WO2023136043A1 - ニューログラニン関連ペプチドの分析方法 - Google Patents

ニューログラニン関連ペプチドの分析方法 Download PDF

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WO2023136043A1
WO2023136043A1 PCT/JP2022/046405 JP2022046405W WO2023136043A1 WO 2023136043 A1 WO2023136043 A1 WO 2023136043A1 JP 2022046405 W JP2022046405 W JP 2022046405W WO 2023136043 A1 WO2023136043 A1 WO 2023136043A1
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protein
neurogranin
matrix
solution
related peptide
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PCT/JP2022/046405
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French (fr)
Inventor
直樹 金子
Original Assignee
株式会社島津製作所
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/62—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating the ionisation of gases, e.g. aerosols; by investigating electric discharges, e.g. emission of cathode
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for analyzing neurogranin-related peptides.
  • Alzheimer's disease is the main cause of dementia, and the number of people affected by it has increased in recent years, making its research even more important.
  • a ⁇ -related peptides such as amyloid ⁇ (A ⁇ ) produced by cleavage of amyloid precursor protein (APP) are deeply involved in the onset of Alzheimer's disease. They then combined immunoprecipitation and mass spectrometry to detect multiple A ⁇ -related peptides in the blood, and reported that the detected specific A ⁇ -related peptide ratio is a promising blood biomarker for brain amyloid accumulation.
  • Alzheimer's disease requires various biomarkers to monitor its progression, and in addition to aluminoid accumulation, biomarkers to reflect each process of tau accumulation and neurodegeneration are required. ing.
  • neurogranin is one of the biomarkers of neurodegeneration and has been reported to increase in the cerebrospinal fluid (CSF) of Alzheimer's disease patients (Non-Patent Document 3, Non Patent document 4). It has also been reported that the fragmentation of neurogranin is accelerated in the brains of Alzheimer's disease patients, generating fragmented peptides (Non-Patent Document 5). Therefore, mass spectrometry of neurogranin or its fragment peptides (neurogranin-related peptides) is expected as a means of confirming neurodegeneration.
  • analyzing neurogranin-related peptides in cerebrospinal fluid requires collecting cerebrospinal fluid, which is not preferable in terms of invasiveness. Therefore, it is desired to analyze blood, which can be collected by a general test and is less invasive.
  • Neurogranin-related peptides present in blood contain very small amounts of peptides, so they cannot be sufficiently detected by conventional mass spectrometry.
  • Kvartsberg H Portelius E, Andreasson U, Brinkmalm G, Hellwig K, Lelental N, Kornhuber J, Hansson O, Minthon L, Spitzer P, Maler JM, Zetterberg H, Blennow K, Lewczuk P.: Characterization of the postsynaptic protein neurogranin in paired cerebrospinal fluid and plasma samples from Alzheimer's disease patients and healthy controls. Alzheimers Res Ther. 2015;7(1):40.
  • Non-Patent Document 6 Even when the analysis method of Non-Patent Document 6 is carried out and when the analysis method of A ⁇ -related peptides described in Non-Patent Document 2 is diverted to neurogranin-related peptides, the analytical sensitivity is insufficient. It has not reached the level of practical use. Therefore, further improvement in sensitivity is required to analyze neurogranin and the like in blood.
  • the purpose of the present invention is to detect neurogranin-related peptides with high sensitivity.
  • a first aspect of the present invention is a method for analyzing neurogranin-related peptides by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, wherein laser irradiation targets are the neurogranin-related peptides, a matrix, and 9 kDa
  • laser irradiation targets are the neurogranin-related peptides, a matrix, and 9 kDa
  • the above protein is contained, and the content of the protein per 1 ⁇ g of the matrix is 10 fmol or more and 600 fmol or less.
  • neurogranin-related peptides can be analyzed with high sensitivity.
  • FIG. 1 is a graph of Example 1 showing the rate of variation in detection sensitivity of MALDI-MS when recombinant Ng is included as a protein in a laser irradiation target.
  • the vertical axis is the signal/noise ratio (S/N) of the mass spectrum peak when protein (recombant Ng) is not contained, and the S/N of the peak when protein is contained, and the horizontal axis is the protein content per 1 ⁇ g of matrix. indicate quantity.
  • FIG. 2 is a graph of Example 2 showing the rate of variation in detection sensitivity of MALDI-MS when Cytochrome C is included as a protein in the object to be irradiated with laser.
  • FIG. 1 is a graph of Example 1 showing the rate of variation in detection sensitivity of MALDI-MS when recombinant Ng is included as a protein in a laser irradiation target.
  • the vertical axis is the signal/noise ratio (S/N) of the mass spectrum peak when protein (
  • FIG. 3 is a graph of Example 3 showing the rate of variation in detection sensitivity of MALDI-MS when bovine sewerum albumin is included as a protein in the object to be irradiated with laser.
  • FIG. 4 is a graph of Example 4 showing variation in detection sensitivity for Ng43-75 peptide when a protein-containing solution was dropped onto a MALDI plate.
  • the vertical axis represents the signal/noise ratio (S/N) of the mass spectrum peak without protein, and the S/N of the peak with protein, and the horizontal axis represents the type of protein.
  • FIG. 5 is a graph of Example 4 showing variation in detection sensitivity for Ng33-75 peptide when a protein-containing solution was dropped onto a MALDI plate.
  • An analysis method is a method for analyzing neurogranin-related peptides in a sample, and includes a purification step and a detection step in this order. Each step will be described in detail below.
  • Neuron-related peptides include neurogranin, translated/modified neurogranin, and fragment peptides thereof.
  • fragment peptides include Ng43-75 (SEQ ID NO: 1), Ng33-75 (SEQ ID NO: 2), Ng50-78 (SEQ ID NO: 3) and the like.
  • the mass (molecular weight) of the Ng-related peptide is generally less than 9 kDa, preferably 8 kDa or less, and for example 1 kDa or more, preferably 2 kDa or more.
  • especially Ng-related peptides of less than 9 KDa can be preferably measured. This mass can be measured, for example, by a MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight) mass spectrometer.
  • the purification step is, for example, affinity purification, and specifically includes a first binding step (an example of the binding step), a first washing step (an example of the washing step), a first elution step, A purification step, a second binding step, a second washing step, and a second elution step (an example of the elution step) are provided in this order.
  • First bonding step In the first binding step, the sample is brought into contact with the first carrier in the binding solution.
  • the binding solution, sample and first carrier are mixed in any suitable order. Thereby, the Ng-related peptide in the sample binds to the first carrier to obtain the first conjugate.
  • the sample is a sample containing neurogranin-related peptides, generally a biological sample.
  • biological samples include body fluids such as blood, cerebrospinal fluid, urine, body secretions, saliva, and sputum; Blood includes whole blood, plasma, serum, and the like.
  • the blood may be whole blood collected from an individual that has been subjected to a treatment such as centrifugation or cryopreservation. In this analysis method, blood is preferably used. Blood is less invasive than cerebrospinal fluid, and is easily available as an object sample for screening in health examinations and the like.
  • the binding solution is preferably a neutral buffer containing a surfactant.
  • buffers include Tris buffer, phosphate buffer, HEPES buffer, ammonium acetate buffer and the like.
  • the pH of the binding solution is, for example, pH 6.0 or higher, preferably 6.5 or higher, and for example, pH 8.5 or lower, preferably 8.0 or lower.
  • surfactants contained in the binding solution include neutral surfactants having a hydrophobic group with 7 or more and 15 or less carbon atoms (preferably 9 or more and 11 or less). This makes it possible to suppress non-specific adsorption to the first conjugate and reduce ionization interference in mass spectrometry.
  • surfactants include n-nonyl- ⁇ -D-maltoside, n-nonyl- ⁇ -D-thiomaltoside, n-decyl- ⁇ -D-maltoside, n-undecyl- ⁇ -D-maltoside.
  • UDM n-Undecyl- ⁇ -D-maltoside
  • other surfactants having maltose in the hydrophilic portion for example, surfactants having glucose in the hydrophilic portion, such as n-decyl- ⁇ -D-glucoside.
  • These surfactants can be used singly or in combination of two or more.
  • the surfactant concentration in the binding solution is, for example, 0.01% (w/v) or higher, preferably 0.05% (w/v) or higher, and for example, 10% (w/v). Below, preferably 3% (w/v) or less. If the concentration of the surfactant is within the above range, sufficient micelles are formed, so that the effects of the surfactant can be reliably exhibited.
  • the first carrier should be capable of binding Ng-related peptides, and examples thereof include antibody-immobilized carriers.
  • the antibody immobilized on the first carrier is an antibody (anti-Ng-related peptide antibody) having an antigen-binding site capable of recognizing the Ng-related peptide. globulin or fragments thereof.
  • immunoglobulins examples include IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgY, IgD, and IgE.
  • immunoglobulin fragments include F(ab')2, F(ab'), F(ab), Fd, Fv, L chains, H chains, and the like. More specifically, clones NG2, NG7, EPR21152 and fragments thereof and the like.
  • Antibodies may be either monoclonal antibodies or polyclonal antibodies.
