JP2003528568A - 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法 - Google Patents
組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法Info
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Abstract
Description
ムは約4.6kgの長さであり、145ヌクレオチドの逆方向末端反復配列(ITRs)を含
む。2つのオープンリーディングフレイムが一連のrepおよびcapポリペプチドを
コードする。repポリペプチド(rep78、rep68、rep62およびrep40)はAAVゲノム
の複製、レスキュー(rescue)および組込みに関与する。capタンパク質(VP1、VP
2およびVP3)は、ビリオン キャプシドを形成する。5'および3'末端でrepおよび cap オープンリーディングフレイムを挟むのは、145bpの逆方向末端反復配列(IT
Rs)であり、その最初の125bpはY-またはT-形の二重構造を形成することができ
る。AAVベクターの開発に重要なことは、全repおよびcapドメインが切り出され
、そして治療用またはレポーター導入遺伝子と交換できることである[B.J.Cart
er、「パルボウイルスのハンドブック」で、P.Tijsser編集、CRC出版、155〜168
頁(1990)]。ITRsはAAVゲノムの複製、レスキュー、パッケージングおよび組込
みに必要な最小配列を表すことが示された。
染色体19に組み込まれ、細胞の潜伏感染をもたらす。感染性ウイルスの生産およ
びウイルスの複製は、細胞をアデノウイルス(Ad)またはヘルペスウイルスのよ
うな溶菌性のヘルパーウイルスと混合感染(coinfected)しない限り起こらない。
ヘルパーウイルスの感染で、AAVプロウルスはレスキューされ、そして増幅し、
そしてAAVおよびヘルパーウイルスの両方が生産される。親のssDNSを感染するこ
とは、rep遺伝的様式で二重鎖複製形(RF)DNAへと広げられる。レスキューされた
AAVゲノムは、形成されたタンパク質キャプシド(直径約20nmの正二十面体)に
パッケージングされ、そして細胞の溶菌後に+または-ssDNAゲノムのいずれかを
パッケージングした感染性のビリオンとして放出される。
的となる独自の特徴を有し、そして様々な群が疾患状態の処置にAAVを使用する
可能性について研究された。本出願で使用するように、用語「導入遺伝子」は動
物に送達されることが望まれるDNAを意味し、このDNAは非-AAV DNAである。しか
し所望の導入遺伝子の状態でDNAを速達するために、形質導入ベクターとしてAAV
を確立することに対する進展は、種々の理由から遅れた。
(encapsidation)および感染性ビリオンの生産に関する高度に効率的なスキー
ムがなかったことであった。R.Kotin,Hum.Gene Ther.,5:793-801(1994)を参照に
されたい。この問題に取り組む1つの方法は、組換えAAV(rAAV)(これは送達
すべきDNAを有するが、repおよびcap遺伝子を欠いている)を宿主細胞にトラン
スフェクションし、続いて野生型(wt)AAV(これはrepおよびcap遺伝子を供給
する)およびアデノウイルス(これはrAAV生産に必要であると言われてきた少な
くとも4つのアデノウイルス遺伝子;E1、E2、E4およびVAIを供給する)での混
合感染が関与する[例えばCarter、同上、を参照にされたい]。しかしこの方法
では混合感染が強制的であり、そして非-相同的組換えから生じる許容できない
高レベルのwtAAVおよび生産されたrAAVへのwtAAVの混入を導く。他のウイルスま
たはプラスミドの混入は、rAAVの精製を必要とする。混入wt AAVまたはヘルパー
アデノウイルスの不存在下で細胞をrAAVとインキューベーションすると、わずか
な組換え体の遺伝子発現しか生じない。
る手段には、2つの異なる相補する(complementing)プラスミドを用いたコ−ト
ランスフェクション(co-transfection)が必要である。このようなプラスミド
の1つは、2つのシスに作用するAAV ITRsの間に挟まれた治療用またはレポータ
ー導入遺伝子を含む。子孫の組換え体ゲノムのレスキューおよびその後のパッケ
ージングに必要なAAV成分は、repおよびcapタンパク質のウイルスオープンリー
ディングフレイムをコードする第2プラスミドによりトランスで提供される。こ
の系では、Adヘルパー機能はwtアデノウイルスにより、またはHEK293細胞により
供給される失ったE1遺伝子を持つ複製−欠損性アデノウイルスにより提供される
。この方法の他の変更はすでに記載されている。例えば、米国特許第5,658,785
号明細書(これはrAAVゲノムで、およびAAV repおよびcap遺伝子で安定にトラン
スフェクトされた哺乳動物細胞、および宿主細胞をヘルパーウイルスで感染する
ことによる生産法に関する)を参照にされたい。
ーターにより置き換えられたAAVベクターをパッケージングするためのパッケー
ジング系および方法に関する。あるいは米国特許第5,622,856号明細書は、ホモ
ロガスなp5プロモーターがrep遺伝子の位置3'に移動し、場合によってはFRT配列
でrep/cap遺伝子および再配置p5プロモーターを挟むAAVベクター生産用の構築物
または方法に関する。
無しに、体細胞遺伝子療法用のベクターとして使用するためのAAVおよび組換えA
AVウイルスの効率的な生産を可能とするさらなる組成物および方法の必要性が存
在する。 発明の要約 本発明は、所望の導入遺伝子DNAを含むrAAVの効率的生産を可能とする。特に
本発明は、rAAV生産中に混入する再集成されたwtAAVを生産する事なく、rAAVの
生産を可能とする組成物および方法の両方を提供する。
よび選択細胞中でハイブリッドウイルスの複製を可能とするために十分なアデノ
ウイルス配列を含む、複製できる(replication-competent)ハイブリッドアデ
ノウイルス/AAVウイルスを提供する。1つの態様では、ハイブリッドウイルス
はハイブリッドウイルスがE4 ORF6機能に必要な配列を含むように、野生型アデ
ノウイルスE3領域に機能的欠失を、かつ/またはE4領域に非−必須アデノウイル
ス配列の欠失を含む。
ルス5'シス-要素;(b)組換えアデノ−随伴ウイルス(rAAV)ベクター;(c
)E3領域からのアデノウイルス配列の欠失;(d)E1aおよびE1b遺伝子産物の発
現を支配する調節配列の制御下のアデノウイルスE1aおよびアデノウイルスE1bを
コードする核酸配列、ここで該E1aおよびE1b核酸配列はE3領域の部位に位置する
;(e)複製およびパッケージングに必要なアデノウイルス3'シス-要素を含む
、アデノウイルス/AAVハイブリッドウイルスを提供する。
、組換えアデノ−随伴ウイルス(rAAV)の生産法、この方法は複製できるrAd/AA
VならびにAAV rep配列およびAAV cap配列をそれらの発現を支配する調節配列の
制御下に含んで成る宿主細胞を培養する工程を含んで成る。適当にはこの方法は
さらに、感染後のrAd/AAVハイブリッドの複製を制御する工程が含まれ、これに
よりrAAVの複製を強化する。好適な態様では、本発明の方法は複製できるrAd/AA
VがパッケージングされるrAAV構築物およびすべての必要なアデノウイルス配列
を提供し、使用するヘルパーウイルスが無く、しかも混入するwtウイルスに対す
る相同的組換えを可能とする十分なアデノウイルス配列が宿主細胞中に無いので
、精製工程が簡略化される。
らに記載する。 発明の詳細な説明 I.E1を発現するアデノウイルス/AAVハイブリッドウイルス 本発明は、組換えアデノウイルス/AAV(rAd/AAV)ハイブリッドウイルスを提供
し、ここでアデノウイルスはrAAVビリオンにパッケージングされるrAAV構築物、
および選択した宿主細胞中でハイブリッドウイルスの複製を可能とする十分なア
デノウイルス配列を含むように操作されている。好適な態様では、すべての必要
なアデノウイルス遺伝子が、rAd/AAVハイブリッドウイルスにより提供され、こ
れは野生型E3からアデノウイルス配列を失っていてよく、そしてアデノウイルス
配列の非機能的欠失を含んでもよく、例えばハイブリッドウイルスはE4 ORF6機
能を発現するために必要な配列を除くすべてのアデノウイルスのE4コード配列を
失ってもよい。rAAV構築物はアデノウイルスのE3またはE1領域のいずれかに挿入
され得る。場合によりE1遺伝子産物をコードする配列は、野生型E3領域に挿入さ
れ、そして発現される。別の態様では、本発明はE1遺伝子産物を発現しているが
、宿主細胞により供給される1以上の他の必要なアデノウイルス配列(例えば、
E2aおよび/またはE4 ORF6)は欠いているrAd/rAAVを提供する。以下に詳細に記
載する本発明のハイブリッドウイルスは、AAV rep配列およびAAV cap配列をそれ
らの発現を支配する調節配列の制御下に含む宿主細胞中でのrAAVの発現に有用で
ある。 A.アデノウイルス遺伝子配列 本発明のrAd/rAAVハイブリッドウルスに使用する最小アデノウイルス配列は、
アデノウイルスのシスに作用する逆方向末端反復(ITR)配列(これは複製起点
として作用する)である。最も好適にはこのようなITR配列は、アデノウイルス
の自然な5'および3'ITRを含む。しかし所望により、このような自然な配列に対
する修飾も操作され得る。あるいはハイブリッドウイルスは異なる血清型のアデ
ノウイルスに由来するITRsを含むように、あるいは2つの同一のITRsを含むよう
に操作することもできる。またrAd/rAAVハイブリッドウイルスは、直線状のAdゲ
ノムおよびE1プロモーターのエンハンサー要素をパッケージングするために必要
な配列を含んでもよい。このような配列は自然なアデノウイルス5'パッケージン
グ/エンハンサードメインにより都合よく提供され得る。さらにrAd/AAVハイブ
リッドウイルスは、選択された宿主細胞中でハイブリッドウイルスの複製を可能
とするために必要なアデノウイルスDNAを含む。
なるアデノウイルス配列を含むことができる。最も好ましくはすべての必要なア
デノウイルスの遺伝子産物、すなわちE1a、E1b、E2a、E2b、E4 ORF6、アデノウ
イルスの中期遺伝子IXおよびIXa、およびアデノウイルスの後期遺伝子L1、L2、
L3、L4およびL5が、ハイブリッドウイルスから発現される。アデノウイルス配列
は1以上の野生型アデノウイルスまたは突然変異体アデノウイルスから誘導して
もよい。
ている46のヒト型[例えば、Horwitz、同上およびアメリカン タイプ カルチャ
