プラスミドDNA、ミニサークルDNA)、mRNA、タンパク質、ウイルスベクター;
・シングルガイドRNAの場合:DNA(例えば、プラスミドDNA、ミニサークルDNA)、RNA、ウイルスベクター;
・相同性鋳型(HDRの場合)の場合:DNA(ssODNのような一本鎖でも、ミニサークルのプラスミドのような二本鎖でもよい)、ウイルスベクター(例えば、AAV)。
送達のための1つの好ましい実施形態において、プラスミドが輸送系として使用される。この場合、プラスミドは、Cas9をコードするDNAとプロモーター駆動sgRNA発現カセットとを含んでよい。例えば、デアミナーゼドメインに融合したコドン最適化されたSpCas9、T2A-Venusカセット、さらにヒトU6プロモーター駆動sgRNAカセット、を含むABEプラスミドを使用してよい。
Casベースのタンパク質、特に塩基エディター、をコードするDNAを含むプラスミド、およびsgRNAを、遺伝欠陥を有するヒト初代幹細胞にトランスフェクトしてもよい。一実施形態において、トランスフェクションは、40,000~90,000細胞/9.5cm2の範囲内、好ましくは55,000~75,000細胞/9.5cm2などの50,000~80,000細胞/9.5cm2の範囲内の細胞密度で、前記ヒト初代筋細胞を使用して実施された。初代ヒト幹細胞に必要な細胞密度は、例えば人工多能性幹細胞(iPSC)のトランスフェクションに必要な細胞密度に比べると驚くほど低い。iPSCのトランスフェクションの場合、約30万細胞/9.5cm2の細胞密度が必要である。
プラスミドベースのエクスビボ送達を使用すると、初代ヒトMuSCにおけるα-サルコグリカンをコードする遺伝子におけるG>A MDを引き起こす変異(SGCA c.157G>A)の90%超の修正が達成された。修正された細胞は、異種移植片において、筋幹細胞コンパートメントの再構成を含む、完全な筋形成能および再生能力を示した。
しかし、プラスミドベースの送達は、導入遺伝子の組み込みのリスクを伴い、遺伝子改変酵素に比較的長くさらされることになる。
したがって、別の好ましい実施形態において、mRNAが輸送系として使用される。mRNAを介した導入遺伝子の送達は、導入遺伝子の組み込みのリスクを排除する一方で、一過性の遺伝子発現をもたらす。遺伝子改変酵素の一過性の発現は、潜在的なオフターゲット変異誘発のリスクを低減する。これは、遺伝子編集戦略の治療的開発にとって重要な側面である。
ヌクレオフェクションにより、mRNAをほぼ100%の細胞に送達できるため、導入遺伝子の発現レベルが極めて均一になり、遺伝子編集された初代筋幹細胞の均質な集団を得るためのレポーター遺伝子や高濃度化工程が不要となる。
一実施形態において、ヌクレオフェクションを用いることによって、ほぼ100%のMuSCへのmRNAのトランスフェクションが達成された。
上述したように、更に好ましい実施形態において、Casベースの組換えタンパク質が、CRISPR/Casベースの遺伝子編集ツールの送達態様として使用される。
組換えタンパク質を送達する場合、タンパク質は既にインビトロで(通常は細菌内で)産生され細胞に導入されているため、細胞内での合成は必要ない。(以下に示す例のABE8eのような)Casベースのタンパク質は通常、sgRNAまたはcrRNA:tracrRNAヘテロ二本鎖とプレインキュベートされ、いわゆるリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体が形成される。その後、RNPが細胞に送達される。しかし、両構成要素を別々に細胞に送達し、細胞内で複合体を形成させることもできる。ヌクレオフェクションは、タンパク質を介した遺伝子編集に応用される。
一実施形態において、ABE8e組換えタンパク質と、NCAM1エクソン7のスプライスドナー部位を変異させるように設計されたsgRNAとからなるリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体を構築した。ABE8eタンパク質とそれぞれのsgRNAを混合してRNP複合体を形成した。
その後、ヌクレオフェクションを使用することによって、RNP複合体がヒト筋幹細胞へトランスフェクトされる。
前述したように、少なくとも1人の筋ジストロフィー患者から採取した単離された筋線維含有組織試料の試料を提供する方法は、以前に記載されている(特許文献1)。
具体的には、筋ジストロフィー患者から採取された前記筋線維含有組織試料からの初代幹細胞は、定義された温度および定義された雰囲気を有する低温条件下で、酸素供給のない処理によって培養される。温度は15℃を超えず、雰囲気は21%(v/v)を超えない酸素含有量を有し、4日~4週間の時間、培養される。
このような条件下で培養することにより、試料中の幹細胞が高濃度化され、第1の期間後には、試料中の全生存細胞の約70~100%が培養幹細胞または培養幹細胞からの誘導体となる。培養は、培養される幹細胞に適したまたは適合させた培地を用いて行われる。
一実施形態において、温度は14℃を超えず、特に13℃を超えず、特に12℃を超えず、特に11℃を超えず、特に10℃を超えず、特に9℃を超えず、特に8℃を超えず、特に7℃を超えず、特に6℃を超えず、特に5℃を超えず、特に4℃を超えず、特に3℃を超えず、特に2℃を超えず、特に1℃を超えず、特に0℃を超えない。一実施形態において、温度は0℃~15℃、特に1℃~14℃、特に2℃~13℃、特に3℃~12℃、特に4℃~11℃、特に5℃~10℃、特に6℃~9℃、特に7℃~8℃の範囲にある。
一実施形態において、雰囲気は、20体積%を超えず、特に19体積%(v/v)を超えず、特に18体積%(v/v)を超えず、特に17体積%(v/v)を超えず、特に16体積%(v/v)を超えず、特に15体積%(v/v)を超えず、特に14体積%(v/v)を超えず、特に13体積%(v/v)を超えず、特に12体積%(v/v)を超えず、特に11体積%(v/v)を超えず、特に10%(v/v)を超えず、特に9%(v/v)を超えず、特に8%(v/v)を超えず、特に7%(v/v)を超えず、特に6%(v/v)を超えず、特に5%(v/v)を超えず、特に4%(v/v)を超えず、特に3%(v/v)を超えず、特に2%(v/v)を超えず、特に1%(v/v)を超えず、特に上述の酸素含有量のいかなるものも超えない、酸素含有量を有する。20%(v/v)未満の酸素含有量を有する雰囲気は、しばしば低酸素条件とも呼ばれる。
