CN115927338A - 牛下丘脑调控cart表达的非编码rna及其应用 - Google Patents
牛下丘脑调控cart表达的非编码rna及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115927338A CN115927338A CN202211642014.4A CN202211642014A CN115927338A CN 115927338 A CN115927338 A CN 115927338A CN 202211642014 A CN202211642014 A CN 202211642014A CN 115927338 A CN115927338 A CN 115927338A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cart
- lncrnas
- mir
- expression
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，具体包括：牛下丘脑lncRNAs的筛选与鉴定：包括牛下丘脑lncRNAs的筛选和lncRNAs的鉴定；lncRNAs的鉴定，包括总RNA提取和RT‑PCR检测；RT‑PCR检测，包括lncRNAs反转录；牛下丘脑关键lncRNAs‑miRNAs特异性结合，包括细胞培养、细胞共转染和双荧光素酶活性检测；细胞培养，包括细胞复苏和细胞铺板；牛下丘脑关键lncRNAs通过特异性吸附miRNAs对CART的表达调控，包括细胞转染和qRT‑PCR检测；qRT‑PCR检测，包括miRNA反转录、lncRNAs反转录、引物设计与合成和RT‑PCR反应；lncRNASNHG3对小鼠CART表达的调控，包括小鼠侧脑室注射处理、qRT‑PCR检测和CART蛋白表达检测。该发明的技术效果为后期通过敲除lncRNAs从而促进卵泡发育、提高排卵率、改善母牛繁殖性能的研究提供理论支持。
Description
技术领域
本发明涉及非编码RNA及其应用技术领域，具体为牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用。
背景技术
牛属于单胎动物，通常一个发情期内卵巢中有2～3个卵泡波，最终仅有一个优势卵泡(dominant follicles,DF)发育成熟并释放卵子。因此，排卵卵泡的数量和质量直接影响优良种畜扩繁及胚胎工程技术的应用。可卡因-苯丙胺调节转录肽(CocaineandAmphetamine RegulatedTranscript Peptide,CART)是一种广泛分布于下丘脑的神经肽，可通过下丘脑-垂体-卵巢(Hypothalamic-Pituitary-Ovary,HPO)轴直接作用于牛卵泡GCs，抑制促卵泡素(follicle stimulating hormone,FSH)介导的E2分泌和cAMP表达，对牛卵泡发育起显著负调控作用，是抑制卵泡优势化的重要因子，因此探讨CART表达调控机制对深入解析牛卵泡发育机理具有重要意义。
LncRNA和miRNA均是调控基因表达的关键因子，二者相互作用可影响下游基因表达，进而引起相应生物学功能变化。微RNA(microRNA,miRNA)是一种长度小于20nt的高度保守的非编码RNA，主要通过与下游靶基因的3'UTR特定序列完全或不完全互补配对，从而促进靶基因mRNA降解或阻碍蛋白质翻译进行基因表达调控。长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一种长度大于200nt，具有mRNA结构，但不具有蛋白编码能力的RNA，一直以来被认为是不具有生物学功能的“垃圾序列”。但近年来研究表明，lncRNA可通过表观遗传学水平、转录水平、转录后水平及蛋白代谢水平等多种机制调控下游基因表达，而目前对lncRNA的研究大多主要集中于其作为竞争性内源RNA(ceRNA)，通过特异性“海绵”吸附miRNA进而参与下游靶基因表达的调控功能，即lncRNA可通过与miRNA结合逆转miRNA对下游靶基因的抑制作用。
本课题组前期研究发现，miR-377、miR-331-3p、miR-493、miR-381、miR-491可抑制CART表达，其中miR-381和miR-491对CART表达抑制作用最强。本发明通过生物信息学、双荧光素酶报告基因检测、qRT-PCR和Western blot等技术探究lncRNAs通过海绵吸附miRNAs对CART表达的调控，进而筛选出调控CART表达的关键lncRNA。从StarBase v2.0、NCBI、DIANAtools数据库预测可能与极显著抑制CART表达的miR-381、miR-491和显著抑制CART表达的miR-377、miR-331-3p、和miR-493结合的lncRNAs，结果显示，TUG1、SNHG3与miR-381存在结合位点；H19、SNHG12、DANCR与miR-491存在结合位点；SNHG4、MEG3、NEAT1与miR-377存在结合位点；XIST与miR-331-3p存在结合位点；MEG 9与miR-493存在结合位点。RT-PCR结果表明，除NEAT1外，其他lncRNAs均在牛下丘脑中有表达。双荧光素酶报告基因试验表明，TUG1、SNHG3与miR-381具有靶向结合关系，H19、SNHG12、DANCR与miR-491具有靶向结合关系。细胞水平表明，SNHG3通过特异性吸附miR-381提高CART表达量作用效果最显著。小鼠活体试验进一步表明，lncRNA SNHG3可通过特异性吸附miR-381极显著提高CART表达，最终影响下丘脑CART蛋白表达。
本发明从体内外水平筛选出调控CART表达的关键lncRNA，最终明确lncRNA SNHG3可通过特异性吸附miR-381进而显著上调CART蛋白表达。本发明进一步完善了调控牛下丘脑CART表达的分子调控网络机制，同时丰富了CART调控牛卵泡发育的机理，为后期通过敲除lncRNAs从而促进卵泡发育、提高排卵率、改善母牛繁殖性能的研究提供理论支持。
发明内容
发明的目的在于提供牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，以实现上述背景技术中提出的技术效果。
为实现上述目的，发明提供如下技术方案：牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，具体包括以下步骤：
步骤一：牛下丘脑lncRNAs的筛选与鉴定：
所述lncRNAs的筛选与鉴定，包括lncRNAs的筛选和lncRNAs的鉴定；
所述lncRNAs的鉴定，包括总RNA提取和RT-PCR检测；
所述RT-PCR检测，包括lncRNAs反转录，引物设计和常规PCR反应；
步骤二：牛下丘脑关键lncRNAs-miRNAs特异性结合：
所述lncRNAs-miRNAs特异性结合，包括细胞培养、细胞共转染和双荧光素酶活性检测；
所述细胞培养，包括细胞复苏和细胞铺板；
步骤三：牛下丘脑关键lncRNAs通过特异性吸附miRNAs对CART的表达调控：
所述lncRNAs通过特异性吸附miRNAs对CART的表达调控，包括细胞转染和qRT-PCR检测；
所述qRT-PCR检测，包括miRNA反转录、lncRNAs反转录、引物设计与合成和RT-PCR反应；
步骤四：lncRNA SNHG3对小鼠CART表达的调控：
所述lncRNA SNHG3对小鼠CART表达的调控，包括小鼠侧脑室注射处理、qRT-PCR检测和CART蛋白表达检测。
优选的，所述lncRNAs的筛选，具体包括：
从miRBase数据库中获取牛和人miR-381、miR-491、miR-377、miR-331-3p、和miR-493的FASTA序列，利用DNAMAN软件进行序列比对，运用StarBase v2.0、NCBI、DIANAtools数据库预测以上5个miRNAs可能结合的lncRNAs。在NCBI数据库中获取相应lncRNAs FASTA序列，并利用RNAhybrid软件预测miRNA-lncRNA结合位点。
优选的，所述总RNA提取，具体包括：
于液氮中研磨牛下丘脑组织，分别置于装有1mL Trizol的离心管中，震荡混匀，使其充分裂解；4℃12,000rpm离心10min，取上清，室温放置5min；加入200μL氯仿，涡旋振荡15s，4℃12,000rpm离心15min，溶液分为三层，取上层无色有机水相于另一离心管中，静置5min；加入500μL异丙醇，颠倒混匀，静置10min；4℃12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL75％乙醇，洗涤沉淀；4℃7,500rpm离心5min，弃上清，室温干燥5min，加30μL DEPC水溶解沉淀；利用核酸蛋白定量仪检测RNA纯度及浓度。