ー コレクションを参照にされたい]を含む1以上のアデノウイルス型の中から
選択することができる。同様に他の動物を感染させることが知られているアデノ
ウイルスは、遺伝子配列を供給することができる。各E1およびE2a遺伝子配列の
選択が本発明を限定することはない。Ad5型の血清型を含め多数のアデノウイル
ス血清型に関する配列は、ジーンバンクから入手可能である。種々のアデノウイ
ルス株は、バージニア州、マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ン(ATCC)から入手でき、あるいは様々な工業用および研究用提供元から入手す
ることができる。以下の実施例の態様では、E1およびE2a遺伝子配列は5型のア
デノウイルス血清型(Ad5)に由来するものである。
、それらの遺伝子産物または任意の機能的部分を意味する。同様に、核酸配列(
例えば遺伝子)またはそれらの機能的部分の任意の対立遺伝子または他の修飾を
含む。本発明で定めるように、「機能的部分または機能的フラグメント」とは、
必要な所望する機能を提供するために必要なコード配列または遺伝子産物の領域
である。そのような修飾は幾つかの様式で、ならびに自然に生じるそれらの対立
遺伝子変異により遺伝子産物(1つまたは複数)の機能を強化するための通例の
遺伝子操作または突然変異誘発法の手段により計画的に導入することができる。
「機能的欠失」とは、その領域の機能を提供するために必要な配列を欠くコード
配列または遺伝子産物の領域を称する。用語「機能的欠失」とは、領域の機能が
排除されることを意味するとは限らない。領域またはそれらのフラグメントの切
り出しは必要ではない。
3遺伝子産物をコードする配列を欠き、すなわちヘテロロガスな配列を複製およ
び感染には必須ではない自然なE3領域に挿入することを可能とする。そのような
ヘテロロガスな配列はアデノウイルスには自然ではない任意の核酸配列、または
同じアデノウイルスの非連続領域からの任意の核酸配列でよい。同様に、rAd/AA
Vハイブリッドウイルスは、必須なE4 ORF6を除きアデノウイルスE4コード配列を
欠いてもよい。適当にはrAd/AAVハイブリッドウイルスは、自然なアデノウイル
スゲノムのサイズの105%を越えないように操作される(例えば36kbの105%)。
すなわち所望するヘテロロガス配列の挿入を望む場合、rAd/AAVはハイブリッド
が操作されるアデノウイルス(1つまたは複数)に対して野生型の配列の他の非
機能的欠失を含むように操作することができる。そのような非機能的欠失は、ハ
イブリッドウイルスがハイブリッドウイルスの複製に必要な機能的遺伝子産物を
発現する能力を消さない欠失を含む。E4 ORF6配列を除くすべてのアデノウイル
スE4コード配列の欠失は、非機能的欠失の例である。他の適当な非機能的欠失も
、容易に設計することができる。
要なすべてのアデノウイルス遺伝子は、ハイブリッドウイルス自体により提供さ
れる。そのようなハイブリッドウイルスはビリオン中にパッケージングされるrA
AV構築物を含み、アデノウイルスのE3をコードするアデノウイルス配列を欠き、
そしてE4 ORF6機能を除くすべてのアデノウイルスE4コード配列を欠く。場合に
より、アデノウイルスE1aおよびE1b遺伝子産物は、野生型E1領域以外の領域から
発現されてもよく、例えばこのような遺伝子産物は野生型E3領域に挿入され、そ
して発現される。
遺伝子を欠いている。ハイブリッドウイルスから欠失した必要なアデノウイルス
の遺伝子産物は、選択したパッケージング細胞による生産プロセスで、または所
望の遺伝子産物の発現を支配する核酸配列によりトランスに供給され得る。好ま
しくはrAd/AAVはE1aおよびE1b遺伝子産物を発現する。1例では、rAd/AAVハイブ
リッドウイルスは野生型E1機能を含むが、E4 ORF6の発現に必要な配列を欠く。
この状況では、rAd/AAVハイブリッドがE4 ORF6の発現に必要な配列を含む宿主細
胞に導入される。別の例では、rAd/AAVハイブリッドウイルスは、rAAVの生産に
使用される宿主細胞中で機能を発現するE2aの発現に必要な配列を欠く。そのよ
うな宿主細胞を以下に詳細に説明する。
計は、発現を促進するために目的遺伝子に操作可能に連結された適当な配列を含
む。「操作可能に連結された」配列は、目的遺伝子と連続する発現制御配列およ
びトランスにまたは目的遺伝子の制御に対して遠くで作用する発現制御配列の両
方を含む。そのような発現制御配列を導入遺伝子と関連して詳細に検討する。
各アデノウイルス遺伝子のプロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモ
ーターまたは天然のプロモーター(すなわちプロモーターはアデノウイルス遺伝
子の5'フランキング領域と自然に結合しているものでよい)から独立して選択す
ることができる。プロモーターは生物または細胞の特別な生理状態(すなわち分
化状態により、または複製もしくは静止細胞中で)により、あるいは例えば外か
ら加えた因子により調節することができる。選択したプロモーターは、同一でも
異なっていてもよい。
ー、限定するわけではないがRSV LTRプロモーター/エンハンサー、CMV前初期プ
ロモーター/エンハンサー、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸シダクターゼプロ
モーター、細胞質β-アクチンプロモーターおよびホスホグリセロールキナーゼ
(PGK)プロモーターの制御下で発現される。
産物の細胞の生産の量および時期を制御するように、誘導性プロモーターがE1遺
伝子産物を発現するために使用される[例えば、William S.M.Wold,J.Cell Bioc hem. ,53:329-335(1993):J.Nevins,Current Opinion in Genetics and Decelopme nt ,4:130-134(1994);E.Harrington et al.,Current Opinion in Genetics and D ecelopment ,4:120-129(1994);G.Evan et al.,Current Opinion in Cell Biology ,7:825-834(1995);J.Nevins,Science,258:424(1992)を参照にされたい]。誘導
性プロモーターは、当該技術分野で既知の、および上記で検討したプロモーター
を含み、限定するわけではないが亜鉛−誘導性ヒツジ メタロチオニン(MT)プロ
モーター;デキサメタゾン(Dex)−誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモー
ター;T7プロモーター;エクジソン昆虫プロモーター;テトラサイクリン-抑制
系;テトラサイクリン-誘導系;RU486-誘導系;およびラパマイシン-誘導系を含
む。強力に調節され、そして高レベルのE1発現を提供する任意の種類の誘導性プ
ロモーターを使用できる。この内容において有用である他の種類の誘導性プロモ
ーターは、特別な生理的状態、例えば温度、急性期、細胞の特別な分化状態、ま
たは複製している細胞のみにより調節されるプロモーターである。 B.組換えAAVに構築物 rAd/AAVウイルスでは、AAV配列を自然なアデノウイルス配列が欠失している領
域のアデノウイルス骨格に導入し、そしてこれらを選択したアデノウイルス配列
により挟む。AAV配列は典型的には本発明の方法に従いrAAVビリオンにパッケー
ジングされるrAAV構築物(例えばカセット)の状態である。rAAV構築物は最小の
(5'から3'への)5'AAV ITR配列、選択したプロモーターおよび他の通例のベクタ
ー調節成分の制御下の選択した導入遺伝子、および3'AAV ITR配列を含む。この
ようなrAAV構築物の各成分を以下に検討する。また米国特許第5,856,152号およ
び同第5,871,982号明細書も参照にされたい。当業者はrAAV構築物を所望のアデ
ノウイルス領域に挿入するように、rAd/AAV ハイブリッドウイルスを容易に操作
することができる。1つの態様では、rAAV構築物はrAd/AAV ハイブリッドウイル
スのアデノウイルスE3領域に位置する。別の適当な態様では、rAAV構築物はrAd/
AAV ハイブリッドウイルスのアデノウイルスE1領域に位置する。しかし本発明は
このような例示する態様に限定されない。 1.AAV配列 使用するAAV配列は、好ましくはシスに作用する5'および3'逆方向末端反復配
列である[例えばB.J.Carter、「パルボウイルスのハンドブック(Handbook of
Parvoviruses)」、P.Tijsser編集、CRC出版、155〜168頁(1990)を参照にされた
い]。ITR配列は約145bpの長さである。好ましくはITRsをコードする実質的に全
配列が分子中で使用されるが、このような配列のわずかな程度の修飾は許容され
得る。このようなITR配列を修飾する能力は、当業者の技術的範囲内である。[
例えば、Sambrook et al.「モレキュラークローニング。ア ラボラトリーマニュ
アル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」、第2版、コールドスプリン
グハーバーラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)、ニューヨーク(1989
)のようなテキスト;Carter et al.、同上;およびK.Fisher et al.,J.Virol.,7 0 :520-532(1996)を参照にされたい]。本発明で使用するそのような分子の例は
、導入遺伝子を含む「シスに作用する」プラスミドであり、ここで選択した導入
遺伝子配列および付随する調節要素は5'および3'AAV ITR配列により挟まれてい
る。
ることができる。同様に、他の動物を感染させることが知られているAAV も、本
発明の分子または構築物で使用するこれらのITRsを提供することができる。例え
ばITRsは1型AAV、2型AAV、3型AAV、4型AAV、5型AAV、6型AAV、他の血清型
のAAVまたはデンソウイルスにより提供され得る。種々のAAV株がアメリカン タ
イプ カルチャー コレクションから入手することができ、あるいは様々な工業用
および研究用の提供源から入手することができる。以下の例示的態様では、AAV-
2が便宜的に使用されている。しかしこのような配列を提供するAAVの種および血
清型の選択は、本出願の教示に従い当業者の技術範囲内であり、そして以下の発
明を限定することはない。 2.導入遺伝子 本発明に従い、rAAV構築物は所望の導入遺伝子、プロモーターおよび宿主細胞
