CN117683815A - Ndufa4l2基因在调控猪肌纤维类型转化上的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了NDUFA4L2基因在调控猪肌纤维类型转化上的应用及调控调控猪肌纤维类型转化的方法，该方法包括在猪骨骼肌卫星细胞过表达或干扰NDUFA4L2基因表达。由此，发现在猪肌肉中受m6A甲基化修饰的靶基因NDUFA4L2，该基因在猪慢肌中发生m6A修饰水平比快肌高，基因的表达量也高，是影响慢肌纤维和快肌纤维肉质差异的原因；在猪骨骼肌卫星细胞中干扰该基因的表达，抑制细胞的分化，为改变肌肉横截面积提供新的方法；再者，过表达NDUFA4L2使肌纤维类型向慢速氧化性肌纤维转化，从而提高猪肉中红肉的比例，为提升猪肉的宰后品质提供了新的方法。通过在饲料中添加甜菜碱来调控m6A对基因的修饰水平，从而调控NDUFA4L2基因的表达，达到促进红肉的比例，为提升红肉比例提供新的思路。

Description

NDUFA4L2基因在调控猪肌纤维类型转化上的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种NDUFA4L2基因在调控猪肌纤维类型转化上的应用。
背景技术
m6A甲基化是一种RNA修饰，它是6-甲基腺嘌呤(m6A)的一种形式，即在RNA分子中的腺嘌呤碱基的第6位氮原子上添加了一个甲基基团。这种修饰通常发生在mRNA的3'非翻译区(UTR)以及终止密码子附近的序列，这些位点在不同生物之间保守度较高。在哺乳动物中，大约25％的mRNA分子都包含m6A甲基化修饰，平均每个转录本上有1-3个修饰位点。m6A甲基化在多个生物过程中都发挥着重要的调控作用。大量研究表明，m6A甲基化在多能性干细胞的分化过程中扮演着关键的调控角色。
骨骼肌是生物体内最具活力和可塑性的组织之一，由多种成分构成，包括水、蛋白质、无机盐、脂肪和碳水化合物等，其总质量大约占据体重的40％。骨骼肌组织在机体蛋白质的构成中占据了50％至75％的比例。它由大量的肌纤维组成，肌肉的收缩性能和代谢特性与肌纤维类型的组成密切相关。骨骼肌纤维类型主要分为两大类，即Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅱ型可以进一步细分为Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb型。富含Ⅰ型肌纤维的肌肉，例如比目鱼肌，通常用于进行持续性的、较为缓慢的收缩活动。而含有丰富Ⅱ型肌纤维的肌肉，如趾长伸肌，通常执行激烈且迅速的收缩活动。成年哺乳动物通常具有四种主要的肌纤维类型，即Ⅰ、Ⅱa、Ⅱx和Ⅱb型，在基因中MYHCⅠ表示慢肌(慢速氧化型肌纤维)基因，MYHCⅡa、MYHCⅡb、MYHCⅡx表示快肌(快速酵解型肌纤维)基因。这些肌纤维类型的比例构成是影响猪肉品质的重要因素之一。不同肌纤维类型的代谢特性存在明显的差异，因此在宰后的肌肉代谢过程中也会表现出不同的特征。实际上，当肌肉中主要以Ⅰ型肌纤维(慢速氧化型肌纤维)为主时，宰后的肉质通常更加出色，简称“红肉”。
NDUFA4L2(NADH dehydrogenase[ubiquinone]1alpha subcomplex,4-like 2)是线粒体有氧呼吸电子传递链酶复合体I(NADH脱氢酶复合体)的一个亚基成分，具有调节复合体I活性的功能，能够影响细胞氧化磷酸化过程，进而影响细胞能量供应。大量研究表明，NDUFA4L2在癌症中扮演着重要的角色。在缺氧条件下，HIF-1α可以诱导NDUFA4L2活化，从而调控非小细胞肺癌细胞系的生存、增殖和迁移。另外，干扰NDUFA4L2的表达可以抑制肾透明细胞癌细胞系的增殖和集落形成。然而，目前关于NDUFA4L2对骨骼肌纤维类型转化的研究在人、小鼠和家畜等皆尚无报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种NDUFA4L2基因在调控猪肌纤维类型转化上的应用，具体是通过调控NDUFA4L2基因表达来调控猪肌纤维类型的转化，为猪等动物的肉质选择提供新的思路。
根据本发明的第一个方面，提供了一种NDUFA4L2基因在调控猪肌纤维类型转化上的应用，该应用是通过调控NDUFA4L2基因的表达来实现对猪肌纤维类型转化的调控；所述的调控NDUFA4L2基因的表达可通过抑制NDUFA4L2基因表达或促进NDUFA4L2基因表达来实现。由此，通过调控NDUFA4L2基因的表达量，来实现对猪肌纤维类型转化的调控，简单高效。
在某些实施方式中，所述的调控猪肌纤维类型转化是当需要促进慢速氧化型肌纤维形成而抑制快速酵解型肌纤维形成时或需要促进快速酵解型肌纤维向慢速氧化型肌纤维转化时，则需要促进NDUFA4L2基因表达；反之则需要抑制NDUFA4L2基因表达。
在某些实施方式中，所述的抑制NDUFA4L2基因表达可通过向细胞中转染抗NDUFA4L2的干扰RNA或降低细胞m6A甲基化修饰水平；所述的促进NDUFA4L2基因表达可通过向细胞中转染NDUFA4L2过表达载体或促进细胞m6A甲基化修饰水平。
在某些实施方式中，所述的抗NDUFA4L2的干扰RNA序列如SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示。
