CN113906945A - 一种促进油茶种子中类黄酮含量积累的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及油茶次生代谢产物技术领域，尤其涉及一种促进油茶种子中类黄酮含量积累的方法，在油茶种子发育过程中增加油茶种子中的褪黑素含量。类黄酮的生物合成受到多种内部和外部因素的控制，本发明研究了吲哚胺类化合物褪黑素对油茶种子中的次生代谢产物类黄酮的影响，通过代谢组分析，对油茶种子不同发育阶段的内源性褪黑素含量、增加外源性褪黑素含量与类黄酮含量关系的测定，发现褪黑素含量与类黄酮含量正相关，即油茶种子中的褪黑素的含量增加会增强其中类黄酮的积累。因此，增加油茶种子中内源性褪黑素或外源性褪黑素含量会增加类黄酮的积累，为油茶种子类黄酮含量的增加研究提供技术支撑。

Description

一种促进油茶种子中类黄酮含量积累的方法

技术领域

本发明涉及油茶次生代谢产物技术领域，尤其涉及一种促进油茶种子中类黄酮含量积累的方法。

背景技术

类黄酮是一组具有可变酚结构的天然物质、具有2-苯基色原酮结构的化合物。它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。类黄酮在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态(苷元)的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物。它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用。此外，类黄酮还是一种重要的抗逆性物质，对于提高植物抗性具有积极的意义。例如类黄酮代谢物可以吸收UV，保护植物细胞免受紫外伤害；在植物的热适应和抗冻性、抗干旱以及其他逆境中发挥作用；类黄酮作为某种信号分子协同一些生物过程共同参与提高植物的抗逆性(类黄酮可以影响酶促抗氧化系统、转录因子和激酶等，从而来调控相关基因的表达参与植物抗逆性)。此外，类黄酮可以作为一种信号分子，在植物抗毒素、解毒剂和抗菌防御化合物的作用，还可与共生微生物的信号传导作用。类黄酮是一类重要的天然产物，具有广泛的促进健康的作用。类黄酮具有抗氧化、抗炎、抗诱变和抗癌的特性，并且具有调节关键细胞酶功能的能力。它们还是多种酶的有效抑制剂，如黄嘌呤氧化酶(XO)、环加氧酶(COX)、脂加氧酶和磷酸肌醇3-激酶。黄酮类化合物的研究因发现心血管死亡率低以及预防冠心病而受到了更多的推动。类黄酮可用作潜在的类固醇生成调节剂，可对抗类固醇生成途径的三种酶3β-羟基类固醇脱氢酶(HSD)，17β-HSD和芳香化酶。因此，类黄酮是各种保健食品，药物，药物和化妆品应用中必不可少的成分。

油茶是我国基本的木本食用油料树种，其油茶籽产量为全球第一。油茶籽主要用于榨油供食用，因此油茶又名茶油树。茶油是我国最优质的保健食用油之一，被誉为“东方橄榄油”、“油中软黄金”，已被《中华人民共和国药典》收载，并且国际粮农组织已将其作为重点推广的健康型高级食用植物油。类黄酮化合物是油茶中的生物活性物质之一，具有抗氧化、抗炎、抗癌、软化血管、降低血脂和血压等的作用，并且对预防冠心病和抗癌等有良好的作用。因此，我们认为油茶中的类黄酮成分可以广泛应用于各类疾病的防御和治疗以及其他的行业。