  • Examples of materials for the first carrier include agarose, sepharose, dextran, silica gel, polyacrylamide, polystyrene, polyethylene, polypropylene, polyester, polyacrylonitrile, (meth)acrylic acid-based polymer, fluororesin, metal complex resin, glass, and metal. , a magnetic material, and the like.
  • the shape of the first carrier may be any shape such as spherical (including bead shape), plate-like, needle-like, irregular shape, etc., and may be the channel wall in the microdevice. .
  • pretreatment for removing antibodies such as IgG and IgM may be performed.
  • the first washing solution is preferably a neutral buffer containing a surfactant.
  • a neutral buffer containing a surfactant As a result, highly hydrophobic unnecessary components (blood proteins, lipids, glycolipids, etc.) can be effectively removed.
  • the neutral buffer and surfactant in the first washing solution include those similar to the neutral buffer and surfactant exemplified for the binding solution.
  • the surfactant concentration in the first cleaning solution is, for example, 0.01% (w/v) or more, preferably 0.02% (w/v) or more, and for example, 5% (w/v) or more. v) less than or equal to 2% (w/v), preferably less than or equal to 2% (w/v); If the concentration of the surfactant is within the above range, sufficient micelles are formed, so that the effects of the surfactant can be reliably exhibited.
  • washing method A known method may be adopted for the washing method, and preferably, washing is performed multiple times. For example, washing with a neutral buffer containing detergent, followed by washing with a neutral buffer without detergent.
  • Neutral buffers containing no surfactant can also be the same as the neutral buffers exemplified for the binding solution. As a result, foaming caused by the surfactant remaining in the first combined body can be suppressed.
  • a general method may be adopted, for example, a method of stirring the carrier in the cleaning solution, a method of injecting the cleaning solution from a cleaning nozzle, and the like. After washing with these neutral buffers, washing with water may be further carried out, if necessary.
  • First elution step In the first elution step, after the first washing step, the first binder is brought into contact with the first acidic solution. As a result, the Ng-related peptide is dissociated from the first conjugate, and the Ng-related peptide is eluted into the first acidic solution. As a result, a first eluate containing Ng-related peptides is obtained.
  • the first acidic solution examples include acidic aqueous solutions such as glycine buffer and hydrochloric acid, preferably glycine buffer.
  • the pH of the first acidic solution is, for example, 3.5 or less, preferably 3.0 or less, and is, for example, 0.5 or more, preferably 1.0 or more.
  • the first acidic solution preferably contains a surfactant. This makes it possible to more reliably dissociate the Ng-related peptide from the first conjugate. It also prevents the eluted Ng-related peptides from adhering to containers such as test tubes and microplates. Therefore, it is possible to reliably improve the recovery rate of Ng-related peptides and improve the detection sensitivity.
  • Surfactants used in the first acidic solution include the same surfactants as those exemplified for the binding solution. Also, the surfactant concentration in the first acidic solution is similar to the surfactant concentration in the first cleaning solution.
  • the first eluate is mixed with a neutral buffer solution after the first elution step. This neutralizes the first eluate to obtain a purified solution containing Ng-related peptides.
  • the neutral buffer used in the neutralization step preferably contains a surfactant. Thereby, non-specific adsorption to the second conjugate can be suppressed in the second binding step.
  • the neutral buffers and surfactants used in the neutralization step include those similar to the neutral buffers and surfactants exemplified for the binding solution. Also, the surfactant concentration in the neutral buffer is similar to the surfactant concentration in the first binding solution.
  • the pH of the resulting purified solution is neutral, for example, pH 6.0 or higher, preferably 6.5 or higher, and for example, pH 8.5 or lower, preferably 8.0 or lower.
  • the coupling efficiency can be improved in the second coupling step.
  • the purified solution is brought into contact with the second carrier after the neutralization step. Thereby, the Ng-related peptide in the purified solution binds to the second carrier to obtain the second conjugate.
  • the second carrier is preferably an antibody-immobilized carrier, and specifically includes the same antibody-immobilized carriers exemplified for the first carrier.
  • the second washing solution is preferably a neutral buffer containing a surfactant.
  • a neutral buffer containing a surfactant for example, highly hydrophobic unnecessary components (blood proteins, lipids, glycolipids, etc.) can be effectively removed.
  • Neutral buffers and surfactants used in the second washing solution include those similar to the neutral buffers and surfactants exemplified for the binding solution.
  • the surfactant concentration in the second cleaning solution is similar to the surfactant concentration in the first cleaning solution.
  • a known method may be adopted for the washing method, and specifically, the same method as the washing method exemplified in the first washing step may be performed.
  • Examples of the acidic aqueous solution constituting the second acidic solution include those similar to the first acidic solution exemplified in the first elution step, preferably hydrochloric acid.
  • the second acidic solution contains protein.
  • the mass of the protein is 9 kDa or more and, for example, 100 kDa or less, preferably 15 kDa or less, more preferably 11 kDa or less.
  • Proteins are not limited as long as their mass is 9 kDa or more, and specific examples include recombinant neurogranin, cytochrome, bovine serum albumin (BSA), ovalbumin, and lysozyme.
  • BSA bovine serum albumin
  • the protein concentration in the second acidic solution is, for example, 10 nM or higher, preferably 20 nM or higher, more preferably 30 nM or higher. , 600 nM or less, preferably 300 nM or less, more preferably 150 nM or less.
  • the concentration is, for example, 0.1 ⁇ g/mL or more, preferably 0.25 ⁇ g/mL or more, and is, for example, 30 ⁇ g/mL or less, preferably 4.00 ⁇ g/mL or less.
  • the second acidic solution preferably contains a volatile organic solvent.
  • Volatile organic solvents include organic solvents that are miscible with water in any proportion, such as acetonitrile, methanol, ethanol, acetone, toluene, isopropanol, hexane, butanol, cyclohexane, ethylene glycol, benzene, chloroform, acetaldehyde, Triethylamine, phenol, naphthalene, formaldehyde, tetrahydrofuran, ethyl acetate and the like, preferably acetonitrile, methanol, ethanol, acetone and isopropanol. These organic solvents can be used singly or in combination of two or more.
  • Volatile organic solvent concentration in the second acidic solution is, for example, 10% (v/v) or more, preferably 25% (v/v) or more, and, for example, 90% (v/v) or less , preferably 80% (v/v) or less. If the concentration is within the above range, the Ng-related peptide can be efficiently dissociated from the second carrier, and the sensitivity (S/N ratio) during mass spectrometry can be improved.
  • the second acidic solution preferably further contains an amino acid such as methiotine.
  • an amino acid such as methiotine.
  • the amino acid concentration in the second acidic solution is, for example, 0.01 mM or higher, preferably 0.05 mM or higher, and is, for example, 5 mM or lower, preferably 1 mM or lower.
  • Detection step In the detection step, after the purification step, the second eluate is subjected to MALDI-MS (Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization-Mass spectrometry) to detect Ng-related Detect peptides. Specifically, Ng-related peptides contained in the second eluate or its dried product are ionized by MALDI, and the ionized peptides are detected by mass spectrometry.
  • MALDI-MS Microx Assisted Laser Desorption / Ionization-Mass spectrometry
  • MALDI-MS for example, MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight) mass spectrometer, MALDI-IT (matrix-assisted laser desorption ionization-ion trap) mass spectrometer, MALDI-IT-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization-ion trap-time-of-flight) type mass spectrometer, MALDI-FTICR (matrix-assisted laser desorption/ionization-Fourier transform ion cyclotron resonance) type mass spectrometer, etc., can be operated according to a conventional method. Just do it.
  • the laser irradiation target is placed on the MALDI plate. Specifically, for example, a matrix-containing solution is dropped onto a MALDI plate and dried (crystallized) to dispose the matrix, and then the second eluate is dropped onto the matrix and dried. As a result, a laser irradiation target is obtained in which the matrix, Ng-related peptides, and proteins of 9 kD or more are present in a dry state (solid state). In addition, if necessary, the object to be irradiated with laser may be obtained in a liquid state in which solid components are concentrated without drying completely.
  • the Ng-related peptide is ionized by irradiating the laser irradiation target with the laser, and the ionized peptide is detected by the mass spectrometer.
  • the mass spectrometer By analyzing the detection result with a mass spectrometer, the Ng-related peptide can be quantified.
  • matrices examples include ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA; ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid), 2,5-dihydroxybenzoic acid, sinapinic acid, and 3-aminoquinoline. These matrices can be used singly or in combination of two or more.
  • solvents that contain the matrix include acetonitrile, trifluoroacetic acid, methanol, ethanol, and water. These solvents can be used singly or in combination of two or more.
  • the matrix concentration in the matrix-containing solution is, for example, 0.1 mg/mL or more, preferably 0.5 mg/mL or more, and is, for example, 50 mg/mL or less, preferably 10 mg/mL or less.
  • the amount of matrix placed on the MALDI plate is, for example, 0.1 ⁇ g or more, preferably 0.5 ⁇ g or more, and is, for example, 50 ⁇ g or less, preferably 10 ⁇ g or less per well.
  • a matrix additive is used together with the matrix.
  • matrix additives include phosphonic acid group-containing compounds and ammonium salts.