在某些实施方式中，所述的降低细胞m6A甲基化修饰水平可通过向细胞培养基中添加环亮氨酸或抑制METTL3基因表达或抑制IGF2BP1基因表达来实现；所述的促进细胞m6A甲基化修饰水平可通过向细胞培养基中添加甜菜碱或促进METTL3基因表达来实现。
根据本发明的第二个方面，提供了一种调控猪肌纤维类型转化的方法，该方法可通过调控NDUFA4L2基因的表达来实现对猪肌纤维类型的转化调控；所述的调控NDUFA4L2基因的表达可通过抑制NDUFA4L2基因表达或促进NDUFA4L2基因表达来实现。由此，可通过调控NDUFA4L2基因的表达量，来实现对猪肌纤维类型转化的调控。
在某些实施方式中，可通过向猪肌肉组织或细胞中中注射或转染抗NDUFA4L2的小干扰RNA si-NDUFA4L2或抗METTL3的小干扰RNA si-METTL3或抗IGF2BP1的小干扰RNA si-IGF2BP1来抑制NDUFA4L2基因的表达，从而促进快速酵解型肌纤维形成，抑制慢速氧化型肌纤维形成或促进慢速氧化型肌纤维向快速酵解型肌纤维转化；所述的si-NDUFA4L2序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；所述的si-METTL3序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；所述的si-IGF2BP1序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；
或通过向猪饲料中添加环亮氨酸或者向猪细胞培养液中添加环亮氨酸来抑制NDUFA4L2基因的表达，从而来促进快速酵解型肌纤维形成，抑制慢速氧化型肌纤维形成或促进慢速氧化型肌纤维向快速酵解型肌纤维转化。
在某些实施方式中，可通过向猪肌肉组织或细胞中中注射或转染NDUFA4L2过表达载体或METTL3过表达载体或IGF2BP1过表达载体来促进NDUFA4L2基因的表达，从而促进慢速氧化型肌纤维形成，抑制快速酵解型肌纤维形成或促进快速酵解型肌纤维向慢速氧化型肌纤维转化；
或通过向猪饲料中添加甜菜碱或者向猪细胞培养液中添加甜菜碱来促进NDUFA4L2基因的表达，从而来促进慢速氧化型肌纤维形成，抑制快速酵解型肌纤维形成或促进快速酵解型肌纤维向慢速氧化型肌纤维转化。
根据本发明的第三个方面，提供了抑制NDUFA4L2基因表达在抑制骨骼肌的成肌分化上的应用，该应用是通过干扰NDUFA4L2基因表达来实现的，所述干扰NDUFA4L2基因表达的si-NDUFA4L2序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示。由于抑制了骨骼肌的成肌分化，而会使得肌纤维数量变少，而最终导致肌肉横截面积变小，由此，可以通过抑制骨骼肌的成肌分化来改变肌肉的横截面积，为改变肌肉横截面积提供新的方法。
根据本发明的第四个方面，提供了一种含有可调控NDUFA4L2基因表达的试剂盒/核酸分子/重组蛋白/重组载体/产品在调控猪肌纤维类型转化上的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明通过在猪骨骼肌肌细胞中干扰NDUFA4L2表达和过表达NDUFA4L2，来研究NDUFA4L2对肌细胞中与肌纤维类型相关的基因及其蛋白表达的影响，发现在猪骨骼肌的发育过程中，存在一个关键的靶标基因NDUFA4L2，它受到METTL3甲基转移酶的催化，发生m6A修饰。这种修饰促进了NDUFA4L2基因的表达，增强了mRNA的稳定性，并最终在猪骨骼肌纤维类型的转化过程中发挥了调控作用。因此，可以通过过表达NDUFA4L2基因，促进慢肌标志基因的表达和抑制快肌标志基因的表达，诱导PSC分化为慢速氧化型肌纤维，从而提高骨骼肌中慢肌纤维的含量，为提高猪的宰后品质提供一种新的方法和靶点，以及新的研究方向。快、慢肌基因及其蛋白的表达会直接影响肌纤维类型的比例，因此可通过过表达或干扰NDUFA4L2基因的方式来调控肌纤维类型的转化，为进一步调控动物的肉质，为改善和培育动物肌肉品质提供基础和新思路。
2、本发明可通过直接或间接促进或抑制NDUFA4L2表达，来调控动物(猪)肌肉组织中糖酵解过程，进而来调控肌纤维类型转化，该方法可高效的改善猪的肌肉类型，可提高猪的宰后肉品质，提高经济效益。
3、在猪骨骼肌卫星细胞中干扰NDUFA4L2表达，可抑制细胞的分化，为改变肌肉横截面积提供新的方法。
附图说明
图1为qPCR技术检测过表达NDUFA4L2基因后猪骨骼肌肌纤维类型相关基因的表达量的结果图：(A)EDL和SOL组织中的m6A修饰和普通转录组图谱；其中(B)图中的pcDNA3.1表示空白对照质粒，pcDNA3.1-NDFA4L2表示猪NDFA4L2基因过表达载体，MYHCⅠ表示慢肌基因表达结果，MYHCⅡa、MYHCⅡb、MYHCⅡx表示快肌基因表达结果，ns表示无显著差异，*表示差异显著，**、***和****表示差异极显著；