褪黑素(Melatonin，MT)，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺(N-acetyl-5-methoxytryptamine)，是一种相对保守的吲哚胺类化合物。杨梅酮(Myricetin,Myr)化学名称为5,7,3',4',5'-五羟基黄酮醇，又称为杨梅黄酮、杨梅酮，是一种黄酮类化合物。有研究表明杨梅酮可以强烈抑制AANAT(AANAT催化血清素转化为N-乙酰血清素，是褪黑激素生物合成途径中的限速酶)的活性从而抑制褪黑素的合成。褪黑素作为一种信号分子，能够通过调控多酚类物质的合成参与多种植物果实发育。在猕猴桃叶片中，褪黑素可以上调植物中总酚、黄酮和花青素等多酚类物质生物合成相关的基因，还能够增强苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羟化酶(C4H)、查尔酮合成酶(CHS)、黄烷酮3-羟化酶(F3H)、隐色花青素还原酶(LAR)、花青素还原酶(ANR)等酶活性以及其合成基因表达量，进而促进黄酮类物质积累。番茄蛋白质组学结果表明，褪黑素处理提高了花青素积累相关蛋白的含量，参与类黄酮生物合成的蛋白同样受到褪黑素的显著影响。此外，在芸苔属植物中观察到与果实成熟期花青素积累相关的八种蛋白质水平也有所增加。但是，在拟南芥中，通过敲除褪黑素合成途径中的基因SNAT1或COMT来阻断内源褪黑激素的生物合成，可以显著提高成熟种子的花青素含量。相反，外源施用褪黑素导致种子中的花青素水平显著降低。目前，褪黑素的研究较少，在不同植物中的作用差异很大，在油茶中更是没有报道。

发明内容

本发明旨在提供一种提高油茶果实中类黄酮含量的方法，为开发油茶活性成分相关的保健产品提供有价值的信息。

具体地，一种促进油茶种子中类黄酮含量积累的方法，在油茶种子发育过程中增加油茶种子中的褪黑素含量。

类黄酮的生物合成受到多种内部和外部因素的控制，本发明研究了吲哚胺类化合物褪黑素对油茶种子中的次生代谢产物类黄酮的影响，通过代谢组分析，对油茶种子不同发育阶段的内源性褪黑素含量、增加外源行褪黑素含量与类黄酮含量关系的测定，发现褪黑素含量与类黄酮含量正相关，即油茶种子中的褪黑素的含量增加会增强其中类黄酮的积累。因此，增加油茶种子中内源性褪黑素或外源性褪黑素含量会增加类黄酮的积累，为油茶种子类黄酮含量的增加研究提供技术支撑。

在一些可能的实施方式中，所述增加油茶种子中的褪黑素含量通过以下中的任一种或多种方式进行：

(a)在油茶种子发育过程中喷施褪黑素或褪黑素合成的前体物质；

(b)增加所述油茶种子发育过程中褪黑素合成关键基因的表达。

增加油茶种子中的褪黑素含量既包括外源性褪黑素含量，也包括内源性褪黑素含量。其中，增加外源性褪黑素含量可以通过在油茶种子发育过程中喷施褪黑素或褪黑素合成的前体物质来增加油茶种子中的褪黑素含量。增加内源性褪黑素含量可以通过增加油茶种子发育过程中褪黑素合成关键基因的表达来实现。增加油茶种子发育过程中褪黑素合成关键基因的表达既包括化学物质的策略，如通过诱导褪黑素合成关键基因的过表达来实现；也包括分子生物手段，如所用的油茶品种为过表达褪黑素合成关键基因的植株。

研究发现，油茶种子中的褪黑素含量与类黄酮含量呈现正相关，两者均在授粉后的第258天达到高峰，检测发现，在油茶授粉之日起的第258±7天采集油茶种子，油茶种子中的类黄酮含量较高。

具体地，在油茶授粉之日起的第258±7天采集油茶种子，提取油茶种子中的类黄酮。

油茶种子包括种皮和种仁，种皮和种仁中均含有类黄酮，其中，按单位量计，种皮中的类黄酮含量更高，因此，本发明对种皮中的类黄酮含量以及种类进行了研究，发现，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施100-150mmol/L的褪黑素溶液，每隔四周喷施一次，喷施后的第4-6周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的类黄酮，此时，种皮中的类黄酮含量更高。

对于类黄酮为表儿茶素来说，若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为表儿茶素，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施50-150mmol/L的褪黑素溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第4-10周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的表儿茶素，此时，种皮中的表儿茶素含量更高；

优选地，若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为表儿茶素，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施50-150mmol/L的褪黑素溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第4-8周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的表儿茶素，此时，种皮中的表儿茶素含量更高；其中，可以在喷施后的第4周、6周或8周采集油茶种子，更优选为于喷施后的第6周采集油茶种子，此时，种皮中的表儿茶素含量更高；