优选的，所述lncRNAs反转录，具体包括：
去除上述所提取的总RNA中残留的基因组DNA，按照表1配制反应体系，轻柔混匀，42℃反应2min，4℃保存；利用上述溶液进行反转录，反应体系见表2；反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃保存；
表1去基因组DNA反应体系
表2反转录反应体系
所述引物设计，具体包括：
在NCBI数据库中分别获取Bos Taurus相对应lncRNAs序列，利用Primer3.0在线设计miRNA-lncRNA包括结合位点大约300bp左右序列的特异性引物，交由上海生工生物工程有限公司合成，具体序列见表3；
表3lncRNAs引物序列
所述常规PCR反应，具体包括：
使用上述引物序列进行PCR扩增，反应体系如表4；配制好后按以下程序进行反应：94℃4min，94℃30s，55～59℃1min，72℃30s，32个循环，72℃5min；利用琼脂糖凝胶电泳(1％，100V/30min)进行检测PCR产物，在凝胶成像仪下观察DNA条带；将目的条带按照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行回收，产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序；
表4PCR反应体系
优选的，所述细胞共转染，具体包括以下步骤：
S1：试验分组：miR-381mimics+TUG1/SNHG3 WT、miR-491mimics+H19/SNHG12/DANCRWT、NC mimic+TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCRWT、miR-381mimics+TUG1/SNHG3 MUT、miR-491mimics+H19/SNHG12/DANCR MUT、NC mimic+TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR MUT、miR-381mimics+pmirGLO、miR-491mimics+pmirGLO、NC mimic+pmirGLO，每组设置3个复孔；
S2：NC mimic与miR-381/491mimics由上海吉玛制药技术有限公司合成。
表8miRNAs mimics序列
S3：取10μL DMEM培养基稀释1ng载体和10pmol miR-381/491mimics，轻轻混匀，室温孵育5min；
S4：取10μL DMEM培养基稀释0.6μL TransIntroTM EL，轻轻混匀，室温孵育5min；
S5：将S4加入S3中，轻柔吹打，室温孵育25min；
S6：吸出96孔板中的培养基，PBS清洗2次，每孔加入200μL RPMI无血清培养基，再加入S4中混合溶液，于细胞培养箱中培养，6h后将培养液更换为完全培养基，继续培养36h。
优选的，所述细胞复苏，具体包括：
于液氮中取出已冻存的293T细胞，37℃水浴锅中复苏后，加1mL终止液，轻轻吹打混匀后转移至15mL离心管，1,000rpm离心6min，弃上清；加2mL完全培养液重悬细胞，转移至细胞培养瓶，铺匀后，补足培养液至6mL，37℃5％CO2培养箱中进行培养；
所述细胞铺板，具体包括：
当细胞融合度达到80％～90％时，吸去细胞培养液，PBS清洗2次，加入1mL胰酶于37℃裂解3min；随后加入1mL终止液转移至15mL离心管，1,000rpm离心7min，弃上清；在细胞计数仪下进行计数，用完全培养基将细胞浓度稀释为5×105个/mL，均匀接种于96孔板后，补足完全培养液于200μL，37℃5％CO2培养箱中培养24h。
优选的，所述双荧光素酶活性检测，具体包括：
吸尽96孔板中的细胞培养液，每孔加入100μL报告基因细胞裂解液，室温放置30min；充分裂解后，转移至无菌Ep管中，15,000rpm离心5min，取上清用于检测；海肾荧光素酶检测工作液配制：按照1：100在海肾荧光素酶缓冲液中加入海肾荧光素酶检测底物(100×)；黑色酶标板每孔100μL样品加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，轻轻混匀，于酶标仪检测萤火虫荧光素酶活性值F(Firely Lueiferase，F)；继续加入100μL海肾荧光素酶检测工作液，吹打混匀，测定海肾荧光素酶活性值R(Renilla Luciferase，R)；以海肾荧光素酶为内参，用F/R值比较样品中目的报告基因的荧光活性。
优选的，所述细胞转染，具体包括：
第一步：合成miR-381/491mimics和NC mimics序列，以及构建TUG1、SNHG3、H19、SNHG12、DANCR、CART的过表达载体，进行三质粒共转染293T细胞，具体试验分组如下：
(1)miRNAs-CART：NC mimic+CART、miR-381/491mimics+PEX-3、miR-381/491mimics+CART；
(2)lncRNAs-CART：pcDNA3.1-EGFP+CART、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+PEX-3、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+CART；
lncRNAs-miRNAs-CART：pcDNA3.1-EGFP+miR-381/491mimics+CART、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+NCmimic+CART、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+miR-381/491mimics+CART；
第二步：按照三种质粒总量：转染试剂(μg:μL)＝1：3的比例转染至293T细胞，每组设置3个重复，具体操作方法同2.2。
优选的，所述miRNA反转录，具体包括：
根据表9配置去除基因组反应体系，轻柔混匀，于37℃反应30min，继续加入1μL0.5M EDTA，85℃恒温5min；将上述反应溶液按照表10配制反转录反应体系，反应程序为：37℃1h，85℃5min；所得cDNA稀释10倍后于-20℃保存；
表9miRNA去除基因组反应
表10miRNA反转录体系
所述lncRNAs反转录，具体与步骤一中的lncRNAs反转录相同；
所述引物设计与合成，具体包括：
从NCBI中获得Bos taurus的miR-381/491、CART、TUG1、SNHG3、H19、SNHG12和DANCR的核酸序列，利用Primer 3.0在线设计特异性引物，内参基因分别为U6和β-actin，参照GenBank上提供的序列，由上海生工公司进行合成，具体序列见表11；
表11目的基因qRT-PCR引物序列
所述qRT-PCR反应，具体包括：
利用上述引物进行qRT-PCR反应，按照表12进行CART、TUG1、SNHG3、H19、SNHG12、DANCR反应体系的配制，按照表13进行miRNA反应体系的配制，反应程序为：预变性95℃10s；PCR反应95℃15s，60℃1min，72℃20s，设置40个循环；溶解曲线阶段95℃15s，60℃1min，95℃15s；
表12mRNA qPCR反应体系
表13miRNAs qPCR反应体系
优选的，所述小鼠侧脑室注射处理，具体包括：
(1)将40只小鼠在22-25℃下适应性饲养7d后，随机分为空白组、生理盐水组、pcDNA3.1-EGFP组及lncRNA SNHG3过表达组；每组10只，自由进食和饮水；
(2)将lncRNA SNHG3过表达质粒稀释至1μg/μL，按照质粒与EntransterTM-invivo为1：2混匀配制，于室温下静置15min；
(3)将小鼠固定后，利用微量注射器于其头部正中线和两耳连线交点位置左右1.2mm处，以1μL/min的流量分别注射生理盐水、pcDNA3.1-EGFP和lncRNA SNHG3质粒，针深2.5mm；
(4)注射完成后停针5min，利用75％的酒精对其注射部位消毒，待小鼠恢复活力后放回鼠笼正常饲养；
(5)72h后进行眼球采血，将装有全血的Ep管倾斜45°于室温放置2h后，4℃4,000rpm离心10min，使血清析出，取上清，于-80℃保存；
(6)断颈处死小鼠，手术剪剥离大脑，取出下丘脑后于液氮保存。
优选的，步骤三中的qRT-PCR检测与步骤四中的qRT-PCR检测方法相同。