一実施形態において、雰囲気は、1%(v/v)~21%(v/v)、特に2%(v/v)~20%(v/v)、特に3%(v/v)~19%(v/v)、特に4%(v/v)~18%(v/v)、特に5%(v/v)~17%(v/v)、特に6%(v/v)~16%(v/v)、特に7%(v/v)~15%(v/v)、特に8%(v/v)~14%(v/v)、特に9%(v/v)~13%(v/v)、特に10%(v/v)~12%(v/v)、特に3%(v/v)~11%(v/v)の範囲の酸素含有量を有する。
代替実施形態において、雰囲気は、30体積%を超えない、特に29%(v/v)を超えない、特に28%(v/v)を超えない、特に27%(v/v)を超えない、特に26体積%(v/v)を超えない、特に25体積%(v/v)を超えない、特に24体積%(v/v)を超えない、特に23体積%(v/v)を超えない、特に22体積%(v/v)を超えない、特に21体積%(v/v)を超えない、酸素含有量を有する。
一実施形態において、温度は0℃~10℃の範囲にあり、酸素含有量は0%(v/v)~8%(v/v)の範囲にある。一実施形態において、温度は2℃~5℃の範囲にあり、酸素含有量は2%(v/v)~5%(v/v)の範囲にある。一実施形態において、温度は3℃~4℃の範囲にあり、酸素含有量は3%(v/v)~4%(v/v)の範囲にある。一実施形態において、温度は10℃を超えず、酸素含有量は8%(v/v)を超えない。
一実施形態において、幹細胞が培養される培地に成長因子が添加される。一実施形態において、幹細胞が2週間より長く、特に4℃で2週間より長く培養される場合にのみ、成長因子が添加される。特に、試料としてHMFFを用い、衛星細胞を培養する場合には、低い血清含有量を有する培地が適している。好適な培地は、Life Technologiesから入手可能なOptiMEMのような、血清を低減した最適化された基礎培地である。第1の期間の長さは5日~2週間、特に6日~1週間、特に1週間が幹細胞の培養および高濃度化に特に適していることが判明した。
一実施形態において、試料は単離された組織試料である。試料は生検などの標準的な方法で患者から単離することができる。一実施形態において、試料は単離された筋線維断片である。ヒト筋線維断片(HMFF)が特に適しており、筋生検検体から容易に得ることができる。
一実施形態において、幹細胞は一体化された細胞構造において培養される。これは、一体化された細胞構造を可能にする支持構造によって最もよく達成され得る。一実施形態において、この支持構造は、細胞が体内で成長する自然な構造である(例えば、本発明の文脈において衛星細胞を培養するのに非常に適しているHMFFなど)。他の実施形態において、この支持構造は、細胞が体内で成長する自然な構造を模倣するかそれに酷似した、人工的な構造である。
十分な量の初代幹細胞を培養した後、筋遺伝子における変異を修正するために、CRISPR/Casベースのツールを使用した上述の遺伝子編集法が初代幹細胞に適用される。
遺伝子修復後、ヒト筋細胞は所望の遺伝子修復/編集イベントについてスクリーニングされる。選択工程(例えばFACSによる選択工程)を実施してもよい。特に、トランスフェクト/編集された細胞によって発現される蛍光分子を用いてもよいし、選択が細胞外エピトープの生細胞染色に基づくものであってもよい。
遺伝子改変された初代幹細胞は更に培養される。
一実施形態において、改変された初代幹細胞はインビトロで多核筋管へ融合される。
更なる態様において、本発明はまた、上記の方法を実施した後に得られる、遺伝子修復または改変されたヒト筋幹細胞に関する。
一実施形態において、遺伝子修復されたヒト筋幹細胞は、少なくとも1つの筋肉タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を含み、この少なくとも1つの遺伝子は、上記で詳細に記載したように、例えば、CRISPR/Casベースのツールを使用したNHEJ、塩基編集、またはプライム編集によって、前記遺伝子における少なくとも1つの変異を標的にした改変を受けた。
先に示したように、本方法によって得られる遺伝子修正された筋幹細胞は、健康な(「野生型」)筋幹細胞とは異なるため、野生型と同一ではない。このことは、LMNAに変異を有する塩基編集ヒト線維芽細胞で実証されている(非特許文献5)。筋ジストロフィー患者からの「野生型」MuSCは天然には存在しないことを強調しておかなければならない。
特に、部位特異的な挿入および欠失はフレームシフトを引き起こす。このようなリフレーミングの結果、野生型とは異なるDNA配列になることが多い。部位特異的挿入がリーディングフレームを復元することがあるが、そのような復元されたリーディングフレームによりコードされるタンパク質は、DYSFまたはCAPN3遺伝子について示されるように、野生型とは異なることがある(更に後述の実施例を参照)。
好ましい実施形態において、遺伝子修復されたヒト筋幹細胞は、以下の筋肉タンパク質の少なくとも1つをコードする少なくとも1つの改変された遺伝子を含む:ラミンA/CをコードするLMNA、カルパイン3をコードするCAPN3、ジスフェリンをコードするDYSF、α-サルコグリカンをコードするSGCA、バロシン含有タンパク質をコードするVCP、ペアードボックス7をコードするPAX7、神経細胞接着分子1をコードするNCAM1、ジストロフィンをコードするDMD。
