CN102121005B - 葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFP1启动子序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFP1启动子序列及其应用，采用染色体步移并结合巢式PCR技术克隆了中国野生华东葡萄白粉病转录因子基因VpRFP1全长1249bp启动子序列，包含103个TATA-box和27个CAAT-box，具有8个与植物防御反应相关的元件，14个光反应元件，5个植物激素反应元件，其他合未知的元件14个。采用农杆菌介导的瞬时转化烟草叶片分析方法，对中国野生华东葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFP1启动子功能表明，该启动子具有较强的启动活性，并且能够积极响应病原菌的侵染及抗病信号物质，通过转基因方法提高小麦、水稻、番茄、玉米、大豆、油菜等植物的抗病能力以及抗高温能力。
Description
技术领域
本发明涉及植物抗病基因启动子克隆，特别是涉及葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFP1启动子序列及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术
植物在受到病原侵袭时，能够响应外界环境信号，通过一系列的信号转导途径传递到作用位点，进而做出防御应答，使寄主植物免受病原菌的侵害。植物对不同病原菌信号的反应机制各不相同，但信号分子均可将信号物质传递到转录因子并将其激活，通过转录因子与启动子特异的顺式作用元件相结合启动靶基因的转录表达，或者形成同源或异源二聚体，或者直接与蛋白质互作引起一系列的生理、生化反应，从而使植株表现出抗病性。在植物抗病应答过程中，涉及不同抗病信号转导途径中的多种基因，而植物抗病相关的转录因子调节植物获得抗性的过程中起着枢纽作用。
锌指蛋白普遍存在于植物中，其中还有一些是植物中特有。目前已经在拟南芥、矮牵牛、小麦、棉花、大豆以及水稻等植物中克隆了一些锌指蛋白。根据锌指蛋白的结构特征或功能差异，又可以分为TF111A蛋白、WRKY蛋白、GALA蛋白、PHD蛋白、DOF蛋白、RING蛋白等亚家族。环锌指(RING)为一类特殊的锌指蛋白，组成了很大的一个基因家族，广泛存在于动物，植物，微生物。在植物中，对环锌指家族基因进行的研究仅限于模式植物拟南芥，对于栽培作物研究较少，尤其在果树上研究更少。已有的研究结果表明，大部分环锌指家族基因具有泛素连接酶的活性，在泛素/26S蛋白酶体蛋白质降解途径中起识别底物的关键作用。环锌指型泛素连接酶在植物胚胎发育、激素响应、光形态建成，逆境胁迫中扮演着重要的角色，最近研究结果表明其在植物抗病反应过程中起重要的作用。
发明内容
本发明的目的在于提供葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFP1启动子序列及其通过转基因技术提高农作物的抗病能力。在克隆得到葡萄抗病基因VpRFP1的基础上，进一步通过染色体步移技术获得抗病基因VpRFP1的启动子序列，并通过启动子功能分析验证VpRFP1基因启动子的功能。
采用CTAB法提取葡萄基因组DNA，酶切基因组后纯化、连接接头，建立葡萄基因组步移文库，以文库库液作为聚合酶链式反应(PCR)反应模板，利用巢式PCR反应克隆VpRFP1的启动子序列，PCR产物经回收、连接至克隆载体，转化后筛选阳性克隆，测序分析后获得启动子序列1249bp；
将VpRFP1启动子序列克隆至瞬时表达载体，瞬时转化烟草，并进行生物或非生物胁迫处理，随后进行化学组织染色和β-葡萄糖醛酸乙酰转移酶(GUS)荧光定量分析葡萄VpRFP1启动子对各种逆境的反应。
本发明对葡萄接种白粉病原菌诱导抗病相关基因的表达，构建了cDNA文库获得107条表达序列标签，其中一条表达序列标签具有环锌指保守结构域，通过基因功能分析表明该基因具有抗病功能，基因的表达是由基因的启动子控制，进一步克隆了该环锌指基因的启动子序列并分析了其启动子功能。
附图说明
附图1为本发明巢式PCR扩增中国野生华东葡萄白河-35-1株系VpRFP1的启动子电泳图。
M：DL2000 Maker；1：EcoR I库/2轮PCR；2：Xba I库/2轮PCR。
附图2为本发明VpRFP1基因启动子瞬时表达载体构建示意图。
P0GUS：GUS基因前不含启动子，作为阴性对照；P35SGUS：CaMV 35S启动子连接在GUS基因前，作为阳性对照；PVpRFP1GUS：VpRFP1基因启动子连接在GUS基因前；PR-VpRFP1GUS：VpRFP1基因启动子反向连接在GUS基因前。
附图3为本发明VpRFP1基因启动子瞬时表达载体构建电泳检测图。
