CN103614472A - 一种检测猪基因组拷贝数变异的pcr试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物检测领域内的一种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒，所述试剂盒包括2×SYBRGreenqPCRMix试剂、如SEQIDNO.1所示的目标序列正向引物、如SEQIDNO.2所示的目标序列反向引物、如SEQIDNO.3所示的参考序列正向引物、如SEQIDNO.4所示的参考序列反向引物、如SEQIDNO.5所示的参考序列、去离子水、无拷贝数变异的对照样本，本发明提供的对CNVs的检测不受猪年龄、性别等限制，检测方法简单易操作、准确，可用于猪基因组CNVs的检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种PCR试剂盒，特别涉及一种检测猪基因组拷贝数变异检测方法。
背景技术
自20世纪80年代以来，由于生物技术的发展，特别是人类基因组计划的起动（1991），基因组DNA序列的遗传变异即分子多态性，被大量开发出来。除了限制性片段长度多态性（RFLP）、单核苷酸多态性（SNPs）、微卫星（Microsatellite）等这些常规的遗传标记外，新近在人类基因组中又发现了另外一类丰富的多态性来源—拷贝数变异（Copy number variations，CNVs）。CNVs是指基因组中与参考序列相比>1kb的DNA片段插入、缺失和/或扩增，及其相互组合衍生出的复杂染色体结构变异。相邻的、部分重叠的CNVs合并在一起成为一个更大的基因组片段成为拷贝数变异区间（Copy Number Variation Region, CNVR）。拷贝数变异具有基因组覆盖范围广（人类基因组上CNVs覆盖率约13%）、突变率高、分布于基因组特定位置、可遗传及相对稳定的特点。
目前，实时荧光定量PCR（qPCR）技术是一种常用的CNVs检测技术。在PCR反应体系中，加入过量SYBR Green 荧光染料，SYBR Green 荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入DNA链中的SYBR分子不发射荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，进而通过检测荧光信号的强度来反映基因组DNA的数量。通过对检测样本的目的基因（具有拷贝数多态）及参考基因（无拷贝数多态，只有2个拷贝）进行相对定量，比较这两个检测值的比值估计检测样本候选基因的拷贝数。该方法具有简单易操作、成本低的优势，可以检测目的片段的绝对拷贝数，但不适于大样本的高通量检测。
猪作为一种重要的经济动物和人类医学研究的模式动物，它的一些重要的经济性状如繁殖、生长、肉质、抗病等备受研究者们关注。因此，对猪基因组CNVs的检测，不仅有利于了解CNVs这一遗传变异对猪基因组的影响，而且为开展CNVs与经济性状和疾病表型之间的关联分析研究提供技术支持。
发明内容
本发明的目标是提供一种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒及检测方法，对CNVs的检测不受猪年龄、性别等限制，检测方法简单易操作、准确。
本发明的目标是这样实现的：一种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒及检测方法，
所述试剂盒包括2×SYBR Green qPCR Mix试剂、如SEQ ID NO.1所示的目标序列正向引物、如SEQ ID NO.2所示的目标序列反向引物、如SEQ ID NO.3所示的参考序列正向引物、如SEQ ID NO.4所示的参考序列反向引物、如SEQ ID NO.5所示的参考序列、去离子水、无拷贝数变异的对照样本；
作为本发明的进一步限定，目标序列如SEQ ID NO.6所示。
所述检测方法包括以下步骤：
1）提取猪的基因组DNA；
2）以上述猪基因组DNA为模板，利用序列为SEQ ID NO.1的目标序列正向引物、序列为SEQ ID NO.2的目标序列反向引物以及序列为SEQ ID NO.3的参考序列正向引物、序列为SEQ ID NO.4的参考序列反向引物通过实时荧光定量PCR反应扩增出试验组目标序列和试验组参考序列；
3)以对照样本为模板，利用序列为SEQ ID NO.1的目标序列正向引物、序列为SEQ ID NO.2的目标序列反向引物以及序列为SEQ ID NO.3的参考序列正向引物、序列为SEQ ID NO.4的参考序列反向引物通过实时荧光定量PCR反应扩增出对照组目标序列和对照组参考序列；
3）根据上述实时荧光定量PCR荧光值，以参考序列为标准，推断目标序列的拷贝数。
作为本发明的进一步限定，所述步骤2）中实时荧光定量PCR反应使用的扩增体系以20μl计为：
50ng/μl模板DNA 1μl，
2×SYBR Green qPCR Mix 10μl，
10pmol/μl引物F 1μl，
10pmol/μl引物R 1μl，
去离子水 7μl。
作为本发明的进一步限定，所述步骤2）中实时荧光定量PCR反应条件为：
a）预变性：
95℃ 5分钟；
b）扩增反应：
变性：95℃ 10秒，
退火：60℃ 10秒，
延伸：72℃ 10秒，
45个循环；
72℃ 10分钟；
c）绘制溶解曲线：
95℃ 5秒，
65℃ 1分钟，
97℃ 10秒。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明提供的对CNVs的检测不受猪年龄、性别等限制；并且检测方法简单易操作、准确。
附图说明
图1为 qPCR时绘制的扩增曲线。
图2为 qPCR时绘制的标准曲线。
