JP6410810B2 - 脳内のアミロイドβペプチド蓄積状態を評価するサロゲート・バイオマーカー及びその分析方法 - Google Patents

脳内のアミロイドβペプチド蓄積状態を評価するサロゲート・バイオマーカー及びその分析方法 Download PDF

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Description

本発明は、脳神経科学分野、及び臨床医学分野に属し、脳内のアミロイド・βペプチド（Ａβ）蓄積状態を評価するサロゲート・バイオマーカー及びその分析方法に関する。より詳しくは、本発明は、アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein； ＡＰＰ）が分解されることにより生じるＡβ及びＡβ様ペプチドの生体由来試料中レベルを指標とした脳内Ａβ蓄積状態を評価するサロゲート・バイオマーカー及びその分析方法に関する。本発明のバイオマーカーは、アルツハイマー病に関して、発症前診断、発症予防介入（先制治療薬投与等）対象者のスクリーニング、及び治療薬・予防薬の薬効評価等に利用するためのマーカーである。
アルツハイマー病（Alzheimer's disease； ＡＤ）は認知症の主な原因で、認知症全体の５０−６０％を占める。２００１年で２４００万人以上いた世界の認知症患者数は、２０４０年には８１００万人に達すると推定される（非特許文献１）。アルツハイマー病の発症にはＡβが深く関わっていると考えられている。Ａβは、膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成るアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）がβセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受けることによって産生される（図１参照）。Ａβの線維化を伴う凝集により老人斑が出現すると、これを引き金にして神経細胞内にタウタンパク質が凝集蓄積し、神経機能不全や神経細胞死が引き起こされる。この結果として、極度の認知能力の低下が起こると考えられている。Ａβは主に４０mer(Aβ1-40)と４２mer（Aβ1-42）からなることが古くから知られており、脳脊髄液（ＣＳＦ）や血液中へ移行することもわかっている。さらに近年では、Aβ1-40とAβ1-42とは長さの異なるＡβ様のペプチドがＣＳＦ中にも存在することが報告されている（非特許文献２）。
アルツハイマー病は潜在的に発症し緩徐に進行する。アルツハイマー病の診断は、臨床症状を調べるためのADAS-cog、MMSE、DemTect、SKT、又は時計描画テストのような認知機能検査や、核磁気共鳴画像診断(MRI)や陽電子放出断層撮影法(PET)等の画像所見の確認などを合わせて行われている。 MRIは脳の変性萎縮を検出できる画像診断法であるが、脳の萎縮はアルツハイマー病に特異的ではない。一方、Ａβ沈着を特異的に検出するリガンド分子（PiB: Pittsburgh compound-B）の停留を可視化する画像診断法としてPiB-PETがある。チオフラビンT-類似体(11C)PiBが、軽度認知障害（Mild Cognitive Impairment：MCI）又は軽度アルツハイマー病を有する患者の脳の特定の領域で次第に蓄積するＡβを反映して停留することが見出されており、Ａβ沈着の検出方法として最適なツールとなっている。アルツハイマー病の剖検病理所見により、軽度の認知機能低下の症例でもすでに多くの老人斑が蓄積していることがわかっている。このことから認知症が顕在化するかなり以前からＡβの凝集・沈着が始まるのではないかと推測されており、PiB-PETの所見でもそれを裏付ける結果が報告されている。しかしながら、PET検査には大掛かりな設備が必要であり、また一回の検査料も高額であり、広く国民が受診できるような方法としては適さない。
血液や脳脊髄液（ＣＳＦ）のバイオマーカーは、病気の発症や進行を分子レベルで検出できる有用な指標である。アルツハイマー病においては、ＣＳＦ中のAβ1-42の濃度やAβ1-42／Aβ1-40の濃度比の低下、総タウ値あるいはリン酸化タウ値の上昇が有用な診断マーカーであると報告されている（特許文献１：特開２０１０−１９８６４号公報、非特許文献３）。しかしながら、ＣＳＦの採取は侵襲性が高く、広く国民が受診できるような方法としては適さない。
そこで、血液検査として、血中に存在するAβ1-42がアルツハイマー病診断マーカーになりえるのではないかと期待されているが、ＣＳＦ中のAβ1-42の挙動とは異なり、血中Aβ1-42濃度とアルツハイマー病発症との関連性は低いことが報告されている（非特許文献３）。その原因については解明されていない。
また、特許文献２：特開２０１３−６３９７６号公報には、可溶性Ａβモノマーを認識せず、可溶性Ａβオリゴマーのみに特異的に結合するモノクローナル抗体が開示され、前記抗体を用いたアルツハイマー病の診断法が開示されている。同号公報の［０１０４］には、被験者の試料中におけるＡβモノマーに対するＡβオリゴマーの比が、健常者と比較して高い場合に、被験者がアルツハイマー病候補であると判定される方法が開示されている。
非特許文献４には、免疫沈降法と質量分析装置の組み合わせにより、ヒト血漿に22種類のＡＰＰ由来のＡβ及びＡβ様ペプチドが存在することが開示されている。また、これらＡβ及びＡβ様ペプチドを定量する方法も開示されている。
特開２０１０−１９８６４号公報 特開２０１３−６３９７６号公報
Blennow K, de Leon MJ, Zetterberg H. : Alzheimer's disease. Lancet. 2006 Jul 29; 368(9533): 387-403 Portelius E, Westman-Brinkmalm A, Zetterberg H, Blennow K. : Determination of beta-amyloid peptide signatures in cerebrospinal fluid using immunoprecipitation-mass spectrometry. J Proteome Res. 2006 Apr; 5(4): 1010-6 Hampel H, Shen Y, Walsh DM, Aisen P, Shaw LM, Zetterberg H, Trojanowski JQ, Blennow K. : Biological markers of amyloid beta-related mechanisms in Alzheimer's disease. Exp Neurol. 2010 Jun; 223(2): 334-46 Kaneko N, Yamamoto R, Sato TA, Tanaka K. : Identification and quantification of amyloid beta-related peptides in human plasma using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 2014;90(3):104-17