(A)BamH I与Pst I双酶切pCAMBIA1380载体，M：DL2000Marker，1：pCAMBIA1380载体，2：pCAMBIA1380载体双酶切；
(B)BamH I与PSt I双酶切pMD-19T/PVpRFP1，pMD-19T/PR-VpRFP重组载体，M：DL2000Marker，1：pMD-19T/PVpRFP1重组载体，2：pMD-19T/PVpRFP1重组载体双酶切，3：pMD-19T/PR-VpRFP重组载体，pMD-19T/PR-VpRFP重组载体双酶切；
(C)BamH I与PSt I双酶切PVpRFP1GUS，PR-VpRFP1GUS重组载体，M：DL2000Marker，1：PVpRFP1GUS重组载体，2：PVpRFP1GUS重组载体双酶切，3：PR-VpRFP1GUS重组载体，PR-VpRFP1GUS重组载体双酶切。
附图4为本发明VpRFP1基因启动子对病原菌的响应图。
(A)瞬时表达载体示意图；(B)用于瞬时转化的烟草叶片；(C)GUS组织染色检测中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子对病原菌的响应；(D)GUS荧光活性检测中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子对病原菌的响应。
附图5为本发明VpRFP1基因启动子对信号分子、高温低温的响应图。
(A)GUS荧光活性检测中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子对高温的响应；(B)GUS荧光活性检测中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子对低温的响应；(C)GUS荧光活性检测中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子对MeJA的响应；(D)GUS荧光活性检测中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子对SA的响应。
具体实施方式
以下结合实施例及附图对本发明做进一步详细描述：
实施例一：葡萄VpRFP1基因启动子的克隆及序列分析
a.葡萄基因组DNA的提取采用CTAB法，取0.2-0.5g幼嫩叶片置于研钵中，加入液氮后研磨成粉末，将粉末迅速装入2ml的离心管中，加入500μl CTAB buffer，再加入100μl 20％的PVP充分混匀，加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，颠倒离心管混匀，65℃温育30min，冷却至室温后，12000rpm离心10min；取上清转移至另一干净的离心管中，加二倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，室温下静置15-30min，沉淀DNA；在2ml离心管中加入1ml70％乙醇，将DNA转入其中洗涤一次；在2ml离心管中加入1ml无水乙醇，将DNA转入其中洗涤一次；倾去无水乙醇，留DNA于管底，置于超净工作台上短暂干燥；加入500μl高盐TE溶解DNA；加入RNase至终浓度为20μg/ml，37℃温育30-60min；加入2倍体积无水乙醇，1/10体积3M NaAc(pH5.2)，-20℃放置1-2h；将沉淀出的DNA转移至1.5ml离心管中，然后用70％乙醇洗涤一次，倾去70％乙醇，留DNA于管底进行干燥；加入适量的TE溶解DNA，置于-40℃冰箱保存备用；
b.葡萄基因组步移文库的建立，取1-2μl葡萄基因组DNA分别用粘性末端限制性内切酶EcoR I、Sal I进行单酶切，酶切体系为：
基因组DNA 15μl
10×反应缓冲液 2μl
限制性内切酶 1μl
灭菌蒸馏水 2μl
37℃酶切24h，酶切后的DNA用等体积的苯酚：氯仿、氯仿各抽提一次，加入二倍体积的无水乙醇和1/10体积3M的NaAc，混匀，13000rpm/min离心10min，沉淀用75％酒精洗涤一次，自然干燥后溶于20μl去离子水中，取8μl用于连接反应；连接反应体系组分为：
10×连接反应缓冲液 2μl
酶切的基因组DNA 8μl
相应的内切酶衔接头 4μl
连接酶 2μl
灭菌蒸馏水 4μl
16℃连接16h，65℃加热10min终止连接反应，所得产物即为葡萄基因组步移文库，库液用作PCR反应模板；