中でAAV配列により挟まれた導入遺伝子の発現を制御そして支配する他の調節要
素を含む。導入遺伝子配列はAAV配列に対してヘテロロガスな核酸配列であり、
導入遺伝子が目的のポリペプチドまたはタンパク質をコードする。導入遺伝子配
列の組成物は、生成するrAAVの意図する用途に依存する。例えば導入遺伝子配列
の1種はレポーターまたはマーカー配列を含んで成り、これは発現で検出可能な
シグナルを生成する。そのようなレポーターまたはマーカー配列は、限定するわ
けではないがβ-ラクタマーゼ、β-ガラクトシダーゼ(LacZ)、アルカリホスフ
ァターゼ、チミジンキナーゼ、緑色の蛍光タンパク質(GFP)、クロラムフェニ
コール アセチルトランスフェラーゼ(CAT)、ルシフェラーゼ、例えばCD2、CD4
、CD8を含む膜結合タンパク質、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質および
当該技術分野で周知の他の配列を含み、これらに向けられる高親和性抗体が存在
するか、または日常的に作成されることができ、そして融合タンパク質は中でも
赤血球凝集素またはMycに由来する抗原標識ドメインに適切に融合した膜結合タ
ンパク質を含んで成る。
ラフィー的、発色的、蛍光的または他の分光的アッセイ、蛍光活性化セルソーテ
ィングアッセイおよびELISA、RIAおよび免疫組織化学を含む免疫学的アッセイを
含む通例の手段により検出可能なシグナルを提供する。例えば導入遺伝子がLacZ
遺伝子である場合、rAAVの存在はベータ−ガラクトシダーゼ活性に関するアッセ
イにより検出される。同様に導入遺伝子がルシフェラーゼである場合、rAAVはル
ミノメーター中での光生産により測定することができる。
または動物に送達され得る非−マーカー遺伝子である。導入遺伝子は、タンパク
質、アンチセンス核酸(例えばRNA)、または触媒的RNAのような生物学的および
医学的に有用な広範な種類の遺伝子産物から選択することができる。本発明は遺
伝子欠失を矯正または改善するために使用することができ、ここで正常な遺伝子
が発現されるが、正常レベルよりは低く、そして機能的遺伝子産物が発現されな
い遺伝的欠陥を矯正または改善するために使用することができる。好適な種類の
導入遺伝子配列は、宿主細胞中で所望の遺伝子産物を発現する治療用遺伝子であ
る。このような治療用核酸配列は典型的には発現すると遺伝的または非−遺伝的
欠陥を矯正または相補することができるか、あるいは後成的な障害または疾患を
処置することができる産物をコードする。しかし選択した導入遺伝子は研究のた
めに望ましい任意の産物をコードすることもできる。この導入遺伝子の選択は本
発明を限定しない。導入遺伝子配列の選択は本出願の教示に従い、当業者の技術
的範囲内にある。
欠陥を矯正または改善するために使用することができるrAAVの製造法を含む。特
定の状況では、異なる導入遺伝子を使用してタンパク質の各サブユニットをコー
ドすることができる。これはタンパク質のサブユニットをコードするDNAのサイ
ズが大きい時、例えば免疫グロブリンまたは血小板由来増殖因子レセプターの時
に望ましい。細胞がマルチ−サブユニットタンパク質を生産するためには、細胞
は異なるサブユニットの各々を含有するrAAVに感染しなければならない。あるい
はタンパク質の異なるサブユニットは、同じ導入遺伝子によりコードされ得る。
この場合、1つの導入遺伝子が各サブユニットをそれぞれコードするDNAを含み
、各サブユニットのDNAはインターナルリボゾームエントリーサイト(internal
ribosome entry site:IRES)により分けられている。これはサブユニットをコ
ードする全DNAおよびIRESが5キロベースよりも小さくなるように、各サブユニ
ットをコードするDNAサイズが小さい時に望ましい。
ホルモン(GH)、副甲状腺ホルモン(PTH)、成長ホルモン放出因子(GRF)、濾
胞刺激ホルモン(FSH)、黄体ホルモン(LH)、ヒト絨毛膜ゴナドトロピン(hCG
)、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンギオポイエチン(angiopoietin)、アンギ
オスタチン(angiostatin)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)、エリスロポイ
エチン(EPO)、結合組織増殖因子(CTGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF
)、酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォー
ミング増殖因子α(TGFα)、血小板由来増殖因子(PDGF)、インスリン−様増
殖因子IおよびII(IGF-IおよびIGF-II)、TGFβ、アクチビン、インヒビンを含
んで成る任意のトランスフォーミング増殖因子β(TGFβ)スーパーファミリー、
あるいは骨形態形成タンパク質(BMP)BMPs1-15、増殖因子のヒグレリン/ニュー
レグリン/ARIA/neu分化因子(NDF)ファミリーの任意の1つ、神経成長因子(
NGF)、脳−由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン NT-3およびNT-4/5
,毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞系由来神経栄養因子(GDNF)、ノル
トリン(neurturin)、アグリン(agrin)、セマホリン(semaphorin)/コラプ
シンのファミリーの任意の1つ、ネトリン-1およびネトリン-2、肝細胞増殖因子
(HGF)、エファリン(ephrin)、ノギン、ソニック ヘッジホックおよびチロシ
ンヒドロキシラーゼを含むホルモンおよび成長および分化因子を含む。
が、トロンボポイエチン(TPO)、インターロイキン(IL) IL-1α、IL-1β、IL-
2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13
、IL-14、IL-15、IL-16およびIL-17、単球ケモアトラクタント(chemoattractan
t)タンパク質(MCP-1)、白血病抑制因子(LIF)、顆粒球−マクロファージ コ
ロニー刺激因子(GM-CSF)、Fas-リガンド、腫瘍壊死因子αおよびβ(TNFαお
よびTNFβ)、インターフェロン(INF)INF-α、INF-βおよびINF-γ、幹細胞因
子、flk-2/flk-3のようなサトカインおよびリンホカインを含む。免疫系により
生産される遺伝子産物も本発明に包含する。これらには限定するわけではないが
、免疫グロブリン IgG、IgM、IgA、IgM、IgDおよびIgE、キメラ免疫グロブリン
、ヒト化抗体、単鎖抗体、T細胞レセプター、キメラT細胞レセプター、単鎖T
細胞レセプター、クラスIおよびクラスII MHC分子ならびに単鎖MHC分子を含む操
作されたMHC分子を含む。遺伝子産物の用途には、補体調節タンパク質、膜コフ
ァクタータンパク質(MCP)、崩壊促進因子(DAF)、CR1、CR2およびCD59のよう
な補体調節タンパク質を含む。
カイン、調節タンパク質および免疫系タンパク質の任意のレセプターを含む。本
発明はコレステロール調節のレセプターを包含し、LDLレセプター、HDLレセプタ
ー、VLLDレセプターおよびスカベンジャーレセプターを含む。また本発明は、ス
テロイドホルモンレセプタースーパーファミリーのような遺伝子産物を包含し、
グルココルチコイドレセプターおよびエストラゲンレセプター、ビタミンDレセ
プターおよび他の核レセプターを含む。さらに有用な遺伝子産物は、jun、fos、
max、mad、血清応答因子(SRF)、AP-1、AP-2、myb、MRG1、CREM、Alx4、FREAC1
、NF-κB、ロイシン ジッパータンパク質の員、Zif268、EGR1、EGR2を含むC2H4
ジンクフィンガータンパク質、グルココルチコイドおよびエストロゲンレセプタ
ーのようなC6ジンクフィンガータンパク質、Pit1により例示されるPOUドメイン
タンパク質、HOX-1を含むホモドメインタンパク質、myc、MyoDおよびミオゲニン
を含む塩基性ヘリックス-ループ-ヘリックスタンパク質、EST-ボックスを含むタ
ンパク質、TFE3、E2F、ATF1、ATF2、ATF3、ATF4、ZF5、NFAT、CREB、HNG-4、C/E
BP、SP1、CCAAT-ボックス結合タンパク質、インターフェロン調節因子(IRF-1)
、Wilms腫瘍タンパク質、EST-結合タンパク質、STAT、GATA-ボックス結合タンパ
ク質、例えばGATA-3、およびウイング(winged)ヘリックスタンパク質のフーク
ヘッドファミリーのような転写因子を包含する。
スカルバミラーゼ、アルギノスクシネート シンセターゼ、アルギノスクシネー
ト リアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニ
ルアラニン ヒドロキシラーゼ、アルファ-1 アンチトリプシン、グルコース-6-
ホスファターゼ、低密度−リポタンパク質レセプター、ポルホビリノーゲン デ
アミナーゼ、第VIII因子、第IX因子、シスタチオン ベータ-シンターゼ、分岐鎖
ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル-CoA デヒドロゲナーゼ
、プロピオニル CoA カルボキシラーゼ、メチル マロニル CoA ムターゼ、グル
タリル CoA デヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルビ
ン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシ
ン デカルボキシラーゼ(P-プロテインとも言われている)、H-プロテイン、T-
プロテイン、メンケス病タンパク質、腫瘍抑制物質(例えばp53)、のう胞性繊
維症トランスメンブランレギュレーター(CFTR)、およびウィルソン病遺伝子PE
Dを含む。
ペプチドのようなポリペプチド、または挿入、欠失またはアミノ酸置換を含む自
然には存在しないアミノ酸配列を含む。例えば単鎖の操作した免疫グロブリンは
、ある種の免疫抑制患者には有用となることができる。他の種類の自然には存在
しない遺伝子配列は、アンチセンス分子およびリボザイムのような触媒的核酸、
これは遺伝子の過剰発現を下げることができる。
するために目的遺伝子に操作可能に連結された適当な配列を含むべきである。発
現制御配列は、適当な転写開始、終止、プロモーターおよびエンハンサー配列;
スプライシングおよびポリアデニレーションシグナルのような効率的なRNAプロ
セッシング シグナル;細胞質mRNAを安定化する配列;翻訳効率を強化する配列