优选地，所述类黄酮为表儿茶素，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施100-150mmol/L的褪黑素溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第4-6周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的表儿茶素，此时，种皮中的表儿茶素含量更高。

对于类黄酮为芦丁来说，若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为芦丁，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施50-150mmol/L的褪黑素溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第4周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的芦丁，此时，种皮中的芦丁含量更高；

优选地，若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为芦丁，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施50mmol/L的褪黑素溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第4-6周采集油茶种子，优选为于喷施后的第6周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的芦丁，此时，种皮中的芦丁含量更高；

若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为芦丁，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施150-200mmol/L的褪黑素溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第6周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的芦丁，此时，种皮中的芦丁含量更高。

本发明研究发现，杨梅酮也能提高种皮中表儿茶素的含量，具体地，所述油茶种子包括种皮和种仁，若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为表儿茶素，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施100mmol/L的杨梅酮溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第6周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的表儿茶素。

类黄酮的生物合成受多种内部和外部因素的控制，其中植物激素是关键的调节因子之一，而植物代谢组是生物体内源性代谢物质的动态整体，因此，如何得到植物激素对类黄酮的影响需要研究来证实。本发明基于此，研究了褪黑素和杨梅酮对油茶种子中类黄酮含量的影响，为油茶种子的有效活性成分的提取提供理论支持。

本发明中，对油茶树的喷施一般为树干以上的树枝、树叶以及果实的喷施。但并不限于此，也可以只喷施油茶树的部分组织，如包括根、茎、叶、果实中的任一种或多种。

本发明与现有技术相比所具有的有益效果：

(1)本发明研究了油茶种子中类黄酮含量的影响因素，发现，在油茶种子发育过程中增加油茶种子中的褪黑素含量有助于提升油茶种子中类黄酮的含量。

(2)本发明还提供了不同浓度褪黑素和杨梅酮喷施对油茶种皮中类黄酮、表儿茶素、芦丁、金丝桃苷、异槲皮苷、柚皮素含量的影响，发现对金丝桃苷、异槲皮苷、柚皮素含量无影响，而喷施后不同时间阶段对类黄酮、表儿茶素、芦丁含量有明显影响，为油茶种子的收获时期提供良好的技术基础。

(3)本发明中，使用的褪黑素溶液为安全高效的制剂，不会对人体造成伤害，并对环境友好，可切实提高油茶果实的类黄酮含量，有利于油茶果实的多元化利用，帮助农户提高经济效益。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1示出了本发明实施例1提供的油茶种子发育过程中内源性褪黑素浓度的曲线变化图；

图2示出了本发明实施例1提供的油茶种子发育过程中内源性杨梅酮含量变化的柱形图；

图3示出了本发明实施例1提供的油茶种子发育过程中类黄酮含量变化的柱形图；

图4示出了本发明实施例1提供的褪黑素、杨梅酮和类黄酮含量的相关性分析图；

图5示出了本发明实施例2提供的不同浓度的褪黑素溶液对油茶种皮中类黄酮含量的影响柱形图；

图6示出了本发明实施例2提供的不同浓度的褪黑素溶液对油茶种皮中表儿茶素含量的影响柱形图；

图7示出了本发明实施例2提供的不同浓度的褪黑素溶液对油茶种皮中芦丁含量的影响柱形图；

图8示出了本发明实施例2提供的不同浓度的杨梅酮溶液对油茶种皮中类黄酮含量的影响柱形图；

图9示出了本发明实施例2提供的不同浓度的杨梅酮溶液对油茶种皮中表儿茶素含量的影响柱形图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不限于下面公开的具体实施例的限制。

前期研究中，取样时间为从210DAP开始取样，每隔7天取一次样品，直至333DAP果实成熟。将收集到的种子进行表型指标以及内含物含量测定。综合分析发现210DAP、235DAP、258DAP、292DAP和333DAP表现出差异，因此后续选择这些日期作为基准进行分析。

实施例1

材料

选用国申优良品种“华硕”为材料，种植于中南林业科技大学材料示范园区(湖南省长沙市望城区)。选取土肥水管理均匀，长势均一，无病虫害的20棵油茶树。其中两棵油茶树取授粉后不同天数的种子作为样本进行内源性褪黑素含量、杨梅酮含量测定和类黄酮含量测定。