图3为 qPCR时引物的溶解曲线。
具体实施方式
用以下实例对本发明做进一步解释，但不限定本发明的范围，若无特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1为本发明的检测方法，步骤如下：
1.1猪耳组织基因组DNA提取
本试验采用QIAGEN血液与组织DNA提取试剂盒，从猪耳组织中提取基因组DNA，具体方法如下：
1）取小于25mg的耳组织置于2ml的离心管中，用手术剪刀充分剪碎；
2)加入180μl BufferATL及20μl蛋白酶K，漩涡混匀，56℃消化2-4小时（每隔0.5小时混匀一次）至组织块消化完全；
3)加入200μl BufferAL，漩涡混匀，56℃消化10min；
4)加入200μl无水乙醇，漩涡混匀；
5)将消化液倒入吸附柱中，置于2ml离心管，8000rpm离心1min；
6)取出吸附柱并置于新的2ml离心管，加入500μl BufferAW1，8000rpm离心1min；
7)取出吸附柱并置于新的2ml离心管，加入500μl BufferAW2，14000rpm离心3min；
8)将吸附柱转移到新的2ml离心管中，加入100μl BufferAE，室温放置5-10min，8000rpm离心1min；
9）基因组DNA存在于离心管中溶液中，4℃保存备用或-20℃长期保存。
1.2目标序列及参考序列的扩增
本发明中的参考序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即胰高血糖素基因（Glucagon,GCG）中的一段147bp的序列，如SEQ ID NO.5所示。正反向扩增通用引物分别为：如SEQ ID NO.3所示的F5’-GAATCAACACCATCGGTCAAAT-3’和如SEQ ID NO.4所示的R5'-CTCCACCCATAGAATGCCCAGT-3'。
目标序列为一段164bp的序列，如SEQ ID NO.6所示，正反向目标引物为：如SEQ ID NO.1所示的F5’-TTGGGAAATGTTCAACTGTGTA -3’和如SEQ ID NO.2所示的R5'-TCAATGGAATGAGGTAGGGTCT -3'。
目标序列和参考序列的实时荧光定量PCR反应体系一样，均以20μl计为：
50ng/μl模板DNA 1μl，
2×SYBRGreenqPCRMix 10μl，
10pmol/μl引物F 1μl，
10pmol/μl引物R 1μl，
去离子水 7μl。
PCR反应条件为：
（1）预变性：
95℃ 5分钟；
（2）扩增反应：
变性：95℃ 10秒，
退火：60℃ 10秒，
延伸：72℃ 10秒，
45个循环；
72℃ 10分钟；
（3）绘制溶解曲线：
95℃ 5秒，
65℃ 1分钟，
97℃ 10秒。
根据NCBI数据库收录的BD114基因（NC_010449.4）序列设计引物，包括如SEQ ID NO.7正向引物和如SEQ ID NO.8反向引物，通过进行qPCR扩增，绘制标准曲线检测引物的扩增效率、扩增曲线和溶解峰来确定引物是否适用于qPCR分析，目标序列和参考序列的引物扩增效率在2.0（1.9-2.1）左右，3个倍比稀释而成的浓度梯度模板进行qPCR时，其扩增曲线有好的梯度，即DNA每稀释2倍，Ct值增加1左右（如图1所示）；绘制的标准曲线3个点在一条直线上（如图2所示）；绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰（如图3所示）。本试剂盒所包含的引物符合上述要求，扩增效果稳定、特异性强，通过实时荧光定量PCR反应可准确反应基因组中目标序列的拷贝数变异情况。
1.3拷贝数变异的推断
每个样品分别用目标序列和参考序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根据2-△△Ct方法进行拷贝数的分析。2-△△Ct计算公式为：2-△△Ct=（Ct目标序列-Ct参考序列）试验组-（Ct目标序列-Ct参考序列）对照组。试验组即为待检测有无CNVs的样本，对照组即为已知无拷贝数变异的对照样本。2-△△Ct表示的是试验组目标序列的拷贝数相对于对照组的倍数。
当目标序列为正常（拷贝数为2）序列时，根据2-△△Ct计算出归一化比值为1左右。目标序列存在单拷贝缺失时（拷贝数为1），Ct值增加1，经2-△△Ct计算归一化比值为0.5左右。目标序列为双拷贝缺失时（拷贝数为0），即没有目标序列，经2-△△Ct计算归一化比值为0左右，当目标序列为单拷贝增加时（拷贝数为3），Ct值降低0.5左右，经2-△△Ct计算归一化比值在1.5左右；双拷贝增加时（拷贝数为4），其Ct值降低1，归一化比值为2左右，其他情况的拷贝数依次类推。
实施例2
本试剂盒在不同猪基因组DNA样品CNVs检测中的应用
按照实施例1的方法，对采自中国不同地区的8头猪进行CNVs检测，结果如下：
表1中C3个体是已知的正常2倍体，为对照样品
表1
| 个体编号 | 品种 | 目标序列Ct值 | 参考序列Ct值 | 2-△△Ct值 | CNVs类型 |
| A1 | 野猪 | 22.8984 | 21.94615 | 0.5168 | 单拷贝缺失 |
| C3 | 长白猪 | 22.90702 | 22.98228 | 1.054 | 正常2倍体 |
| D4 | 杜洛克猪 | 21.3702 | 21.54976 | 1.133 | 正常2倍体 |
| DN | 滇南小耳猪 | 21.70024 | 21.8932 | 1.143 | 正常2倍体 |
| MS | 梅山猪 | 21.59271 | 21.81051 | 1.163 | 正常2倍体 |
| R2 | 荣昌猪 | 21.73956 | 21.89401 | 1.113 | 正常2倍体 |