(すなわち、コザックのコンセンサス配列);タンパク質の安定性を強化する配
列;および所望する時には、タンパク質の分泌を強化する配列を含む。莫大な数
の発現制御配列(天然の、構成的、誘導性および/または組織-特異的)が当該
技術分野では知られており、そして所望する発現の種類に依存して導入遺伝子の
発現を駆動するために使用することができる。真核細胞には、発現制御配列は典
型的にはプロモーター、エンハンサー(免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメ
ガロウイルス等から誘導されるようなもの)、およびスプライスドナーおよびア
クセプター部位を含むポリアデニレーション配列を含む。ポリアデニレーション
配列は一般に導入遺伝子配列の後、そして3'AAV ITR配列の前に挿入される。本
発明に有用なrAAV構築物は、望ましくはプロモーター/エンハンサー配列と導入
遺伝子との間に配置されたイントロンも含む。1つの可能なイントロン配列もSV
40に由来し、そしてSV-40 Tイントロン配列と称する。使用できる別のベクター
要素は、インターナル リボザイム エントリー サイト(IRES)である。IRES配
列は1つの遺伝子転写物から1以上のポリペプチドを生成するために使用される
。IRES配列は1以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質を生成するために使用さ
れる。このようなおよび他の通例のベクター要素の選択は常法であり、そして多
くのそのような配列が入手可能である[例えば、Sambrook et al.,およびそこに
引用されている文献、例えば第3.18-3.26および16.17-16.27頁およびAusebel et
al.,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,1
989を参照にされたい]。
の例は、限定するわけではないがレトロウイルス ラウス肉腫ウイルス(RSV)LTR
プロモーター/エンハンサー、サイトメガロウイルス(CMV)前初期プロモータ
ー/エンハンサー[例えば、Boshart et al.,Cell.41:521-530(1985)]、SV40プ
ロモーター、ジヒドロ葉酸シダクターゼプロモーター、細胞質β-アクチンプロ
モーターおよびホスホグリセロールキナーゼ(PGK)プロモーターを含む。
ら供給される化合物により調節されるプロモーターであり、限定するわけではな
いが亜鉛−誘導性ヒツジ メタロチオニン(MT)プロモーター;デキサメタゾン(D
ex)−誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモーター;T7ポリメラーゼプロモ
ーター系[国際公開第98/10088号明細書];エクジソン昆虫プロモーター[No e
t al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:3346-3351(1996)];テトラサイクリン-抑制
系[Gossen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:5547-5551(1992)];テトラサ
イクリン-誘導系[Gossen et al.,Science,268:1766-1769(1995);ならびにまた
Havey et al.,Curr.Opin.Chem.Biol.,2:512-518(1988)を参照にされたい];RU4
86-誘導系[Wang et al.,Nat.Biotech.,15:239-243(1997)およびWang et al.,Ge ne Ther. ,4:432-441(1997)];およびラパマイシン-誘導系[Magari et al.,J.C lin.Invest. ,100:2865-2872(1997)]を含む。この内容において有用である他の
種類の誘導性プロモーターは、特別な生理的状態、例えば温度、急性期、または
複製している細胞のみにより調節されるプロモーターである。好適な態様では導
入遺伝子はP5天然AAVプロモーターの制御下である。
ーターは、導入遺伝子の発現が自然な発現を模倣するべき時に望ましい。天然の
プロモーターは、導入遺伝子の発現が一時的または発育的に、あるいは組織−特
異的様式で、あるいは特異的な転写刺激に応答して調節されなければならない時
に使用できる。さらなる態様では、エンハンサー要素、ポリアデニレーション部
位またはコザックのコンセンサス配列のような別の天然の発現制御要素も自然な
発現を模倣するために使用することができる。
入遺伝子を含む。例えば骨格筋中での発現を所望する場合、筋肉中で活性なプロ
モーターを使用するべきである。これらには、骨格筋α-アクチン、ミオシン軽
鎖2A、ジストロフィン、筋肉クレアチンキナーゼをコードする遺伝子に由来する
プロモーター、ならびに自然に存在するプロモーターよりも高い活性を持つ合成
の筋肉プロモーター[Li et al.,Nat.Biotech.17:241-245(1999)]を含む。組織
−特異的であるプロモーターの例は、中でも肝臓について[アルブミン、Miyata
ke et al.,J.Virol.,71:5124-32(1997);B型肝炎ウイルスコアプロモーター、S
andig et al.,Gene Ther.,3:1002-9(1996);アルファ-フェトプロテイン(AFP)、
Arbuthnot et al.,Hum.Gene Ther.,7:1503-14(1996)]、骨について[オステオ
カルシン、Stein et al.,Mol.Biol.Rep.,24:185-86(1997);骨のシアロプロテイ
ン、Chen et al.,J.Bone Miner.Res.,11:654-64(1996)]、リンパ球について[C
D2、Hansal et al.,J.Immunol.,161:1063-8(1998);免疫グロブリン重鎖;T細
胞レセプターα鎖]、ニューロンについて[ニューロン−特異的エノラーゼ(NSE
)プロモーター、Andersen et al.,Cell.Mol.Neurobiol.,13:503-15(1993);ニュ
ーロフィラメント軽鎖遺伝子、Piccioli et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:56
11-5(1991);ニューロン-特異的vgf遺伝子、Piccioli et al.,Neuron,15:373-84
(1995)]知られている。
子を発現させるために等しくよく機能するわけではない。しかし当業者は、本発
明から逸脱することなくこのような発現制御配列の中から選択することができる
。適当なプロモーター/エンハンサー配列は、本出願により提供される手引きを
使用して、当業者により選択され得る。そのような選択は日常的な事柄であり、
分子または構築物を限定しない。例えば目的の導入遺伝子に操作可能に連結され
た1以上の発現制御配列を選択し、そして発現制御配列および導入遺伝子を含ん
で成る「ミニ遺伝子」をAAVベクターに挿入することができる。本出願で教示す
る、または当該技術で教示するようにrAAVをパッケージングする1方法に従った
後、インビトロまたはインビボで適当な細胞を感染させることができる。細胞中
の導入遺伝子のコピー数は、サザンブロッティングまたは定量的なポリメラーゼ
連鎖反応(PCR)によりモニターすることができ;RNA発現のレベルはノーザンブロ
ッティングまたは定量的な逆転写酵素(RT)-PCRによりモニターすることができ:
そしてタンパク質発現のレベルはウエスタンブロッティング、免疫組織化学、酵
素−結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、放射性免疫アッセイ(RIA)または導入遺
伝子の遺伝子産物の生物活性の試験によりモニターすることができる。すなわち
特定の発現制御配列が特別な導入遺伝子に適当であるかどうかを容易にアッセイ
し、そして所望の導入遺伝子の発現に最も適当な発現制御配列を選択することが
できる。 C.rAd/AAV ハイブリッド ウイルスの生産 本発明のrAd/AAV ハイブリッド ウイルスは、本明細書に記載し、ならびに当
業者に既知である材料および方法を使用して構築し、そして生産することができ
る。本発明の任意の態様を構築するために使用するそのような操作法は、核酸操
作の当業者には既知であり、そして遺伝子操作、組換え工学および合成技法を含
む。例えばSambrook et al.,and Ausubel、同上;および国際特許出願公開第95
/13598号明細書を参照にされたい。さらにアデノウイルスのカプシド中にrAAVカ
セットを生産するために適する方法は、米国特許第5,856,152号および同第5,871
,982号明細書に記載された。
られ、そして本明細書中に記載した技法を使用して、選択した宿主細胞中で感染
および複製により生産することができる。例えば米国特許第5,856,152号および
同第5,871,982号明細書、および以下の第II部に記載するrAd/AAVを用いた宿主細
胞の感染および培養法の検討を参照にされたい。 II.rAAVの生産 本発明の方法は、複製できるrAd/AAVを使用してrAAVの生産を提供する。特に
好適な態様では、本発明の方法で使用するrAd/AAVはrAAVカセットおよび宿主細
胞に対してすべての必要なアデノウイルス配列を提供し、すなわちヘルパーウイ
ルスを用いた第2感染またはトランスフェクションの必要性を回避する。最も適
当にはrAd/AAVハイブリッドウイルスは、ハイブリッドウイルスの複製に必要な
すべてのアデノウイルス遺伝子産物がrAd/AAVハイブリッドウイルスにより発現
されるように、本明細書に記載するように操作される。
させる。いったんrAd/AAVハイブリッドウイルスが細胞に取り込まれると、AAV I
TRにより挟まれた導入遺伝子は、好ましくは宿主パッケージング細胞中に存在す
るAAV rep遺伝子を感染した細胞に供給することにより、アデノウイルス骨格か
らレスキューされなければならない。組換えAAVゲノムは、好ましくは宿主パッ
ケージング細胞中に存在するAAV cap遺伝子を感染した細胞に供給することによ
りパッケージングされる。
産に重要である、宿主細胞の感染後の選択した時期に、rAd/AAVが複製する能力
を制御する(すなわち、抑制または消失)工程を含む。この工程はrAd/AAVによ
り運ばれるrAAV構築物がレスキューされ、そしてrAAVビリオンにパッケージング
される能力を強化する。これは種々の手段により達成され、これを本明細書でよ
り詳細に記載する。 A.AAV RepおよびCap配列 rAd/AAVハイブリッドにより提供されるrAAV構築物をrAAVビリオンにパッケー