更なる態様において、本発明はまた、遺伝子修復または改変された筋幹細胞の医学的使用に関する。それにより、幹細胞は、全ての型の肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)、特にLGMD1/D型、LGMD2/R型(非特許文献14)と、全てのX連鎖性筋ジストロフィー、特にエメリー・ドレイフス型MD、デュシェンヌ型MD、ベッカー型MDと、反復伸長(すなわち、筋緊張性ジストロフィー1型および2型)または反復欠失(顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー)変異によって引き起こされる全てのMDと、を含む筋ジストロフィー(MD)のための細胞置換療法に使用されることを意図されている。この幹細胞は、Pax7ミオパチー(非特許文献15)またはVCPミオパチーの治療にも使用できる。
これにより、培養幹細胞を、それを必要とする被検者または患者に移植する方法が開示され、該方法は、上で概説されたように培養された遺伝子修復または改変された幹細胞を特に自家移植によって患者に投与することを、含む。
これにより、筋ジストロフィーに苦しむ患者を治療する方法が開示され、該方法は、遺伝子改変された筋幹細胞を患者に投与することを含む。一実施形態において、筋幹細胞は衛星細胞である。一実施形態において、遺伝子改変された幹細胞は細胞懸濁液として投与される。組織支持構造系の形態で送達することも可能である。
以下、本発明を例示的な実施形態および図を参照してより詳細に説明する。
実施例1:SGCA関連筋ジストロフィー患者由来細胞に対する遺伝子編集
a)複合ヘテロ接合性SGCA c.157G>A変異を有する患者およびキャリアからの初代MuSCの単離。
複合ヘテロ接合性SGCA c.157G>A変異を有する10歳男性LGMD2D患者および関連キャリアから得られた筋生検検体から初代MuSCを単離し、特徴づけた。
初代MuSC単離および培養。生検直後、筋検体を輸送用の溶液A(30mM HEPES、130mM NaCl、3mM KCl、10mM D-グルコース、および3.2μM フェノールレッド、pH7.6)に移した。新鮮な筋検体は手作業で解剖し、MuSC単離のための下流プロセスに先立ち、断片は4~6℃で2~7日間低温処理した。記載されているように、機械的解剖後にオリゴクローナルMuSCコロニーを得た(非特許文献19)。成長中のコロニーは継代4まで増殖させ、凍結保存の前に特徴づけした。取り扱いの難しい生検検体における利用可能なMuSCの確率を高めるため、古典的な精製を並行して行った(非特許文献3)。この研究で使用した全ての細胞集団は、95%以上のDesmin陽性であった。筋芽細胞-筋管融合を誘導するため、細胞がコンフルエンスに達すると、培地をOpti-MEM I Reduced Serum Media(Thermo Fisher Scientific)に切り替えた。
患者およびキャリアからの初代MuSC培養物は、95~100%Desmin+であり、筋原性マーカーPax7、MyoD、Myf5および増殖マーカーKi-67を発現していた。c.157G>A変異はエクソン2の最後のコーディングヌクレオチドに影響を及ぼす。
b)ABEは、検出可能なオフターゲット編集を生じることなく、初代ヒトMuSCにおけるSGCA c.157G>Aを90%超修正する。
c.157G>Aは、-NGG PAMの15bp上流(プロトスペーサー6位に相当し、したがって、ABE活性ウィンドウの中心にある)に位置するため、理想的なABE標的であることが分かった。ABE活性ウィンドウ内には他のアデニンは位置しないため、望ましくないバイスタンダー編集は起こりにくい。まず、患者iPS細胞におけるc.157G>A変異の修復にABEを使用可能かどうかを評価した。
患者からのMuSCを、ABE7.10_4.1(図1A)をコードするプラスミドの様々な量でトランスフェクトした。このプラスミドは、ABE7.10に基づくベクター(非特許文献16)であり、N末端がTadAヘテロダイマーに融合したコドン最適化されたCas9(D10A)ニッカーゼを含み、その後にCAGプロモーターの制御下にあるT2A-Venusカセット、そしてU6プロモーター駆動sgRNA発現カセットが続く。
これを、FACSを介してVenus陽性細胞(図1A)検出のために高濃度化し、EditR(非特許文献20)を用いてABE効率を評価した。
ヒト初代MuSCのトランスフェクションおよび分別。ヒト初代MuSCをトランスフェクションの1日前に、Skeletal Muscle Cell Growth Medium(SMCGM、Provitro)中に55,000細胞/9.5cm2の密度でプレーティングし、Lipofectamine(登録商標)3000(Thermo Fisher Scientific)を用いて製造業者の指示に従ってトランスフェクトした。SMCGMは1日後に交換した。トランスフェクションの2日後、50%SMCGMと、0.05mM EDTAと、100μg/ml Primocin(商標)とを含むPBS中でFACS分別のために細胞を収集した。Venus陽性細胞は、FACSAria Fusionセルソーター(BD Biosciences)を用いて分別し、SMCGM中で培養した。100μg/ml Primocin(商標)を2日間培地に添加した。
EditRによる解析のとおり、全てのベクター濃度において、患者およびキャリアMuSCにおけるc.157Gヌクレオチド率は99%超となった(図1B)。その後、Crispresso2(26)による後続の解析でアンプリコンシーケンシングを行い、患者MuSCでは90%超、キャリアMuSCでは85%超の高いc.157Gヌクレオチド率が確認された(図1C)。プロトスペーサー10位のバイスタンダーA>G編集は、非常に低いパーセンテージ(0.2~2%)のリード(read)で検出された。2つの試料では、インデルを含むリードが1.1%および0.3%と検出された。gRNAを省略しても、A>G編集やインデルという結果にはならなかった(図1C)。
アンプリコンシーケンスデータにおいて両アレルが同等に表れていることが確認されたため、検出バイアスは除外された(図1D)。