| Y2 | 约克夏猪 | 22.1074 | 22.32098 | 1.160 | 正常2倍体 |
| Z5 | 藏猪 | 21.54754 | 21.64914 | 1.073 | 正常2倍体 |
本发明利用猪基因组DNA，根据实时荧光定量PCR得到的Ct值进行计算即可判定待测个体基因组拷贝数变异情况，而不受猪年龄、性别的限制，且操作简便，结果准确性高。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
<110>扬州创日畜牧科技有限公司
<120>一种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒及检测方法
<160>8
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
TTGGGAAATGTTCAACTGTGTA 22
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
TCAATGGAATGAGGTAGGGTCT 22
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
GAATCAACACCATCGGTCAAAT 22
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
CTCCACCCATAGAATGCCCAGT 22
<210>5
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
GAATCAACAC CATCGGTCAA ATATTCAGAT TTCTGATAAG TCTATCAAGA 50
ATTCAACGAC CATGAAATCA GCTCTTTGTA AATAAGACAT AGCATATTTA 100
GTACAGAAAA CAACTATCCT CATTCACTGG GCATTCTATG GGTGGAG 147
<210>6
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
TTGGGAAATG TTCAACTGTG TACATTTAGG TAAACCACTG ACACATCAAA 50
AATCATCCTA CATGGATGCA AACATGGTAT TCATGATAAG AAATTAATAT 100
GAAATATGCC TCTATTAAAG CTCCAGCCCA GAGAAGATTA GAAGACCCTA 150 CCTCATTCCA TTGA 164
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
TTGGGAAATGTTCAACTGTGTA 22
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
TCAATGGAATGAGGTAGGGTCT 22
Claims (5)
1.一种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒，其特征在于，包括2×SYBR Green qPCR Mix试剂、如SEQ ID NO.1所示的目标序列正向引物、如SEQ ID NO.2所示的目标序列反向引物、如SEQ ID NO.3所示的参考序列正向引物、如SEQ ID NO.4所示的参考序列反向引物、如SEQ ID NO.5所示的参考序列、去离子水、无拷贝数变异的对照样本。
2.根据权利要求1所述的一种检测猪基因组拷贝数变异的PCR试剂盒，其特征在于，目标序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种使用权利要求1或2所述的PCR试剂盒检测猪基因组拷贝数变异的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）提取猪的基因组DNA；
2）以上述猪基因组DNA为模板，利用序列为SEQ ID NO.1的目标序列正向引物、序列为SEQ ID NO.2的目标序列反向引物以及序列为SEQ ID NO.3的参考序列正向引物、序列为SEQ ID NO.4的参考序列反向引物通过实时荧光定量PCR反应扩增出试验组目标序列和试验组参考序列；
3)以对照样本为模板，利用序列为SEQ ID NO.1的目标序列正向引物、序列为SEQ ID NO.2的目标序列反向引物以及序列为SEQ ID NO.3的参考序列正向引物、序列为SEQ ID NO.4的参考序列反向引物通过实时荧光定量PCR反应扩增出对照组目标序列和对照组参考序列；
3）根据上述实时荧光定量PCR荧光值，以参考序列为标准，推断目标序列的拷贝数。
4.根据权利要求3所述的一种检测猪基因组拷贝数变异的检测方法，其特征在于，所述步骤2）中实时荧光定量PCR反应使用的扩增体系以20μl计为：
50ng/μl模板DNA 1μl，
2×SYBR Green qPCR Mix 10μl，
10pmol/μl引物F 1μl，
10pmol/μl引物R 1μl，
去离子水 7μl。
5.根据权利要求3所述的一种检测猪基因组拷贝数变异的检测方法，其特征在于，所述步骤2）中实时荧光定量PCR反应条件为：
a）预变性：
95℃ 5分钟；
b）扩增反应：
变性：95℃ 10秒，
退火：60℃ 10秒，
延伸：72℃ 10秒，
45个循环；
72℃ 10分钟；
c）绘制溶解曲线：
95℃ 5秒，
65℃ 1分钟，
97℃ 10秒。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140305 |