ジングするために、宿主細胞はAAV repおよびAAV capまたはそれらの機能的フラ
グメントを発現するために必要な配列を含まなければならない。例えばrep78/52
タンパク質は、必要なrep機能を提供するために十分であり得る。AAVrepおよびc ap 配列は、上記で確認されたAAV供給源から得られる。AAV repおよびcap配列は
限定するわけではないがトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポ
ソーム送達、膜融合法、高速DNA-コートペレット、ウイルス感染およびプロトプ
ラスト融合を含む上記のような当業者に既知の様式で宿主細胞に導入することが
できる。1つの態様では、repおよびcap配列は1以上の核酸分子により宿主細胞
中にトランスフェクトされ、そしてエピソームとして細胞中で安定に存在し得る
。別の態様では、repおよびcap配列は細胞のゲノムに安定に組み込まれる。rep
およびcapを含む適当な宿主細胞は、PCT/US98/19463に記載されたB-50である。
別の態様は、宿主細胞で一時的に発現されるrepおよびcap配列を有する。例えば
そのようなトランスフェクションに有用な核酸分子は、5'から3'へ、プロモータ
ー、場合によりプロモーターとrep遺伝子配列の開始部位との間に挿入されたス
ペーサー、AAV rep遺伝子配列、およびcap遺伝子配列を含んで成る。
れることができ、あるいは各々の配列をそれ自体のベクターで供給してもよい。
好ましくはrepおよびcap配列は同じベクターで供給される。あるいはrepおよびc ap 配列は、宿主細胞に導入される他のDNA配列を含むベクターで供給することが
できる。
または上記のような任意の構成的、誘導性または天然のプロモーターである。好
適な態様では、AAV P5プロモーター配列が使用される。これは任意の上記AAV源
から得ることができるが、パルボウイルスP5プロモーターは好ましくはrepおよ
びcap遺伝子配列を提供するAAV血清型に相同的である。あるいはプロモーターは rep およびcap配列を提供する型とは別のAAV型に由来するP5プロモーターでよい
。ヒトまたは他の動物に感染することが知られているAAVも、P5プロモーターを
提供することができる。任意のこのような配列を提供するためのAAVの選択は、
本発明を限定しない。
記に検討したように、誘導性プロモーターには限定するわけではないが、メタロ
チオニン(MT)プロモーター;デキサメタゾン(Dex)−誘導性マウス乳ガンウイル
ス(MMTV)プロモーター;T7ポリメラーゼプロモーター系;エクジソン昆虫プロモ
ーター;テトラサイクリン-抑制系;テトラサイクリン-誘導系;RU486-誘導系;
およびラパマイシン-誘導系を含む。rep発現に好適なプロモーターはT7プロモー
ターである。T7プロモーターにより調節されるrep遺伝子およびcap遺伝子を含ん
で成るベクターを、構成的または誘導的にT7ポリメラーゼを発現する細胞にトラ
ンスフェクトまたは形質転換する。1998年3月12日さ公開された国際公開第98/10
088号明細書を参照にされたい。
ーターとrep遺伝子ATG開始部位との間に挿入されたDNA配列である。スペーサー
は所望の設計を有してよく;すなわちスペーサーはヌクレオチドの無作為な配列
であるか、あるいはマーカー遺伝子のような遺伝子産物をコードすることができ
る。スペーサーは、開始/停止およびポリA部位を典型的に取り込む遺伝子を含
むことができる。スペーサーは原核または真核生物に由来する非−コードDNA配
列、反復非コード反復、転写制御が無いコード配列または転写制御を含むコード
配列であることができる。2つのスペーサー配列の供給源の例は、λファージ
ラダー配列または酵母ラダー配列であり、これらは中でも例えばギブコ(Gibco
)またはインビトロゲン(Imvitrogen)から販売にれている。スペーサーはrep7
8およびrep68遺伝子産物の発現を下げ、rep52、rep40およびcap遺伝子の発現は
正常レベルに残すために十分な任意のサイズであることができる。したがってス
ペーサーの長さは約10bpから約10.0kbp、好ましくは約100bpから約8.0kbpの範囲
である。組換えの可能性を下げるために、スペーサーの長さは好ましくは2kbp
未満であり;しかし本発明のそのように限定されない。
Rep/Cap、pP5-Rep/CapおよびpMMTV-Rep/Capである。このようなプラスミドはそ
れぞれ、ネオマイシン選択マーカー遺伝子を含み、そしてそれらの天然のP5プロ
モーター(pP5-Rep/Cap)、亜鉛−誘導性ヒツジメタロチオニンプロモーター(pMT
RRep/Cap)、あるいはデキサメタゾン(Dex)-誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)
プロモーター(pMMTV-Rep/Cap)のいずれかにより駆動されるAAV rep/cap遺伝子を
発現する。このようなタンパク質は種々の手段により細胞に提供され得るが、本
発明の方法の例には様々なプラスミドの使用を含む。プラスミドpMT-Rep/Capの
構築には、ORF6配列をpMTE4ORF6プラスミド[G.P.Geo et al.,J.Virol.,70:8934
-8943(1996)]からBamHI消化により取り出し、そして鋳型としてpSub201プラスミ
ド[Samulski,R.J.et al.,J.Virol.,63:3822-3828(1989)]を使用したPCR増幅に
より調製した4.1kbrep/capフラグメントと置き換えた。プラスミドpMMTV-Rep/Ca
pはpMT-Rep/Capの構築と同様に構築したが、pMMTVEORF6プラスミド[Geo et al.
,同上]をベクター骨格として使用した。P5-Rep/Capの構築には、MTプロモータ
ーおよびORF6配列をpMTEORF6プラスミド[G.P.Geo et al.,J.Virol.,70:8934-89
43(1996)]からEcoRI/BamHI消化により取り出し、そしてXbaI消化によりpSub201
プラスミド[Samulski,R.J.et al.,J.Virol.,63:3822-3828(1989)]から単離した
4.3kbのP5 Rep/Capフラグメントと置き換えた。プラスミドの構築には、Sambroo
k et al.,同上に記載されているような通例の遺伝子工学法が含まれた。すべて
の上記に引用した参考文献は本明細書に編入する。
野では知られており、そして本発明の宿主細胞に使用することができる。例えば
、rep/cap構築物は、上記の構築物において言うようなプロモーターとrep/cap遺
伝子との間のスペーサーを省略してもよい。P5プロモーターをrep/cap遺伝子に
対して3'に配置する米国特許第5,622,856号明細書に記載されているような当該
技術における他の構築物も、本内容において使用することができる。
任意の形態でよい。本明細書中に例示するように、この分子は好ましくはマーカ
ー遺伝子のような他の非−ウイルス配列を含むことができるプラスミドの形態で
ある。この分子はAAV IRTを含み、そして一般にはAAVパッケージング配列は含ま
ない。相同的組換えが起こることを回避するために、他のウイルス配列、特にア
デノウイルス配列はこのプラスミドでは避けられる。このプラスミドは望ましく
は細胞に安定にトランスフェクトされ得るように構築される。
が、宿主細胞は例えばエプソームとして、または宿主細胞の染色体への組込みに
より宿主細胞中で機能的rep/capタンパク質を発現するために必要な配列で安定
に形質転換されることが好ましい。そのような安定にトランスフェクトした宿主
細胞の発現を制御するプロモーターに依存して、rep/capタンパク質は一時的に
発現され得る(例えば誘導性プロモーターの使用を通して)。
るような通例の遺伝子工学または組換え工学法である。この明細書は特別な構築
物の具体的な説明例を提供するが、本明細書に提供される情報を使用して、当業
者はスペーサー、P5プロモーターおよび少なくとも1つの翻訳開始および停止シ
グナル、ならびに任意のポリアデニレーション部位の最適な付加を含む他の要素
の選択を使用して、他の適当な構築物を選択し、そして設計することができる。 B.宿主細胞 哺乳動物の宿主細胞自体は、限定するわけではないがヒト、サル、マウス、ラ
ット、ウサギおよびハムスターを含む哺乳動物に由来するA549、WEHI、3T3、10T
1/2、BHK、MDCK、COS1、COS7、BSC 1、BSC 40、BMT 10、VERO、W138、HeLa、293
細胞(これは機能的アデノウイルスE1を発現する)、Saos、C2C12、L細胞、H
T1080、HepG2および初代繊維芽細胞、肝細胞および筋芽細胞のようなヒトの細胞
型のような任意の哺乳動物種から選択することができる。細胞を提供する哺乳動
物種の選択は本発明を限定せず;あるいは哺乳動物細胞の型、すなわち繊維芽細
胞、肝細胞、腫瘍細胞等をも限定しない。使用する細胞に関する要件は、rAAVの
生産中に混入するウイルスの相同的組換えをもたらすことができるウイルス遺伝
子を運んではならないということであり;そしてDNAのトランスフェクションお
よびトランスフェクトしたDNAの発現が可能でなければならないということであ
る。
クトされたrepおよびcapを有するものである。米国特許第5,658,785号明細書に
記載されているような他の安定なrep/cap発現細胞系も同様に使用することがで
きる。別の適当な態様では、宿主細胞はハイブリッドウイルスが無いrAd/AAVハ
イブリッドウイルスの複製に必要な任意のアデノウイルス遺伝子産物を発現する
ために必要な配列で安定にトランスフェクトされる。
合、選択した細胞系はE4 ORF6タンパク質の発現に必要な配列で安定にトランス
フェクトされるように操作する。そのような場合、細胞系は好ましくはrep/cap
の発現のための配列を含むものである。rAd/AAVによる細胞の感染後、ハイブリ
ッドウイルスにより発現されたE1aおよびE1b機能が宿主細胞によるrep/cap機能
の発現を始めさせる。その後E4 ORF6発現は、望ましくはE4 ORF6遺伝子産物を発
現するためにE4 ORF6機能を制御するプロモーターを誘導するために必要な薬剤
を供給することにより始めさせる。
ことができる: (a)AAVrepおよびcap遺伝子(またはそれらの機能的フラグメント)およびE4 O
RF6遺伝子産物により安定にトランスフェクトされた細胞; (b)AAVrepおよびcap遺伝子(またはそれらの機能的フラグメント)、アデノウ
イルスE2a遺伝子産物およびアデノウイルスE4 ORF6で安定にトランスフェクトさ