优选的，所述CART蛋白表达检测，具体包括：
(1)下丘脑总蛋白提取：
将WB Lysis Buffer和PMSF蛋白酶抑制剂按100：1配制混匀备用；小鼠下丘脑组织在液氮中充分研磨，每20mg组织加入200μL裂解液，摇晃至充分裂解后，冰上放置5min，14,000rpm离心5min，取上清分装于新离心管中进行后续试验；
(2)蛋白浓度测定(BCA法)：
使用Easy II Protein Quantitative Kit(BCA)试剂盒进行测定。将BSAStandard Solution利用PBS稀释为500μg/mL，并将BCA SolutionA和BCA Solution B充分混匀配制BCA工作液(50：1)；分别取0、1、2、4、8、12、16、20μL稀释后的BSA溶液于96孔板中，用PBS补充至20μL(将标准液浓度依次稀释为0、25、50、100、200、300、400、500μg/mL)；将待测样品利用PBS稀释后取20μL加入样品孔中；随后在各孔中分别加入200μL BCA工作液，37℃温育60min，所有待测样品重复三次；于562nm波长处测定各样品OD值，并绘制标准曲线计算待测样品蛋白浓度；
(3)Western Blot检测：
电泳装置组装进行检漏后，按照表14分别配制10％、12％分离胶，晃动混匀后，快速加入玻璃板约2/3处，取蒸馏水封胶，室温静置35min，待分离胶充分凝固后弃去蒸馏水；按照表15配制5％浓缩胶，晃动混匀，快速加入玻璃板中，插入1.5mm梳子，室温静置30min，待浓缩胶充分凝固后进行下一步试验；
表14SDS-PAGE分离胶配制
表15SDS-PAGE 5％浓缩胶配制
上样：蛋白浓度测定后，利用蛋白裂解液将其浓度统一为4μg/μL，并加入适量5×蛋白上样缓冲液(蛋白样品：5×蛋白上样缓冲液＝4：1)，充分混匀后于100℃金属浴加热10min，完成后冷却至室温进行电泳；
电泳：加入电泳缓冲液，调节电压至80V，待蛋白样品到达分离胶后将电压调节为120V，当溴酚蓝指示剂迁移至距底部约1cm处，关闭电源；
转膜：根据Marker指示，在转膜液中对目的蛋白条带进行切胶，按照黑板-垫网-滤纸-胶-NC膜-滤纸-垫网-白板顺序进行叠放，放入转膜槽，在预冷的转膜液中进行转膜，条件为：250mA 60min(4℃)；
封闭：将NC膜置于5％脱脂奶粉中封闭1h；
一抗孵育：去除封闭液，加入一抗稀释液(β-actin一抗：封闭液＝1：2,500，CART一抗：封闭液＝1：500)，4℃过夜后，用1×TBST洗膜3次，每次5min；
二抗孵育：加入二抗稀释液(β-actin二抗：1×TBST＝1:5,000，CART二抗：1×TBST＝1：5,000)，室温摇床1h后，用1×TBST洗膜3次，每次5min；
显影：将eECL发光液试剂盒中A液：B液＝1：1的比例混匀后避光保存；取适量发光液均匀涂至NC膜上，避光显色5min，放置蛋白凝胶成像仪中进行检测。
与现有技术相比，发明的有益效果是：该牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，从体内外水平筛选出调控CART表达的关键lncRNA，最终明确lncRNA SNHG3可通过特异性吸附miR-381进而显著上调CART蛋白表达。并且进一步完善了调控牛下丘脑CART表达的分子调控网络机制，同时丰富了CART调控牛卵泡发育的机理，为后期通过敲除lncRNAs从而促进卵泡发育、提高排卵率、改善母牛繁殖性能的研究提供理论支持。
附图说明
图1为实施例中的lncRNAs-miRNAs结合位点预测示意图；
图2为实施例中的lncRNAs内源性表达示意图；
图3为实施例中的野生型与突变型重组质粒测序结果示意图；
图4为实施例中的TUG1与miR-381双荧光素酶报告基因检测结果示意图；
图5为实施例中的SNHG3与miR-381双荧光素酶报告基因检测结果示意图；
图6为实施例中的H19与miR-491双荧光素酶报告基因检测结果示意图；
图7为实施例中的SNHG12与miR-491双荧光素酶报告基因检测结果示意图；
图8为实施例中的DANCR与miR-491双荧光素酶报告基因检测结果示意图；
图9为实施例中的miRNAs和CART表达量检测示意图；
图10为实施例中的lncRNAs和CART mRNA相对表达量示意图；
图11为实施例中的各组lncRNAs相对表达量示意图；
图12为实施例中的各组miRNAs相对表达量示意图；
图13为实施例中的各组CART mRNA相对表达量示意图；
图14为实施例中的各组miR-381、SNHG3和CART相对表达量示意图；
图15为实施例中的SNHG3对CART蛋白表达量的影响示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-15，发明提供一种技术方案：牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，具体包括以下步骤：
步骤一：牛下丘脑lncRNAs的筛选与鉴定：
所述lncRNAs的筛选与鉴定，包括lncRNAs的筛选和lncRNAs的鉴定；
所述lncRNAs的鉴定，包括总RNA提取和RT-PCR检测；
所述RT-PCR检测，包括lncRNAs反转录，引物设计和常规PCR反应；
步骤二：牛下丘脑关键lncRNAs-miRNAs特异性结合：
所述lncRNAs-miRNAs特异性结合，包括细胞培养、细胞共转染和双荧光素酶活性检测；
所述细胞培养，包括细胞复苏和细胞铺板；
步骤三：牛下丘脑关键lncRNAs通过特异性吸附miRNAs对CART的表达调控：
所述lncRNAs通过特异性吸附miRNAs对CART的表达调控，包括细胞转染和qRT-PCR检测；
所述qRT-PCR检测，包括miRNA反转录、lncRNAs反转录、引物设计与合成和RT-PCR反应；
步骤四：lncRNA SNHG3对小鼠CART表达的调控：
所述lncRNA SNHG3对小鼠CART表达的调控，包括小鼠侧脑室注射处理、qRT-PCR检测和CART蛋白表达检测。
优选的，所述lncRNAs的筛选，具体包括：
从miRBase数据库中获取牛和人miR-381、miR-491、miR-377、miR-331-3p、和miR-493的FASTA序列，利用DNAMAN软件进行序列比对，运用StarBase v2.0、NCBI、DIANAtools数据库预测以上5个miRNAs可能结合的lncRNAs。在NCBI数据库中获取相应lncRNAs FASTA序列，并利用RNAhybrid软件预测miRNA-lncRNA结合位点。
优选的，所述总RNA提取，具体包括：
于液氮中研磨牛下丘脑组织，分别置于装有1mL Trizol的离心管中，震荡混匀，使其充分裂解；4℃12,000rpm离心10min，取上清，室温放置5min；加入200μL氯仿，涡旋振荡15s，4℃12,000rpm离心15min，溶液分为三层，取上层无色有机水相于另一离心管中，静置5min；加入500μL异丙醇，颠倒混匀，静置10min；4℃12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL75％乙醇，洗涤沉淀；4℃7,500rpm离心5min，弃上清，室温干燥5min，加30μL DEPC水溶解沉淀；利用核酸蛋白定量仪检测RNA纯度及浓度。
优选的，所述lncRNAs反转录，具体包括：
去除上述所提取的总RNA中残留的基因组DNA，按照表1配制反应体系，轻柔混匀，42℃反应2min，4℃保存；利用上述溶液进行反转录，反应体系见表2；反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃保存；
表1去基因组DNA反应体系
表2反转录反应体系
所述引物设计，具体包括：
在NCBI数据库中分别获取Bos Taurus相对应lncRNAs序列，利用Primer3.0在线设计miRNA-lncRNA包括结合位点大约300bp左右序列的特异性引物，交由上海生工生物工程有限公司合成，具体序列见表3；
表3lncRNAs引物序列
所述常规PCR反应，具体包括：
使用上述引物序列进行PCR扩增，反应体系如表4；配制好后按以下程序进行反应：94℃4min，94℃30s，55～59℃1min，72℃30s，32个循环，72℃5min；利用琼脂糖凝胶电泳(1％，100V/30min)进行检测PCR产物，在凝胶成像仪下观察DNA条带；将目的条带按照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行回收，产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序；