1、内源性褪黑素含量的测定

选取210DAP、235DAP、258DAP、292DAP和333DAP的种子为研究材料，取0.5g种子在液氮中粉碎，用9mL 0.01mol/L PBS(pH 7.2-7.4)悬浮，25℃3000rpm离心20min，上清液用于测定内源性褪黑素含量。使用褪黑素ELISA试剂盒(上海晶康生物工程有限公司，中国上海)按照制造商的说明测定和计算内源性褪黑素含量。

结果如图1所示。从图1可以看出，内源褪黑素含量从210DAP增加至258DAP达到峰值，含量为44ng/g，相较于210DAP增加了1.21倍。随后褪黑素含量快速降低至292DAP，相较于258DAP降低了了37.95％。之后褪黑素含量保持稳定直至种子成熟。

2、杨梅酮含量测定

选取210DAP、235DAP、258DAP、292DAP和333DAP的种子为研究材料，液氮速冻后于-80℃中保存备用。取出超低温冷冻保存的油茶种子，进行真空冷冻干燥。干燥后的样品，利用研磨仪(MM 400,Retsch)在30Hz条件下研磨1.5min。称取100mg的粉末，利用含有0.1mg/L利多卡因作为内标的70％甲醇1.0mL于4℃提取过夜，期间涡旋三次，使提取更为充分。提取后，10,000g离心10min，吸取上清，用微孔滤膜(0.22μm)过滤样品，并保存在进样瓶中随后用于LC-MS/MS分析。UPLC分析条件主要包括：①色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C181.8μm(2.1mm*100mm)；②流动相：水相为超纯水(加入0.04％的乙酸)，有机相为乙腈(加入0.04％的乙酸)；③洗脱梯度：0min水/乙腈(95:5V/V)，11.0min为5:95V/V，12.0min为5:95V/V，12.1min为95:5V/V，15.0min为95:5V/V；④流速0.4mL/min；柱温40℃；进样量2μL。分离的样品进入ESI-QTRAP-MS进行质谱分析。质谱条件主要包括：电喷雾离子源温度：550℃；质谱电压：5500V；帘气：25psi；碰撞诱导电离参数设置为高；每个离子对根据优化的去簇电压和碰撞能进行扫描检测。所得到的数据利用软件Analyst 1.6.1(AB SCIEX)进行数据处理。

质谱数据处理方法：

(1)代谢物定性：根据公共数据库与自建数据库对代谢物进行定性分析。代谢物结构解析参考Mass Bank、KNAPSAc K、HMDB、MoTo DB和METLIN等已有的质谱公共数据库。

(2)代谢物定量：利用三重四级杆质谱的多反应监测模式(multiple reactionmonitoring，MRM)进行分析。通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度(CPS)，用Multia Quant软件打开样本下机质谱文件。获得不同样本的代谢物质谱分析数据后，对所有物质质谱峰进行峰面积积分，并对其中同一代谢物在不同样本中的质谱出峰进行积分校正，以确保定量的准确性。最后导出所有色谱峰面积积分数据保存。

测定结果如图2所示。从图2可以看出，杨梅酮含量从210DAP迅速降低至258DAP，相较于210DAP降低了99.91％。之后含量保持稳定直至种子成熟。

3、类黄酮含量测定

选取210DAP、235DAP、258DAP、292DAP和333DAP的种子为研究材料，将油茶种子在液氮中碾磨成粉末状，无明显颗粒感；称取500mg粉末置于离心管中，加入7ml浓度为70％的甲醇溶液，浸提30min后，放入超声波破碎仪中提取20min；将粗提液离心处理，转速为10000r、离心时间为10min，离心后移取上清液；将滤渣加入3ml的70％的甲醇溶液重新提取，离心后，合并两次上清液；将上清液置于氮吹仪中浓缩干燥至原液的1/3体积；将浓缩液过0.22μm口径的有机滤膜保存于进样瓶中，4℃保存用于HPLC分析。