れた細胞; (c)エプソームに運ばれるか、または細胞の染色体に組込まれたAAVrepおよび cap 遺伝子(またはそれらの機能的フラグメント)で安定にトランスフェクトされ
、そして一時的にアデノウイルスのE2a遺伝子産物を発現する細胞; (d)少なくとも1つのAAVrepおよびcap遺伝子およびアデノウイルスE2a遺伝子
産物(またはそれらの機能的フラグメント)で安定にトランスフェクトされた細
胞;および (e)1以上のエプソームとして、または組込まれたDNAとして安定に、AAVrep
遺伝子、AAVcap遺伝子、E2a遺伝子(またはそれらの機能的フラグメント)で安定
にトランスフェクトされ、そして導入遺伝子を含む核酸分子を一時的に発現する
細胞。
配列および任意の必要なアデノウイルス配列を供給しない場合、このような配列
は例えばトランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜
誘導法、高速DNA-コートペレット、ウイルス感染およびプロトプラスト融合を含
む任意の適当な方法により宿主細胞に導入することができる。
がE2a遺伝子産物を発現しない場合、E2a遺伝子産物を発現するアデノウイルスDN
Aを、E2a遺伝子産物の発現を支配するプロモーターおよび他の調節成分も含む核
酸配列の状態で宿主細胞に提供することができる。E2a用のプロモーターは、上
記のような構成的、誘導性または天然のプロモーターでよい。E2a遺伝子産物の
発現の制御に於けるプロモーターはある態様では構成的プロモーターでよいが、
好適な態様ではプロモーターはE2a遺伝子産物生成(これは過剰に蓄積すると細
胞に傷害性である[D.Brough et al., Virology,190:624-634(1992)およびD.Kle
ssig et al.,Virus Res.,1:169-188(1984)])の量および時期をE1遺伝子産物の
生産に対して制御するような誘導性プロモーターである。1つの好適な態様は、
E2aの生産を支配するプロモーターはE1aおよびE1bの発現を支配するプロモータ
ーとは異なる誘導性プロモーターであり、そしてE1誘導性プロモーターに使用す
るものとは異なる誘導剤に暴露することにより誘導可能である態様を提供する。
有用な宿主細胞を調製することは、当業者に既知の技術を使用して、そして本明
細書を通して記載したように達成することができる。核酸分子の構築法には、cD
NAおよびゲノムクローニング(これらは周知であり、そしてSambrook et al.,an
d Ausubel et al.、同上に記載されいる)、ポリメラーゼ連鎖反応、合成法およ
び所望のヌクレオチド配列を提供するための任意の他の適当な方法と組合わせた
アデノウイルスおよびAAVゲノムの重複オリゴヌクレオチド配列の使用が含まれ
る。好適な態様では、標準的なトランスフェクション法、例えばハイブリットア
デノウイルス/AAVベクターによるヒト胚性腎細胞系HEK293(トランスに作用する
E1タンパク質を提供する機能的アデノウイルスE1遺伝子を含むヒトの腎臓細胞)
およびB50細胞系(安定に組込まれたrepおよびcap遺伝子を含むHeLa細胞系)のよ
うな細胞系へのCaPO4トランスフェクションまたはエレクトロポレーション、お
よび/または感染を使用する。 D.rAAVの生産法 上記のように、本発明は混入するヘルパーウイルスまたは野生型の不存在下で
、組換えアデノ−随伴ウイルス(rAAV)を生産する方法を提供する。適当には、
宿主細胞をrAd/AAVハイブリッドウイルスに、約0.5〜約1000またはその間、例え
ば約1〜約500、約10〜約250、そして約50〜約200の範囲の感染多重度で感染さ
せる。
、AAVrep配列およびAAV capを配列をそれらの発現を支配する調節配列の制御下
に含む本明細書に記載するようなrAd/AAVハイブリッドウイルスを含む哺乳動物
細胞を培養することを含む。その後に、導入遺伝子の発現を支配する組換えAAV
ビリオンを、混入するヘルパーウイルスまたは野生型AAVの不存在下で細胞また
は細胞培養物から単離する。
びシグナル生成の測定法等を含む。メッセージまたはシグナルを検出するために
、あるいはrAAVを他のウイルスから分離するために精製工程は必要ない。一般に
生産では、溶解物中の細胞タンパク質からrAAVを濃縮するために、クロライド勾
配遠心またはカラムクロマトグラフィーのような通例の精製法が使用される。例
えば、トランスフェクション培地を一緒に含む細胞がスクレーパーにより回収さ
れ、そしてエタノール−ドライアイスおよび37℃の水浴中で3回の凍結−解凍に
かけられる。細胞は例えば4℃で15分間、遠心することもできる。
感染後、rAAVビリオンの生産を至適化するために、rAd/AAVハイブリッドウイル
スが複製する能力を制御し、これによりAAV構築物をレスキューし、そしてrAAV
ビリオンにパッケージングする能力を強化することが望ましい。rAd/AAVハイブ
リッドウイルスが感染後に複製する能力は、当業者には容易に明らかな種々の方
法により抑制することができる。
イルスの複製および/またはパッケージングに必要なアデノウイルス遺伝子(例
えばアデノウイルス遺伝子のE2b)に含むrAd/AAVハイブリッドウイルスを、約10
0〜約200のMOIで感染させる。その後に、宿主細胞を約32℃〜約37℃の温度で培
養し、そして本明細書に記載するように単離する。以下の実施例で具体的に説明
するように、この方法はrAAVの卓越した収率の提供することが分かった。温度感
受性突然変異を含有する適当なrAdの1例は、すでに記載されたsub100rである[
Schaack,J.et al.,J.Virol.,69:4079-4085(1995)]。
現を制御することができる。例えばアデノウイルスのE4(またはE4 ORF6)は、r
Ad/AAVにより、またはrAd/AAVハイブリッドウイルスが遺伝子産物を発現しない
宿主細胞により、誘導性プロモーターの制御下で発現される。別の例では、アデ
ノウイルスE1およびE2遺伝子産物は、少なくとも1つの誘導性プロモーターの制
御下で発現する。すなわちこの方法はさらに培養した宿主細胞と、少なくとも1
つの必要なアデノウイルス遺伝子産物の発現を制御する少なくとも1つの誘導剤
を接触させる工程を含む。必要な各アデノウイルス遺伝子産物が異なる誘導性プ
ロモーターの制御下にある場合、この方法はさらに宿主細胞培養に第1誘導性プ
ロモーター用の第1誘導剤および第2誘導性プロモーター用の第2誘導剤を加え
る工程が必要となる。この方法の態様は、このようにしてアデノウイルス遺伝子
産物、例えばアデノウイルス遺伝子のE1a、E1b、E2aおよび/またはE4 ORF6の制
御された発現を可能とする。さらに本発明はアデノウイルスの遺伝子産物(例え
ばE1aおよびE1b)を、他のアデノウイルス遺伝子産物(1つまたは複数)(例えばE2
a)の発現に対して、所望の比率で発現することを可能とし、これは特定の宿主細
胞中でその細胞に適する培養条件下でのrAAV生産に最適である。
定は、細胞の種類、使用する構成的および/または誘導性プロモーターの強さ、
使用する誘導剤(1つまたは複数)の量、および好適な遺伝子産物の誘導の順序
および時期を考慮して当業者により行われ得る。rAAVの最大生産を可能とする最
適な比率は、このような因子が異なるので異なるかもしれない。例えばE1a遺伝
子が弱いまたは中程度の強度の構成的プロモーターにより制御される場合、適当
な比率を得るためにE2a遺伝子は強力な誘導性プロモーターにより制御され、そ
して誘導剤を培養の初期に加えるべきである。E1a遺伝子ならびにE2a遺伝子が誘
導性プロモーターにより制御される場合、rAAVのための最適な生産系を提供する
ために、2種の誘導剤は量を変動させて、そして誘導の順序を変動させて加える
ことができる。しかし好適な量および順序を決定するために使用するそのような
至適化実験は当業者の技術範囲内であり、そして本明細書の開示に照らせば単な
る日常的な実験である。
で発現され、そしてE1bおよびにE2a遺伝子、ならびに存在する他のアデノウイル
ス遺伝子(例えばE4ORF6および/またはVAI RNA)はそれらの自然なプロモータ
ーの制御下で発現される。上記で検討したように、E1a遺伝子産物はE1b、E2aお
よび他のアデノウイルス遺伝子の自然なプロモーターを活性化する。細胞が誘導
されない時に低い基準レベルのE1aを発現し、そして細胞が誘導剤と接触した時
に高レベルのE1aを発現する限り、任意の誘導性プロモーターを使用することが
できる。多数の誘導性プロモーターが当該技術分野では知られており、そして本
明細書を通して検討した。特別な誘導性プロモーターには限定するわけではない
が、亜鉛−誘導性ヒツジ メタロチオニン(MT)プロモーター;デキサメタゾン(D
ex)−誘導性マウス乳ガンウイルス(MMTV)プロモーター;エクジソン昆虫プロモ
ーター;テトラサイクリン-抑制系;テトラサイクリン-誘導系;RU486-誘導系;
およびラパマイシン-誘導系を含む。
な実施例は単に説明であり、そして本発明の範囲を限定するものではない。
された方法を使用して構築するが、ただしE3遺伝子を削除し、そしてRSVまたはP
GKプロモーターに操作可能に連結し、そして制御下にあるE1遺伝子を、アデノウ
イルスゲノムのE3領域にクローン化する。Ad/AAVハイブリッドベクターは、米国
特許第5,856,152号明細書に記載されたようにパッケージングする。
モーターの制御下で安定に発現する細胞である。この細胞系はコンカテマー状態
のP5-rep-cap-遺伝子カセットの多コピー(少なくとも5コピー)が宿主染色体に
組込まれていることが特徴である。このB-50細胞系は、特許手続きのための微生
物の寄託の国際承認に関するブタペスト条約の要件に従い、1997年9月18日にバ
ージニア州 20110-2209、マナッサス 10801 ブルヴァール大学のアメリカン タ
イプ カルチャー コレクションに寄託番号CRL-12401で寄託された。
4時間後、播種培地(抗生物質を補充したDMEM/10%FBS)をDMEM/2%FBSと交
換する。細胞はE1およびrAAVミニ遺伝子を含有する組換えAd/AAVクローンにより
適当なMOIで感染させる。このB-50細胞の1段階感染で、rAAV生産に必要なすべ
てのヘルパー遺伝子が提供される。すなわちsub100rのような他のヘルパーウイ
ルスは必要ない。
て当該技術分野で既知の方法により滴定する。rAAVがrAAVLacZならば、溶解物は
以下のように滴定することができる。細胞をトランスフェクション培地と一緒に
、スクレーパーにより回収し、そしてエタノール−ドライアイスおよび37℃の水
浴中で3回の凍結−解凍にかける。細胞は4℃で15分間、卓上で3000rpmにて遠