  • Phosphonic acid group-containing compounds include, for example, phosphonic acid, methylphosphonic acid, phenylphosphonic acid, 1-naphthylmethylphosphonic acid, methylenediphosphonic acid (MDPNA; Methylenediphosphonic acid), ethylenediphosphonic acid, ethane-1-hydroxy-1, 1-diphosphonic acid, nitrilotriphosphonic acid, ethylenediaminotetraphosphonic acid and the like.
  • the matrix additive concentration in the matrix-containing solution is, for example, 0.01% (w/v) or more, preferably 0.1% (w/v) or more, and for example, 10% (w/v). Below, preferably 1% (w/v) or less.
  • the content of a protein of 9 kDa or more per 1 ⁇ g of matrix is 10 fmol or more and 600 fmol or less. It is preferably 20 fmol or more, more preferably 30 fmol or more, and preferably 300 fmol or less, more preferably 150 fmol or less. If the protein content is below the above lower limit, the effect of blending the protein may not be produced and the detection sensitivity may not be improved. On the other hand, when the protein content exceeds the above upper limit, there is a possibility that the detection sensitivity may be lowered compared to the case where the protein is not contained.
  • the Ng-related peptides contained in the second eluate (and thus the sample) can be measured.
  • the laser irradiation target contains a protein of 9 kDa or more, and the protein content per 1 ⁇ g of the matrix is 10 fmol or more and 600 fmol or less. can be detected. This is because in MADLI-MS, a sample is usually singly ionized by receiving protons from a laser-excited matrix, and the singly charged ion peak is detected.
  • Ng-related peptides due to their structure, divalent ionization also occurs, and the intensity of monovalent ions is relatively reduced.
  • the first embodiment since proteins of 9 kDa or more coexist in the matrix, the number of proton receptors increases and the protons are dispersed, so it is presumed that divalent ions decrease. Note that the first embodiment is not limited to the above mechanism.
  • a protein of 9 kDa or more is added to the second acidic solution.
  • the detection step on a plate irradiated with a laser, 2.
  • the laser irradiation target is made to contain the protein of 9 kDa or more.
  • the analysis method of the second embodiment includes a purification step and a detection step in order.
  • the purification step is, for example, affinity purification, and includes a first binding step, a first washing step, a first elution step, a neutralization step, a second binding step, a second washing step, and a second elution. and steps in this order.
  • the first binding step, the first washing step, the first elution step, the neutralization step, the second binding step, and the second washing step are the same as those steps in the first embodiment.
  • the second elution step in the second embodiment is the same as the second elution step in the first embodiment, except that the second acidic solution, and thus the second eluate, does not contain a protein of 9 kDa or more. .
  • the laser irradiation target is placed on the MALDI plate.
  • the protein-containing liquid is added dropwise.
  • the matrix-containing solution is dropped onto a MALDI plate and dried, and then the second eluate and protein-containing solution are dropped onto it and dried.
  • the laser irradiation target is irradiated with a laser, and ionized peptides are detected by a mass spectrometer. Since the matrix, the Ng-related peptide, and the protein of 9 kD or more need only be contained in a dry state, the order of dropping the matrix, the Ng-related peptide, and the protein of 9 kD or more does not matter.
  • the protein-containing liquid contains a protein of 9 kDa or more and a solvent.
  • the solvent include, but are not limited to, the same solvent as the matrix-containing solvent, preferably the solvent used for the second acidic solution.
  • the protein concentration per 1 ⁇ g of matrix is 10 fmol or more and 600 fmol or less (preferably 20 fmol or more, more preferably 30 fmol or more, and preferably 300 fmol or less and 150 fmol). below).
  • the protein concentration is, for example, 10 nM or more, preferably 50 nM or more, and, for example, 1000 nM or less, preferably 600 nM or less
  • the dropping amount is, for example, 0.1 ⁇ L or more. , preferably 0.2 ⁇ L or more, and for example, 10 ⁇ L or less, preferably 5 ⁇ L or less.
  • the first embodiment is preferable from the viewpoint of not increasing the number of steps for accurately dropping onto the MALDI plate and facilitating uniform mixing of laser irradiation targets.
  • immunoprecipitation is performed multiple times (twice) as the purification step, but for example, immunoprecipitation is performed only once. You may
  • the analysis method of the third embodiment includes a first binding step (binding step), a first washing step (washing step), a second elution step (elution step), and a detection step.
  • the second acidic solution solution for elution
  • the second acidic solution contains a protein of 9 kDa or more.
  • the analysis method of the fourth embodiment includes a first binding step (binding step), a first washing step (washing step), a second elution step (elution step), and a detection step.
  • first binding step binding step
  • first washing step washing step
  • second elution step elution step
  • detection step detection step
  • the first and second embodiments are preferable from the viewpoint that the Ng-related peptides can be reliably analyzed even when the amount of the Ng-related peptides present in the sample is much smaller.
  • An analysis method is a method of analyzing a neurogranin-related peptide by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, wherein the laser irradiation target is the neurogranin-related peptide, the matrix , and a protein of 9 kDa or more, and the content of the protein with respect to 1 ⁇ g of the matrix may be 10 fmol or more and 600 fmol or less.
  • the content of the protein with respect to 1 ⁇ g of the matrix may be 30 fmol or more and 150 fmol or less.
  • the mass of the protein may be 9 kDa or more and 15 kDa or less.
  • the sample containing the neurogranin-related peptide is brought into contact with the carrier in the binding solution, and the neurogranin-related peptide is a binding step of obtaining a conjugate bound to a carrier; a washing step of washing the conjugate with a washing solution; and a detection step of performing matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry on the eluate to detect the neurogranin-related peptide, wherein the acidic The solution may contain said protein.
  • the concentration of the protein in the eluate may be 10 nM or more and 600 nM or less.
  • the sample containing the neurogranin-related peptide is brought into contact with the carrier in the binding solution, and the neurogranin-related peptide is a binding step of obtaining a conjugate bound to a carrier; a washing step of washing the conjugate with a washing solution; and a detection step of performing matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry on the eluate to detect the neurogranin-related peptide, wherein the detection In the step, the eluate and the liquid containing the protein may be mixed on a plate irradiated with laser.
  • the concentration of the protein in the liquid containing the protein may be 10 nM or more and 600 nM or less.
  • Example 1 (First binding step, first washing step, first elution step) An anti-Ng antibody (IgG1) clone NG2 (BioLegend) with epitope at residues 52-63 of human Neurogranin (Ng) was prepared. 5.5 mg of magnetic beads (Dynabeads M-270 Epoxy) per 100 ⁇ g of anti-Ng antibody were added in an immobilization buffer (0.1 M phosphate buffer containing 1.5 M ammonium sulfate; pH 7.4) at 37°C. for 16-24 hours. Thus, antibody beads were produced.
  • an immobilization buffer 0.1 M phosphate buffer containing 1.5 M ammonium sulfate; pH 7.4
  • a sample of 250 ⁇ L containing two types of Ng peptides (concentration of each peptide: 40 pM) listed in Table 1 below was prepared.
  • the sample was added to a binding buffer (0.1% n-undecyl- ⁇ -D-maltoside (UDM), 800 mM GlcNAc, 100 mM Tris- HCl, 300 mM NaCl; pH 7.4) was mixed with 250 ⁇ L and allowed to stand on ice for 5 to 60 minutes.
  • the mixed sample was mixed with the antibody beads and shaken on ice for 1 hour.
  • Antibody beads were then washed three times with 100 ⁇ L of the first wash buffer (0.05% UDM, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl; pH 7.4) and twice with 50 ⁇ L of 50 mM ammonium acetate buffer.
  • the antibody beads were then contacted with a first acidic solution (0.05% UDM, 50 mM glycine buffer; pH 2.8) to elute the Ng-related peptides into the first acidic solution. This gave a first eluate containing Ng-related peptides.
  • the first eluate was mixed with a neutral buffer (0.1% UDM, 800 mM GlcNAc, 300 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl; pH 7.4) to obtain a purified solution.
  • a neutral buffer (0.1% UDM, 800 mM GlcNAc, 300 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl; pH 7.4
  • the antibody beads are brought into contact with 5 ⁇ L of a second acidic solution (a 70% (v/v) acetonitrile aqueous solution containing the amounts shown in Table 2 of recombinant Ng, 5 mM hydrochloric acid and 0.1 mM methionine) to obtain Ng-related peptides. was eluted in the second acidic solution. This gave a second eluate containing Ng-related peptides.
  • a second acidic solution a 70% (v/v) acetonitrile aqueous solution containing the amounts shown in Table 2 of recombinant Ng, 5 mM hydrochloric acid and 0.1 mM methionine
  • Detection process As a mass spectrometer, AXIMA Performance (Shimadzu/KRATOS, Manchester, UK), which is a MALDI-TOF MS device, was used. 2 mg/mL CHCA/0.2 using ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) as matrix for Linear TOF, methylene diphosphonic acid (MDPNA) as matrix additive and acetonitrile as solvent A % (w/v) MDPNA matrix solution was prepared.