(1)色谱条件主要包括：①仪器与色谱柱：Agilent 1200Infinity Series LC；Agilent Eclipes Plus C18液相色谱柱(4.6mm×100nm，3.5μm)；②流动相A：乙酸水溶液(超纯水添加0.01％体积的冰乙酸)；流动相B：纯乙腈溶液；③洗脱梯度0-5min，15％-20％流动相B；5-10min，20％-25％流动相B；10-15min，25％-45％流动相B；15-20min，45％-80％流动相B；20-25min，80％-45％流动相B；25-26min，45％-15％流动相B；26-30min，15％流动相B；④流速0.6ml/min；柱温30℃；进样量10μl；检测波长280nm。

(2)计算方法：

①标准溶液的配制：分别将芦丁、表儿茶素、金丝桃苷、异槲皮苷、柚皮素溶解在甲醇溶剂中，配制成浓度为0.1mg/ml、0.125mg/ml、0.17mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml的标准溶液。

②根据检测方法，利用标准品的标准曲线采用外标法计算油茶种子中类黄酮的含量。

结果如图3所示。从图3可以看出，类黄酮含量从210DAP显著降低至235DAP，随后迅速增加至258DAP达到峰值，含量为893.39μg/g。之后258DAP开始缓慢减少至种子成熟，在333DAP的类黄酮含量相较于258DAP减少了41.72％。

其中，上述内容中，DAP表示授粉后天数，如210DAP为授粉后第210天。

4、褪黑素、杨梅素与类黄酮含量的相关性分析

根据上述方法测定得到的内源褪黑素、杨梅酮以及类黄酮的含量，使用RStudio1.3.959(RStudio,Boston,Massachusetts,USA)中的corrplot包进行相关性分析。

结果如图4所示。根据图4所示，褪黑素含量与类黄酮正相关，相关性为0.71，而与杨梅酮负相关(-0.65)。杨梅酮与类黄酮负相关，相关系数只有-0.25，呈现不显著负相关。杨梅酮可以作为褪黑素的抑制剂判断其对类黄酮含量的影响。

实施例2

1、基于显微技术观察油茶种子中类黄酮的分布情况

将授粉后第258天的新鲜油茶种子徒手切成的种皮和种仁进行类黄酮染色，具体地：将新鲜徒手切成的种皮和种仁用在0.01％(V/V)Triton X-100中的2.52mg/mL二苯硼酸2-氨基乙基酯染色25分钟，并在水中洗涤2分钟。使用共焦激光扫描显微镜cLSM-510META(版本4.2SP1)连接到Axiovert 200M(卡尔.蔡司)上拍摄图像。设置如下：类黄酮的激发波长是488nm，发射波长是500-650nm。所有图像均使用LSM图像浏览器4.2版(Carl Zeiss)处理。

结果发现，类黄酮主要分布于细胞壁附近，虽然在油茶种子和种仁中均有分布，分析发现在种皮中的含量为298μg/g*FW，而种皮中的含量为699μg/g*FW，种皮中的累积显著高于种仁。因此，后续以油茶种皮作为研究对象，来研究激素处理后对种皮中类黄酮含量的影响。

2、激素喷施

材料同实施例1，不同的是，将其余18棵油茶树在不同的授粉后的天数进行不同的处理。不同处理包括CK组、褪黑素处理组和杨梅酮处理组，不同组分为不同时间喷施不同的液体，其中，CK(阴性对照)喷施的液体为含有体积浓度为0.1％酒精和体积浓度为0.01％Tween-20中的清水溶液；褪黑素处理组是以含有体积浓度为0.1％酒精和体积浓度为0.01％Tween-20中的清水溶液作为溶剂溶解不同浓度的褪黑素(50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L)；杨梅酮处理组是以含有体积浓度为0.1％酒精和体积浓度为0.01％Tween-20中的清水溶液作为溶剂溶解不同浓度的杨梅酮(50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L)。