心する。各溶解物の1/10を84-31細胞、rAAVにより形質導入可能なE1/E4-二重相
補(complementing)細胞系を24時間感染させるために使用する。次いで84-31細
胞をX-Galで組織化学的に染色する。各感染で多数の青色の細胞が採点され、そ
して各トランスフェクションで生産されたrAAVLacZの感染単位(IU、IUは計数さ
れた1つの青色細胞と定めた)として表す。実施例2−複製できるAd-AAVハイブリッドウイルスによるB50細胞中のrAAVの生
産 緑色の蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子がCMVプロモーターにより駆動さ
れ、そしてAAV2 ITRsにより挟まれたAArVCMVGFPゲノムを、Ad5突然変異体、Sub1
00rウイルスのE3領域にクローン化した。Sub100rのE2b末端タンパク質遺伝子は
、3bpの挿入により破壊され、温度感受性の表現型とした。生成した組換えAd-A
AVハイブリッドは、E11、E2a、E4およびVARNA遺伝子については遺伝子型では野生
型であるが、E3遺伝子は今、rAAVCMVGFPゲノムに置き換えらている。すなわちこ
の第2世代のAd-AAVハイブリッドは、すべての必須なヘルパー遺伝子およびrAAV
ゲノムを保有し、そして理論的にはB50細胞をウイルスで1回感染させれば、rAA
Vゲノムのレスキュー、複製およびパッケージングを導くはずである。 A.複製できるrAd-AAVハイブリッドウイルスの構築 市販されているプラスミド構築物pAB27は、マイクロビックス バイオシステム
ズ(Microbix Biosystms)(オンタリオ州、カナダ)から購入した。このプラス
ミドはA5dゲノムの以下のセダメントを持つ:m.u.78.3n85.8に広がる2.7kbE3欠
失を含むm.u.0−1、10.6−16.1および69−100。組換えAAVCMVGFPゲノムは、prAA
VCMVGFP構築物[強化されたGFP、EGFPを含むクローンテックの製品]からPvuII
フラグメントとして単離され、そしてpAB27プラスミドのScaI部位にクローン化
された。生成したシャトルプラスミドを、pABrAAVCMVEGFP[図1A]と命名した
。Ad E2B末端タンパク質突然変異体、Sub100rは許容され得る32℃で条件付きで
複製できるある新しいAd-AAVハイブリッドを構築するためにウイルス骨格として
使用した。rAAVCMVEGFPをSub100rゲノムに導入するために、Sub100rウイルスDNA
を制限エンドヌクレアーゼSpeIで消化し、そしてpABrAAVCMVEGFPを用いて293細
胞にリン酸カルシウム法によりコー−トランスフェクトした。トランスフェクト
した細胞をトップアガーに重層し、そして32℃で14日間培養した。Sub100r-rAAV
CMVGFPの緑色のウイルスプラークをさらなるプラーク精製のために単離し、そし
て大規模なウイルス調製用に拡大した。Sub100rAAVCMVGFPハイブリッドウイルス
を生成するための相同的組換え工程の具体的説明については図1Bを参照にされ
たい。 B.rAAVの生産 B50細胞は、ウェルあたり1×105細胞密度で12ウェルプレートにまいた。24時
間後、細胞をSub100rAAVCMVGFPハイブリッドで細胞あたり100、1000、2000およ
び4000ウイルス粒子に感染させた。各感染について3重の12ウェルプレートを、
異なる温度32、37および39.5℃でのインキューベーションのために準備した。陽
性対照として、12ウェル中のB50細胞を野生型Ad5ヘルパーおよびSub100rAAVCMVG
FPを用い、上記のMOIで同時に、または24時間の間隔で感染させた。感染から72
、96および120時間後、各感染の全細胞溶解物を回収した。3回の凍結−解凍サ
イクルを通した後、溶解物を4℃で15分間、3000rpmで遠心した。生成した各サ
ンプルの上清を集め、そして-80℃で保存した。各感染で生産されたrAAVCMVGFP
を定量するために、各サンプルの一部を56℃に1時間加熱して、感染性Ad-AAVハ
イブリッドsub100r-AAVCMVGFPを不活性化し、そして84-31細胞、E1/E4相補細胞
クローンに連続希釈して乗せた。各サンプルの緑色の蛍光形成単位(GFFU)を感
染から24〜48時間でUV-顕微鏡下で採点し、最初のsub100rAAVCWGFP感染において
使用したB50細胞あたりのGFFUとしてコンピーター処理した。ここでの1GFFUは
限定-希釈感染において、rAAVCMVGFPによるGFP形質導入のフォーカスにより定め
た。すなわち細胞あたりのGFFUは、対応する実験の設定で各B50細胞により生産
される各々のrAAVCMVGFPを表す。 C.B50細胞中でAAVを生産するために、複製できるrAd-AAVハイブリッド使用の
至適化 新規B50/ハイブリッド系により生産される最大収率のrAAVのための条件を至
適化するために一連の実験を設定し、そしてもとのB50/ハイブリッド系と比較し
た。
下にて生産されたrAAVCMVGFPの約1/3〜1/6を生産することができる。この表1に
まとめるこのデータは、rAAV生産にB50/複製可能なAd-AAVハイブリッド感染系を
使用することの可能性を示した。
ッド系がrAAVを生産できることを示唆している。しかし最大収率はB50細胞をAd5
Wtヘルパーおよびハイブリッドで感染させた24時間間隔に比べて3〜6倍に低下
した。単回感染系は、39.5℃に比べて32および37℃でより良く行われた。
能な運命に直面すると仮定した:複製されるか、あるいはAVVレスキュー、複製
およびパッケージングのためにRepタンパク質により無能にされる(crippled)か
のいずれかである。この系を使用したrAAVの生産的感染は、両方向の微妙なバラ
ンスがとられるのだろう。我々はすでにB50/Adヘルパー/E1-欠失Ad-AAVハイブリ
ッドによる高収率AVV生産には、Ad5 E1タンパク質により誘発されるRep/cap遺伝
子発現間の重要な一時的関係、入ってくるAd-AAVハイブリッドの一時的な増幅、
ハイブリッド骨格からのrAAVゲノムの分解(resolving)、そしてさらにAVVゲノ
ムの複製があることを示した。Sub100r突然変異体に許容され得る温度は32℃で
あるが、そのよ うな温度感受性は37℃ではいくらか漏出性であり、しかし39.5
℃では極めて緊縮である。我々は37℃で、sub100rAAVCMVGFPの複製は低下するが
、Rep/cap、AAVレスキュー、複製およびパッケージングは最適であると予想した
。このデータは、系が32℃よりも37℃で正により生産的であることを示した。し
かし39.5℃でのAVVの生産性は鋭く低下した。この場合、おそらくハイブリッド
は全く複製されなかった。さらに全細胞器官が高温度ストレス下にあり、rep/ca
p発現、AAVレスキュー、複製およびパッケージングの欠失をもたらした。 1.sub100rAAVCMVGFPに関する感染の最適多重度の決定 実施例2Bからのデータに基づき、低いMOIでのB50細胞の感染がAVVの生産に
有利であると思われる。最初の実験からのデータに従い、生産温度32および37℃
で、rAAVの収率はsub100rAAVCMVGFP感染のMOIが上昇するほど鋭く低下する。100
pts/細胞と1000pts/細胞との間のAVV生産性において劇的な差異が存在すること
は、最大の生産性のための最適MOIがその範囲にあることを示唆している。最適
なMOIを定めるために行った第2実験は、32および37℃の両方で20と1,000粒子(p
t)/細胞の間のMOIの影響を調査することであった(表2)。したがってB50細胞
を上記のように12ウェルプレートにまき、そしてsub100rAAVGFPの20、40、100、
200、400および1000粒子で感染させた。粗細胞溶解物を調製し、そして細胞あた
りのrAAVCMVGFP生産性について上記のようにアッセイした。
明らかとなった。しかし37℃での状況は極めて異なり、ここでは最適MOIは200pt
s/細胞に厳しく限定された。MOIの2倍の増加または減少が、AVV生産性において
60%の低下をもたらした。ここで、そしてこれまでの実験で観察されたAVV生産
に対するMOIの影響は、AVV生産用のB50/ハイブリッド系の使用において、ハイブ
リッドの複製とrAAVパッケージングの間に微妙なバランスが達成されることが重
要であることが証明された。アデノウイルスの複製過程は特に許容および半許容
状態下では高度にMOI依存的であることは周知である。高いMOIでは、ハイブリッ
ドウイルスの複製が優勢になるが、rAAVレスキュー、複製およびパッケージング
は有意に低下するのが妥当と思われる。一方、限定されたハイブリッドウイルス
の増幅は、レスキューおよびパッケージングに関するrAAVゲノムの数を増加させ
るために望ましい。これは表2に与える結果で明らかに示されている。32℃がsu
b100rAAVCMVGFPに許容され得るが、100と200pts/細胞との間に観察されるAVV収
率について明らかな差異はなかった。MOIが400pts/細胞を越える時のみ、AVV収
率は劇的に低下した。しかし感染が半許容温度の37℃で行われた時、最適なMOI
は200pts/細胞のみに限定された。ここで限定され、そしてMOI依存的なハイブリ
ッドウイルスの複製が、最大のAVVパッケージングに重要となる。 2.sub100rAAVGFPを用いた単回感染に最適温度の決定 最初の実験から、39.5℃では大変少量のAVVしか生産されないが、32および37
℃でのAAV生産性は比較できるものであることが分かった。感染温度がAAV生産性
に及ぼす影響を調査するために、上記のMOI実験を32および37℃で二重に行った
。
たことをも示した。これはまた限定されたハイブリッドウイルスの複製とAVVレ
スキュー、複製およびパッケージングとの間にバランスが必要であることによっ
ても説明することができた。明らかに半許容温度の37℃で、2つの異なる出来事
の平衡はAVVパッケージングに向かって優先して移動し、より高い生産性を導い
た。 3.感染工程中の37から32℃への温度の切り替え 12ウェルプレート中のB50細胞は、細胞あたり100粒子のsub100rAAVCMVGFPで、
37℃で36および60時間感染させた。次いでプレートを32℃に設定した別のインキ
ューベーターに移動した。粗細胞溶解物は84-31細胞でのAAV生産性の滴定のため
に、感染後72、96、120、144および168時間に調製した。
れた複製を行うが、Rep/capタンパク質用のP5プロモーターの活性化は最適であ
るはずであるからである。37℃で24時間のインキューベーションにより、限定さ