c.巢式PCR反应以所得库液为模板，进行两轮巢式PCR反应，第一轮PCR：模板1μl，高保真Taq酶，0.5μl，Cassette Primer C1：GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA 1μl，Special Primer S1：ATCACGTCAAACAAAAGAGGACAAACAACA 1μl，10×PCR缓冲液5μl，灭菌蒸馏水补齐至50μl，反应程序为：95℃5min；95℃30S，68℃30S，72℃3min，30个循环；72℃10min；4℃10min，所得PCR产物稀释10倍，用作第二轮PCR：模板1μl，高保真Taq酶，0.5μl，Cassette Primer C2：CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA，Special Primer S2：CCCTCTTCTTCTTGCCGAACTCCTTAGAGA 1μl，10×PCR缓冲液5μl，灭菌蒸馏水补齐至50μl，反应程序同上；
d.PCR产物回收与连接所得PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，将大于1000bp的电泳条带进行分别回收，回收的PCR产物连接到pMD19-T载体上；连接反应为：PCR产物 2μl
pMD19-T载体 0.5μl
Solution I 2.5μl
样品混匀离心后，置于4℃12h进行连接反应；
e.转化与测序连接产物转化至TOP 10感受态细胞，涂板到在附加100mg·L-1Amp培养基上进行蓝白斑筛选，经菌液PCR与质粒酶切检测为阳性克隆后测序，得到启动子序列1249bp；
f.葡萄VpRFP1基因启动子序列分析，将克隆得到的中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子序列进行顺势作用元件的预测分析，预测分析显示该启动子具有植物启动子的典型特征，具有103个TATA-box和27个CAAT-box，此外还具有8个与植物防御反应相关的元件，14个光反应元件，5个植物激素反应元件，其他合未知的元件14个，8个与植物防御反应相关的元件分别为3个TC-rich重复元件，该元件与植物的防御和胁迫反应相关；1个TCA元件，该元件与水杨酸(SA)反应相关；1个TGACG基序，该基序与茉莉酸甲酯(MeJA)反应相关；1个CGTCA基序，该基序与茉莉酸甲酯(MeJA)反应相关；1个HSE元件，该元件与高温胁迫反应相关；1个MRE元件，该元件为MYB转录因子的一个结合位点；
实施例二：葡萄VpRFP1基因对病原菌的反应
采用SDS/酚法提取接种病原菌后不同时期叶片的总RNA，按PrimeScriptTM RT-PCR Kit说明进行反转录，7个不同时期的反转录产物作为Real-time PCR模板，检测中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1在抗感病株系中对病原菌的反应，Real-time PCR按照TAKARA公司的SYBR PremixEx TMTaqII试剂盒进行操作，反应体系为：模板1μl，SYBR Mix 12.5μl，正反向引物各1μl，灭菌蒸馏水补齐至25μl，反应程序为：95℃5min；95℃30S，68℃30S，72℃30S，30个循环；72℃5min；4℃10min，VpRFP1正向引物为5’-GCAAACAGTCCCACAAGTC-3’，反向引物为5’-CTGAACAACACCCACCACT-3’，VpGAPDH作为内参基因，正向引物为5’-TTCACTGACAAGGACAAGGC-3’，反向引物为5’-CCAACAACGAACATAGGAGC-3’，PCR反应在Bio-Rad公司的iCycler iQ5Real-time PCR仪上进行，Thresh值按PCR仪默认为30，分别记录每个反应荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数，然后用以未接种白粉菌的叶片为对照，对不同时间点VpRFP1基因的相对表达量进行规一化；
实施例三：葡萄VpRFP1基因启动子对生物和非生物胁迫的响应
将中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子序列连接到植物瞬时表达载体pC0390GUS上，检测中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子的活性以及该启动子对病原菌、病原菌相关信号分子、高温低温的反应活性，利用中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子序列的正向引物5’-GGGGGATCCGTGGATGTGTTAAATTAAGTGGAGTTTATAGG-3’，反向引物5’-GGGCTGCAGGGTTGAGTCGAGTCGCCTTCACAGAACGG-3’进行PCR反应，得到中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