ベクター濃度が最低または最高のABE活性ウィンドウにおいて、Aヌクレオチドを含む(CRISPORによって)上位に予測されたオフターゲット遺伝子座では、Cas9依存オフターゲット編集イベントは検出されなかった(図1E)。
ABE7.10_4.1は、適切なgRNA(gRNA#1)と組み合わせた場合、効率的なc.157A>G変換を誘導し、アンプリコンシーケンシングおよびCrispresso2解析で検出されたバイスタンダーA>G編集は極小の(0.2~2%)に過ぎないことが分かった。
したがって、SGCA c.157G>A変異は、ヒト初代MuSCにおいてABEを介して非常に高い効率と特異性で修復され得ることが、結論づけられた。修復されたSGCA c.157G>Aを、以下、SGCA c.157Grepと呼ぶ。
c)SGCA c.157Grep初代MuSCは、正常なα-サルコグリカンmRNAおよびタンパク質の発現を示す。
ABEの機能結果を評価するために、SGCA c.157Grep筋管におけるα-サルコグリカンmRNAおよびタンパク質発現を解析した。SGCA c.157Grepにおけるエクソン2を含むα-サルコグリカン転写物は、未編集の患者およびキャリア筋管と比較して増加し、患者筋管の場合にはコントロール3(het. c.748-2A>Gキャリア)と同程度のレベルに達したことから示されるように、スプライシング欠陥が回復されたことが分かった。更に、SGCA mRNAの全体のレベルは、ABE後に患者筋管において増加した。これは、おそらく、エクソン2+3の共スキッピング(エクソン2単独ではなく)が、中途終止コドンにつながるフレームシフトを誘導し、それによって、おそらくナンセンス変異依存mRNA分解(NMD)が起こるためであろう。ウエスタンブロットおよび免疫染色分析により、SGCA c.157Grep患者細胞においてα-サルコグリカンタンパク質が復元されていることが、明らかになった。
d)SGCA c.157Grep患者MuSCは、生存可能であり、増殖性、筋原性を有する。
初代細胞は、広範囲な操作によって誘発されるストレスに特に影響を受けやすい。膜の完全性を司る遺伝子に変異を有するMD患者由来の初代MuSCは、特に脆弱である。トランスフェクトされていない患者MuSCと比較すると、トランスフェクションおよび分別後の最初の数日間において、細胞増殖の減少が観察された。しかし、Venus陽性細胞(ソース細胞集団の48%以上)は、分別後に広範囲に増殖し、凍結保存前に少なくとも2~3継代にわたって更に増殖させた。SGCA c.157Grep初代MuSCは、インビトロで容易に多核筋管に融合することができた。更に、α-サルコグリカンの局在のパターンはコントロールの筋管と区別がつかなかった。
e)SGCA c.157Grep初代MuSCは、インビボで筋肉を再生し、衛星細胞ニッチを再構築する。
SGCA c.157Grep初代MuSCを易感染性NSGマウスの放射線照射前脛骨筋に移植した。SGCA c.157Grep患者MuSCは豊富なヒト筋線維を生じたことが分かった。更に、サルコレンマと基底膜との間の衛星細胞ニッチには、ヒト由来の多数のPax7+細胞が存在していた。これらを総合すると、SGCA c.157Grep患者MuSCは、インビボにおいて筋線維再生と衛星細胞コンパートメントの再構成の両方が可能である。
ヒトMuSC移植
99%Desmin+、27%Pax7+、25%Ki-67+、66%MyoD+、および40%Myf5+であったSGCA c.157Grep患者MuSCを移植に使用した。6週齢の雄性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjI/SzJ(NSG)マウスを、実験の1週間前にCharles River Laboratoriesから購入した。動物収容と衛生監視はFELASAの推奨に従った。記述されたように、レシピエント後肢への局所照射は、細胞移植の2日前に行った(17,18)。記述されたように、無菌PBS+2%FCS溶液に2.5×104個の細胞を含む5.5μlの注射を、TA筋の内側部分に平行な軌道に沿って2回行った(移植筋あたり合計5×104細胞)(18)。マウスは細胞移植の19日後に屠殺した。TA筋は液体窒素で冷やしたイソペンタンで凍結保存し、トラガカントゴムにマウントし、-80℃で保存した。
99%Desmin+、27%Pax7+、25%Ki-67+、66%MyoD+、および40%Myf5+であったSGCA c.157Grep患者MuSCを移植に使用した。6週齢の雄性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1WjI/SzJ(NSG)マウスを、実験の1週間前にCharles River Laboratoriesから購入した。動物収容と衛生監視はFELASAの推奨に従った。記述されたように、レシピエント後肢への局所照射は、細胞移植の2日前に行った(17,18)。記述されたように、無菌PBS+2%FCS溶液に2.5×104個の細胞を含む5.5μlの注射を、TA筋の内側部分に平行な軌道に沿って2回行った(移植筋あたり合計5×104細胞)(18)。マウスは細胞移植の19日後に屠殺した。TA筋は液体窒素で冷やしたイソペンタンで凍結保存し、トラガカントゴムにマウントし、-80℃で保存した。
実施例2:LMNA関連筋ジストロフィー患者由来細胞における遺伝子編集
古典的ラミノパチーは、核ラミナタンパク質ラミンA/Cをコードする遺伝子LMNAにおける変異によって引き起こされる疾患を指す。最先端の遺伝子編集ツールは、ゲノムレベルでの変異を修正する可能性を提供し、特に、DNAの二本鎖切断を伴わない一塩基変異を修正する強力な塩基エディターである。
8歳の女児が、LMNA c.1366A>Gに優性変異を有する筋ジストロフィーと診断された。まず、編集効率を検査するための無制限細胞源である患者由来人工多能性幹細胞(iPSC)を用いて、塩基編集が行われた。