表4PCR反应体系
优选的，所述细胞共转染，具体包括以下步骤：
S1：试验分组：miR-381mimics+TUG1/SNHG3 WT、miR-491mimics+H19/SNHG12/DANCR WT、NC mimic+TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR WT、miR-381mimics+TUG1/SNHG3MUT、miR-491mimics+H19/SNHG12/DANCR MUT、NC mimic+TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR MUT、miR-381mimics+pmirGLO、miR-491mimics+pmirGLO、NC mimic+pmirGLO，每组设置3个复孔；
S2：NC mimic与miR-381/491mimics由上海吉玛制药技术有限公司合成。
表8miRNAs mimics序列
S3：取10μL DMEM培养基稀释1ng载体和10pmol miR-381/491mimics，轻轻混匀，室温孵育5min；
S4：取10μL DMEM培养基稀释0.6μLTransIntroTM EL，轻轻混匀，室温孵育5min；
S5：将S4加入S3中，轻柔吹打，室温孵育25min；
S6：吸出96孔板中的培养基，PBS清洗2次，每孔加入200μL RPMI无血清培养基，再加入S4中混合溶液，于细胞培养箱中培养，6h后将培养液更换为完全培养基，继续培养36h。
优选的，所述细胞复苏，具体包括：
于液氮中取出已冻存的293T细胞，37℃水浴锅中复苏后，加1mL终止液，轻轻吹打混匀后转移至15mL离心管，1,000rpm离心6min，弃上清；加2mL完全培养液重悬细胞，转移至细胞培养瓶，铺匀后，补足培养液至6mL，37℃5％CO2培养箱中进行培养；
所述细胞铺板，具体包括：
当细胞融合度达到80％～90％时，吸去细胞培养液，PBS清洗2次，加入1mL胰酶于37℃裂解3min；随后加入1mL终止液转移至15mL离心管，1,000rpm离心7min，弃上清；在细胞计数仪下进行计数，用完全培养基将细胞浓度稀释为5×105个/mL，均匀接种于96孔板后，补足完全培养液于200μL，37℃5％CO2培养箱中培养24h。
优选的，所述双荧光素酶活性检测，具体包括：
吸尽96孔板中的细胞培养液，每孔加入100μL报告基因细胞裂解液，室温放置30min；充分裂解后，转移至无菌Ep管中，15,000rpm离心5min，取上清用于检测；海肾荧光素酶检测工作液配制：按照1：100在海肾荧光素酶缓冲液中加入海肾荧光素酶检测底物(100×)；黑色酶标板每孔100μL样品加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，轻轻混匀，于酶标仪检测萤火虫荧光素酶活性值F(Firely Lueiferase，F)；继续加入100μL海肾荧光素酶检测工作液，吹打混匀，测定海肾荧光素酶活性值R(Renilla Luciferase，R)；以海肾荧光素酶为内参，用F/R值比较样品中目的报告基因的荧光活性。
优选的，所述细胞转染，具体包括：
第一步：合成miR-381/491mimics和NC mimics序列，以及构建TUG1、SNHG3、H19、SNHG12、DANCR、CART的过表达载体，进行三质粒共转染293T细胞，具体试验分组如下：
(1)miRNAs-CART：NC mimic+CART、miR-381/491mimics+PEX-3、miR-381/491mimics+CART；
(2)lncRNAs-CART：pcDNA3.1-EGFP+CART、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+PEX-3、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+CART；
lncRNAs-miRNAs-CART：pcDNA3.1-EGFP+miR-381/491mimics+CART、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+NC mimic+CART、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+miR-381/491mimics+CART；
第二步：按照三种质粒总量：转染试剂(μg:μL)＝1：3的比例转染至293T细胞，每组设置3个重复，具体操作方法同2.2。
优选的，所述miRNA反转录，具体包括：
根据表9配置去除基因组反应体系，轻柔混匀，于37℃反应30min，继续加入1μL0.5M EDTA，85℃恒温5min；将上述反应溶液按照表10配制反转录反应体系，反应程序为：37℃1h，85℃5min；所得cDNA稀释10倍后于-20℃保存；
表9miRNA去除基因组反应
表10miRNA反转录体系
所述lncRNAs反转录，具体与步骤一中的lncRNAs反转录相同；
所述引物设计与合成，具体包括：
从NCBI中获得Bos taurus的miR-381/491、CART、TUG1、SNHG3、H19、SNHG12和DANCR的核酸序列，利用Primer 3.0在线设计特异性引物，内参基因分别为U6和β-actin，参照GenBank上提供的序列，由上海生工公司进行合成，具体序列见表11；
表11目的基因qRT-PCR引物序列
所述qRT-PCR反应，具体包括：
利用上述引物进行qRT-PCR反应，按照表12进行CART、TUG1、SNHG3、H19、SNHG12、DANCR反应体系的配制，按照表13进行miRNA反应体系的配制，反应程序为：预变性95℃10s；PCR反应95℃15s，60℃1min，72℃20s，设置40个循环；溶解曲线阶段95℃15s，60℃1min，95℃15s；
表12mRNA qPCR反应体系
表13miRNAs qPCR反应体系
优选的，所述小鼠侧脑室注射处理，具体包括：
(1)将40只小鼠在22-25℃下适应性饲养7d后，随机分为空白组、生理盐水组、pcDNA3.1-EGFP组及lncRNA SNHG3过表达组；每组10只，自由进食和饮水；
(2)将lncRNA SNHG3过表达质粒稀释至1μg/μL，按照质粒与EntransterTM-invivo为1：2混匀配制，于室温下静置15min；
(3)将小鼠固定后，利用微量注射器于其头部正中线和两耳连线交点位置左右1.2mm处，以1μL/min的流量分别注射生理盐水、pcDNA3.1-EGFP和lncRNA SNHG3质粒，针深2.5mm；
(4)注射完成后停针5min，利用75％的酒精对其注射部位消毒，待小鼠恢复活力后放回鼠笼正常饲养；
(5)72h后进行眼球采血，将装有全血的Ep管倾斜45°于室温放置2h后，4℃4,000rpm离心10min，使血清析出，取上清，于-80℃保存；
(6)断颈处死小鼠，手术剪剥离大脑，取出下丘脑后于液氮保存。
优选的，步骤三中的qRT-PCR检测与步骤四中的qRT-PCR检测方法相同。
优选的，所述CART蛋白表达检测，具体包括：
(1)下丘脑总蛋白提取：
将WB Lysis Buffer和PMSF蛋白酶抑制剂按100：1配制混匀备用；小鼠下丘脑组织在液氮中充分研磨，每20mg组织加入200μL裂解液，摇晃至充分裂解后，冰上放置5min，14,000rpm离心5min，取上清分装于新离心管中进行后续试验；
(2)蛋白浓度测定(BCA法)：
使用Easy II Protein Quantitative Kit(BCA)试剂盒进行测定。将BSAStandard Solution利用PBS稀释为500μg/mL，并将BCA SolutionA和BCA Solution B充分混匀配制BCA工作液(50：1)；分别取0、1、2、4、8、12、16、20μL稀释后的BSA溶液于96孔板中，用PBS补充至20μL(将标准液浓度依次稀释为0、25、50、100、200、300、400、500μg/mL)；将待测样品利用PBS稀释后取20μL加入样品孔中；随后在各孔中分别加入200μL BCA工作液，37℃温育60min，所有待测样品重复三次；于562nm波长处测定各样品OD值，并绘制标准曲线计算待测样品蛋白浓度；
(3)WesternBlot检测：
电泳装置组装进行检漏后，按照表14分别配制10％、12％分离胶，晃动混匀后，快速加入玻璃板约2/3处，取蒸馏水封胶，室温静置35min，待分离胶充分凝固后弃去蒸馏水；按照表15配制5％浓缩胶，晃动混匀，快速加入玻璃板中，插入1.5mm梳子，室温静置30min，待浓缩胶充分凝固后进行下一步试验；