  • CHCA ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid
  • MDPNA methylene diphosphonic acid
  • solvent acetonitrile
  • 0.5 ⁇ L of the matrix solution (that is, 1 ⁇ g of matrix per well) was dropped onto 4 wells of a MALDI plate ( ⁇ Focus MALDI plate 900 ⁇ m (Hudson Surface Technology, Inc., Fort Lee, NJ)) and dried. After that, 1 ⁇ L of the second eluate was added dropwise and dried.
  • the MALDI-TOF MS was then run to detect Ng-related peptides (Ng43-75 and Ng33-75).
  • mass spectral data was acquired with a linear TOF in positive ion mode. 400 spots and 16000 shots were accumulated for each well.
  • the m/z value of Linear TOF is indicated by the average mass of peaks.
  • the m/z values were calibrated using human angiotensin II and human ACTH fragment 18-39, bovine insulin oxidized beta-chain, bovine insulin, and cytochrome c as external standards.
  • the concentration of the protein (recombiant Ng) contained in the second acidic solution, and thus the second eluate, is set to a plurality of concentrations (0 to 1600 nM) shown in Table 2 below, and the measurement is performed. bottom.
  • the mass of recombinant Ng is 9925.92 Da
  • the mass of Cytochrome C is 12360.52 Da
  • Bovine sewrum albumin was 66296 Da.
  • Example 4 It was carried out in the same manner as in Examples 1-3. However, instead of 5 ⁇ L of the second acidic solution containing proteins (rNg, CytC, BSA), 2.5 ⁇ L of the second acidic solution containing no protein was used. In addition, 0.5 ⁇ L of the matrix solution was dropped into each well of the MALDI plate, dried, and then 0.5 ⁇ L of the second eluate and a protein-containing solution (protein concentration: 100 nM, solvent: 5 mM hydrochloric acid and 0.1 mM methionine 0.5 ⁇ L of 70% (v/v) acetonitrile aqueous solution containing and dried.
  • protein concentration 100 nM
  • solvent 5 mM hydrochloric acid
  • methionine 0.5 ⁇ L of 70% (v/v) acetonitrile aqueous solution containing and dried.

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Abstract

ニューログラニン関連ペプチドを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法により分析する方法であって、レーザー照射対象が、前記ニューログラニン関連ペプチド、マトリックス、および、９ｋＤａ以上のタンパク質を含有し、前記マトリックス１μｇに対する前記タンパク質の含有量が、１０ｆｍｏｌ以上、６００ｆｍｏｌ以下である。

Description

ニューログラニン関連ペプチドの分析方法
　本発明は、ニューログラニン関連ペプチドの分析方法に関する。
　アルツハイマー病は、認知症の主な原因であり、その罹患者は、近年ますます増加しており、その研究はより一層重要となってきている。アルツハイマー病の発症では、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ；Amyloid precursor protein）の切断によって生じるアミドロイドβ（Ａβ）などのＡβ関連ペプチドが深く関わっている。そして、免疫沈降法および質量分析法を組み合わせて血液内の複数のＡβ関連ペプチドを検出し、その検出した特定のＡβ関連ペプチド比が、脳内アミロイド蓄積の血液バイオマーカーとして有望であることが報告されている（非特許文献１～２、特許文献１～３）。
　一方、アルツハイマー病は、その病態進行をモニターするためには、種々のバイオマーカーが必要であり、アルミロイド蓄積以外にも、タウ蓄積、神経変性の各プロセスを反映するためのバイオマーカーが要求されている。その中で、ニューログラニン(Neurogranin)は、神経変性のバイオマーカーの１つであり、アルツハイマー病患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中で増加することが報告されている（非特許文献３、非特許文献４）。また、アルツハイマー病患者の脳内では、ニューログラニンの断片化が促進され、断片ペプチドが発生していることも報告されている（非特許文献５）。よって、ニューログラニンまたはその断片ペプチドなど（ニューログラニン関連ペプチド）の質量分析法が、神経変性を確認する手段として、期待されている。
　ところで、脳脊髄液中のニューログラニン関連ペプチドを分析することは、脳脊髄液を採取する必要があり、侵襲性の点で好ましくない。そのため、一般的な検査で採取が可能であり、低侵襲性である血液での分析が望まれている。
　しかしながら、血液に存在するニューログラニン関連ペプチドは、ごく微少なペプチドも含まれているため、従来の質量分析法では、充分に検出できない。例えば、免疫沈降法と質量分析法とを組み合わせた方法により、ニューログラニンなどを検出できたことが報告されている程度である（非特許文献６）。
WO２０１５／１７８３９８ WO２０１７／４７５２９ 特開２０１７－２０９８０号公報
Kaneko N, Nakamura A, Washimi Y, Kato T, Sakurai T, Arahata Y, Bundo M, Takeda A, Niida S, Ito K, Toba K, Tanaka K, Yanagisawa K. : Novel plasma biomarker surrogating cerebral amyloid deposition. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014;90(9):353-364. Nakamura A, Kaneko N, Villemagne VL, Kato T, Doecke J, Dore V, Fowler C, Li QX, Martins R, Rowe C, Tomita T, Matsuzaki K, Ishii K, Ishii K, Arahata Y, Iwamoto S, Ito K, Tanaka K, Masters CL, Yanagisawa K. : High performance plasma amyloid-β biomarkers for Alzheimer's disease. Nature. 2018;554(7691):249-254. Portelius E, Olsson B, Hoglund K, Cullen NC, Kvartsberg H, Andreasson U, Zetterberg H, Sandelius A, Shaw LM, Lee VMY, Irwin DJ, Grossman M, Weintraub D, Chen-Plotkin A, Wolk DA, McCluskey L, Elman L, McBride J, Toledo JB, Trojanowski JQ, Blennow K. : Cerebrospinal fluid neurogranin concentration in neurodegeneration: relation to clinical phenotypes and neuropathology. Acta Neuropathol. 2018 ;136(3):363-376. Thorsell A, Bjerke M, Gobom J, Brunhage E, Vanmechelen E, Andreasen N, Hansson O, Minthon L, Zetterberg H, Blennow K. : Neurogranin in cerebrospinal fluid as a marker of synaptic degeneration in Alzheimer's disease. Brain Res. 2010;1362:13-22. Kvartsberg H, Lashley T, Murray CE, Brinkmalm G, Cullen NC, Hoglund K, Zetterberg H, Blennow K, Portelius E. : The intact postsynaptic protein neurogranin is reduced in brain tissue from patients with familial and sporadic Alzheimer’s disease. Acta Neuropathol. 2019;137(1):89-102. Kvartsberg H, Portelius E, Andreasson U, Brinkmalm G, Hellwig K, Lelental N, Kornhuber J, Hansson O, Minthon L, Spitzer P, Maler JM, Zetterberg H, Blennow K, Lewczuk P. : Characterization of the postsynaptic protein neurogranin in paired cerebrospinal fluid and plasma samples from Alzheimer’s disease patients and healthy controls. Alzheimers Res Ther. 2015;7(1):40.