アルツハイマー病（ＡＤ）患者では、認知機能低下が顕在化する以前に大量のＡβが沈着していることがわかっている。PiB-PETはＡβ蓄積の検出に有効であるが、検査費用が高額で、検査の所要時間も長いため、多くの高齢者が容易に受診できる診断方法ではない。したがって、臨床症状が顕在化する前にＡβ蓄積の増加を検出できる簡便な分析方法が必要とされている。
上述したように、一般的に、血液や脳脊髄液（ＣＳＦ）に存在するバイオマーカーを指標とした検査方法は、病気の発症や進行を分子レベルで簡便に検出できる有効な方法である。上記特許文献１、及び非特許文献３には、アルツハイマー病においては、ＣＳＦ中のAβ1-42の濃度やAβ1-42／Aβ1-40の濃度比の低下、総タウ値あるいはリン酸化タウ値の上昇が有用な診断マーカーであると報告されている。しかしながら、一方で、非特許文献３には、ＣＳＦ Aβ1-42とは異なり、血中Aβ1-42濃度とＡＤ発症との関連性は低いことが報告されている。
血液中のＡβに関するこれまでの報告では、血液中のAβ1-40及びAβ1-42の２種類の濃度についてのみしかＡＤとの相関性が調べられていない。しかし、ＣＳＦ中にはAβ1-40及びAβ1-42以外にも、Aβ1-40のＮ末端側やＣ末端側で切断されている短いＡβも存在することが、免疫沈降法と質量分析装置を組み合わせた方法で発見されている。血液中においてはＣＳＦ中よりも微量に存在するＡβを免疫沈降法と質量分析装置で検出することは技術的に難しかったが、免疫沈降法の改良により、ヒトの血漿中に22種類のＡＰＰ由来のＡβ及びＡβ様ペプチドが存在することが明らかとなり、そのペプチドの定量方法も開発された（非特許文献４）。
そこで、本発明の目的は、生体由来試料中のアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のペプチドを指標とした脳内のＡβ蓄積状態を評価するバイオマーカー及びその分析方法を提供することにある。特に、本発明の目的は、血液試料中のアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のＡβ及びＡβ様ペプチドを指標とした脳内のＡβ蓄積状態を評価するバイオマーカー及びその分析方法を提供することにある。より詳しくは、本発明の目的は、アルツハイマー病に関して、発症前診断、発症予防介入（先制治療薬投与等）対象者のスクリーニング、及び治療薬・予防薬の薬効評価等に利用するためのマーカー及びその分析方法を提供することにある。
本発明者らは、鋭意検討の結果、特定のＡＰＰ由来のＡβ及びＡβ様ペプチドが上記目的を達成することを見出し、本発明を完成するに至った。
本明細書において、アミロイド・βペプチドの略称として「Ａβ」を用いる。すなわち、「Ａβ」とは、Ａβ１−４０、及びＡβ１−４２を含んでいる。アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）が切断されることにより生じる前記Ａβ以外のペプチドをＡβ様ペプチドと称することがある。アミロイド前駆タンパク質（Amyloid precursor protein；ＡＰＰ）が切断されることにより生じるＡβ及びＡβ様ペプチドを、「ＡＰＰ派生型ペプチド」と称することがある。
本発明は、以下の発明を含む。
（１） 被験対象に由来する生体由来試料を、
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）と、
ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号７）、ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）（配列番号１）、ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）（配列番号２）、ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）（配列番号３）、ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号４）、及びＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）（配列番号５）からなる群から選ばれる少なくとも１つと
を含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中の
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）と、
ＡＰＰ６６９−７１１、ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）、ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）、ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）、ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）、及びＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）からなる群から選ばれる前記少なくとも１つと
の各測定レベルを得る測定工程と、
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）レベルの比：
ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）レベルの比：
ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）レベルの比：
ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）レベルの比：
ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）； 及び
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）レベルの比：
ＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）
からなる群から選ばれる少なくとも１つの比を求める算出工程と、
被験対象の前記各比が、脳内のＡβの蓄積が陰性である認知機能正常者ＮＣ−の前記各比を基準レベルとして、前記各比の基準レベルよりも高い場合に、被験対象の脳内Ａβの蓄積量は、前記認知機能正常者ＮＣ−の脳内Ａβの蓄積量よりも多いと判断する評価工程と、
を含む脳内のＡβ蓄積状態を判断する分析方法。
（２） 前記生体由来試料が、血液、脳脊髄液、尿、体分泌液、糞便、唾液、及び痰からなる群から選ばれる、上記（１）に記載の脳内のＡβ蓄積状態を判断する分析方法。
（３） 生体由来試料中のＡＰＰ６６９−７１１（配列番号７）とＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）との組み合わせ：
ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）（配列番号１）とＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）との組み合わせ：
ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）（配列番号２）とＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）との組み合わせ：
ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）（配列番号３）とＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）との組み合わせ：
ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号４）とＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）との組み合わせ： 及び
ＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）（配列番号５）とＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）との組み合わせ
からなる群から選ばれる脳内のＡβ蓄積状態を判断するマーカー。
（４） 被験対象に由来する血液試料をＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）を含むマーカーの検出に供して、前記血液試料中のＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）の測定レベルを得る測定工程と、
被験対象の前記ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）の測定レベルが、脳内のＡβの蓄積が陰性である認知機能正常者ＮＣ−のＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）のレベルを基準レベルとして、前記基準レベルよりも低い場合に、被験対象の脳内Ａβの蓄積量は、前記認知機能正常者ＮＣ−の脳内Ａβの蓄積量より多いと判断する評価工程と、
を含む脳内のＡβ蓄積状態を判断する分析方法。
（５） 被験対象に対して行われた医学的介入の前後において、
被験対象に由来する生体由来試料を、
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）と、
ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号７）、ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）（配列番号１）、ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）（配列番号２）、ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）（配列番号３）、ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号４）、及びＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）（配列番号５）からなる群から選ばれる少なくとも１つと
を含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中の
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）と、
ＡＰＰ６６９−７１１、ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）、ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）、ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）、ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）、及びＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）からなる群から選ばれる前記少なくとも１つと
の各測定レベルを得る測定工程と、
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）レベルの比：
ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）レベルの比：
ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）レベルの比：
ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）レベルの比：
ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）； 及び
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）レベルの比：
ＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）
からなる群から選ばれる少なくとも１つの比を求める算出工程と
を行い、
医学的介入の前における被験対象の前記各比と、医学的介入の後における被験対象の前記各比との比較を行い、脳内のＡβ蓄積状態に関して前記医学的介入の有効性を判断する方法。
本発明において、マーカーのレベルとは、基本的には濃度を意味するが、当業者が濃度に準じて用いる他の単位でもよい。被験対象とは、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物（ラット、イヌ、ネコなど）が含まれる。また、本発明において、生体由来試料は、由来元の被験対象（例えば、被験者）に戻すことなくは破棄される。医学的介入とは、治療薬や予防薬の投与、食事療法、運動療法、学習療法、外科手術などが含まれる。
本発明によれば、生体由来試料中のＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）と、ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号７）、ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）（配列番号１）、ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）（配列番号２）、ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）（配列番号３）、ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号４）、及びＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）（配列番号５）からなる群から選ばれる少なくとも１つとの組み合わせからなる、被験対象の脳内のＡβ蓄積状態を判断するマーカーが提供される。また、前記マーカーの分析方法が提供される。
被験対象の生体由来試料中の前記マーカーの分析を行うことにより、被験対象の脳内のＡβ蓄積が基準レベル以下か、あるいは、脳内のＡβが過剰蓄積している状態かの判別を行うことができる。本発明は、脳内のＡβが過剰蓄積されていて認知機能障害も現れているアルツハイマー病進行段階のみならず、脳内のＡβが過剰に蓄積されているが認知機能障害は現れていないアルツハイマー病早期段階の検出にも適用可能である。