表14SDS-PAGE分离胶配制
表15SDS-PAGE 5％浓缩胶配制
上样：蛋白浓度测定后，利用蛋白裂解液将其浓度统一为4μg/μL，并加入适量5×蛋白上样缓冲液(蛋白样品：5×蛋白上样缓冲液＝4：1)，充分混匀后于100℃金属浴加热10min，完成后冷却至室温进行电泳；
电泳：加入电泳缓冲液，调节电压至80V，待蛋白样品到达分离胶后将电压调节为120V，当溴酚蓝指示剂迁移至距底部约1cm处，关闭电源；
转膜：根据Marker指示，在转膜液中对目的蛋白条带进行切胶，按照黑板-垫网-滤纸-胶-NC膜-滤纸-垫网-白板顺序进行叠放，放入转膜槽，在预冷的转膜液中进行转膜，条件为：250mA 60min(4℃)；
封闭：将NC膜置于5％脱脂奶粉中封闭1h；
一抗孵育：去除封闭液，加入一抗稀释液(β-actin一抗：封闭液＝1：2,500，CART一抗：封闭液＝1：500)，4℃过夜后，用1×TBST洗膜3次，每次5min；
二抗孵育：加入二抗稀释液(β-actin二抗：1×TBST＝1:5,000，CART二抗：1×TBST＝1：5,000)，室温摇床1h后，用1×TBST洗膜3次，每次5min；
显影：将eECL发光液试剂盒中A液：B液＝1：1的比例混匀后避光保存；取适量发光液均匀涂至NC膜上，避光显色5min，放置蛋白凝胶成像仪中进行检测。
试验结果：
3.1lncRNAs筛选结果：
利用StarBase v2.0、NCBI、DIANAtools数据库预测与极显著抑制CART表达的miR-381、miR-491和显著抑制CART表达的miR-377、miR-331-3p、和miR-493结合的lncRNAs，结果显示，TUG1、SNHG3与miR-381存在结合位点；H19、SNHG12、DANCR与miR-491存在结合位点；SNHG4、MEG3、NEAT1与miR-377存在结合位点；XIST与miR-331-3p存在结合位点；MEG 9与miR-493存在结合位点；具体结合位点见图1。
3.2RT-PCR检测lncRNAs内源性表达结果：
内源性表达结果显示，除NEAT1外，MEG9、SNHG4、H19、XIST、SNHG12、TUG1、SNHG3、MEG3、DANCR部分序列在牛下丘脑中均有表达，且测序结果与已登录(NCBI)序列完全一致，如图2所示，可进行下一步试验。
3.3双荧光素酶载体鉴定
将构建的TUG1-WT、TUG1-MUT、SNHG3-WT、SNHG3-MUT、H19-WT、H19-MUT、SNHG12-WT、SNHG12-MUT、DANCR-WT、DANCR-MUT重组质粒进行测序，结果与已知序列一致，如图3所示，表明目的片段成功插入pmirGLO载体中，可进行下一步试验。
3.4lncRNAs-miRNAs结合性分析
将NC mimic与pmirGLO、miR-381mimics与pmirGLO分别共转染至293T细胞中，结果如图4所示，两组相对荧光活性无显著差异(P>0.05)，表明试验体系良好；miR-381mimics与TUG1-WT共转染时，与NC mimic和TUG1-WT组相比，相对荧光活性极显著下降(P<0.01)；miR-381mimics与TUG1-MUT共转染时，相对荧光活性与NC mimic和TUG1-MUT组相比无显著差异(P>0.05)，表明miR-381可极显著抑制TUG1-WT荧光素酶活性表达。
miR-381mimics与SNHG3-WT共转染时，与NC mimic和SNHG3-WT组相比，相对荧光活性极显著下降(P<0.01)，如图5所示；miR-381mimics与SNHG3-MUT组共转染时，相对荧光活性与NC mimic和SNHG3-MUT组相比无显著差异(P>0.05)，表明miR-381可极显著抑制SNHG3-WT荧光素酶活性表达。
将NC mimic与pmirGLO、miR-491mimics与pmirGLO分别共转染至293T细胞中，结果如图6所示，两组相对荧光活性无显著差异(P>0.05)，表明试验体系良好；miR-491mimics与H19-WT共转染时，与NC mimic和H19-WT组相比，相对荧光活性显著下降(P<0.05)；miR-491mimics与H19-MUT共转染时，相对荧光活性与NC mimic和H19-MUT组相比无显著差异(P>0.05)，表明miR-491可显著抑制H19-WT荧光素酶活性表达。
miR-491mimics与SNHG12-WT共转染时，与NC mimic和SNHG12-WT组相比，相对荧光活性极显著下降(P<0.01)，如图7所示；miR-491mimics与SNHG12-MUT组共转染时，相对荧光活性与NC mimic和SNHG12-MUT组相比无显著差异(P>0.05)，表明miR-491可极显著抑制SNHG12-WT荧光素酶活性表达。
miR-491mimics与DANCR-WT共转染时，与NC mimic和DANCR-WT组相比，相对荧光活性极显著下降(P<0.01)，如图8所示；miR-491mimics与DANCR-MUT组共转染时，相对荧光活性与NC mimic和DANCR-MUT组相比无显著差异(P>0.05)，表明miR-491可显著抑制DANCR-WT荧光素酶活性表达。
3.4lncRNAs特异性吸附miR-381/491对CART表达的影响
(1)miR-381/491对CART表达的影响
瞬时转染miR-381/491-CART后，miR-381和miR-491表达结果见图9A，相比于miR-381/491+PEX-3组，miR-381/491+CART组中miR-381和miR-491的表达量均极显著降低(P<0.01)，表明各组中miR-381和miR-491均转染成功；对CART相对表达量分析见图9B，可知miR-381/491+CART组中CART表达量均极显著低于NC mimic+CART组(P<0.01)，表明miR-381/491-CART过表达细胞模型构建成功，且miR-381和miR-491均极显著抑制CART表达(P<0.01)。(注：A：各组中miR-381/491过表达检测；B：各组中CART相对表达量检测)。
(2)lncRNAs对CART表达的影响
分别瞬时共转染TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+CART后，各试验组中TUG1、SNHG3、H19、SNHG12和DANCR的表达量如图10A所示，可知TUG1、SNHG3、H19、SNHG12和DANCR成功转染至293T细胞中；对CART相对表达量分析由图10B可知，各试验组与对照组pcDNA3.1-EGFP+CART中CART相对表达量无显著差异(P>0.05)，表明TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR-CART过表达细胞模型构建成功，且TUG1、SNHG3、H19、SNHG12和DANCR均对CART表达无显著影响(P>0.05)。(注：A：lncRNAs过表达检测；B：各组中CART相对表达量检测)。
1)瞬时转染lncRNAs-miRNAs-CART对lncRNAs表达的影响
qRT-PCR结果表明(如图11)，试验组TUG1/SNHG3+miR-381+CART相比于对照组TUG1/SNHG3+NC+CART中，各组TUG1和SNHG3表达量极显著降低(P<0.001)；试验组H19/SNHG12/DANCR+miR-491+CART相比于对照组H19/SNHG12/DANCR+NC+CART中，各组H19、SNHG12和DANCR表达量极显著降低(P<0.001),表明各组中TUG1、SNHG3、H19、SNHG12和DANCR过表达质粒均转染成功。(注：A～E依次为TUG1、SNHG3、H19、SNHG12、DANCR过表达检测)。
2)瞬时转染lncRNAs-miRNAs-CART对miRNAs表达的影响
图12表明，试验组TUG1/SNHG3+miR-381+CART相比于对照组TUG1/SNHG3+NC+CART，各试验组中均有miR-381表达，表明试验组中miR-381均转染成功；H19/SNHG12/DANCR+miR-491+CART组相比于H19/SNHG12/DANCR+NC+CART组中均有miR-491表达，表明试验组中miR-491均转染成功。(注：A、B为miR-381过表达检测；C～E为miR-491过表达检测)。
3)瞬时转染lncRNAs-miRNAs-CART对CART表达的影响