　しかしながら、非特許文献６の分析方法を実施した場合においても、非特許文献２に記載のＡβ関連ペプチドの分析方法をニューログラニン関連ペプチドに転用した場合においても、分析感度が不十分であり、実用化のレベルに至っていない。したがって、血液中のニューログラニンなどを分析するには、さらなる感度の向上が要求されている。
　本発明は、ニューログラニン関連ペプチドを高感度で検出することを目的とする。
　本発明の第１の態様は、ニューログラニン関連ペプチドを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法により分析する方法であって、レーザー照射対象が、前記ニューログラニン関連ペプチド、マトリックス、および、９ｋＤａ以上のタンパク質を含有し、　前記マトリックス１μｇに対する前記タンパク質の含有量が、１０ｆｍｏｌ以上、６００ｆｍｏｌ以下である。
　本発明の第１の態様によれば、ニューログラニン関連ペプチドを高感度で分析することができる。
図１は、タンパク質としてrecombiant Ngをレーザー照射対象に含有させた場合において、ＭＡＬＤＩ－ＭＳの検出感度の変動率を示す実施例１のグラフである。縦軸は、タンパク質（recombiant Ng）を含有しない場合のマススペクトルピークのシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）に対するタンパク質を含有する場合のピークのＳ／Ｎ、横軸は、マトリックス１μｇに対するタンパク質の含有量を示す。 図２は、タンパク質としてCytochrome Cをレーザー照射対象に含有させた場合において、ＭＡＬＤＩ－ＭＳの検出感度の変動率を示す実施例２のグラフである。 図３は、タンパク質としてBovine sewrum albuminをレーザー照射対象に含有させた場合において、ＭＡＬＤＩ－ＭＳの検出感度の変動率を示す実施例３のグラフである。 図４は、タンパク質含有液をＭＡＬＤＩプレートに滴下した際において、Ｎｇ４３－７５ペプチドの検出感度の変動率を示す実施例４のグラフである。縦軸は、タンパク質を含有しない場合のマススペクトルピークのシグナル/ノイズ比（Ｓ／Ｎ）に対するタンパク質を含有する場合のピークのＳ／Ｎ、横軸は、タンパク質の種類を示す。 図５は、タンパク質含有液をＭＡＬＤＩプレートに滴下した際において、Ｎｇ３３－７５ペプチドの検出感度の変動率を示す実施例４のグラフである。
　１．第１の実施形態
　第１の実施形態にかかる分析方法は、試料中のニューログラニン関連ペプチドを分析する方法であって、精製工程と、検出工程とを順に備える。以下、各工程を詳述する。
　なお、「ニューログラニン関連ペプチド」（以下、「Ｎｇ関連ペプチド」と略する。）には、ニューログラニン、翻訳・修飾されたニューログラニン、および、これらの断片ペプチドが含まれる。断片ペプチドとしては、例えば、Ｎｇ４３－７５（配列番号１）、Ｎｇ３３－７５（配列番号２）、Ｎｇ５０－７８（配列番号３）などが挙げられる。Ｎｇ関連ペプチドの質量（分子量）は、一般的には、９ｋＤａ未満であり、好ましくは、８ｋＤａ以下であり、また、例えば、１ｋＤａ以上、好ましくは、２ｋＤａ以上である。第１の実施形態では、特に、９ＫＤａ未満のＮｇ関連ペプチドに対して、好適に測定することができる。この質量は、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間）型質量分析装置などによって測定することができる。
　１－１．精製工程
　精製工程は、例えば、アフィニティ精製であり、具体的には、第１結合工程（結合工程の一例）と、第１洗浄工程（洗浄工程の一例）と、第１溶出工程と、中性化工程と、第２結合工程と、第２洗浄工程と、第２溶出工程（溶出工程の一例）とをこの順に備える。
　（第１結合工程）
　第１結合工程では、結合液中にて、試料を第１担体に接触させる。例えば、結合溶液、試料および第１担体を適宜の順で混合する。これにより、試料中のＮｇ関連ペプチドが第１担体に結合して、第１結合体が得られる。
　試料は、ニューログラニン関連ペプチドを含有する試料であって、一般的には、生体試料である。生体試料としては、例えば、血液、脳脊髄液、尿、体分泌液、唾液、痰などの体液；例えば、糞便などが挙げられる。血液には、全血、血漿、血清などが含まれる。血液は、個体から採取された全血に、遠心分離、冷凍保存などの処理がなされたものであってよい。本分析方法では、好ましくは、血液が挙げられる。血液は、脳骨髄液と比較して低侵襲性であり、また、健康診断等におけるスクリーニングの対象試料であって入手が容易である。
　結合溶液は、好ましくは、界面活性剤を含有する中性緩衝液である。緩衝液としては、例えば、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、酢酸アンモニウム緩衝液などが挙げられる。結合溶液のｐＨは、例えば、ｐＨ６．０以上、好ましくは、６．５以上であり、また、例えば、８．５以下、好ましくは、８．０以下である。
　結合溶液に含有される界面活性剤としては、例えば、疎水基の炭素数が７以上１５以下（好ましくは、９以上１１以下）である中性界面活性剤が挙げられる。これにより、第１結合体への非特異的吸着を抑制したり、質量分析において、イオン化干渉を低減することができる。このような界面活性剤としては、例えば、ｎ－ノニル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－ノニル－β－Ｄ－チオマルトシド、ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－ウンデシル－β－Ｄ－マルトシド（ＵＤＭ：n-Undecyl-β-D-maltoside）などのマルトースを親水性部分に有する界面活性剤；例えば、α－Ｄ－グルコピラノシルα－Ｄ－グルコピラノシド　モノデカノエート（トレハロースＣ１０）などのトレハロースを親水性部分に有する界面活性剤；例えば、ｎ－デシル－β－Ｄ－グルコシドなどのグルコースを親水性部分に有する界面活性剤などが挙げられる。これら界面活性剤は、１種単独で用いることができ、また、２種以上を併用することができる。
　結合溶液中の界面活性剤濃度は、例えば、０．０１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは、０．０５％（ｗ／ｖ）以上であり、また、例えば、１０％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは、３％（ｗ／ｖ）以下である。界面活性剤濃度が上記範囲であれば、ミセルが充分に形成されるため、界面活性剤の効果を確実に発揮させることができる。
　第１担体は、Ｎｇ関連ペプチドが結合可能なものであればよく、例えば、抗体固定化担体が挙げられる。
　第１担体に固定化されている抗体は、Ｎｇ関連ペプチドを認識可能な抗原結合部位を有する抗体（抗Ｎｇ関連ペプチド抗体）であり、例えば、Ｎｇ関連ペプチドを認識可能な抗原結合部位を有する免疫グロブリンまたはその断片が挙げられる。
　免疫グロブリンとしては、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＹ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが挙げられる。免疫グロブリン断片としては、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｌ鎖、Ｈ鎖などが挙げられる。より具体的には、クローンＮＧ２、ＮＧ７、ＥＰＲ２１１５２およびこれらの断片などである。抗体は、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体のいずれでもよい。
　第１担体の材質としては、例えば、アガロース、セファロース、デキストラン、シリカゲル、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリロニトリル、（メタ）アクリル酸系ポリマー、フッ素樹脂、金属錯体樹脂、ガラス、金属、磁性体などが挙げられる。
　第１担体の形状としては、球状（ビーズ形状を含む）、板状、針状、不定形などのいずれの形状であってもよく、また、マイクロデバイス内の流路壁などであってもよい。
　第１結合工程の前に、必要に応じて、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの抗体を除去する前処理などを実施してもよい。
　（第１洗浄工程）
　第１洗浄工程では、第１結合工程の後において、第１洗浄溶液を用いて第１結合体を洗浄する。
　第１洗浄溶液は、好ましくは、界面活性剤を含有する中性緩衝液である。これにより、疎水性の高い不要成分（血中タンパク質、脂質、糖脂質など）を効果的に除去することができる。第１洗浄溶液における中性緩衝液および界面活性剤としては、結合溶液で例示した中性緩衝液および界面活性剤と同様のものが挙げられる。
　第１洗浄溶液中の界面活性剤濃度は、例えば、０．０１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは、０．０２％（ｗ／ｖ）以上であり、また、例えば、５％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは、２％（ｗ／ｖ）以下である。界面活性剤濃度が上記範囲であれば、ミセルが充分に形成されるため、界面活性剤の効果を確実に発揮させることができる。
　洗浄方法は、公知の方法を採用すればよく、好ましくは、複数回洗浄を実施する。例えば、界面活性剤を含有する中性緩衝液を用いて洗浄し、続いて、界面活性剤を含有しない中性緩衝液を用いて洗浄する。
　界面活性剤を含有しない中性緩衝液も、結合溶液で例示した中性緩衝液と同様のものを使用することができる。これにより、界面活性剤が第１結合体に残存することによる泡立ちを抑制することができる。
　洗浄方法としては、一般的な方法を採用すればよく、例えば、洗浄溶液内で担体を攪拌する方法、洗浄ノズルから洗浄溶液を噴射する方法などが挙げられる。これら中性緩衝液による洗浄後に、必要に応じて、水による洗浄をさらに実施してもよい。