最初の検査は、mTeSR Plus幹細胞培地において、トランスフェクション試薬Lipofectamine(登録商標)3000を用いて2つのベクターをiPSCに同時トランスフェクションして行われた。一方のDNAベクターは、最初に報告されたシチジン塩基エディターの強化版であるCBE4maxと、古典的Cas9ではこれまで編集不可能であった変異を編集できる新しいニアPAMレスCas9(near-PAMless Cas9)であるSpRYを担持しており、もう一方のベクターはsgRNAを発現する。
最初の編集結果では、トランスフェクション効率が低いため編集効率は低いが、GからAへの変換が示された(図2)。
ABE編集プロジェクトの予備的な結果に基づき、DNAベクターの代わりに合成Cas9 mRNAでトランスフェクションしたところ、より高い編集効率が示された。したがって、CBE4maxおよびSpRY配列を含む合成mRNAを合成sgRNAとともにトランスフェクションすることにより、編集効率を向上させることができる。
iPSCにおける最適化されたCBE編集の後、患者由来筋幹細胞を同様のプロトコルで編集し、最終的に、修正された筋幹細胞を移植療法に用いることで、患者の筋機能が改善されるであろう。
実施例3:患者初代MuSC/筋芽細胞におけるDYSF遺伝子編集
a)ヒト初代MuSC培養
ヒトMuSCを、10cmのプラスチックディッシュ(Corning)上で、37℃、5%CO2を含む加湿雰囲気内において、ウシ胎仔血清(FCS)サプリメントミックス(Provitro)と2.72mMグルタミン(GlutaMAX(商標)、Thermo Fisher Scientific)とを添加した骨格筋細胞成長培地(SMCGM)(Provitro)中で成長させた。細胞継代のために、ヒトMuSCをダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)(Thermo Fisher Scientific)で洗浄し、0.25% Trypsin/EDTA(Thermo Fisher Scientific)で37℃、5分間処理した。
剥離した細胞をSMCGM+サプリメントに回収し、1:10に希釈し、200g、5分間、室温(RT)で遠心した。ペレットを適量のSMCGM+サプリメントに再懸濁し、10cmプレートに1~2*104細胞/cm2の密度で播種した。細胞は、成長速度/コンフルエンスに応じて2~3日毎に継代した。
b)CRISPR/Cas9ベースの遺伝子編集
c)Cas9/sgRNA複合体のリポトランスフェクション
CRISPR/Cas9実験のために、トランスフェクションの1日前に、ヒトMuSCを6ウェルプレートの各ウェルにつき75,000細胞/ウェルの密度で播種した。1μgのSpCas9::VenusプラスミドDNA(sgRNAあり、なし)を、Lipofectamine(登録商標)3000トランスフェクション試薬(Invitrogen,ドイツ)を使用して、製造業者の指示に従ってトランスフェクションした。トランスフェクションから48時間後、FACSAria Fusion(BD)を使用してVenus陽性細胞を分別した。分別された細胞を再びプレーティングし、フローサイトメトリーまたは免疫蛍光染色を介したゲノムDNA単離およびジスフェリンタンパク質分析のために、それぞれ増殖させた。
ジスフェリン免疫染色のために、ヒトMuSCをSMCGM+サプリメントに8-well ibidi μ-Slides(IBIDI GmbH Martinsried、Cat. No.80826)において播種し、70%/80%コンフルエンスに達するまで増殖させた。培地をOptiMEM(Thermo Fisher Scientific)に切り替えることにより、筋芽細胞融合を誘導した。4日後、細胞を固定し、DysferlinのN末端部分に対する抗体(ab124684、Abcam)で染色した。
図3は、DYSF遺伝子編集で得られた結果を示す。コントロール(上パネル)とエクソン44にホモ接合性DYSF c.4782_4786delinsCCC変異を有する患者(中パネル)からゲノムDNAを単離した。c.4782_4786delinsCCC変異は、DYSFコード配列のc.4782位のGヌクレオチドの欠失(フレームシフトを引き起こす)および4つ下流の位置のG>C置換である。
+1Aの挿入によりDYSFのリーディングフレームが復元され、その結果、中途終止コドンが除去され、その一方で、4つのアミノ酸(青で示す)が野生型タンパク質配列と異なっている(下パネル)。ジスフェリンタンパク質の発現は、+1A挿入によってリーディングフレームを復元した後、患者のMuSCおよび由来の筋管において回復されている。+1Aリフレームされた患者筋管におけるジスフェリンの局在は、コントロール筋管と同様である。
実施例4:患者初代筋芽細胞におけるCAPN3遺伝子編集
CAPN3によってコードされるタンパク質であるカルパイン3は、骨格筋に支配的に発現するシステインプロテアーゼである。CAPN3における変異は、治療法のない進行性の骨格筋障害であり世界で最も一般的な型のLGMDである、肢帯型MD2A(LGMD2A)を引き起こす。
37の異なるCAPN3変異を有する35人の患者からヒト初代筋幹細胞を単離し、増殖させた。患者の20%は、よく知られた創始者変異CAPN3 c.550delAを有しており、エクソン4においてフレームシフトを引き起こし、これにより中途終止コドンが形成される。ほとんどの場合、患者は複合ヘテロ接合性CAPN3 c.550delA変異を有するが、ホモ接合性c.550delA変異を有する2人の患者もコホートに含まれている。
ホモ接合性患者からの初代MuSCを単離し、増殖させ、変異特異的sgRNAおよびSpCas9::Venusを有するプラスミドでトランスフェクトした。細胞分別および増殖の後、CAPN3 c.550DNA領域の詳細な配列解析により、最大60%の効率で標的CAPN3遺伝子座における塩基の挿入および欠失(インデル)が示された。sgRNAのうちの1つは、変異の位置に+1bpを優先して挿入し、特定のsgRNAのインデルシグネチャーバイアス(indel signature bias)およびオープンリーディングフレーム(ORF)のリフレーミングを示していた。