本発明によれば、前記生体由来試料として、血液のみならず、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、体分泌液、糞便、唾液、及び痰も用い得る。そのため、アルツハイマー病の予防法ならびに先制的治療法が確立した段階においては、一般の健康診断や人間ドック等において、認知機能正常者に対しても脳内のＡβの蓄積状態を分析することによりアルツハイマー病発症前診断に有効である。
被験対象に対して行われた医学的介入の前後において、本発明を適用すれば、アルツハイマー病の治療薬、予防薬の薬効評価、あるいはその他の処置の有効性評価を行い得る。また、本発明は、アルツハイマー病患者の経過観察にも有用である。
アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）の分解による、Ａβ及びｐ３ペプチドの生成経路を模式的に示す図である。 実施例１において、図２は、APP672-713(Aβ1-42)について、各グループ（ＮＣ−、ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ）における内部標準SIL-Aβ1-38に対するAPP672-713(Aβ1-42)の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。 図３（Ａ）、及び図３（Ｂ）は、それぞれ、APP672-713(Aβ1-42)／SIL-Aβ1-38について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ）の受信者動作特性（Receiver Operatorating Characteristic；ＲＯＣ）曲線である。 図４（Ｃ）、及び図４（Ｄ）は、それぞれ、APP672-713(Aβ1-42)／SIL-Aβ1-38について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。 実施例１において、図５は、各グループ（ＮＣ−、ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ）におけるAPP672-713(Aβ1-42)に対するAPP672-709 (Aβ1-38)の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。 図６（Ａ）、及び図６（Ｂ）は、それぞれ、APP672-709 (Aβ1-38)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ）のＲＯＣ曲線である。 図７（Ｃ）、及び図７（Ｄ）は、それぞれ、APP672-709 (Aβ1-38)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。 実施例１において、図８は、各グループ（ＮＣ−、ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ）におけるAPP672-713(Aβ1-42)に対するAPP674-711 (Aβ3-40)の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。 図９（Ａ）、及び図９（Ｂ）は、それぞれ、APP674-711 (Aβ3-40)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ）のＲＯＣ曲線である。 図１０（Ｃ）、及び図１０（Ｄ）は、それぞれ、APP674-711 (Aβ3-40)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。 実施例１において、図１１は、各グループ（ＮＣ−、ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ）におけるAPP672-713(Aβ1-42)に対するAPP672-710 (Aβ1-39)の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。 図１２（Ａ）、及び図１２（Ｂ）は、それぞれ、APP672-710 (Aβ1-39)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ）のＲＯＣ曲線である。 図１３（Ｃ）、及び図１３（Ｄ）は、それぞれ、APP672-710 (Aβ1-39)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。 実施例１において、図１４は、各グループ（ＮＣ−、ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ）におけるAPP672-713(Aβ1-42)に対するAPP672-711 (Aβ1-40)の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。 図１５（Ａ）、及び図１５（Ｂ）は、それぞれ、APP672-711 (Aβ1-40)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ）のＲＯＣ曲線である。 図１６（Ｃ）、及び図１６（Ｄ）は、それぞれ、APP672-711 (Aβ1-40)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。 実施例１において、図１７は、各グループ（ＮＣ−、ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ）におけるAPP672-713(Aβ1-42)に対するOxAPP672-711 (OxAβ1-40)の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。 図１８（Ａ）、及び図１８（Ｂ）は、それぞれ、OxAPP672-711 (OxAβ1-40)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ）のＲＯＣ曲線である。 図１９（Ｃ）、及び図１９（Ｄ）は、それぞれ、OxAPP672-711 (OxAβ1-40)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。 実施例１において、図２０は、各グループ（ＮＣ−、ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ）におけるAPP672-713(Aβ1-42)に対するAPP669-711の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。 図２１（Ａ）、及び図２１（Ｂ）は、それぞれ、APP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ）のＲＯＣ曲線である。 図２２（Ｃ）、及び図２２（Ｄ）は、それぞれ、APP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。 実施例１において、図２３は、全６２症例における脳皮質領域のPiB集積平均値（mcSUVR:mean cortical Standard Uptake Value Ratio）とAPP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)の散布図である。確率楕円（p=0.95）を曲線で示した。