　（第１溶出工程）
　第１溶出工程では、第１洗浄工程の後において、第１結合体を第１酸性溶液に接触させる。これにより、第１結合体からＮｇ関連ペプチドが解離して、第１酸性溶液にＮｇ関連ペプチドが溶出する。その結果、Ｎｇ関連ペプチドを含有する第１溶出液が得られる。
　第１酸性溶液としては、例えば、グリシン緩衝液、塩酸などの酸性水溶液が挙げられ、好ましくは、グリシン緩衝液が挙げられる。第１酸性溶液のｐＨは、例えば、３．５以下、好ましくは、３．０以下であり、また、例えば、０．５以上、好ましくは、１．０以上である。
　第１酸性溶液は、好ましくは、界面活性剤を含有する。これにより、第１結合体からＮｇ関連ペプチドをより確実に解離させることができる。また、溶出されたＮｇ関連ペプチドが、試験管、マイクロプレートなどの容器に付着することを抑制する。したがって、Ｎｇ関連ペプチドの回収率を確実に向上させて、検出感度を向上させることができる。第１酸性溶液に用いる界面活性剤としては、結合溶液で例示した界面活性剤と同様のものが挙げられる。また、第１酸性溶液中の界面活性剤濃度は、第１洗浄溶液中の界面活性剤濃度と同様である。
　（中性化工程）
　中性化工程では、第１溶出工程の後において、第１溶出液を中性緩衝液と混合する。これにより、第１溶出液が中性化して、Ｎｇ関連ペプチドを含有する精製溶液が得られる。
　中性化工程に用いる中性緩衝液は、好ましくは、界面活性剤を含有する。これにより、第２結合工程で第２結合体への非特異的吸着を抑制することができる。中性化工程に用いる中性緩衝液および界面活性剤としては、結合溶液で例示した中性緩衝液および界面活性剤と同様のものが挙げられる。また、中性緩衝液中の界面活性剤濃度は、第１結合溶液中の界面活性剤濃度と同様である。
　得られる精製溶液のｐＨは、中性であって、例えば、ｐＨ６．０以上、好ましくは、６．５以上であり、また、例えば、８．５以下、好ましくは、８．０以下である。これにより、第２結合工程において、結合効率を向上させることができる。
　（第２結合工程）
　第２結合工程では、中性化工程の後において、精製溶液を第２担体に接触させる。これにより、精製溶液のＮｇ関連ペプチドが第２担体に結合して、第２結合体が得られる。
　第２担体としては、好ましくは、抗体固定化担体であり、具体的には、第１担体で例示した抗体固定化担体と同様のものが挙げられる。
　（第２洗浄工程）
　第２洗浄工程では、第２結合工程の後において、第２洗浄溶液を用いて第２結合体を洗浄する。
　第２洗浄溶液は、好ましくは、界面活性剤を含有する中性緩衝液である。これにより、例えば、疎水性の高い不要成分（血中タンパク質、脂質、糖脂質など）を効果的に除去することができる。第２洗浄溶液に用いる中性緩衝液および界面活性剤としては、結合溶液で例示した中性緩衝液および界面活性剤と同様のものが挙げられる。また、第２洗浄溶液中の界面活性剤濃度は、第１洗浄溶液中の界面活性剤濃度と同様である。
　洗浄方法は、公知の方法を採用すればよく、具体的には、第１洗浄工程で例示した洗浄方法と同様の方法を実施すればよい。
　（第２溶出工程）
　第２溶出工程では、第２洗浄工程の後において、第２結合体を、第２酸性溶液（溶出用溶液）に接触させる。これにより、第２結合体からＮｇ関連ペプチドが解離して、第２酸性溶液にＮｇ関連ペプチドが溶出する。その結果、Ｎｇ関連ペプチドを含有する第２溶出液が得られる。
　第２酸性溶液を構成する酸性水溶液としては、第１溶出工程で例示した第１酸性溶液と同様のものが挙げられ、好ましくは、塩酸が挙げられる。
　第２酸性溶液は、タンパク質を含有する。タンパク質の質量は、９ｋＤａ以上であり、また、例えば、１００ｋＤａ以下、好ましくは、１５ｋＤａ以下、より好ましくは、１１ｋＤａ以下である。第２酸性溶液に上記質量のタンパク質を配合することにより、レーザー照射対象に上記タンパク質が含まれ、その結果、Ｎｇ関連ペプチドの検出感度が向上する。また、タンパク質の質量の下限を９ｋＤａとすることにより、分析対象であるＮｇ関連ペプチドの質量域との重複を回避することができ、Ｎｇ関連ペプチドのみを正確に検出することができる。タンパク質の質量の上限を１００ｋＤａ、好ましくは１５ｋＤａ、特に１１ｋＤａとすることにより、検出感度を格段に向上させることができる。
　タンパク質は、質量が９ｋＤａ以上であれば限定的でなく、具体的には、リコンビナントニューログラニン、シトクロム、ウシ血清アルブミン（Bovine Serum Albumin;BSA）、オボアルブミン、リゾチームなどが挙げられる。
　第２酸性溶液におけるタンパク質の濃度、ひいては、第２溶出液（溶出液の一例）におけるタンパク質の濃度は、例えば、１０ｎＭ以上、好ましくは、２０ｎＭ以上、より好ましくは、３０ｎＭ以上であり、また、例えば、６００ｎＭ以下、好ましくは、３００ｎＭ以下、より好ましくは、１５０ｎＭ以下である。換言すると、当該濃度は、例えば、０．１μｇ／ｍＬ以上、好ましくは、０．２５μｇ／ｍＬ以上であり、また、例えば、３０μｇ／ｍＬ以下、好ましくは、４．００μｇ／ｍＬ以下である。タンパク質の濃度を上記範囲とすることにより、適切に検出感度を向上させることができる。
　第２酸性溶液は、好ましくは、揮発性有機溶媒を含有する。これにより、第２結合体からＮｇ関連ペプチドを効率よく解離させ、第２酸性溶液に溶出させることができ、Ｎｇ関連ペプチドの回収率を向上させることができる。
　揮発性有機溶媒としては、水と任意の割合で混和する有機溶媒が挙げられ、例えば、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、トルエン、イソプロパノール、ヘキサン、ブタノール、シクロヘキサン、エチレングリコール、ベンゼン、クロロホルム、アセトアルデヒド、トリエチルアミン、フェノール、ナフタレン、ホルムアルデヒド、テトラヒドロフラン、酢酸エチルなどが挙げられ、好ましくは、アセトニトリル、メタノール、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどが挙げられる。これら有機溶剤は、１種単独で用いることができ、また、２種以上を併用することもできる。
　第２酸性溶液中の揮発性有機溶媒濃度は、例えば、１０％（ｖ／ｖ）以上、好ましくは、２５％（ｖ／ｖ）以上であり、また、例えば、９０％（ｖ／ｖ）以下、好ましくは、８０％（ｖ／ｖ）以下である。濃度が上記範囲内であれば、第２担体からＮｇ関連ペプチドが効率よく解離させることができ、また、質量分析時の感度（Ｓ／Ｎ比）を向上させることができる。
　第２酸性溶液は、好ましくは、メチオチンなどのアミノ酸をさらに含有する。これにより、質量分析装置に配置し、分析が開始するまでの間において、Ｎｇ関連ペプチドの酸化を低減させることができ、分析感度を向上させることができる。第２酸性溶液中のアミノ酸濃度は、例えば、０．０１ｍＭ以上、好ましくは、０．０５ｍＭ以上であり、また、例えば、５ｍＭ以下、好ましくは、１ｍＭ以下である。
　１－２．検出工程
　検出工程では、精製工程の後において、第２溶出液に対してＭＡＬＤＩ－ＭＳ（Matrix Assisted Laser Desorption / Ionization－Mass spectrometry；マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法）を実施して、Ｎｇ関連ペプチドを検出する。すなわち、第２溶出液またはその乾燥物に含まれるＮｇ関連ペプチドをＭＡＬＤＩによってイオン化し、イオン化したペプチドを質量分析によって検出する。
　ＭＡＬＤＩ－ＭＳでは、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＩＴ－ＴＯＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－イオントラップ－飛行時間）型質量分析装置、ＭＡＬＤＩ－ＦＴＩＣＲ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化－フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴）型質量分析装置などを用いて、常法に従って操作すればよい。
　ＭＡＬＤＩ－ＭＳの検出操作では、まず、ＭＡＬＤＩプレートに、レーザー照射対象を配置する。具体的には、例えば、マトリックス含有溶液をＭＡＬＤＩプレートに滴下し、乾燥（結晶化）させることにより、マトリックスを配置した後、そのマトリックス上に、第２溶出液を滴下し、乾燥させる。これにより、マトリックス、Ｎｇ関連ペプチドおよび９ｋD以上のタンパク質が乾燥状態（固体状態）で存在するレーザー照射対象が得られる。なお、必要に応じて、完全な乾燥をせずに、固体成分が濃縮された液体状態で存在するレーザー照射対象を得てもよい。
　続いて、レーザー照射対象にレーザーを照射させることにより、Ｎｇ関連ペプチドがイオン化され、イオン化したペプチドが、上記質量分析装置によって検出される。その検出結果を質量分析装置により解析することにより、Ｎｇ関連ペプチドを定量することができる。
　マトリックスとしては、例えば、α－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ；α-cyano-4-hydroxycinnamic acid）、２，５-ジヒドロキシ安息香酸、シナピン酸、３－アミノキノリンなどが挙げられる。これらマトリックスは、１種単独で用いることができ、また、２種以上を併用することができる。
　マトリックスを含有させる溶媒としては、例えば、アセトニトリル、トリフルオロ酢酸、メタノール、エタノール、水などが挙げられる。これら溶媒は、１種単独で用いることができ、また、２種以上を併用することができる。
　マトリックス含有溶液におけるマトリックス濃度は、例えば、０．１ｍｇ／ｍＬ以上、好ましくは０．５ｍｇ／ｍＬ以上であり、また、例えば、５０ｍｇ／ｍＬ以下、好ましくは、１０ｍｇ／ｍＬ以下である。