タンパク質レベルへの影響は、免疫染色に適した特注の抗カルパイン3モノクローナル抗体を使用して解析した。
実施例5:ヒト初代筋幹細胞へのCas9遺伝子編集ツールのmRNAを介した送達
a)mRNAヌクレオフェクションは、最小限の毒性で、初代ヒトMuSCの100%に近いトランスフェクション効率をもたらす。
初代MuSCをTrypLE Expressを使用して採取し、200gで5分間遠心沈殿した後、DPBSで1回洗浄した。2回目の遠心沈殿後、上清を除去し、細胞はmRNA(SpCas9mRNA, Aldevron, ND, 米国;ABE7.10mRNA, AmpTec GmbH, Hamburg, ドイツ;GFP mRNA, Aldevron)またはsgRNA(IDT/Synthego, CA, 米国)と予め混合したP5 Primary Cell Nucleofector Solution(Lonza, Basel, スイス)に7.5x106細胞/mlの濃度で再懸濁した。3μgの遺伝子編集分子エンコーディングmRNAに対して、2μgの5’/3’末端修飾sgRNA(1:0.67比)を20μlの反応液に添加した。反応は直線的にスケールアップできる。16ウェルヌクレオフェクションキュベット付きX Unitを使用し、Amaxa 4D Nucleofector(Lonza, Basel, スイス)で細胞を電気穿孔した。細胞をヌクレオフェクトした後、80μlの予熱したSMCGMを加え、2mlの予熱したSMCGMを含む6ウェルプレートの1ウェルに細胞を移した。細胞培地は翌日交換した。
編集した細胞を移植療法に使用することが意図される場合、細胞の適合度と生存率は極めて重要である。GFP+細胞で測定される高いトランスフェクション効率と最小限の細胞毒性をもたらすパラメーターを決定するために、我々は、異なるヌクレオフェクションプログラムを比較した。パルス(すなわち、ヌクレオフェクションプログラム)の強度を徐々に下げることにより、ヌクレオフェクションを最適化した。パルスコードEY-100、EX-100、EP-100、EO-100、EH-100、EE-100、DU-00、DI-100、DH-100、DA-100、CY-100、CX-100、およびCO-100は、95%以上のトランスフェクション効率をもたらした(図6A)。ヌクレオフェクション後の細胞生存率は、最も強いパルスコードEY-100から、より弱いパルスコードCY-100、そしてCX-100に向かい徐々に上昇した(図6B)。パルスコードの最適化後も編集効率が変わらないことを確認するため、我々は、強パルス(EY-100)と弱パルス(CY-100)のパラメーターを用いて編集結果を比較した(図7)。有意差は認められなかった。
b)mRNAを介したSpCas9の送達により、多くのドナーからのMuSCにおいて高効率の遺伝子編集が行われる。
ヒト初代MuSCへの遺伝子編集ツールのmRNAを介した送達のためのパイプラインを開発し、体系的に評価するために、全てのドナーからのMuSCに関連する普遍的な読み出しシステムが確立された。この目的のために、生きた細胞において検出しやすい細胞外ドメインを有する全てのヒトMuSCおよび筋芽細胞により発現される膜タンパク質である、神経細胞接着分子1(NCAM1)をコードする遺伝子を標的とする戦略が設計された。異なる年齢と性別の6人のドナーからのMuSCに、S. pyogenes Cas9(SpCas9)をコードするmRNAを送達した。様々な濃度のSpCas9 mRNAとNCAM1エクソン3を標的とするsgRNAを一定の比率でトランスフェクションした結果、効率的なインデル形成が得られ、SpCas9 mRNA 2μgで最も高い編集率が観察された。遺伝子編集により、蛍光免疫染色とフローサイトメトリーで評価したNCAM1タンパク質のノックアウトは同程度の割合となった。ヌクレオフェクション後2日目から8日目にかけて、編集されたMuSCの割合の増加が全てのドナーで観察され、8日目には最高90%超のインデル率に達した。一貫して、NCAM1陽性細胞はヌクレオフェクション後4日目から6日目の間に減少し、その後は一定であった。
c)ABE7.10のmRNAを介した送達により、ヒトMuSCの非常に効率的な選択不要の塩基編集が可能となる。
塩基エディターABE7.10のmRNAベースの送達を検討した。NCAM1エクソン7のスプライスドナー部位を変異させるようにsgRNAを設計した(図4A)。ABE7.10および対応するsgRNAのmRNA送達により、ABE活性ウィンドウの中心、プロトスペーサー5位(A5)に位置する標的アデニンが90%を超えてAからGに変換されたことが、アンプリコンシーケンシングにより確認された(図4B~4D)。プロトスペーサー8位(A8)の隣接アデニンは、シーケンシングリードの最大22%で共編集された。これに対して、同一のスプライスドナー標的戦略を用いたプラスミドベースの実験では、平均編集効率が低く、A5対A8からGへの変換率も低かった(示さず)。記述したA5およびA8におけるヌクレオチドの変化は、明確なNCAM1タンパク質のノックアウトをもたらさなかった。
d)ヒトMuSCは、mRNAを介した遺伝子および塩基編集後も筋原性および増殖性を保持する。
遺伝子編集ツールのmRNAを介した送達またはNCAM1のノックアウトがヒトMuSCの筋原性または増殖性を変化させるかどうかを判断するために、同じドナーから採取した継代一致の未編集細胞および編集細胞の筋原性マーカーおよび増殖マーカーの発現プロファイルを解析した。線維芽細胞マーカーTE7で対比染色し、筋原性マーカーDesmin(DES)により判定されたように、MuSC集団の純度は一定で95%超であった。筋原性転写因子PAX7、MYF5、および増殖マーカーKI-67は、編集されたMuSCでも編集されていないMuSCでも同様に発現した。KI-67陽性で増殖しているMuSCは、編集前と編集後で30%から60%と、細胞集団間でばらつきがあった(示さず)。次に、編集されたMuSCのインビトロでの分化能を筋芽細胞融合アッセイで評価した。編集されたMuSC集団も編集されていないMuSC集団も全て、典型的な線条パターンを有する多核筋管を生じた(示さず)。融合指標は、ドナーおよび継代を一致させた未トランスフェクト細胞と、SpCas9またはABE7.10 mRNAとそれぞれのsgRNAとで編集した細胞との間で一定であった(示さず)。