图2为Western blot技术检测过表达NDFA4L2基因后猪骨骼肌纤维类型相关基因的标志蛋白的表达结果图：(A)Western blot检测过表达NDUFA4L2后，MYHC各亚型蛋白的条带；(B)使用ImageJ软件量化Western blot条带灰度值，统计分析后的相对表达量结果：其中pcDNA3.1表示空白对照质粒，pcDNA3.1-NDUFA4L2表示猪NDUFA4L2基因过表达载体，MYHCⅠ表示慢肌基因蛋白表达结果，MYHCⅡa、MYHCⅡb、MYHCⅡx表示快肌基因蛋白表达结果，ns表示无显著差异，*表示差异显著，**与***表示差异极显著；
图3为qPCR检测干扰NDUFA4L2基因后猪肌纤维类型标志基因mRNA表达量的结果图：其中，si-NC表示空白对照siRNA，si-NDFA4L2表示猪干扰siRNA，ns表示无显著差异，*表示差异显著，**与***表示差异极显著；
图4为Western blot技术检测干扰NDUFA4L2基因后对猪骨骼肌肌纤维类型相关的蛋白表达结果图：(A)为Western blot检测抑制NDUFA4L2的表达后，MYHC各亚型蛋白的条带；(B)为使用ImageJ软件量化Western blot条带灰度值，统计分析后的相对表达量结果：其中，si-NC表示空白对照siRNA，si-NDFA4L2表示猪干扰siRNA，ns表示无显著差异，*表示差异显著；
图5为qPCR检测干扰NDUFA4L2基因后猪肌细胞分化标志基因mRNA表达量的结果图：其中si-NC表示空白对照siRNA，si-NDFA4L2表示猪干扰siRNA，ns表示无显著差异，*表示差异显著；
图6为Western blot技术检测siRNA干扰NDUFA4L2基因后对猪骨骼肌成肌分化的标志蛋白的表达结果图：(A)为Western blot检测干扰NDUFA4L2后，MYOG、MYOD和MYHC蛋白的条带；(B)为使用ImageJ软件量化Western blot条带灰度值，统计分析后的相对表达量结果：其中，si-NC表示空白对照siRNA，si-NDFA4L2表示猪干扰siRNA，ns表示无显著差异，*表示差异显著，**表示差异极显著；
图7为分别使用含甜菜碱或环亮氨酸的培养基培养PSC，提高或降低细胞整体m6A甲基化修饰水平后，利用qPCR技术检测NDUFA4L2的mRNA表达量的结果图：其中，(A)为甜菜碱处理PSC对NDUFA4L2基因表达量的影响；(B)为环亮氨酸处理PSC对NDUFA4L2基因表达量的影响，*表示差异显著，**表示差异极显著；
图8为qPCR技术检测干扰和过表达METTL3后，NDUFA4L2的mRNA表达量的结果图，其中，(A)为PSC上干扰METTL3后，检测NDUFA4L2的表达情况，(B)为PSC上过表达METTL3后，检测NDUFA4L2的表达情况，*表示差异显著，**和***表示差异极显著；
图9为验证METTL3催化了NDUFA4L2发生m6A修饰，利用RIP技术获取METTL3蛋白富集结合的RNA片段后，通过qPCR实验检测富集片段中NDUFA4L2的丰度的结果图：其中lgG表示空白对照免疫球蛋白G，****表示差异极显著；
图10为qPCR实验检测抑制IGF2BP1的表达对NDUFA4L2的mRNA表达量变化的结果图：PSC上干扰IGF2BP1后，检测NDUFA4L2的表达情况:其中，si-NC表示空白对照siRNA，si-IGF2BP1表示干扰siRNA，*表示差异显著，**、***和****表示差异极显著；
图11为NDUFA4L2基因调控猪肌纤维类型转化的原理图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一NDUFA4L2的获得
引物设计：在ensemble网站上搜索猪NDUFA4L2基因(ID:ENSSSCG00000027621)，筛选出预测的转录本(ID:ENSSSCT00000023219.4),获取其CDS序列，利用NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的引物设计功能设计全长引物，
表1猪NDUFA4L2的扩增引物
注：下划线部分为核酸限制性内切酶位点。
扩增NDUFA4L2基因全长产物，其序列如SEQ ID NO:3所示：
ATGGCAGGAACGACCCTTGGAGCCCGCTTCTATCGGCAGATCAAGAGACATCCCGGGCTCATCCCGATGATTGGCTTCATTGGCCTGGGCATGGGCAGCGCTGCGCTCTACTTGCTGCGACTCGCCCTACGCAGCCCCGACGTCTGCTGGGACAGAAAGAACAACCCAGAGCCCTGGAACCGCCTGAGCCCCAACGACCAATACAAGTTCCTTGCAGTTTCCACTGACTATAAGAAGCTGAAGAAGGACCGGCCAGACTTCTAA
使用HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wiper)(艾科瑞生物)将猪比目鱼肌中提取出来的RNA反转录为cDNA，将原液稀释10倍后作为扩增模板，用表1中引物，PCR反应体系见表2：
表2 PCR反应体系
反应条件如表3所示：
表3 PCR反应条件
实施例二NDUFA4L2过表达载体的构建