　ＭＡＬＤＩプレートに配置されるマトリックス量は、１ｗｅｌｌあたり、例えば、０．１μｇ以上、好ましくは０．５μｇ以上であり、また、例えば、５０μｇ以下、好ましくは、１０μｇ以下である。
　好ましくは、マトリックスとともに、マトリックス添加剤を併用する。マトリックス添加剤としては、例えば、ホスホン酸基含有化合物、アンモニウム塩などが挙げられ、好ましくは、洗浄溶液の残存によるバックグランドへの悪影響を抑制できる観点から、ホスホン酸基含有化合物が挙げられる。ホスホン酸基含有化合物としては、例えば、ホスホン酸、メチルホスホン酸、フェニルホスホン酸、１－ナフチルメチルホスホン酸、メチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ；Methylenediphosphonic acid）、エチレンジホスホン酸、エタン－１－ヒドロキシ－１，１－ジホスホン酸、ニトリロトリホスホン酸、エチレンジアミノテトラホスホン酸などが挙げられる。
　マトリックス含有溶液におけるマトリックス添加剤濃度は、例えば、０．０１％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは、０．１％（ｗ／ｖ）以上であり、また、例えば、１０％（ｗ／ｖ）以下、好ましくは、１％（ｗ／ｖ）以下である。
　レーザー照射対象において、マトリックス１μｇに対する９ｋＤａ以上のタンパク質の含有量は、１０ｆｍｏｌ以上、６００ｆｍｏｌ以下である。好ましくは、２０ｆｍｏｌ以上、より好ましくは、３０ｆｍｏｌ以上であり、また、好ましく、３００ｆｍｏｌ以下、より好ましくは、１５０ｆｍｏｌ以下である。タンパク質の含有量が上記下限を下回ると、タンパク質配合の効果が生じず、検出感度が向上しないおそれがある。一方、タンパク質の含有量が上記上限を上回ると、タンパク質を含有しない場合と比べて、検出感度が低下するおそれがある。
　これにより、第２溶出液（ひいては、試料）に含有されるＮｇ関連ペプチドを測定することができる。この分析方法では、特に、レーザー照射対象が９ｋＤａ以上のタンパク質を含有し、マトリックス１μｇに対するタンパク質の含有量が１０ｆｍｏｌ以上、６００ｆｍｏｌ以下であるため、Ｎｇ関連ペプチドを非常に高感度（Ｓ／Ｎ）で検出することができる。これは、ＭＡＤＬＩ－ＭＳでは、通常、試料が、レーザーにより励起されたマトリックスからプロトンを受け取ることにより、一価でイオン化されて、その一価イオンのピークを検出する。しかしながら、Ｎｇ関連ペプチドでは、その構造上、二価イオン化も発生してしまい、相対的に一価イオンの強度が低下する。これに対し、第１の実施形態では、９ｋＤａ以上のタンパク質がマトリックス内に共存するため、プロトン受容体が増加し、プロトンが分散されるため、二価イオンが減少することによると推測される。なお、第１の実施態様は上記メカニズムに限定されない。
　２．第２の実施形態
　第１の実施形態では、精製工程において、第２酸性溶液に９ｋＤａ以上のタンパク質を添加するが、第２の実施形態では、検出工程において、レーザーを照射するプレート上で、第２溶出液と、９ｋＤａ以上のタンパク質を含有する液体（タンパク質含有液）とを混合することにより、レーザー照射対象に９ｋＤａ以上のタンパク質を含有させる。
　第２の実施形態の分析方法は、精製工程と、検出工程とを順に備える。精製工程は、例えば、アフィニティ精製であり、第１結合工程と、第１洗浄工程と、第１溶出工程と、中性化工程と、第２結合工程と、第２洗浄工程と、第２溶出工程とをこの順に備える。第１結合工程と、第１洗浄工程と、第１溶出工程と、中性化工程と、第２結合工程と、第２洗浄工程とは、第１の実施形態におけるこれらの工程と同様である。第２の実施形態における第２溶出工程は、第２酸性溶液、ひいては、第２溶出液において、９ｋＤａ以上のタンパク質が含まれない以外は、第１の実施形態における第２溶出工程と同様である。
　検出工程では、ＭＡＬＤＩプレート上に、レーザー照射対象を配置する。この際、マトリックス含有溶液および第２溶出液に加えて、タンパク質含有液を滴下する。具体的には、ＭＡＬＤＩプレートに、マトリックス含有溶液を滴下および乾燥させ、続いて、その上に第２溶出液およびタンパク質含有液を滴下して、乾燥させる。これにより、マトリックス、Ｎｇ関連ペプチドおよび９ｋＤ以上のタンパク質が、乾燥状態で含有するレーザー照射対象が得られる。その後、第１の実施形態と同様に、レーザー照射対象に、レーザーを照射し、イオン化したペプチドを質量分析装置により検出する。なお、マトリックス、Ｎｇ関連ペプチドおよび９ｋＤ以上のタンパク質が、乾燥状態で含有していればよいため、マトリックス、Ｎｇ関連ペプチド、９ｋＤ以上のタンパク質、それぞれの滴下の順番は問わない。
　タンパク質含有液は、９ｋＤａ以上のタンパク質および溶媒を含有する。溶媒としては、限定的でなく、例えば、マトリックスを含有させる溶媒と同様の溶媒、好ましくは、第２酸性溶液に用いる溶媒などが挙げられる。タンパク質含有液におけるタンパク質濃度、および、その滴下量は、マトリックス１μｇに対するタンパク質濃度が、１０ｆｍｏｌ以上、６００ｆｍｏｌ以下（好ましくは、２０ｆｍｏｌ以上、より好ましくは、３０ｆｍｏｌ以上であり、また、好ましく、３００ｆｍｏｌ以下、１５０ｆｍｏｌ以下）となるように調整すればよい。具体的には、タンパク質の濃度は、例えば、１０ｎＭ以上、好ましくは、５０ｎＭ以上であり、また、例えば、１０００ｎＭ以下、好ましくは、６００ｎＭ以下とすればよく、滴下量は、例えば、０．１μＬ以上、好ましくは、０．２μＬ以上であり、また、例えば、１０μＬ以下、好ましくは、５μＬ以下とすればよい。
　これら第２の実施形態も第１の実施形態と同様の作用効果を奏する。ＭＡＬＤＩプレートへの正確な滴下作業工程数が増加せず、レーター照射対象が均一に混合しやすい観点から、第１の実施形態が好ましい。
　３．第３および第４の実施形態
　第１および第２の実施形態の分析方法では、精製工程として、複数回（２回）の免疫沈降を実施しているが、例えば、免疫沈降を１回のみ実施してもよい。
　具体的には、第３の実施形態の分析方法は、第１結合工程（結合工程）と、第１洗浄工程（洗浄工程）と、第２溶出工程（溶出工程）と、検出工程とを備えており、第２溶出工程において、第２酸性溶液（溶出用溶液）が、９ｋＤａ以上のタンパク質を含有する。
　第４の実施形態の分析方法は、第１結合工程（結合工程）と、第１洗浄工程（洗浄工程）と、第２溶出工程（溶出工程）と、検出工程とを備えており、検出工程において、プレート上で、第２溶出液とタンパク質含有液とを混合する。
　これら第３および第４の実施形態も第１の実施形態と同様の作用効果を奏する。試料中のＮｇ関連ペプチドの存在量がより一層微量である場合でもＮｇ関連ペプチドを確実に分析することができる観点から、第１および第２の実施形態が好ましい。
　４．態様
　上述した複数の例示的な実施形態は、以下の態様の具体例であることが当業者により理解される。
　（第１項）一態様に係る分析方法は、ニューログラニン関連ペプチドを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法により分析する方法であって、レーザー照射対象が、前記ニューログラニン関連ペプチド、マトリックス、および、９ｋＤａ以上のタンパク質を含有し、前記マトリックス１μｇに対する前記タンパク質の含有量が、１０ｆｍｏｌ以上、６００ｆｍｏｌ以下であってもよい。
　（第２項）第１項に記載の分析方法において、前記マトリックス１μｇに対する前記タンパク質の含有量が、３０ｆｍｏｌ以上、１５０ｆｍｏｌ以下であってもよい。
　（第３項）第１項または第2項に記載の分析方法において、前記タンパク質の質量が、９ｋＤａ以上、１５ｋＤａ以下であってもよい。
　（第４項）第１～３項のいずれか一項に記載の分析方法において、ニューログラニン関連ペプチドを含有する試料を結合溶液中で担体に接触させて、前記ニューログラニン関連ペプチドが前記担体に結合した結合体を得る結合工程と、前記結合体を、洗浄溶液を用いて、洗浄する洗浄工程と、前記結合体を酸性溶液に接触させて、前記ニューログラニン関連ペプチドが前記酸性溶液に溶出した溶出液を得る溶出工程と、前記溶出液に対して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法を実施して、前記ニューログラニン関連ペプチドを検出する検出工程とを順に備え、前記酸性溶液は前記タンパク質を含有してもよい。
　（第５項）第４項に記載の分析方法において、前記溶出液における前記タンパク質の濃度が、１０ｎＭ以上、６００ｎＭ以下であってもよい。
　（第６項）第１～３項のいずれか一項に記載の分析方法において、ニューログラニン関連ペプチドを含有する試料を結合溶液中で担体に接触させて、前記ニューログラニン関連ペプチドが前記担体に結合した結合体を得る結合工程と、前記結合体を、洗浄溶液を用いて、洗浄する洗浄工程と、前記結合体を酸性溶液に接触させて、前記ニューログラニン関連ペプチドが前記酸性溶液に溶出した溶出液を得る溶出工程と、前記溶出液に対して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法を実施して、前記ニューログラニン関連ペプチドを検出する検出工程とを順に備え、前記検出工程において、レーザーを照射するプレート上で、前記溶出液と、前記タンパクを含有する液体とを混合してもよい。
　（第７項）第６項に記載の分析方法において、前記タンパクを含有する液体における前記タンパク質の濃度が、１０ｎＭ以上、６００ｎＭ以下であってもよい。
　次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらによって限定されない。
　＜実施例１＞
　（第１結合工程、第１洗浄工程、第１溶出工程）
　ヒトNeurogranin（Ｎｇ）の５２－６３残基をエピトープとする抗Ｎｇ抗体（ＩｇＧ１）のクローンＮＧ２（BioLegend社）を用意した。抗Ｎｇ抗体１００μｇに対して磁性ビーズ（Dynabeads M-270 Epoxy）５．５ｍｇを、固定化緩衝液（１．５Ｍ硫酸アンモニウムを含有する０．１Ｍリン酸緩衝液；ｐＨ７．４）中で、３７℃で１６～２４時間反応させた。これにより、抗体ビーズを作製した。