e)mRNAベースのABE送達により、ヒトMuSCにおけるSGCA c.157G>A筋ジストロフィー原因変異が効率的に修正される。
ヘテロ接合性SGCA c.157G>A変異を有するヒトMuSCに、ABE7.10 mRNAおよび対応するsgRNAをトランスフェクトした(図5A)。mRNAを介した塩基編集は効率的に変異を修復し、c.157Gのヌクレオチド率は80%超となった。プロトスペーサー10位に位置するアデニンのバイスタンダー編集は、0.4%未満という非常に低い割合のリードで見られ、mRNAトランスフェクトされたまたは編集された試料に特異的なインデルは検出されなかった(図5B、5C)。
実施例6.ABE8e組換えタンパク質およびsgRNAのヌクレオフェクションにより、ヒト初代MuSCにおけるNCAM1エクソン7スプライスドナー部位の破壊が生じる。
まず、ABE8e組換えタンパク質とNCAM1エクソン7のスプライスドナー部位を変異させるように設計されたsgRNAとからなるリボヌクレオタンパク質(RNP)複合体を構築した(ABE8e組換えタンパク質はMax-Delbruck Centerタンパク質コア施設で製造され、sgRNAはIntegrated DNA Technologies, IDTから購入した)。コンセンサスNCAM1エクソン7スプライスドナー部位に適合する標的アデニンはプロトスペーサーの5位に位置している。更なるアデニンが、ABE編集ウィンドウ内、プロトスペーサー8位に存在する(図8-標的アデニン:A5;バイスタンダー編集:A8)。ABE8eタンパク質とそれぞれのsgRNAを無菌PBS中で1:1.2(ABE8e:sgRNA)のモル比で穏やかに混合し、混合物を室温で20分から1時間インキュベートしてRNP複合体を形成した。その後、RNPはヌクレオフェクションまで4℃で保存した。RNP中のABE8eタンパク質の最終濃度は2μg/μlであった。
培養した初代MuSCをTrypLE Expressを用いて採取し、200gで5分間遠心した。それらをPBSに再懸濁し、カウントした。適切な数の細胞を再度200gで遠心した。上清を吸引し、RNPを含むP5 Primary Cell Nucleofector Solution(Lonza, Basel, スイス)に細胞ペレットを再懸濁した。Amaxa 4D Nucleofector、特に16ウェルヌクレオフェクションキュベット付きX Unit(Lonza, Basel, スイス)を用い、パルスコードCY-100またはEY-100を使用して、150,000個の細胞を20μlの反応液でヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクション後、80μlの予熱した骨格筋細胞成長培地+Supplement(SMCGM、Provitro)を各キュベットに加えて細胞を採取し、予熱したSMCGMを2ml入れた6ウェルプレートの1ウェル(パルスコードCY-100でMuSCをヌクレオフェクションした場合)または2ウェル(パルスコードEY-100でMuSCをヌクレオフェクションした場合)に移した。培地は1日おきに交換し、細胞を増殖させた後、ヌクレオフェクションの7日後にゲノムDNA単離のために採取した。塩基編集は、標的遺伝子座のPCR増幅とその後のサンガーシーケンシングによって解析した。AまたはGに対応する%ピーク面積は、オンラインツールEditRを使用して計算した(非特許文献21)。筋原性マーカーDesmin、PAX7、MYF5、MYOD、および増殖マーカーKI-67に対して陽性に染色された細胞および線維芽細胞マーカーTE7に対して陰性に染色された細胞の割合の顕微鏡判定によれば、編集されたMuSCは、筋原性および増殖性を保持していた(示さず)。
Claims (18)
- 初代ヒト筋幹細胞(衛星細胞)における遺伝子修復のためのエクスビボ方法であって、
一遺伝子性筋肉疾患を有する少なくとも1人の患者から採取された単離された筋線維含有組織試料の試料を提供する工程であって、前記一遺伝子性筋肉疾患は、少なくとも1つの筋肉タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子における少なくとも1つの変異によって引き起こされる、工程と、
前記筋線維含有組織試料から初代幹細胞を単離し培養する工程と、
CRISPR/Casベースのツールを使用する遺伝子編集によって、前記少なくとも1つの変異を標的にした改変により、前記培養された初代幹細胞において前記少なくとも1つの筋肉タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子における前記少なくとも1つの変異を修正する工程と、
を含み、
前記CRISPR/Casベースの遺伝子編集ツールは、少なくとも1つのDNAおよび/またはRNAおよび/またはタンパク質ベースのキャリア、特にプラスミド、非組み込みウイルスベクター、mRNA、またはタンパク質によって、前記培養された初代筋幹細胞へ送達される、
方法。 - 請求項1に記載の方法において、
前記一遺伝子性筋肉疾患は、以下のうちの1つを含む:全ての型の肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)、特にLGMD1/D型、LGMD2/R型、全てのX連鎖性筋ジストロフィー(エメリー・ドレイフス型MD、デュシェンヌ型MD、ベッカー型MD)、反復伸長(すなわち筋緊張性ジストロフィー1型および2型)もしくは反復欠失(顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー)変異によって引き起こされる全てのMD、Pax7ミオパチー、またはVCPミオパチーを含む、筋ジストロフィー、