qRT-PCR检测CART表达情况如图13，结果显示，pcDNA3.1-EGFP+miR-381/491+CART、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+NC+CART、TUG1/SNHG3+miR-381+CART、H19/SNHG12/DANCR+miR-491+CART组中均有CART表达，表明各组中CART过表达质粒均转染成功，同时各组lncRNA-miRNA-CART细胞模型也均构建成功。
对各组CART mRNA相对表达量进行显著性分析，结果表明：TUG1+miR-381+CART组中CART表达量极显著低于TUG1+NC+CART组(P<0.01),但与miR-381+CART组相比无显著差异(P>0.05)，表明TUG1通过特异性吸附miR-381进而调控CART作用不显著；SNHG3+miR-381+CART组与SNHG3+NC+CART组之间CART表达量差异不显著(P>0.05)，但极显著高于miR-381+CART组(P<0.01)，表明SNHG3可通过特异性吸附miR-381极显著增加CART表达；H19+miR-491+CART组中CART表达量极显著低于H19+NC+CART(P<0.0001)，但与miR-491+CART相比无显著差异(P>0.05)，表明H19通过特异性吸附miR-491进而调控CART作用不显著；SNHG12+miR-491+CART组中CART表达量极显著低于SNHG12+NC+CART(P<0.01)，但极显著高于miR-491+CART(P<0.01)，表明SNHG12可通过特异性吸附miR-491极显著增加CART表达；DANCR+miR-491+CART组中CART表达量极显著低于DANCR+NC+CART(P<0.0001)，但与miR-491+CART相比无显著差异(P>0.05)，表明DANCR通过特异性吸附miR-491进而调控CART作用不显著；SNHG3+miR-381+CART组中CART表达量极显著高于SNHG12+miR-491+CART组(P<0.01)，表明SNHG3通过吸附miR-381上调CART表达效果最显著。
(4)小鼠下丘脑中miR-381、SNHG3、CARTmRNA表达量的检测
qRT-PCR检测miR-381、SNHG3和CART在小鼠体内表达情况，结果显示，miR-381在空白组、生理盐水组、pcDNA3.1-EGFP组和SNHG3组均有表达，如图14A所示，SNHG3组极显著低于其它各组(P<0.01)；SNHG3在各组中的表达量如图14B，结果显示SNHG3组极显著高于空白组、生理盐水组和pcDNA3.1-EGFP组(P<0.001)，表明SNHG3过表达成功；小鼠体内过表达SNHG3，各组CART mRNA相对表达量如图14C，SNHG3组CART表达量极显著高于空白组、生理盐水组和pcDNA3.1-EGFP组(P<0.01)，表明SNHG3可通过特异性吸附miR-381极显著上调CART表达。(注：A：miR-381内源性表达检测；B：lncRNA SNHG3过表达检测；C：CART mRNA相对表达量检测，CK：空白对照组，NS：生理盐水组)。
(5)小鼠下丘脑CART蛋白表达量检测
Westernblot检测结果显示，与空白组、生理盐水组、pcDNA3.1-EGFP组相比，脑室注射SNHG3可显著提高CART蛋白表达(P<0.05，图15)，表明SNHG3能够通过特异性吸附miR-381在转录后水平调控CART表达。(注：A～H为Western Blot检测结果(8个生物学重复)，1：空白对照组，2：生理盐水组，3：pcDNA3.1-EGFP组，4：lncRNA SNHG3组；J：Image J灰度分析结果，CK：空白对照组，NS：生理盐水组)。
技术效果：该牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，从体内外水平筛选出调控CART表达的关键lncRNA，最终明确lncRNA SNHG3可通过特异性吸附miR-381进而显著上调CART蛋白表达。并且进一步完善了调控牛下丘脑CART表达的分子调控网络机制，同时丰富了CART调控牛卵泡发育的机理，为后期通过敲除lncRNAs从而促进卵泡发育、提高排卵率、改善母牛繁殖性能的研究提供理论支持。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (12)
1.牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，其特征在于：具体包括以下步骤：
步骤一：牛下丘脑lncRNAs的筛选与鉴定：
所述lncRNAs的筛选与鉴定，包括lncRNAs的筛选和lncRNAs的鉴定；
所述lncRNAs的鉴定，包括总RNA提取和RT-PCR检测；
所述RT-PCR检测，包括lncRNAs反转录，引物设计和常规PCR反应；
步骤二：牛下丘脑关键lncRNAs-miRNAs特异性结合：
所述lncRNAs-miRNAs特异性结合，包括细胞培养、细胞共转染和双荧光素酶活性检测；
所述细胞培养，包括细胞复苏和细胞铺板；
步骤三：牛下丘脑关键lncRNAs通过特异性吸附miRNAs对CART的表达调控：
所述lncRNAs通过特异性吸附miRNAs对CART的表达调控，包括细胞转染和qRT-PCR检测；
所述qRT-PCR检测，包括miRNA反转录、lncRNAs反转录、引物设计与合成和RT-PCR反应；
步骤四：lncRNA SNHG3对小鼠CART表达的调控：
所述lncRNA SNHG3对小鼠CART表达的调控，包括小鼠侧脑室注射处理、qRT-PCR检测和CART蛋白表达检测。
2.如权利要求1所述的牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，其特征在于：所述牛下丘脑关键lncRNAs的筛选，具体包括：
从miRBase数据库中获取牛和人miR-381、miR-491、miR-377、miR-331-3p、和miR-493的FASTA序列，利用DNAMAN软件进行序列比对，运用StarBase v2.0、NCBI、DIANAtools数据库预测以上5个miRNAs可能结合的lncRNAs。在NCBI数据库中获取相应lncRNAs FASTA序列，并利用RNAhybrid软件预测miRNA-lncRNA结合位点。
3.如权利要求1所述的牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，其特征在于：所述总RNA提取，具体包括：
于液氮中研磨牛下丘脑组织，分别置于装有1mL Trizol的离心管中，震荡混匀，使其充分裂解；4℃12,000rpm离心10min，取上清，室温放置5min；加入200μL氯仿，涡旋振荡15s，4℃12,000rpm离心15min，溶液分为三层，取上层无色有机水相于另一离心管中，静置5min；加入500μL异丙醇，颠倒混匀，静置10min；4℃12,000rpm离心10min，弃上清，加入1mL 75％乙醇，洗涤沉淀；4℃7,500rpm离心5min，弃上清，室温干燥5min，加30μL DEPC水溶解沉淀；利用核酸蛋白定量仪检测RNA纯度及浓度。
4.如权利要求1所述的牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，其特征在于：所述lncRNAs反转录，具体包括：
去除上述所提取的总RNA中残留的基因组DNA，按照表1配制反应体系，轻柔混匀，42℃反应2min，4℃保存；利用上述溶液进行反转录，反应体系见表2；反应条件为：37℃15min，85℃5s，4℃保存；
表1去基因组DNA反应体系
表2反转录反应体系
所述引物设计，具体包括：
在NCBI数据库中分别获取Bos Taurus相对应lncRNAs序列，利用Primer3.0在线设计miRNA-lncRNA包括结合位点大约300bp左右序列的特异性引物，交由上海生工生物工程有限公司合成，具体序列见表3；
表3lncRNAs引物序列
所述常规PCR反应，具体包括：
使用上述引物序列进行PCR扩增，反应体系如表4；配制好后按以下程序进行反应：94℃4min，94℃30s，55～59℃1min，72℃30s，32个循环，72℃5min；利用琼脂糖凝胶电泳(1％，100V/30min)进行检测PCR产物，在凝胶成像仪下观察DNA条带；将目的条带按照DNA凝胶回收试剂盒说明书进行回收，产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序；
表4PCR反应体系
5.如权利要求1所述的牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，其特征在于：所述细胞共转染，具体包括以下步骤：