子序列的全长，克隆到植物瞬时表达载体pC0390GUS，经测序验证启动子序列正确后，重组载体转化至农杆菌GV3101中，进行农杆菌介导的瞬时转化烟草叶片，瞬时转化后对烟草叶片接种烟草赤星病病原菌，随后进行化学组织染色和GUS荧光定量分析中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子对病原菌的反应，结果表明该启动子具有较强的启动活性，并且能够积极响应病原菌，暗示VpRFP1启动子对启动抗病基因的表达具有积极地作用，进一步用抗病相关的信号分子处理烟草叶片，结果表明VpRFP1启动子能够积极地响应抗病信号物质，同时对烟草进行高温和低温处理，说明VpRFP1启动子能够积极地响应高温，但对低温没有反应。
Claims (3)
1.葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFP1启动子序列，其特征在于：抗白粉病转录因子基因VpRFP1启动子全长序列1249bp是：
GTGGATGTGT TAAATTAAGT GGAGTTTATA GGATAATAGA TATCATCAAG GTTAAAAAAA
TTGTCATAAT AGATGAAGAT AAGGGTTTGT TTGATTATTG TTTCTTTCTT TCAATATATA
TTTTTTATAT TTAGTGTTTT ATTTTCAATC ATTTTACATG TTTATATAAT TATTTTTTAA
AATGGTTTTT AAAAAATAAG TGAAAACAAT ATAAAATAAT TAAAAGATGT TATAAAAAAA
TATTTTGGCT TTGTTTGATA ATTGTCTTAA AAAATAATTA TAAAAAATAG GTTTTTAGAA
CAAGTTTTAA AAATTGTTTT ATTGATTTTA ATAGAGCAAA AGTTTATTTA AAAACCTAAA
ATATTTTTAA ATATTTTGCA TACCCAATGG TTTATTTTTA ATAATTTTAT ATGTTTATAT
AATTATTTTT TAAAATAATT TAAAAAAAAC AAGTGAAAAT AATATAAAAG AACTCAAATA
TATTATTTGA AGACAAAAAA CAATTTTTGG TTGTCAACAA TGTTTTTTGT TATGGATAAT
AGAAGACTAT TCTAAAAAGT AGTTTCCAAA TCGACCCTAT TTTCTGTTCG AAAATTATTT
AGAATCCATG TAGTAATTTT AGGAAGCATT TTTAAGTTTT TTCACACTTC AAACATTTCT
ATATTTAAAG TATTAAAAAA AAGAAGGTAA AAACACTTTT GGAAATAGCA AACACTCTTA
ATTAATTATA TTTTAAAAAT TATTTTAAAA ATAGACTTAA AGGAAAATTT GGCCATATTA
TCTTGAGCAG ATGGTAAGAA AATTGAGGGT GAAGAGATAA TCGTGTAATA ATTACATTAA
TTAATGGCAT AATCCAAATT TAGTACAACA GGAAGGCAAA GACAAATAAA ATAGAGAAAA
AGGTGCCACC AACCTTAAAC GCCCTCACAA AACGACGTCG CCTCAGTGTT GATATGCGAT
TTCCTAGGAA TTTTTGTGCC CATAGGAACA TGAGAAATCA AGCTTTCAAC AGAAGGGTAG
CTCGGAAAAT TAGTTGAAAA CCAGGGGTGG TTTGGTAACT TAGCTACTAT AAATTCCTAA
ATCGGAGGGT TTGATTTGTT GGTCTGGGAC AAGGGGTTGA GCGAAGCAGA GGAGTTTCCG
TTATCCATTT TCTATCTAAA TTTGCTCTCT AAGAAATTGA CGGGATATTT TCTCGAGAAA
ATTAGGGTTT TTTGGAATTT CCGTTCTGTG AAGGCGACTC GACTCAACC。
2.根据权利要求1所述的葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFP1启动子序列，其特征在于：中国野生华东葡萄白河35-1 VpRFP1基因启动子的克隆及序列分析如下：