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1~2の何れか一項に記載の方法において、
前記少なくとも1つの遺伝子変異は、欠失、挿入、点変異、反復伸長、または反復欠失、特に欠失または点変異、であり得る
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1~3の何れか一項に記載の方法において、
前記少なくとも1つの変異は、以下の遺伝子のうちの少なくとも1つに位置する:ラミンA/CをコードするLMNA、カルパイン3をコードするCAPN3、ジスフェリンをコードするDYSF、アルファサルコグリカンをコードするSGCA、バロシン含有タンパク質をコードするVCP、ペアードボックス7をコードするPAX7、神経細胞接着分子1をコードするNCAM1、またはジストロフィンをコードするDMD、
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1~4の何れか一項に記載の方法において、
前記CRISPR/Casベースのツールを使用する遺伝子編集は、以下のうちの少なくとも1つを含む:アデニン塩基編集(ABE)、シチジン塩基編集(CBE/BE)、C-to-G塩基編集(CGBE)、グリコシラーゼ塩基編集(GBE)、プライム編集、非相同末端結合(NHEJ)、マイクロホモロジー媒介末端結合(MMEJ)、および/または相同性指向修復(HDR)、
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1~5の何れか一項に記載の方法において、
前記CRISPR/Casベースの遺伝子編集ツールは、プラスミドを輸送系として使用して、前記培養された初代筋幹細胞へ送達される
ことを特徴とする、方法。 - 請求項6に記載の方法において、
前記CRISPR/Casベースの遺伝子編集ツールのための輸送系としてのプラスミドのトランスフェクションが、40,000~90,000細胞/9.5cm2の範囲内、好ましくは55,000~75,000細胞/9.5cm2などの50,000~80,000細胞/9.5cm2の範囲内の細胞密度で、前記ヒト初代筋細胞を使用して実施された
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1~5の何れか一項に記載の方法において、
前記CRISPR/Casベースの遺伝子編集ツールはmRNAを輸送系として使用して前記培養された初代筋幹細胞へ送達される
ことを特徴とする、方法。 - 請求項8に記載の方法において、
前記CRISPR/Casベースの遺伝子編集ツールのための輸送系としてのmRNAのトランスフェクションが、電気穿孔(ヌクレオフェクション)を使用して実施された
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1~5の何れか一項に記載の方法において、
前記CRISPR/Casベースの遺伝子編集ツールは組換えタンパク質を輸送系として使用して前記培養された初代筋幹細胞へ送達される
ことを特徴とする、方法。 - 請求項10に記載の方法において、
前記CRISPR/Casベースの遺伝子編集ツールのための輸送系としての組換えタンパク質のトランスフェクションが、電気穿孔(ヌクレオフェクション)を使用して実施された
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1~11の何れか一項に記載の方法において、
前記筋線維含有組織試料からの前記初代幹細胞が、定義された温度および定義された雰囲気を有する低温条件下で、酸素供給のない処理によって培養され、
前記温度は15℃を超えず、前記雰囲気は21%(v/v)を超えない酸素含有量を有し、
第1の期間は4日~4週間である
ことを特徴とする、方法。 - 請求項12に記載の方法において、
前記温度は10℃を超えず、前記酸素含有量は10%(v/v)を超えない
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1~13の何れか一項に記載の方法において、
遺伝子改変された初代幹細胞が更に培養される
ことを特徴とする、方法。 - 請求項1~14の何れか一項に記載の方法を実施した後に得られる遺伝子修復されたヒト筋幹細胞。
- 遺伝子修復されたヒト筋幹細胞であって、
少なくとも1つの筋肉タンパク質をコードする少なくとも1つの遺伝子を含み、
前記少なくとも1つの遺伝子は前記遺伝子における少なくとも1つの変異を標的にした改変を受けた
ことを特徴とする、遺伝子修復されたヒト筋幹細胞。 - 請求項16に記載の遺伝子修復されたヒト筋幹細胞において、
前記少なくとも1つの改変された遺伝子は、以下の筋肉タンパク質の少なくとも1つをコードする:ラミンA/CをコードするLMNA、カルパイン3をコードするCAPN3、ジスフェリンをコードするDYSF、アルファサルコグリカンをコードするSGCA、バロシン含有タンパク質をコードするVCP、ペアードボックス7をコードするPAX7、神経細胞接着分子1をコードするNCAM1、またはジストロフィンをコードするDMD、
ことを特徴とする、遺伝子修復されたヒト筋幹細胞。 - 筋ジストロフィー、特に全ての型の肢帯型筋ジストロフィー(LGMD)、特にLGMD1/D型、LGMD2/R型、全てのX連鎖性筋ジストロフィー(エメリー・ドレイフス型MD、デュシェンヌ型MD、ベッカー型MD)、反復伸長(すなわち筋緊張性ジストロフィー1型および2型)もしくは反復欠失(顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー)変異によって引き起こされる全てのMD、およびPax7もしくはVCPミオパチーのための、細胞置換療法に使用するための遺伝子修復されたヒト筋幹細胞。
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