れたハイブリッドウイルスの複製レべルで開始さるRep/cap発現、そしてこれに
よりB50細胞をAVVレスキュー、複製およびパッケージングについて条件付けるこ
とを可能とする。いったん感染を32℃に切り替えると、ハイブリッドウイルスの
複製も細胞中に蓄積したRepタンパク質の阻害効果により幾分遅くなるはずであ
る。温度切り替え実験の結果(表3)が予想に反したのは、おそらくハイブリッド
の複製とAVVレスキューおよび複製との間の最適なバランスが達成できなかった
からであろう。しかしデータはより早い時期の温度の切り替えは、遅い切り替え
よりも良い収率をもたらし、切り替えの時期がAVV生産に重要な役割を果たすこ
とを示唆している。
加 12ウェルプレート中のB50細胞は、細胞あたり100粒子のsub100rAAVCMVGFPで
、37℃で24時間感染させた。細胞あたり100粒子で第2バッチのsub100rAAVCMVGF
Pを37℃で加え、そして他の組を32℃に設定したインキューベーターに移動した
。各条件下でのAVV生産は最初の感染後72、96、120、144および168時間で調査し
た。
ーウイル感染と第2Ad-AVVハイブリッド感染との間に24時間の間隔を有すること
が必須である。2つの感染間のこの微妙な一時的関係は、高い収率のAVV生産の
ために、ハイブリッドウイル複製とAVVレスキューの適切な割合を調節するため
に、適切なレベルのRepタンパク質のような最適な細胞条件を作ることを可能と
する。その場合、AdヘルパーウイルスとE1-欠失ハイブリッド感染との間の差異
は、E1タンパク質の存在および不存在である。しかし複製できるAd-AVVハイブリ
ッドをB50細胞中でAVV生産に使用する時、Adヘルパーウイルスとハイブリッドと
の間にはそれらがすべての必要なヘルパー機能を提供する能力という意味で差異
はない。細胞を2つのバッチのハイブリッドで24時間の間隔で感染させる場合、
第1バッチは丁度Ad Wt感染のようにヘルパーとして役立ち、そして第2バッチ
は増幅、レスキューおよびパッケージングのためのrAAVゲノムを運ぶための丁度
E1-欠失ハイブリッドとなるはずである。我々は850/複製可能なAd−AAVハイブリ
ッド法のAAV生産性は、古典的なB50/ハイブリッド系のAAV生産性くらい高くなる
と予想した。実験から得られたデータは、我々の理論を正に支持していた(表4)
。1つの種類のアデノウイルスだけをこの新しい生産法に使用したので、精製法
は幾分簡略され、そしてスケールアップ工程も容易となる。さらにまた、我々は
E4欠失のようなより一層重い突然変異をハイブリッド骨格に導入し、そして対応
してAd遺伝子をB50細胞に安定に導入することができた。このように我々はハイ
ブリッドウイルス自体を無能にするので、たとえAAV調製物に幾らかの欠損ハイ
ブリッドが混入していても、そのような欠損ハイブリッドのインビボにおける副
作用はさらに最小となるだろう。
た技術文書は、引用により本明細書に編入する。本発明の多くの修飾および変更
が上記の本明細書に含まれ、そして当業者には自明であると予想される。本発明
の方法に対するそのような修飾および変更は、前記特許請求の範囲に包含される
と考える。
的説明である。
ルスとの間の相同的組換えによる複製できるrAd-AAVハイブリッドの生産の概略
的説明である。
Claims (29)
- 【請求項1】 組換えアデノ−随伴ウイルス(rAAV)ベクター、E1aおよびE
1b遺伝子産物の発現を支配する調節配列の制御下のアデノウイルスE1aおよびア
デノウイルスE1bをコードする核酸配列を含んで成るアデノウイルス/AAVハイブ
リッドウイルスであって、選択された宿主細胞中で該ハイブリッドウイルスの複
製を可能とするために十分なアデノウイルス配列を含むハイブリッドウイルス。 - 【請求項2】 さらにE3領域に機能的欠失を含んで成る、請求項1に記載の
アデノウイルス/AAVハイブリッドウイルス。 - 【請求項3】 さらにE4領域にアデノウイルスのコード配列の非−機能的欠
失を含んで成り、ここで上記ハイブリッドウイルスがE4 ORF6領域を含む、請求
項1に記載のアデノウイルス/AAVハイブリッドウイルス。 - 【請求項4】 上記E1aおよびE1b核酸配列が野生型E3領域の部位に位置する
、請求項1に記載のアデノウイルス/AAVハイブリッドウイルス。 - 【請求項5】 上記rAAVベクターが野生型アデノウイルスのE1aおよびE1b領
域に位置する、請求項4に記載のアデノウイルス/AAVハイブリッドウイルス。 - 【請求項6】 AAVベクターがAAV5'および3'逆方向末端反復配列(ITRs)およ
び導入遺伝子をそれらの発現を支配する調節配列の制御下に含んで成る、請求項
1に記載のアデノウイルス/AAVハイブリッドウイルス。 - 【請求項7】 調節配列が、E1a遺伝子産物の発現を支配する第1プロモー
ターを含んで成る、請求項1に記載のアデノウイルス/AAVハイブリッドウイル
ス。 - 【請求項8】 第1プロモーターが、E1aの天然のプロモーター、誘導性プ
ロモーター、組織−特異的プロモーターおよび構成的プロモーターから成る群か
ら選択される、請求項7に記載のアデノウイルス/AAVハイブリッドウイルス。 - 【請求項9】 調節配列が、アデノウイルスE1b遺伝子産物の発現を支配す
る第2プロモーターを含んで成る、請求項1に記載のアデノウイルス/AAVハイ
ブリッドウイルス。 - 【請求項10】 第2プロモーターが第1プロモーターと同一である、請求
項9に記載のアデノウイルス/AAVハイブリッドウイルス。 - 【請求項11】 第2プロモーターおよび第1プロモーターが異なる、請求
項9に記載のアデノウイルス/AAVハイブリッドウイルス。 - 【請求項12】 上記ウイルスがさら温度感受性突然変異をアデノウイルス
E2b遺伝子に含んで成る、請求項1に記載のアデノウイルス/AAVハイブリッドウ
イルス。 - 【請求項13】 (a)複製およびパッケージングに必要なアデノウイルス
5'シス-要素; (b)天然のアデノウイルスE1aおよびE1b領域中のアデノウイルス配列の欠失; (c)組換えアデノ-随伴ウイルス(rAAV)ベクター; (d)E3領域からのアデノウイルス配列の欠失 (e)E1aおよびE1b遺伝子産物の発現を支配する調節配列の制御下のアデノウイ
ルスE1aおよびアデノウイルスE1bをコードする核酸配列、ここでE1aおよびE1b核
酸配列はE3領域の部位に位置し;および (f)複製およびパッケージングに必要なアデノウイルス3'シス-要素、 を含んで成るアデノウイルス/AAVハイブリッドウイルス。 - 【請求項14】 上記ハイブリッドアデノウイルス/AAVウイルスがさらに
、アデノウイルスE2a遺伝子産物をコードする核酸配列を、宿主細胞中でそれら
の発現を支配する調節配列の制御下に含んで成る、請求項13に記載のハイブリ
ッドアデノウイルス/AAVウイルス。 - 【請求項15】 上記ハイブリッドアデノウイルス/AAVウイルスがさらに
、アデノウイルスE4遺伝子産物またはそれらの機能的フラグメントをコードする
核酸配列を、宿主細胞中でそれらの発現を支配する調節配列の制御下に含んで成
る、請求項13に記載のハイブリッドアデノウイルス/AAVウイルス。 - 【請求項16】 上記E4遺伝子産物の機能的フラグメントがE4 ORF6である
、請求項15に記載のハイブリッドアデノウイルス/AAVウイルス。 - 【請求項17】 さらにVAI RNAをコードするアデノウイルス配列を含んで
成る、請求項13に記載のハイブリッドアデノウイルス/AAVウイルス。 - 【請求項18】 組換えアデノ−随伴ウイルス(rAAV)の生産法であって; (a)AAV rep配列およびAAV cap配列の発現を支配する調節配列の制御下のAAV rep 配列およびAAV cap配列;および (b)組換えアデノ−随伴ウイルス(rAAV)ベクター、E1aおよびE1b遺伝子産物
の発現を支配する調節配列の制御下のアデノウイルスE1aおよびアデノウイルスE
1bをコードする核酸配列を含んで成るアデノウイルス/AAVハイブリッドウイル
ス(ここで該ハイブリッドウイルスが、選択された宿主細胞中で該ハイブリッド
ウイルスの複製を可能とするために十分なアデノウイルス配列を含む)、 を含んで成る宿主細胞を培養する、 工程を含んで成る上記方法。 - 【請求項19】 さらにrAAVを上記宿主細胞または宿主細胞培養物から単離
する工程を含んで成る、請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】 宿主細胞がAAV rep配列により安定に形質転換される、請
求項18に記載の方法。 - 【請求項21】 宿主細胞がAAV cap配列により安定に形質転換される、請
求項18に記載の方法。 - 【請求項22】 rep配列が宿主細胞中で一時的に発現される、請求項18
に記載の方法。 - 【請求項23】 cap配列が宿主細胞中で一時的に発現される、請求項18
に記載の方法。 - 【請求項24】 さらに培養前に、宿主細胞を約0.5〜約1000の感染多重度
でハイブリッドアデノウイルス/AAVにより感染させる工程を含んで成る、請求
項18に記載の方法。 - 【請求項25】 ハイブリッドアデノウイルス/AAVがさらに温度−感受性
突然変異をアデノウイルスE2b遺伝子に含んで成る、請求項18に記載の方法。 - 【請求項26】 ハイブリッドアデノウイルス/AAVが、約32℃〜約37℃の
温度で培養される、請求項18に記載の方法。 - 【請求項27】 請求項18に記載の方法に従い生産された組換えAAV。
- 【請求項28】 混入するヘルパーウイルスまたは野生型ウイルスの不存在
下で組換えアデノ−随伴ウイルス(rAAV)を生産する方法であって; (a)AAV rep配列およびAAV cap配列の発現を支配する調節配列の制御下のAAV rep 配列およびAAV cap配列;および (b)組換えアデノ−随伴ウイルス(rAAV)ベクター、E1aおよびE1b遺伝子産物
の発現を支配する調節配列の制御下のアデノウイルスE1aおよびアデノウイルスE
1bをコードする核酸配列を含んで成るアデノウイルス/AAVハイブリッドウイル
ス(ここで該ハイブリッドウイルスは、選択された宿主細胞中で該ハイブリッド
ウイルスの複製を可能とするために十分なアデノウイルス配列を含む)、 を含む宿主細胞を培養する工程を含んで成り、ここで該宿主細胞は該ハイブリッ
ドウイルスの複製を制御する条件下で培養され、これによりrAAVの収率を増強す
る上記方法。 - 【請求項29】 請求項1に記載のアデノウイルス/AAV ハイブリッドウイ
ルスを含む哺乳動物宿主細胞。
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