每个处理包含2棵树，喷施整株油茶树，每四周喷施一次直至果实成熟，喷施时间选择阴天或者傍晚，并且每棵树要均匀喷施直至树体呈滴水状态以保证充分吸收。喷施后每隔2周收集材料，若收集材料与喷施为同一天，先收集材料，然后再进行喷施。每个处理组分别采摘20个果实(两棵树各10个果实)。去除果壳后，选择大小正常、无机械损伤、无病虫害的种子，准备3次生物学重复。液氮速冻后放置于-80℃冰箱保存备用。

类黄酮含量测定：

将不同处理组以及CK组的油茶种子的种皮分离，然后将种皮在液氮中碾磨成粉末状，无明显颗粒感；后续测定同实施例1关于类黄酮含量测定步骤。

结果如图5-图9所示。

图5展示了褪黑素不同时间处理后于不同时间取样的样品中的类黄酮含量的变化柱形图。具体地，如图5所示，处理后4-10周，相较于其他浓度的褪黑素，150mmol/L褪黑素(M150)显著增加了种皮中类黄酮的含量，并且150mmol/L褪黑素处理的种皮中类黄酮含量相较于CK增加超过了37％。而且在处理后6周时的种皮中类黄酮含量达到峰值，含量为1156.44μg/g。但是从处理后12周开始，褪黑素处理的种皮中类黄酮含量均低于未处理种皮中或与未处理种皮差别不明显，其中最明显的是50mmol/L褪黑素(M50)显著降低了类黄酮含量，尤其是在处理后16周时类黄酮相较于未处理种皮显著降低了40.45％。此外，高浓度的褪黑素(200mmol/L；M200)对种皮中的类黄酮含量影响并不稳定，时而增加时而减少。综上所述，100-150mmol/L褪黑素可在适当处理时间中增加类黄酮的含量，并以150mmol/L褪黑素处理为佳，取样时间为4-6周为佳，尤以6周更佳。而该阶段主要是油茶果实成熟之前，之后类黄酮含量降低可能是因为油脂迅速累积的原因。

图6和图7分别展示了褪黑素不同时间处理后于不同时间取样的样品中的表儿茶素和芦丁含量的变化柱形图。其他类黄酮如金丝桃苷、异槲皮苷和柚皮素未检测出，说明褪黑素主要是对表儿茶素和芦丁起作用。

对于表儿茶素的影响：在处理后4-14周，不同浓度的褪黑素基本均提高了种皮中表儿茶素的含量。其中，在处理4-8周取样的样品中，50-150mmol/L褪黑素组均显著提高了种皮中表儿茶素的含量；在处理4-10周取样的样品中，50-100mmol/L褪黑素组均提高了种皮中表儿茶素的含量；其中以在处理4-6周取样的样品中，100-150mmol/L褪黑素组提高种皮中表儿茶素的含量更显著；并以在处理6周取样的样品中，100-150mmol/L褪黑素组提高种皮中表儿茶素的含量最显著。

即该图说明，主要是100和150mmol/L褪黑素(MA00,M150)具有显著效果，尤其是在处理6周，相较于未处理种皮中，MA00和M150使表儿茶素含量分别显著增加了352.48和389.02％。之后随着处理时间的增加，表儿茶素含量也在逐渐降低。

对于芦丁的影响：如图7所示，在处理4-6周取样的样品中，50-150mmol/L褪黑素处理组基本均增加了芦丁的含量；如在处理4周取样的样品中，50-150mmol/L褪黑素均显著增加了芦丁的含量，而在处理6周取样的样品中，50、150-200mmol/L褪黑素均显著增加了芦丁的含量，并且这些浓度之间不存在显著差异。在处理8-16周时，各浓度褪黑素对种皮中的芦丁含量没有显著影响或降低了芦丁含量。