(1)分别用相同的限制性内切酶(KpnⅠ和XbaⅠ)酶切NDUFA4L2全长片段和真核基因表达载体pcDNA3.1，酶切体系见表4:
表4pcDNA3.1双酶切反应体系
注：震荡混匀，37℃酶切2h，然后凝胶电泳检测酶切产物，胶回收合格的酶切产物。
(2)使用T4连接酶(广州昂科生物科技有限公司)连接酶切后的目的片段和pcDNA3.1，反应体系如表5:
表5酶切体系
注：混匀，22℃孵育20min。
(3)进行重组连接产物转化，具体操作如下：
将Trans10感受态细胞从-80℃中取出，置于冰上融化。
1.吸取50μL感受态细胞至1.5mL离心管中。
2.吸取5μL酶连产物加至上述管中，轻轻吹打，冰上静置30min。
3.静置结束后，将1.5mL离心管放入水浴锅42℃热激30sec。
4.取出于冰上静置2min。
5.向管中加入500μL LB液体培养基，吹打混匀后置于恒温空气摇床中，37℃，200rpm，培养1h。
6.吸取50μL培养后的菌液均匀滴加在LA固体培养基表面，用消烧过的接种环将菌液均匀捈开，培养皿正放在恒温培养箱中，培养30min后倒扣培养皿继续培养14-16h。
7.用10μL枪头小心挑出单克隆菌落，将挑出的菌落连同枪头一起放入1.5mL离心管中，每管加入500μL的LA液体培养基，恒温空气摇床中，37℃，220rpm，培养6小时，至培养基呈浑浊。
8.将菌液转移至50mL离心管中，每管中加入20mL LA液体培养基，37℃，220rpm，培养过夜。
9.吸取2μL培养后的菌液，用目的片段引物进行PCR扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测载体是否构建成功。
10.将PCR鉴定为阳性的菌液送至深圳华大基因股份有限公司进行测序。
挑选测序正确的菌液进行无内毒素质粒的抽提，采用Endo-free Plasmid MiniKitⅡ试剂盒(Omega)抽提，最后测浓度并记录，便可获得猪的NDUFA4L2过表达载体，-20℃保存备用。
实施例三干扰片段合成
本研究所用的NDUFA4L2、METTL3和si-IGF2BP1小干扰RNA片段均委托苏州吉玛基因股份有限公司设计合成，小干扰RNA序列见表6:
表6干扰片段序列
实施例四NDUFA4L2过表达载体对肌纤维类型转化的影响
用实施例二中构建获得的NDUFA4L2过表达载体(质粒)转染到猪骨骼肌卫星细胞中，对转染后的细胞进行qPCR验证及蛋白表达验证，具体操作如下：
1、qPCR验证
(1)细胞RNA提取
1.每孔用0.5mL DPBS轻柔润洗细胞两遍后，向孔中加入0.5mL Trizol试剂，用1mL移液枪反复吹打贴壁细胞，使其快速脱落，然后将细胞试剂混悬液转移至1.5mL离心管，充分混匀后室温静置2min，使细胞充分裂解。
2.向上一步的离心管中加入100uL三氯甲烷，充分混匀后室温静置5min。
3.将离心管放入提前预冷的离心机中，4℃，13000rpm离心15min。
4.离心后液体分为三层，用200μL移液枪小心将上层水相吸出，转移至新的1.5mL离心管中，向管中加入等体积的异丙醇，上下轻轻颠倒10次，充分混匀，冰上静置10min。
5.将离心管放入提前预冷的离心机中，4℃，13000rpm离心15min。
6.此时RNA沉淀于管底，呈白色小圆点状，小心吸弃上清。
7.向管中加入1mL 75％乙醇溶液，轻轻摇晃离心管，清洗沉淀，使沉淀悬浮。
8.将离心管放入提前预冷的离心机中，4℃，7500rpm离心15min。
9.小心吸弃上清，重复步骤7再次清洗沉淀。
10.吸弃上清，通风橱内晾干，晾干后的RNA变为透明。
11.根据RNA沉淀物的量向离心管内加入15-25uL DEPC水溶解RNA，反复吹打混匀。
12.利用NanoDrop 2000DNA/RNA浓度测定仪测定所提取的RNA的浓度。
(2)cDNA的制备
使用Evo M-MLV反转录试剂盒(艾科瑞生物)合成cDNA，操作步骤如下：
1.去除基因组DNA。按照下表配制好反应液，进行基因组DNA去除反应。
表7基因组DNA去除反应体系
注：反应条件：42℃2min；4℃。
2.反转录反应。配制反转录反应液，置于PCR仪进行变性、退火反应，将反转录后得到的cDNA保存于-20℃。
(3)实时荧光定量PCR
qPCR采用QuantStudioTM5实时荧光定量PCR系统进行。反应体系及反应条件如表8和表9所示：
表8 qPCR反应体系
反应条件如表9所示：
表9 qPCR反应条件
2、数据分析
实验利用Quant StudioTM 5Flex实时荧光定量PCR系统进行，每次实验准备三个样本重复和三个技术重复，反应结束后确认溶解曲线及扩增曲线是否准确无误，使用方法，以β-Actin作为内参基因，计算各样品的/>、标准误差以及实验组与对照之间的差异性。
蛋白表达验证，取转染后的六孔细胞培养板样品，具体操作如下：
(1)细胞蛋白提取
1.以六孔细胞培养板为例，吸弃孔中培养基，用DPBS清洗两遍。
2.吸净液体，每孔加入200μL含有1％PMSF的RIPA裂解液，用细胞刮将贴壁细胞刮下，用移液枪转移至1.5mL离心管中，冰上孵育10min。
3.4℃，12000rpm，离心7min。
4.轻轻吸取上清，分装后，于-80℃保存。
(2)PAGE凝胶电泳
1.润洗称量器皿。
配制电泳缓冲液以及转膜缓冲液，如表10和表11所示：
表10电泳缓冲液体系
表11转膜缓冲液体系
注：甲醇在使用前15min加入。
2.清洗电泳槽和电极夹板，然后用ddH2O润洗，将制好的凝胶装入电极夹板，向板槽内加入ddH2O验漏10min，确定不漏后将水倒出，加入电泳缓冲液。
3.向每个加样孔中加入25μL样品，向两边最外孔中加入5μL marker，没有点样的孔用5μL蛋白上样缓冲液补齐。
4.恒压150V，电泳70min。
(3)转膜
1.转膜前，将海绵、滤纸、转膜板、镊子和切胶板置于转膜缓冲液中浸泡10min，裁剪好的PVDF膜置于甲醇中浸泡10min。
2.将凝胶的玻璃板拆开，根据蛋白Marker指示的大小，切取目的蛋白的凝胶，将凝胶放入转膜液中。
3.按照三明治法，打开转膜板，将黑色一面平行于桌面水平放置，在黑色板子上垫一层海绵、两层滤纸，然后将包含目的蛋白的凝胶放在滤纸上，再将PVDF膜轻轻覆盖在凝胶上，轻柔按压驱除气泡，然后分别放上一层滤纸，一层海绵，轻轻合上夹子，装入转膜槽中，向槽内灌满转膜缓冲液。
4.恒流200mA，电泳时间根据目的蛋白分子量大小而定。
(4)抗原抗体免疫反应
1.转膜结束后，将膜小心取出放入孵育盒，加入适量1×TBS洗涤3次，每次5min。
2.倒净TBS，加入适量6％脱脂奶粉(1×TBST配制)，置于37℃恒温空气摇床中，40rpm，封闭3h。
3.封闭结束后，使用1×TBS洗涤3次，每次10min。
4.一抗孵育过夜。
5.孵育结束，回收抗体，使用1×TBST清洗3次，1×TBS清洗1次，每次10min。
6.二抗孵育1h。
7.倒净二抗，使用1×TBST清洗3次，1×TBS清洗1次，每次10min。
(5)显影
1.配制3mL ECL化学发光液(Millipore)：A液和B液等体积混合(各1.5mL)，避光操作。
2.避光情况下，小心将膜上的液体用滤纸吸干，然后将膜充分浸泡于ECL发光液中，沾有发光液的膜放于化学发光成像仪中成像。
3.用ImageJ软件量化灰度值，统计数据。
3、结果分析
将NDUFA4L2过表达载体分别转染到PSC猪骨骼肌卫星细胞(以下简称“PSC细胞”)中，利用qPCR、Western blot蛋白检测NDUFA4L2过表达载体对肌纤维类型转化的影响，结果如下(结果图中MYHCⅠ为慢肌基因表达结果，MYHCⅡa、MYHCⅡb、MYHCⅡx为快肌基因表达结果)：
如图1所示，过表达NDUFA4L2显著增加了猪骨骼肌卫星细胞慢肌基因的mRNA的表达量，且快肌基因的mRNA表达量得到显著降低。
如图2所示，过表达NDUFA4L2后，显著增加了猪骨骼肌卫星细胞慢肌相关基因蛋白的表达量，并抑制了快肌相关基因蛋白的表达量。
上述结果表明过表达NDUFA4L2基因能够促进慢肌纤维表达，抑制快肌纤维表达，从而促进慢速氧化型肌纤维形成，抑制快速酵解型肌纤维形成；或促进快速酵解型肌纤维向慢速氧化型肌纤维转变。
实施例五干扰NDUFA4L2对肌纤维类型转化标志基因的影响
此实施例的qPCR和Western blot实验操作与实施例四相同。
将实施例三表6中si-NDUFA4L2干扰片段分别转染到PSC猪骨骼肌卫星细胞中，利用qPCR、Western blot蛋白检测干扰对肌纤维类型转化的影响，结果如下(结果图中MYHCⅠ为慢肌基因表达结果，MYHCⅡa、MYHCⅡb、MYHCⅡx为快肌基因表达结果)：
如图3所示，干扰NDUFA4L2显著促进了快肌标志基因MYHCⅡb mRNA的表达量，抑制了慢肌标志基因MYHCⅠ的mRNA表达量。
如图4所示，干扰NDUFA4L2显著降低了慢肌标志基因MYHCⅠ蛋白的表达量，促进了快肌标志基因MYHCⅡb蛋白的表达量。
上述结果表明抑制NDUFA4L2基因表达能够促进快肌纤维表达，抑制慢肌纤维表达，从而促进快速酵解型肌纤维形成，抑制慢速氧化型肌纤维形成；或促进慢速氧化型肌纤维向快速酵解型肌纤维转变。
实施例六干扰NDUFA4L2对猪骨骼肌成肌分化的影响
此实施例的qPCR和Western blot实验操作与实施例四相同。
将实施例三表6中si-NDUFA4L2转染至PSC猪骨骼肌卫星细胞并诱导分化，收取细胞样品提取RNA，通过qPCR实验检测猪骨骼肌分化标志基因表达量的变化。同时将si-NDUFA4L2转染至PSC细胞并诱导分化，收取细胞提取蛋白样品，Westernblot实验检测猪骨骼肌分化标志蛋白表达量的变化。结果如下(结果图中的MYOD代表肌分化决定因子1、MYOG代表肌细胞生成素、MYHC代表肌球重链蛋白)：
如图5所示，干扰NDUFA4L2后，MYHC蛋白的mRNA表达量显著下降，表明抑制NDUFA4L2基因表达能够抑制骨骼肌的成肌分化。由于抑制了骨骼肌的成肌分化，而会使得肌纤维数量变少，而最终导致肌肉横截面积变小，由此，可以通过抑制骨骼肌的成肌分化来改变肌肉的横截面积，为改变肌肉横截面积提供新的方法。
如图6所示，干扰NDUFA4L2的蛋白表达后，MYHC蛋白的表达量明显降低，可以进一步的证明抑制NDUFA4L2基因表达能够抑制骨骼肌的成肌分化。
上述结果表明抑制NDUFA4L2基因表达不仅能够促进快肌纤维表达，抑制慢肌纤维表达，还可以抑制骨骼肌的成肌分化。
实施例七m6A修饰与NDUFA4L2的表达相关性研究
分别使用含甜菜碱或环亮氨酸的培养基培养PSC猪骨骼肌卫星细胞，提高或降低细胞整体m6A甲基化修饰水平后(其中，甜菜碱可提高细胞整体m6A甲基化修饰水平；环亮氨酸可降低细胞整体m6A甲基化修饰水平)，利用qPCR技术检测相应PSC细胞中NDUFA4L2的mRNA表达量。此实施例的qPCR实验操作与实施例四相同。
1.将甜菜碱和环亮氨酸粉末溶于无菌水中，配制成浓度为1mM的药液，分装后保存于-20℃。
2.以六孔板为例，将生长状态良好的细胞接种至六孔细胞培养板，于37℃细胞培养箱中培养。
3.待细胞密度长至70％-80％时，更换新鲜增殖培养基，向处理组孔中加入40μL药液(最终浓度为20μM)，向对照组孔中加入等体积无菌水，于37℃细胞培养箱中继续培养。
4.待细胞即将长满时，更换为新鲜分化培养基，处理组孔中分别加入含有浓度为10μM的环亮氨酸或10μM的甜菜碱的分化培养基，向处理组孔中加入40μL药液(最终浓度为20μM)，向对照组孔中加入等体积无菌水，于37℃细胞培养箱中继续培养。
5.诱导分化2天后，更换新的含有相同药物浓度的分化培养基，于37℃细胞培养箱中继续培养1天。
6.收取细胞样品，提取蛋白或RNA。
结果如图7所示，当PSC整体m6A修饰水平上升时，NDUFA4L2表达量随之上升；当PSC整体m6A修饰水平下降时，NDUFA4L2表达量随之下降。说明NDUFA4L2基因是受m6A甲基化修饰的靶基因，m6A修饰水平与NDUFA4L2基因表达量正相关。
实施例八METTL3介导NDUFA4L2的m6A修饰发生
本实验首先分别将si-METTL3(序列如表6中所示)和pcDNA3.1-METTL3过表达载体(METTL3过表达载体构建方式与实施例一和二中NDUFA4L2过表达载体构建方法相同：即将METTL基因全长序列插入pcDNA3.1载体中构建成新的重组pcDNA3.1-METTL3过表达载体)转染至PSC，干扰和过表达METTL3后，通过qPCR实验检测NDUFA4L2的mRNA表达量变化。此实施例中的qPCR实验操作与上述实施例四相同。
1.将细胞接种于六孔板细胞培养板中，于37℃细胞培养箱中培养，待细胞的密度达到70％-80％时进行转染。
2.每孔转染体系：A液为125μL Opti-MEM培养基中加入5μL Lipofectamine 3000，混合均匀；B液为125μL Opti-MEM培养基中加入1ugpcDNA3.1-METTL3过表达载体质粒或pcDNA3.1空载体或者si-METTL3干扰片段或NC-siRNA，混匀，静置5min。
3.将上一步中的A液和B液混合，室温静置孵育15min。
4.转染试剂孵育期间，将待转染细胞取出，吸弃原来的培养基，更换新鲜增殖培养基。
5.孵育完成后，每孔加入250μL转染试剂，摇晃混匀，于37℃细胞培养箱中培养，6小时后根据细胞密度大小决定所更换培养基，若细胞密度大于80％，则更换为分化培养基诱导分化，否则更换为新鲜增殖基培养至80％以上再诱导分化，结果如图8所示：
如图8(A)所示，干扰METTL3显著降低了NDUFA4L2的表达。
如图8(B)所示，过表达METTL3显著增加了NDUFA4L2的表达。
由于METTL3基因的表达量，反应了细胞的m6A修饰水平，当细胞中METTL3基因的表达量高时，则PSC细胞的m6A甲基化修饰水平高，反之则低。以上结果也表明当PSC整体m6A修饰水平上升时，NDUFA4L2表达量随之上升，当PSC整体m6A修饰水平下降时，NDUFA4L2表达量随之下降，进一步表明m6A修饰能够促进NDUFA4L2的表达，对其起正向调控作用。
实施例九METTL3与NDUFA4L2的结合作用
为进一步验证是METTL3催化了NDUFA4L2发生m6A修饰，从而促进了NDUFA4L2的表达，采用RIP试验验证METTL3与NDUFA4L2的结合关系。
(1)裂解产物的配制
1.收取诱导分化3-5天的骨骼肌卫星细胞，根据所得细胞量(以10cm培养皿为例)，配制适量的全RIP裂解缓冲液。向200μL RIP裂解缓冲液，加入0.5μL蛋白酶抑制剂混合物和0.25μL核糖核酸酶抑制剂，置于冰上待用。
2.用10mL预冷PBS，洗涤10cm培养皿上的细胞两次。
3.加入10mL预冷PBS。从每个烧瓶或平板上刮下细胞，转移到一个离心管中。
4.在4℃下，1500rpm速度离心5分钟，弃去上清液，收集细胞。
5.将细胞沉淀重悬于与等体积的完全RIP裂解缓冲液中。用移液管吹打混合，直至细胞在混合液分散均匀。将裂解产物置于冰上孵育5分钟。每种裂解产物取约200μL，置于不含核酸酶的微量离心管中，贮藏于-80℃。
(2)用于免疫沉淀的磁珠配制
1.通过颠倒微量离心管或移液管吹打，重悬磁珠至完全分散均匀重悬。
2.标记用于免疫沉淀实验的适当数量微量离心管。
3.量取50μL磁珠悬浮液，转移到每个离心管中。
4.在每个离心管中加入0.5mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。
5.把离心管置于磁力架上，磁珠被磁力架吸附在管壁后，弃去上清液。
6.从磁力架中取出离心管。在每个离心管中加入0.5mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。
7.把离心管放在磁力架中，弃去上清液。
8.从磁力架中取出离心管，使磁珠重悬于100μL RIP洗涤缓冲液中。在离心管中加入约5μg目的抗体。
9.室温下，旋转培养30分钟。
10.离心管短暂离心，放在磁力架中，除去上清液。
11.从磁力架中取出离心管。在每个离心管中加入0.5mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。
12.把离心管放在磁力架中，弃去上清液。
13.重复第11-12步，再进行一次洗涤。
14.从磁力架中取出离心管。在每个离心管中加入0.5mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。把离心管置于冰上备用。
(3)RNA结合蛋白-RNA复合物免疫共沉淀(RIP)
1.配制RIP免疫沉淀缓冲液。每次免疫沉淀实验需要900μL RIP免疫沉淀缓冲液。每一次反应中，在860μL RIP洗涤缓冲液中加入35μL 0.5M的EDTA和5μL核糖核酸酶抑制剂。
2.把(2)第14步所得离心管放在磁力架中，弃去上清液。在每个离心管中加入900μL RIP免疫沉淀缓冲液。
3.快速解冻(1)步骤中所得RIP裂解产物，4℃下，14,000rpm，离心10分钟。取100μL上清液加至含有磁珠-抗体复合物的RIP免疫沉淀缓冲液中。免疫沉淀反应的最终体积将为1.0mL。
4.取RIP裂解产物的上清液10μL，置于一个新的离心管中，标记为“input”，贮藏在-80℃。
5.将所有离心管放置在旋转器上，4℃下，孵育过夜。
6.短暂离心免疫沉淀反应离心管，放在磁力架中，弃去上清液。
7.从磁力架中取出离心管，在每个离心管中加入0.5mL RIP洗涤缓冲液，短暂涡旋。
8.把离心管放在磁力架中，弃去上清液。
9.重复五次第7步至第8步操作，用500μL预冷的RIP洗涤缓冲液洗涤磁珠六次。
(4)RNA的纯化
1.配制蛋白酶K缓冲液。每次免疫沉淀需要150μL蛋白酶K缓冲液。此缓冲液含有117μL RIP洗涤缓冲液、15μL 10％SDS和18μL 10mg/mL蛋白酶K可通过加入浓SDS，减少蛋白酶K变性的风险。
2.重悬(3)第9步免疫沉淀物于150μL蛋白酶K缓冲液中。
3.解冻(3)第4步所得的input样品，在离心管中加入107μL RIP洗涤缓冲液、15μL10％SDS和18μL蛋白酶K，定容至总体积150μL。
4.使所有离心管置于55℃下孵育30分钟，同时振荡以充分消化蛋白。
5.孵育后，短暂离心离心管，把离心管放在磁力架上。把上清液转移到一个新的离心管中。
6.在装有上清液的离心管中，加入250μL RIP洗涤缓冲液。
7.在每个离心管中加入400μL苯酚：氯仿：异戊醇。涡旋15秒，在室温下，14,000rpm，离心10分钟，以分离各相。
8.小心取出350μL水相，放在一个新的离心管中。加入400μL氯仿，涡旋15秒，在室温下，1,4000rpm，离心10分钟，以分离各相。
9.小心取出300μL水相，放在一个新离心管中。
10.在每个离心管中，加入50μL盐溶液I、15μL盐溶液II、5μL沉淀增强剂，然后加入850μL无水乙醇。混匀，在-80℃下保存1小时至过夜，以沉淀RNA。
11. 4℃下，14,000rpm，离心30分钟，小心弃去上清液。
12.用80％乙醇洗涤沉淀一次。4℃下，14,000rpm，离心15分钟。小心弃去上清液，使沉淀自然风干。
13.重悬RNA沉淀于不含核糖核酸酶的10-20μL水中，将离心管置于冰上备用。
(5)免疫沉淀RNA的分析
1.标记适当数量的0.2mL PCR离心管，置于冰上备用。
2.在PCR离心管中，加入9μL(至多2μg RNA)样品，并放回到冰上备用。
3.按照下表，向放置在冰上的每个PCR反应管，加入相应的试剂。
表12蛋白酶K缓冲液
4.把PCR反应管放在PCR仪中，启动下述RT反应程序：
表13RT反应程序
5.取出PCR离心管。用180μL不含核酸酶的水稀释反应物(10×稀释)。反应物可以在-20℃下贮藏。
结果如图9所示，通过qPCR实验检测富集片段中NDUFA4L2的丰度，发现METTL3蛋白能够显著特异富集NDUFA4L2基因。这可以表明METTL3甲基转移酶与NDUFA4L2结合催化发生m6A修饰，从而促进NDUFA4L2的表达。
实施例十识别蛋白IGF2BP1促进NDUFA4L2的表达
将si-IGF2BP1干扰片段(如表6中所示)转染至PSC细胞，收取细胞样品提取RNA，通过qPCR实验检测NDUFA4L2的mRNA表达量变化，结果显示干扰IGF2BP1后，NDUFA4L2基因的表达量随之下降。此实施例的qPCR实验操作与实施例四相同。
如图10所示，干扰IGF2BP1后，NDUFA4L2基因的表达量随之下降，说明IGF2BP1识别蛋白可能通过与NDUFA4L2上的m6A修饰位点结合并增强其稳定性来促进NDUFA4L2的表达。