S1：试验分组：miR-381mimics+TUG1/SNHG3 WT、miR-491mimics+H19/SNHG12/DANCRWT、NC mimic+TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCRWT、miR-381mimics+TUG1/SNHG3 MUT、miR-491mimics+H19/SNHG12/DANCR MUT、NC mimic+TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR MUT、miR-381mimics+pmirGLO、miR-491mimics+pmirGLO、NC mimic+pmirGLO，每组设置3个复孔；
S2：NC mimic与miR-381/491mimics由上海吉玛制药技术有限公司合成。
表8miRNAs mimics序列
S3：取10μL DMEM培养基稀释1ng载体和10pmol miR-381/491mimics，轻轻混匀，室温孵育5min；
S4：取10μL DMEM培养基稀释0.6μL TransIntroTM EL，轻轻混匀，室温孵育5min；
S5：将S4加入S3中，轻柔吹打，室温孵育25min；
S6：吸出96孔板中的培养基，PBS清洗2次，每孔加入200μL RPMI无血清培养基，再加入S4中混合溶液，于细胞培养箱中培养，6h后将培养液更换为完全培养基，继续培养36h。
6.如权利要求1所述的牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，其特征在于：所述细胞复苏，具体包括：
于液氮中取出已冻存的293T细胞，37℃水浴锅中复苏后，加1mL终止液，轻轻吹打混匀后转移至15mL离心管，1,000rpm离心6min，弃上清；加2mL完全培养液重悬细胞，转移至细胞培养瓶，铺匀后，补足培养液至6mL，37℃5％CO2培养箱中进行培养；
所述细胞铺板，具体包括：
当细胞融合度达到80％～90％时，吸去细胞培养液，PBS清洗2次，加入1mL胰酶于37℃裂解3min；随后加入1mL终止液转移至15mL离心管，1,000rpm离心7min，弃上清；在细胞计数仪下进行计数，用完全培养基将细胞浓度稀释为5×105个/mL，均匀接种于96孔板后，补足完全培养液于200μL，37℃5％CO2培养箱中培养24h。
7.如权利要求1所述的牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，其特征在于：所述双荧光素酶活性检测，具体包括：
吸尽96孔板中的细胞培养液，每孔加入100μL报告基因细胞裂解液，室温放置30min；充分裂解后，转移至无菌Ep管中，15,000rpm离心5min，取上清用于检测；海肾荧光素酶检测工作液配制：按照1：100在海肾荧光素酶缓冲液中加入海肾荧光素酶检测底物(100×)；黑色酶标板每孔100μL样品加入100μL萤火虫荧光素酶检测试剂，轻轻混匀，于酶标仪检测萤火虫荧光素酶活性值F(Firely Lueiferase，F)；继续加入100μL海肾荧光素酶检测工作液，吹打混匀，测定海肾荧光素酶活性值R(Renilla Luciferase，R)；以海肾荧光素酶为内参，用F/R值比较样品中目的报告基因的荧光活性。
8.如权利要求1所述的牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，其特征在于：所述细胞转染，具体包括：
第一步：合成miR-381/491mimics和NC mimic序列，以及构建TUG1、SNHG3、H19、SNHG12、DANCR、CART的过表达载体，进行三质粒共转染293T细胞，具体试验分组如下：
(1)miRNAs-CART：NC mimic+CART、miR-381/491mimics+PEX-3、miR-381/491mimics+CART；
(2)lncRNAs-CART：pcDNA3.1-EGFP+CART、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+PEX-3、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+CART；
lncRNAs-miRNAs-CART：pcDNA3.1-EGFP+miR-381/491mimics+CART、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+NCmimic+CART、TUG1/SNHG3/H19/SNHG12/DANCR+miR-381/491mimics+CART；
第二步：按照三种质粒总量：转染试剂(μg:μL)＝1：3的比例转染至293T细胞，每组设置3个重复，具体操作方法同2.2。
9.如权利要求1所述的牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，其特征在于：所述miRNA反转录，具体包括：
根据表9配置去除基因组反应体系，轻柔混匀，于37℃反应30min，继续加入1μL 0.5MEDTA，85℃恒温5min；将上述反应溶液按照表10配制反转录反应体系，反应程序为：37℃1h，85℃5min；所得cDNA稀释10倍后于-20℃保存；
表9miRNA去除基因组反应
表10miRNA反转录体系
所述lncRNAs反转录，具体与步骤一中的lncRNAs反转录相同；
所述引物设计与合成，具体包括：
从NCBI中获得Bos taurus的miR-381/491、CART、TUG1、SNHG3、H19、SNHG12和DANCR的核酸序列，利用Primer 3.0在线设计特异性引物，内参基因分别为U6和β-actin，参照GenBank上提供的序列，由上海生工公司进行合成，具体序列见表11；
表11目的基因qRT-PCR引物序列
所述qRT-PCR反应，具体包括：
利用上述引物进行qRT-PCR反应，按照表12进行CART、TUG1、SNHG3、H19、SNHG12、DANCR反应体系的配制，按照表13进行miRNA反应体系的配制，反应程序为：预变性95℃10s；PCR反应95℃15s，60℃1min，72℃20s，设置40个循环；溶解曲线阶段95℃15s，60℃1min，95℃15s；
表12mRNA qPCR反应体系
表13miRNAs qPCR反应体系
10.如权利要求1所述的牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，其特征在于：所述小鼠侧脑室注射处理，具体包括：
(1)将40只小鼠在22-25℃下适应性饲养7d后，随机分为空白组、生理盐水组、pcDNA3.1-EGFP组及lncRNA SNHG3过表达组；每组10只，自由进食和饮水；
(2)将lncRNA SNHG3过表达质粒稀释至1μg/μL，按照质粒与EntransterTM-in vivo为1：2混匀配制，于室温下静置15min；
(3)将小鼠固定后，利用微量注射器于其头部正中线和两耳连线交点位置左右1.2mm处，以1μL/min的流量分别注射生理盐水、pcDNA3.1-EGFP和lncRNA SNHG3质粒，针深2.5mm；
(4)注射完成后停针5min，利用75％的酒精对其注射部位消毒，待小鼠恢复活力后放回鼠笼正常饲养；
(5)72h后进行眼球采血，将装有全血的Ep管倾斜45°于室温放置2h后，4℃4,000rpm离心10min，使血清析出，取上清，于-80℃保存；
(6)断颈处死小鼠，手术剪剥离大脑，取出下丘脑后于液氮保存。
11.如权利要求1所述的牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，其特征在于：步骤三中的qRT-PCR检测与步骤四中的qRT-PCR检测方法相同。
12.如权利要求1所述的牛下丘脑调控CART表达的非编码RNA及其应用，其特征在于：所述CART蛋白表达检测，具体包括：
(1)下丘脑总蛋白提取：
将WB Lysis Buffer和PMSF蛋白酶抑制剂按100：1配制混匀备用；小鼠下丘脑组织在液氮中充分研磨，每20mg组织加入200μL裂解液，摇晃至充分裂解后，冰上放置5min，14,000rpm离心5min，取上清分装于新离心管中进行后续试验；
(2)蛋白浓度测定(BCA法)：