图8和图9展示了杨梅酮不同时间处理后于不同时间取样的样品中的类黄酮含量和表儿茶素含量的变化柱形图。

杨梅酮(Myricetin,Myr)是一种黄酮类化合物，也可能是褪黑激素生物合成的抑制剂。在杨梅酮整个处理期间，油茶种皮中的类黄酮低于CK或与CK无差别。在处理2-6周时，种皮中类黄酮含量基本随着杨梅酮浓度的增加而增加，尤其是在处理6周时，相较于50mmol/L杨梅酮(Y50)，200mmol/L杨梅酮(Y200)使类黄酮含量显著增加了60.48％，此时的含量为693.53μg/g。在该处理阶段，CK中类黄酮的含量最高，是50mmol/L杨梅酮(Y50)的1.94倍。然而，在处理后8周之后，种皮中类黄酮含量随着杨梅酮浓度的增加而减少，影响最明显的是150mmol/L杨梅酮(Y150)，对比于未处理种皮，150mmol/L杨梅酮(Y150)处理使类黄酮含量减少了超过40％。虽然杨梅酮是一种类黄酮，但是在种子发育后期，种皮中的类黄酮含量在不断下降，因可能是造成杨梅酮抑制类黄酮累积的原因。此外，杨梅素可能是褪黑素合成的抑制剂的推论可能是正确的。

杨梅酮对其他类黄酮如金丝桃苷、异槲皮苷、柚皮素和芦丁的影响进行检测，未检测出，说明褪黑素主要是对表儿茶素起作用。如图9所示，在处理6周所取样品中，种皮中表儿茶素含量基本随着杨梅酮浓度的增加而增加，并且均高于未处理种皮中的表儿茶素含量。其中，100mmol/L杨梅酮(Y100)的作用效果最显著，相较于CK，表儿茶素含量增加了71.04％。在其他处理后取样中，相较于CK，杨梅酮主要降低了表儿茶素的含量或差异不明显。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种促进油茶种子中类黄酮含量积累的方法，其特征在于，在油茶种子发育过程中增加油茶种子中的褪黑素含量。

2.根据权利要求1所述的促进油茶种子中类黄酮含量积累的方法，其特征在于，所述增加油茶种子中的褪黑素含量通过以下中的任一种或多种方式进行：

(a)在油茶种子发育过程中喷施褪黑素或褪黑素合成的前体物质；

(b)增加所述油茶种子发育过程中褪黑素合成关键基因的表达。

3.根据权利要求2所述的促进油茶种子中类黄酮含量积累的方法，其特征在于，在油茶授粉之日起的第258±7天采集油茶种子，提取油茶种子中的类黄酮。

4.根据权利要求2所述的促进油茶种子中类黄酮含量积累的方法，其特征在于，所述油茶种子包括种皮和种仁，若是提高油茶种皮中类黄酮含量，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施100-150mmol/L的褪黑素溶液，每隔四周喷施一次，喷施后的第4-6周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的类黄酮。

5.根据权利要求2所述的提高油茶种皮中类黄酮含量的方法，其特征在于，所述油茶种子包括种皮和种仁，若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为表儿茶素，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施50-150mmol/L的褪黑素溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第4-10周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的表儿茶素。

6.根据权利要求5所述的提高油茶种皮中类黄酮含量的方法，其特征在于，所述油茶种子包括种皮和种仁，若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为表儿茶素，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施50-150mmol/L的褪黑素溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第4-8周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的表儿茶素；

优选地，所述类黄酮为表儿茶素，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施100-150mmol/L的褪黑素溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第4-6周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的表儿茶素。

7.根据权利要求2所述的提高油茶种皮中类黄酮含量的方法，其特征在于，所述油茶种子包括种皮和种仁，若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为芦丁，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施50-150mmol/L的褪黑素溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第4周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的芦丁。

8.根据权利要求2所述的提高油茶种皮中类黄酮含量的方法，其特征在于，所述油茶种子包括种皮和种仁，若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为芦丁，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施50mmol/L的褪黑素溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第4-6周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的芦丁。

9.根据权利要求2所述的提高油茶种皮中类黄酮含量的方法，其特征在于，所述油茶种子包括种皮和种仁，若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为芦丁，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施150-200mmol/L的褪黑素溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第6周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的芦丁。

10.根据权利要求1所述的提高油茶种皮中类黄酮含量的方法，其特征在于，所述油茶种子包括种皮和种仁，若是提高油茶种皮中类黄酮含量，所述类黄酮为表儿茶素，在油茶授粉之日起的第210天开始喷施100mmol/L的杨梅酮溶液，每隔4周喷施一次，于喷施后的第6周采集油茶种子，提取油茶种子种皮中的表儿茶素。

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