2.a中国野生华东葡萄白河35-1基因组DNA的提取采用CTAB法，取0.2-0.5g幼嫩叶片置于研钵中，加入液氮后研磨成粉末，将粉末迅速装入2ml的离心管中，加入500μl CTAB buffer，再加入100μl 20％的PVP充分混匀，加入等体积的比例为24∶1的氯仿与异戊醇，颠倒离心管混匀，65℃温育30min，冷却至室温后，12000rpm离心10min；取上清转移至另一干净的离心管中，加二倍体积的无水乙醇或等体积的异丙醇，室温下静置15-30min，沉淀DNA；在2ml离心管中加入1ml 70％乙醇，将DNA转入其中洗涤一次；在2ml离心管中加入1ml无水乙醇，将DNA转入其中洗涤一次；倾去无水乙醇，留DNA于管底，置于超净工作台上短暂干燥；加入500μl高盐TE溶解DNA；加入RNase至终浓度为20μg/ml，37℃温育30-60min；加入2倍体积无水乙醇，1/10体积3MpH值为5.2的NaAc，-20℃放置1-2h；将沉淀出的DNA转移至1.5ml离心管中，然后用70％乙醇洗涤一次，倾去70％乙醇，留DNA于管底进行干燥；加入适量的TE溶解DNA，置于-40℃冰箱保存备用；
2.b中国野生华东葡萄白河35-1基因组步移文库的建立，取1-2μl葡萄基因组DNA分别用粘性末端限制性内切酶EcoR I、Sal I进行单酶切，酶切体系为：
37℃酶切24h，酶切后的DNA用等体积的苯酚：氯仿、氯仿各抽提一次，加入二倍体积的无水乙醇和1/10体积3M的NaAc，混匀，13000rpm/min离心10min，沉淀用75％酒精洗涤一次，自然干燥后溶于20μl去离子水中，取8μl用于连接反应；连接反应体系组分为：
16℃连接16h，65℃加热10min终止连接反应，所得产物即为葡萄基因组步移文库，库液用作PCR反应模板；
2.c巢式PCR反应以所得库液为模板，进行两轮巢式PCR反应，第一轮PCR：模板1μl，高保真Taq酶，0.5μl，Cassette Primer C1：GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA 1μl，Special Primer S1：ATCACGTCAAACAAAAGAGGACAAACAACA 1μl，10×PCR缓冲液5μl，灭菌蒸馏水补齐至50μl，反应程序为：95℃5min；95℃30S，68℃30S，72℃3min，30个循环；72℃10min；4℃10min，所得PCR产物稀释10倍，用作第二轮PCR：模板1μl，高保真Taq酶，0.5μl，Cassette PrimerC2：CGTTAGAACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGA，Special Primer S2：CCCTCTTCTTCTTGCCGAACTCCTTAGAGA 1μl，10×PCR缓冲液5μl，灭菌蒸馏水补齐至50μl，反应程序同上；
2.d PCR产物回收与连接所得PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，将大于1000bp的电泳条带进行分别回收，回收的PCR产物连接到pMD19-T载体上；连接反应为：
PCR产物 2μl
pMD19-T载体 0.5μl
Solution I 2.5μl
样品混匀离心后，置于4℃12h进行连接反应；
2.e转化与测序连接产物转化至TOP 10感受态细胞，涂板到在附加100mg·L-1Amp培养基上进行蓝白斑筛选，经菌液PCR与质粒酶切检测为阳性克隆后测序，得到启动子序列1249bp；
2.f中国野生华东葡萄白河35-1 VpRFP1基因启动子序列分析，将克隆得到的中国野生华东葡萄抗白粉病基因VpRFP1启动子序列进行顺势作用元件的预测分析，预测分析显示该启动子具有植物启动子的典型特征，具有103个TATA-box和27个CAAT-box，此外还具有8个与植物防御反应相关的元件，14个光反应元件，5个植物激素反应元件，其他的元件14个，8个与植物防御反应相关的元件分别为3个TC-rich重复元件，该元件与植物的防御和胁迫反应相关；1个TCA元件，该元件与水杨酸反应相关；1个TGACG基序，该基序与茉莉酸甲酯反应相关；1个CGTCA基序，该基序与茉莉酸甲酯反应相关；1个HSE元件，该元件与高温胁迫反应相关；1个MRE元件，该元件为MYB转录因子的一个结合位点。
3.根据权利要求1所述的葡萄抗白粉病转录因子基因VpRFP1启动子序列的应用，其特征在于：将VpRFP1启动子序列克隆至瞬时表达载体，瞬时转化烟草，并进行生物或非生物胁迫处理，随后进行化学组织染色和β-葡萄糖醛酸乙酰转移酶荧光定量分析葡萄VpRFP1启动子对各种逆境的反应。
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| CN102121005A (zh) | 2011-07-13 |
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