使用Easy II Protein Quantitative Kit(BCA)试剂盒进行测定。将BSA StandardSolution利用PBS稀释为500μg/mL，并将BCA SolutionA和BCA Solution B充分混匀配制BCA工作液(50：1)；分别取0、1、2、4、8、12、16、20μL稀释后的BSA溶液于96孔板中，用PBS补充至20μL(将标准液浓度依次稀释为0、25、50、100、200、300、400、500μg/mL)；将待测样品利用PBS稀释后取20μL加入样品孔中；随后在各孔中分别加入200μL BCA工作液，37℃温育60min，所有待测样品重复三次；于562nm波长处测定各样品OD值，并绘制标准曲线计算待测样品蛋白浓度；
(3)WesternBlot检测：
电泳装置组装进行检漏后，按照表14分别配制10％、12％分离胶，晃动混匀后，快速加入玻璃板约2/3处，取蒸馏水封胶，室温静置35min，待分离胶充分凝固后弃去蒸馏水；按照表15配制5％浓缩胶，晃动混匀，快速加入玻璃板中，插入1.5mm梳子，室温静置30min，待浓缩胶充分凝固后进行下一步试验；
表14SDS-PAGE分离胶配制
表15SDS-PAGE 5％浓缩胶配制
上样：蛋白浓度测定后，利用蛋白裂解液将其浓度统一为4μg/μL，并加入适量5×蛋白上样缓冲液(蛋白样品：5×蛋白上样缓冲液＝4：1)，充分混匀后于100℃金属浴加热10min，完成后冷却至室温进行电泳；
电泳：加入电泳缓冲液，调节电压至80V，待蛋白样品到达分离胶后将电压调节为120V，当溴酚蓝指示剂迁移至距底部约1cm处，关闭电源；
转膜：根据Marker指示，在转膜液中对目的蛋白条带进行切胶，按照黑板-垫网-滤纸-胶-NC膜-滤纸-垫网-白板顺序进行叠放，放入转膜槽，在预冷的转膜液中进行转膜，条件为：250mA 60min(4℃)；
封闭：将NC膜置于5％脱脂奶粉中封闭1h；
一抗孵育：去除封闭液，加入一抗稀释液(β-actin一抗：封闭液＝1：2,500，CART一抗：封闭液＝1：500)，4℃过夜后，用1×TBST洗膜3次，每次5min；
二抗孵育：加入二抗稀释液(β-actin二抗：1×TBST＝1:5,000，CART二抗：1×TBST＝1：5,000)，室温摇床1h后，用1×TBST洗膜3次，每次5min；
显影：将eECL发光液试剂盒中A液：B液＝1：1的比例混匀后避光保存；取适量发光液均匀涂至NC膜上，避光显色5min，放置蛋白凝胶成像仪中进行检测。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211642014.4A CN115927338A (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 牛下丘脑调控cart表达的非编码rna及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211642014.4A CN115927338A (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 牛下丘脑调控cart表达的非编码rna及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115927338A true CN115927338A (zh) | 2023-04-07 |
Family
ID=86557316
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211642014.4A Pending CN115927338A (zh) | 2022-12-20 | 2022-12-20 | 牛下丘脑调控cart表达的非编码rna及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115927338A (zh) |
-
2022
- 2022-12-20 CN CN202211642014.4A patent/CN115927338A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cai et al. | Identification and characterization of human ovary-derived circular RNAs and their potential roles in ovarian aging | |
| CN110628766B (zh) | 与羊骨骼肌发育相关的lncRNA编码基因及其应用 | |
| CN110129428B (zh) | miR-26a调节生殖细胞凋亡的应用 | |
| US20220243270A1 (en) | Application of circular rna in preparing drug for treating systemic lupus erythematosus | |
| CN108753776A (zh) | 一种参与鸡肌肉生长发育的环状RNA circGHR及检测引物 | |
| Gu et al. | Integrated analysis of miRNA and mRNA expression profiles in 2-, 6-, and 12-month-old Small Tail Han Sheep ovaries reveals that oar-miR-432 downregulates RPS6KA1 expression | |
| CN110511903A (zh) | 一种miR-21-5p靶向Smad7调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究方法及其应用 | |
| CN113355434B (zh) | 一种与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的标志物Lnc-482286及其应用 | |
| Yuan et al. | Identification of target genes for adenohypophysis-prefer miR-7 and miR-375 in cattle | |
| CN111484993B (zh) | 长链非编码rna il21-as1及其用途 | |
| CN114959057B (zh) | 与猪骨骼肌卫星细胞增殖相关的circRNA及其应用 | |
| CN115927338A (zh) | 牛下丘脑调控cart表达的非编码rna及其应用 | |
| CN102260672B (zh) | 抑制猪生长抑素受体2基因表达的siRNA | |
| CN110564846B (zh) | 作为男性骨质疏松症诊断用的tyw3 | |
| Zongsheng et al. | Effect of Inhibin-βA Subunit Gene on Reproductive Performance of Kazakh Sheep in Non-breeding Season | |
| CN108239671B (zh) | 一种猪lncRNA的分离和其特异表达启动子鉴定 | |
| Schennink et al. | A novel first exon directs hormone-sensitive transcription of the pig prolactin receptor | |
| CN112011628A (zh) | 一种与湖羊肌肉细胞增殖相关的LncRNA标志物及其检测引物和应用 | |
| CN113621701A (zh) | 雌激素受体相关受体γ（ESRRG）变异型转录本在垂体腺瘤辅助诊断中的应用 | |
| Huang et al. | Xie | |
| Lenasi et al. | Functional study of the equine β-casein and κ-casein gene promoters | |
| Ni et al. | Expression characterization and transcription regulation analysis of porcine Yip1 domain family member 3 gene | |
| CN106434912B (zh) | 一种与猪产仔数相关的microRNA标记应用 | |
| CN114774524A (zh) | miR-491、miR-381在牛下丘脑CART转录后表达调控中的应用 | |
| CN108300763A (zh) | 一种筛选miR-101-3P靶基因的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |