CN110093425A - 一种检测小尾寒羊ormdl1基因cnv标记的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的方法及其应用：基于实时荧光定量PCR技术，以小尾寒羊耳组织全基因组DNA为模板，扩增小尾寒羊ORMDL1基因的拷贝数变异区域，并以扩增小尾寒羊ANKRD1基因片段作为内参，然后利用2*2‑ΔΔCt的方法计算个体的拷贝数变异类型。通过对拷贝数变异与生长性状进行关联分析，本发明提供的检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的方法为建立小尾寒羊ORMDL1基因拷贝数变异与生长性状之间的关联奠定了基础，以用于加快小尾寒羊品种改良的选育进程，该方法简单、快速，便于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子遗传学研究领域，具体涉及小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的检测。
背景技术
绵羊为人类提供肉和毛皮等产品。体尺性状和羊肉的质量是由多种基因共同调控的。随着对基因组研究的深入，有证据证明拷贝数变异(copy number variations,CNVs)可能影响基因网络并调节相关基因的表达，促成个体表型的可变性，因此优化与体尺性状相关的候选DNA标记如CNVs能够加速绵羊遗传进程的发展。
拷贝数变异一般是指在全基因组范围大于50bp的缺失、复制和插入的结构变异，是基因组内发生重排导致的，可以改变对剂量效应敏感的基因的表达水平；通过产生融合基因、基因功能阻断、位置效应、隐性等位基因的去除效应等影响基因的功能和个体间的表型。
目前，人和动物全基因组范围内的CNVs检测方法主要有三种：微阵列比较基因组杂交芯片(array-based comparative genomic hybridization,aCGH)、单核苷酸多态性芯片(SNP Array)和二代测序技术(Next-Generation Sequencing,NGS)。在比较基因组杂交芯片中寡核苷酸探针芯片被广泛使用，具有高灵敏度、高精度和样本量小的特点；SNPArray是利用芯片探针的平均信号强度和最小等位基因频率，并结合统计模型进行拷贝数的推断，但其准确性并不比aCGH芯片高，而且不同算法检测的结果差异较大。现有的芯片平台对新的拷贝数变异的检测效率很低，随着二代测序技术的发展，当前最有效的CNVs检测手段是通过重测序来检测基因组结构变异，但这种方法相较之前的方法成本较高。
目前，对基因组己知的CNV检测主要有两种方法，基于PCR的检测技术和基于杂交的检测技术。PCR检测技术主要包括实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)、依赖连接的多重扩增探针杂交技术(multiplex ligation-dependent probeamplification,MLPA)和短片段多重定量技术(quantitative multiplex PCR of shortfluorescent fragments,QMPSF)。目前使用最广泛的是qPCR技术，该方法敏感性高、操作方法简单、速度快、重复性好而且污染少。杂交技术主要包括Southern blotting杂交、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)、多重扩增探针杂交技术(multiplex amplifiable probe hybridization,MAPH)等，但这些方法成本比较高，时间长而且不够准确，目前使用较少。
ORMDL1是一种与鞘脂代谢、神经酰胺稳态相关的蛋白编码基因。研究表明ORMDL蛋白是神经酰胺生物合成的主要调控因子，在哺乳动物细胞中介导神经酰胺生物合成的反馈调控。目前的研究揭示ORMDL1基因的功能主要集中在调节人鞘磷脂生物合成，此基因多态性与人类哮喘病有关。但在绵羊上还没有相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的方法及其应用。
为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的方法，包括以下步骤：
以小尾寒羊耳组织全基因组DNA为模板，以引物对ORMDL1-CNV及引物对ANKRD1-REF为引物，通过实时荧光定量PCR分别扩增ORMDL1基因的拷贝数变异区域以及作为内参序列的ANKRD1基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定小尾寒羊ORMDL1基因的拷贝数变异类型；所述的ORMDL1基因的拷贝数变异区域位于ORNDL1基因参考基因组序列Oar_v4.0的118432001bp到118434800bp，共2800bp。
优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2-ΔΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2*2-ΔΔCt>2；缺失型，2*2-ΔΔCt<2；正常型，2*2-ΔΔCt＝2。
优选的，所述的引物对ORMDL1-CNV为：
上游引物F1：5’-CCCAGTAGCACACTTATTTTGTC-3’
下游引物R1：5’-CCGGGTATTCGGATTCACCT-3’；
所述的引物对ANKRD1-REF为：
上游引物F2：5’-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3’
下游引物R2：5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3’。
优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的扩增体系包括25ng/μL模板DNA1μL、10pmol/L的引物对ORMDL1-CNV或引物对ANKRD1-REF所对应的上、下游引物各0.5μL以及2×RealStar Green Fast Mixture 6.25μL和ddH2O 4.25μL。
优选的，所述的实时荧光定量PCR所用的反应程序为：1)95℃预变性10min；2)95℃变性15s，60℃退火1min，72℃延伸30s，共40个循环；3)绘制熔解曲线(Bio Rad CFX963.1)。
优选的，基于引物对ORMDL1-CNV扩增的PCR产物片段大小为144bp，基于引物对ANKRD1-REF扩增的PCR产物片段大小为143bp。
上述检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的方法在小尾寒羊分子标记辅助选择育种中的应用。
优选的，小尾寒羊中具有插入型和正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上优于具有缺失型拷贝数变异类型的个体；所述生长性状为体高、体长、十字部高、胸围、胸深。
一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，包括上述引物对ORMDL1-CNV及引物对ANKRD1-REF。
本发明的有益效果体现在：
本发明根据所发现的位于绵羊ORMDL1基因(GenBank Accession No.Oar_v4.0)候选区域Chr2:118432001-118434800bp的拷贝数变异位点，建立了通过实时荧光定量PCR技术检测该位点在小尾寒羊群体中的拷贝数变异的方法，检测方法操作简便，可以快速、准确、可靠的获得小尾寒羊个体ORMDL1基因拷贝数变异类型；通过对小尾寒羊ORMDL1基因拷贝数变异与体高、体长、十字部高、胸围、胸深、胸宽、管围等重要经济性状进行关联分析，发现小尾寒羊ORMDL1基因的这一拷贝数变异位点可以作为CNV标记，其检测不受年龄和性别的限制，可用于早期选育，为绵羊生长性状的分子标记辅助选择提供科学依据，从而加快优势绵羊种群的建立及育种进程。
附图说明
图1为本发明实施例中进行qPCR(ANKRD1基因)绘制的扩增曲线(a)和熔解曲线(b)。
图2是本发明实施例中进行qPCR(ORMDL1基因)绘制的扩增曲线(a)和熔解曲线(b)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做详细说明。
本发明利用实时荧光定量PCR对小尾寒羊ORMDL1基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：
(1)根据NCBI数据库的绵羊ORMDL1基因序列，用Primer-BLAST网站进行引物设计；
(2)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；
(3)利用SPSS 18.0软件将拷贝数变异类型与小尾寒羊生长性状进行关联分析，筛选到一个与小尾寒羊生长性状相关的CNV标记；该CNV标记位于绵羊ORMDL1基因(GenBankAccession No.Oar_v4.0)参考序列的118432001-118434800bp区域内。
(4)根据拷贝数变异类型进行生长性状优异的绵羊优势种群选育。
本发明具体包括以下步骤：
1、羊样本采集
以182头小尾寒羊作为检测对象，182头小尾寒羊的耳组织样本采集自甘肃省永靖县瑞霖科技养殖有限公司，小尾寒羊采样时间2017年9月。
2、耳组织样基因组DNA的提取
1)取约10mg耳组织样，放于1.5mL的离心管中，用小剪刀尽量剪碎。
2)剪碎的组织样加入1.5mL的离心管，然后加入600μL的SE。
3)向离心管中加入30μL的蛋白酶K，再加入15μL的SDS，充分混匀。
4)消化过夜，65℃水浴12～16h。
5)向离心管中加入200μL 65℃预热的6mol/L NaCl，充分混匀。
6)样品放在冰上，加入600μL氯仿。
7)将离心管包埋在冰里，轻柔摇动20min，避免DNA断裂，然后12000r/min离心15min。
8)将上层清液用移液器移入新的灭菌离心管。
9)加入1倍体积无变性的冰冷无水乙醇，轻轻扣底摇动多次，直到DNA析出，然后-20℃放置10～30min。
10)加入500μL冰冷的体积分数70％乙醇，轻柔摇动。
11)10min后，15000r/min离心10min，倾倒出体积分数70％的乙醇，真空干燥15min或空气干燥3～4h。
12)根据DNA的量，加入50～100μL水，保存于4℃，过夜，使DNA完全溶解。
13)第二天，用1％琼脂糖凝胶电泳检测其质量，待分光光度计测定其浓度后，-80℃保存。
3、目标序列及内参序列的扩增
以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的绵羊ORMDL1基因序列(GenBank Accession No.Oar_v4.0)为参考序列，利用Primer-BLAST设计扩增小尾寒羊ORMDL1基因对应拷贝数变异区域(目标序列)的实时荧光定量PCR引物对。内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，具体选择为ANKRD1基因中的一段143bp的序列。目标序列和内参序列的扩增引物对序列信息具体参见表1(引物设计时间2018年7月)。
表1.实时荧光定量PCR的引物信息
进行实时荧光定量PCR所用的扩增体系以12.5μL计为：25ng/μL模板DNA(提取自耳组织样本的基因组DNA)1μL，10pmol/L的上、下游引物各0.5μL，2×RealStar Green FastMixture 6.25μL，ddH2O 4.25μL。
PCR扩增的反应程序为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃退火1min，72℃延伸30s，共40个循环；(3)绘制熔解曲线(Bio Rad CFX96 3.1)。
通过绘制扩增曲线和熔解峰确定引物适用于qPCR分析。根据绘制的熔解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(图1、图2)。
4、拷贝数变异的推断
每个样品分别用目标序列和内参序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2*2-ΔΔCt方法进行拷贝数的分析。其中ΔCt＝Ct目标序列–Ct内参序列。2*2-ΔΔCt表示的是拷贝数。根据2*2-ΔΔCt将定量结果分为三类：插入型(Gain)，2*2-ΔΔCt>2；缺失型(Loss)，2*2-ΔΔCt<2；正常型(Median)，2*2-ΔΔCt＝2。Ct即Cycle threshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
5、ORMDL1基因CNV位点与生长性状的关联分析
生产数据：体高、体长、胸围、管围、胸宽、胸深、十字部高。
关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS18.0软件分析各基因型间的生产性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：
Yijkl＝μ+Ai+sj+CNVk+eijkl
其中：Yijkl为性状观察值，μ为总体均值，Ai为第i头个体的年龄，Sj为第j头个体的性别，CNVk为第k个拷贝数变异类型的固定效应，eijkl为随机误差。各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示。
表2.小尾寒羊ORMDL1基因拷贝数变异与生长性状的关联性分析
注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)；*P<0.05，**P<0.01；括号里面的数值表示拷贝数类型的数量。
关联分析结果表明(见表2)：具有插入型和正常型拷贝数变异类型的小尾寒羊个体在生长性状上优于具有缺失型拷贝数变异类型的小尾寒羊个体。说明ORMDL1基因上的CNV位点(Oar_v4.0的118432001bp到118434800bp)可以作为一个提高小尾寒羊生长性状(体高、体长、十字部高、胸围、胸深)的候选分子遗传标记。
6、上述CNV标记在绵羊选育中的应用
以上的CNV位点(Oar_v4.0的118432001bp到118434800bp)可作为候选分子遗传标记，以对小尾寒羊进行分子标记辅助选择，从而加快小尾寒羊品种改良的选育进程。
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的方法及其应用
<160> 4
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cccagtagca cacttatttt gtc 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ccgggtattc ggattcacct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<400> 3
tgggcaccac gaaattctca 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
tggcagaaat gtgcgaacg 19
Claims (10)
1.一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的方法，其特征在于：包括以下步骤：
利用实时荧光定量PCR，以待测小尾寒羊基因组DNA为模板，分别扩增ORMDL1基因拷贝数变异区域，以及作为内参序列的ANKRD1基因部分片段，然后根据定量结果鉴定小尾寒羊个体ORMDL1基因拷贝数变异类型，所述的ORMDL1基因拷贝数变异区域位于ORMDL1基因参考基因组序列Oar_v4.0的118432001bp到118434800bp。
2.如权利要求1所述一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的拷贝数变异类型是根据2*2-ΔΔCt将定量结果分为的三类：插入型，2*2-ΔΔCt>2；缺失型，2*2-ΔΔCt<2；正常型，2*2-ΔΔCt＝2。
3.如权利要求1所述一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的ORMDL1基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：
上游引物F1：5’-CCCAGTAGCACACTTATTTTGTC-3’
下游引物R1：5’-CCGGGTATTCGGATTCACCT-3’；
所述的ANKRD1基因部分片段的扩增引物对为：
上游引物F2：5’-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3’
下游引物R2：5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3’。
4.如权利要求1所述一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火1min，72℃延伸30s，共40个循环。
5.如权利要求1-4中任意一项权利要求所述的方法在小尾寒羊分子标记辅助选择育种中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：具有插入型和正常型拷贝数变异类型的个体在生长性状上优于缺失型拷贝数变异类型的个体。
7.一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括用于扩增小尾寒羊ORMDL1基因拷贝数变异区域的引物对，所述的ORMDL1基因拷贝数变异区域位于ORMDL1基因参考基因组序列Oar_v4.0的118432001bp到118434800bp。
8.如权利要求7所述一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的ORMDL1基因拷贝数变异区域的扩增引物对为：
上游引物F1：5’-CCCAGTAGCACACTTATTTTGTC-3’
下游引物R1：5’-CCGGGTATTCGGATTCACCT-3’。
9.如权利要求7所述一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于扩增内参序列的引物对，内参序列选自ANKRD1基因部分片段。
10.如权利要求9所述一种检测小尾寒羊ORMDL1基因CNV标记的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于：所述的ANKRD1基因部分片段的扩增引物对为：
上游引物F2：5’-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3’
下游引物R2：5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3’。
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