综上所述，本发明公开了一种调控肌纤维类型的方法，该方法包括在猪骨骼肌卫星细胞过表达和干扰NDUFA4L2基因。由此，发现了一个在猪肌肉中受m6A甲基化修饰的靶基因NDUFA4L2，该基因在猪慢肌中发生m6A修饰水平比快肌高，基因的表达量也高，可能是慢肌纤维和快肌纤维肉质差异的原因；同时还可以在猪骨骼肌卫星细胞中干扰NDUFA4L2基因的表达，抑制肌细胞的分化，为改变肌肉横截面积提供一种新的方法；再者，过表达NDUFA4L2使肌纤维类型向慢速氧化性肌纤维转化，从而为提高猪肉中红肉的比例，即为提升猪肉的宰后品质提供了一种新的方法和靶点，以及研究的新方向。另外，通过小分子药物，包括饲料中可能会用到的成分甜菜碱来调控m6A对基因的修饰水平，从而调控NDUFA4L2基因的表达，通过影响不同代谢途径达到促进红肉的比例，为提升红肉比例提供新的思路和靶点。此外，还通过干扰实验，证明在猪骨骼肌卫星细胞中识别NDUFA4L2基因的m6A识别蛋白为IGFBP1，为进一步从m6A角度调控猪肌纤维类型提供理论基础。通过调控NDUFA4L2基因表达来调控猪肌纤维类型转化的原理如图11所示。
以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

Claims (10)

1.NDUFA4L2基因在调控猪肌纤维类型转化上的应用，其中，所述应用是通过调控NDUFA4L2基因的表达来实现对猪肌纤维类型转化的调控；所述的调控NDUFA4L2基因的表达可通过抑制NDUFA4L2基因表达或促进NDUFA4L2基因表达来实现。
2.根据权利要求1中所述的应用，其中，所述的调控猪肌纤维类型转化是当需要促进慢速氧化型肌纤维形成而抑制快速酵解型肌纤维形成时或需要促进快速酵解型肌纤维向慢速氧化型肌纤维转化时，则需要促进NDUFA4L2基因表达；反之则需要抑制NDUFA4L2基因表达。
3.根据权利要求2中所述的应用，其中，所述的抑制NDUFA4L2基因表达可通过向细胞中转染抗NDUFA4L2的干扰RNA或降低细胞m6A甲基化修饰水平；所述的促进NDUFA4L2基因表达可通过向细胞中转染NDUFA4L2过表达载体或促进细胞m6A甲基化修饰水平。
4.根据权利要求3中所述的应用，其中，所述的抗NDUFA4L2的干扰RNA序列如SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示。
5.根据权利要求3中所述的应用，其中，所述的降低细胞m6A甲基化修饰水平可通过向细胞培养基中添加环亮氨酸或抑制METTL3基因表达或抑制IGF2BP1基因表达来实现；所述的促进细胞m6A甲基化修饰水平可通过向细胞培养基中添加甜菜碱或促进METTL3基因表达来实现。
6.一种调控猪肌纤维类型转化的方法，其中，所述方法可通过调控NDUFA4L2基因的表达来实现对猪肌纤维类型的转化调控；所述的调控NDUFA4L2基因的表达可通过抑制NDUFA4L2基因表达或促进NDUFA4L2基因表达来实现。
7.根据权利要求6中所述的方法，其中，所述抑制NDUFA4L2基因表达可通过向猪肌肉组织或细胞中中注射或转染抗NDUFA4L2的小干扰RNA si-NDUFA4L2或抗METTL3的小干扰RNAsi-METTL3或抗IGF2BP1的小干扰RNA si-IGF2BP1来抑制NDUFA4L2基因的表达，从而促进快速酵解型肌纤维形成，抑制慢速氧化型肌纤维形成或促进慢速氧化型肌纤维向快速酵解型肌纤维转化；所述的si-NDUFA4L2序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；所述的si-METTL3序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示；所述的si-IGF2BP1序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示；
或通过向猪饲料中添加环亮氨酸或者向猪细胞培养液中添加环亮氨酸来抑制NDUFA4L2基因的表达，从而来促进快速酵解型肌纤维形成，抑制慢速氧化型肌纤维形成或促进慢速氧化型肌纤维向快速酵解型肌纤维转化。
8.根据权利要求6中所述的方法，其中，所述促进NDUFA4L2基因表达可通过向猪肌肉组织或细胞中注射或转染NDUFA4L2过表达载体或METTL3过表达载体或IGF2BP1过表达载体来促进NDUFA4L2基因的表达，从而促进慢速氧化型肌纤维形成，抑制快速酵解型肌纤维形成或促进快速酵解型肌纤维向慢速氧化型肌纤维转化；
或通过向猪饲料中添加甜菜碱或者向猪细胞培养液中添加甜菜碱来促进NDUFA4L2基因的表达，从而来促进慢速氧化型肌纤维形成，抑制快速酵解型肌纤维形成或促进快速酵解型肌纤维向慢速氧化型肌纤维转化。
9.抑制NDUFA4L2基因表达在抑制骨骼肌的成肌分化上的应用，其中，所述应用是通过干扰NDUFA4L2基因表达来实现的，所述干扰NDUFA4L2基因表达的si-NDUFA4L2序列如SEQID NO:4和SEQ ID NO:5所示。
10.含有可调控NDUFA4L2基因表达的试剂盒/核酸分子/重组蛋白/重组载体/产品在调控猪肌纤维类型转化上的应用。
CN202311749855.XA 2023-12-19 2023-12-19 Ndufa4l2基因在调控猪肌纤维类型转化上的应用 Pending CN117683815A (zh)

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