　下記表１に記載の２種類のＮｇペプチド（各ペプチド濃度４０ｐＭ）を含有する試料２５０μＬを用意した。その試料を、安定同位体標識されたＮｇ５０－７８（ＳＩＬ－Ｎｇ５０－７８）２０ｐＭを含む結合緩衝液（０．１％ｎ－ウンデシル－β－Ｄ－マルトシド（ＵＤＭ）、８００ｍＭ　ＧｌｃＮＡｃ、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）２５０μＬと混合し、氷上で５～６０分静置させた。その混合試料を、上記抗体ビーズと混合し、氷上で１時間振盪させた。その後、抗体ビーズを、第１洗浄緩衝液（０．０５％ＵＤＭ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）１００μＬで３回洗浄し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液５０μＬで２回洗浄した。その後、抗体ビーズを、第１酸性溶液（０．０５％ＵＤＭ、５０ｍＭグリシン緩衝液；ｐＨ２．８）に接触させて、Ｎｇ関連ペプチドを第１酸性溶液に溶出させた。これにより、Ｎｇ関連ペプチドを含む第１溶出液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（中性化工程）
　第１溶出液を中性緩衝液（０．１％ＵＤＭ、８００ｍＭ　ＧｌｃＮＡｃ、３００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、３００ｍＭ　ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）と混合して、精製溶液を得た。
　（第２結合工程、第２洗浄工程、第２溶出工程）
　精製溶液を抗体ビーズと混合し、氷上で1時間振盪させた。その後、抗体ビーズを、第２洗浄緩衝液（０．０５％ＵＤＭ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）５０μＬで５回洗浄し、５０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液５０μＬで２回洗浄し、水３０μＬで１回洗浄した。その後、抗体ビーズを、５μLの第２酸性溶液（表２に示す量のrecombiant Ngと５ｍＭ塩酸と０．１ｍＭメチオニンとを含む７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液）に接触させて、Ｎｇ関連ペプチドを第２酸性溶液に溶出させた。これにより、Ｎｇ関連ペプチドを含む第２溶出液を得た。
　（検出工程）
　質量分析装置として、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ装置であるAXIMA Performance (Shimadzu/KRATOS,Manchester,UK)を用いた。Ｌｉｎｅａｒ　ＴＯＦ用のマトリックスとしてα－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（ＣＨＣＡ）を用い、マトリックス添加剤としてメチレンジホスホン酸（ＭＤＰＮＡ）を用い、溶媒としてアセトニトリルを用いて、２ｍｇ／ｍＬ　ＣＨＣＡ／０．２％（ｗ／ｖ）ＭＤＰＮＡマトリックス溶液を調製した。ＭＡＬＤＩプレート(μFocus MALDI plate 900μm(Hudson Surface Technology,Inc.,Fort Lee,NJ))の４ｗｅｌｌに、マトリックス溶液を０．５μＬずつ（すなわち、１ｗｅｌｌ当たりマトリックス１μｇとなるように）滴下し、乾燥させた後、さらに第２溶出液を１μＬずつ滴下し、乾燥させた。
　次いで、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを作動させて、Ｎｇ関連ペプチド（Ｎｇ４３－７５およびＮｇ３３－７５）を検出した。設定条件として、マススペクトルデータは、ポジティブイオンモードのＬｉｎｅａｒ　ＴＯＦで取得した。１ｗｅｌｌに対して４００スポット、１６０００ショットずつ積算した。Ｌｉｎｅａｒ　ＴＯＦのｍ／ｚ値はピークのアベレージマスで表示した。ｍ／ｚ値は外部標準としてhuman angiotensin IIおよびhuman ACTH fragment 18-39、bovine insulin oxidized beta-chain、bovine insulin、cytochrome cを用いてキャリブレーションした。
　このとき、第２酸性溶液、ひいては、第２溶出液に含有されるタンパク質（recombiant Ng）の濃度を、下記表２に示す複数の濃度（０～１６００ｎＭ）の条件に設定して、測定を実施した。タンパク質を含有しない場合（濃度０ｎＭ）のピークのシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）に対する表１の量のタンパク質を含有する場合（濃度２５～１６００ｎＭ）のピークのＳ／Ｎを算出し、これらのグラフを図１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　＜実施例２～３＞
　第２酸性溶液に含有されるタンパク質の種類および濃度を、表２に記載の種類および濃度に変更した以外は、実施例１と同様にして、分析方法を実施した。これらの結果を図２～図３に示す。図１～３から、マトリックス１μｇに対するタンパク質の含有量が、１０～６００ｆｍｏｌである場合に、検出感度が向上していることが分かる。
　なお、使用したタンパク質において、recombinant Ng（rNg;abcam社）の質量は、９９２５．９２Ｄａ、Cytochrome C(CytC; Sigma社)の質量は、１２３６０．５２Ｄａ、Bovine sewrum albumin (BSA;ナカライテスク社製）の質量は、６６２９６Ｄａであった。
　＜実施例４＞
　実施例１～３と同様に実施した。ただし、タンパク質（ｒＮｇ，ＣｙｔＣ，ＢＳＡ）を含有する第２酸性溶液５μＬの代わりに、タンパク質を含有しない第２酸性溶液２．５μＬを使用した。また、ＭＡＬＤＩプレートの各ｗｅｌｌに、それぞれ、マトリックス溶液０．５μＬを滴下し、乾燥させた後、第２溶出液０．５μＬおよびタンパク質含有液（タンパク質濃度１００ｎＭ、溶媒：５ｍＭ塩酸と０．１ｍＭメチオニンとを含む７０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル水溶液）０．５μＬを滴下し、乾燥させた。このときのマトリックス１μｇ当たりのタンパク質の配合量は、５０ｆｍｏｌであった。Ｎｇ４３－７５ペプチドについて、タンパク質（ｒＮｇ，ＣｙｔＣ，ＢＳＡ）ごとの、タンパク質を含有しない場合（添加タンパク質なし）のピークのシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）に対するタンパク質を含有する場合のピークのＳ／Ｎ結果を図４に示す。Ｎｇ３３－７５ペプチドについて、タンパク質（ｒＮｇ，ＣｙｔＣ，ＢＳＡ）ごとの、タンパク質を含有しない場合（添加タンパク質なし）のピークのシグナル／ノイズ比（Ｓ／Ｎ）に対するタンパク質を含有する場合のピークのＳ／Ｎ結果を図５に示す。

 

Claims (7)

  1. 　ニューログラニン関連ペプチドを、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法により分析する方法であって、
    　レーザー照射対象が、前記ニューログラニン関連ペプチド、マトリックス、および、９ｋＤａ以上のタンパク質を含有し、
    　前記マトリックス１μｇに対する前記タンパク質の含有量が、１０ｆｍｏｌ以上、６００ｆｍｏｌ以下である、ニューログラニン関連ペプチドの分析方法。
  2. 　前記マトリックス１μｇに対する前記タンパク質の含有量が、３０ｆｍｏｌ以上、１５０ｆｍｏｌ以下である、請求項１に記載の分析方法。
  3. 　前記タンパク質の質量が、９ｋＤａ以上、１５ｋＤａ以下である、請求項１に記載の分析方法。
  4. 　ニューログラニン関連ペプチドを含有する試料を結合溶液中で担体に接触させて、前記ニューログラニン関連ペプチドが前記担体に結合した結合体を得る結合工程と、
    　前記結合体を、洗浄溶液を用いて、洗浄する洗浄工程と、
    　前記結合体を酸性溶液に接触させて、前記ニューログラニン関連ペプチドが前記酸性溶液に溶出した溶出液を得る溶出工程と、
    　前記溶出液に対して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法を実施して、前記ニューログラニン関連ペプチドを検出する検出工程と
    を順に備え、
    　前記酸性溶液が前記タンパク質を含有する、請求項１に記載の分析方法。
  5. 　前記溶出液における前記タンパク質の濃度が、１０ｎＭ以上、６００ｎＭ以下である、請求項４に記載の分析方法。
  6. 　ニューログラニン関連ペプチドを含有する試料を結合溶液中で担体に接触させて、前記ニューログラニン関連ペプチドが前記担体に結合した結合体を得る結合工程と、
    　前記結合体を、洗浄溶液を用いて、洗浄する洗浄工程と、
    　前記結合体を酸性溶液に接触させて、前記ニューログラニン関連ペプチドが前記酸性溶液に溶出した溶出液を得る溶出工程と、
    　前記溶出液に対して、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法を実施して、前記ニューログラニン関連ペプチドを検出する検出工程と
    を順に備え、
    　前記検出工程において、レーザーを照射するプレート上で、前記溶出液と、前記タンパクを含有する液体とを混合する、請求項１に記載の分析方法。
  7. 　前記タンパクを含有する液体における前記タンパク質の濃度が、１０ｎＭ以上、６００ｎＭ以下である、請求項６に記載の分析方法。
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