［１．被験対象］
本発明において、被験対象には、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物（ラット、イヌ、ネコなど）が含まれる。以下、ヒトの場合について主として説明するが、ヒト以外の哺乳動物の場合にも、同様である。
本発明の方法において、これまでの病歴を問わず、健常者と思われる者を含め、どのような者でも被験者とすることができる。健常者と思われる者の場合には、一般の健康診断や人間ドック等において、好ましくは血液検査によって脳内のＡβの蓄積状態を判断することができ、アルツハイマー病の早期発見・診断に特に有効である。また、臨床症状を調べるためのADAS-cog、MMSE、DemTect、SKT、又は時計描画テストのような認知機能検査や、核磁気共鳴画像診断(MRI)や陽電子放出断層撮影法(PET)等の画像所見の確認などにより、アルツハイマー病候補の疑いのある被験者の場合には、本発明の方法により、アルツハイマー病診断の補助とすることができる。
［２．生体由来試料］
本発明のマーカーは、被験者の生体由来試料において検出及び分析可能である。従って、本発明の方法においては、被験者の生体由来試料中のマーカーのレベルが分析される。
生体由来試料は、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、尿、体分泌液、唾液、及び痰などの体液； 及び糞便から選ぶことができる。これらのうち、一般の健康診断や人間ドック等におけるアルツハイマー病の診断および発症前診断には、血液が好ましい。
血液試料は、マーカーレベルの測定工程に直接供される試料であり、全血、血漿及び血清などが含まれる。血液試料は、被験対象から採取された全血を、適宜処理することによって調製することができる。採取された全血から血液試料の調製を行う場合に行われる処理としては特に限定されず、臨床医学的に許容されるいかなる処理が行われてよい。例えば遠心分離などが行われうる。また、測定工程に供される血液試料は、その調製工程の中途段階又は調製工程の後段階において、適宜冷凍など低温下での保存が行われたものであってよい。なお、本発明において血液試料などの生体由来試料は、由来元の被験者に戻すことなく破棄される。
［３．マーカー］
本発明のマーカーは、生体由来試料中のＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）と、ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号７）、ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）（配列番号１）、ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）（配列番号２）、ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）（配列番号３）、ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号４）、及びＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）（配列番号５）からなる群から選ばれる少なくとも１つとの組み合わせからなる。これらマーカーは、脳内のＡβ蓄積が陰性である認知機能正常者からの血漿試料中のレベルと、脳内のＡβが過剰に蓄積されている被験者からの血漿試料中のレベルとの間に有意な差が認められたものである。
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA
ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号７）：
VKMDAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）（配列番号１）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG
ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）（配列番号２）：
EFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）（配列番号３）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGV
ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号４）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV
ＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）（配列番号５）：
DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVV （Met ７０６が酸化されている）
アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、膜一回貫通タンパク質で７７０残基のアミノ酸から成る。アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）は、βセクレターゼとγセクレターゼによってタンパク質分解を受け、タンパク質分解によってアミロイド・ベータペプチド（Ａβ）が産生される。ＡＰＰ６７２−７１３とＡβ１−４２とは同じペプチドを表す（配列番号６）。また、ＡＰＰ６７２−７１１とＡβ１−４０とは同じペプチドを表す（配列番号４）。
ＡＰＰ派生型ペプチドのアミノ酸配列を表１に示し、その理論平均質量を表２に示す。これらのペプチドを対象に脳内のＡβ蓄積状態を判断するためのマーカーの分析を行った。
表１〜２において、
APP-derived peptides: ＡＰＰ派生型ペプチド
Theoretical average mass: 理論平均質量
表１〜２において、配列番号５のＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）は、配列番号４のＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）のMet ７０６で酸化されたペプチドを示す。
アルツハイマー病においては家族性アルツハイマー病が存在する。本発明のマーカーは、一般に知られている家族性アルツハイマー病のアミノ酸配列変異が起きていてもよい。
家族性アルツハイマー病には、例えば、次の変異配列が知られている。
Swedish変異：APP670〜671 のアミノ酸 KM が NL に変異している
Italian変異：APP673 のアミノ酸 A が V に変異している
Leuven変異：APP682 のアミノ酸 E が K に変異している
Icelandic変異：APP673 のアミノ酸 A が T に変異している
British変異：APP677 のアミノ酸 H が R に変異している
Tottori変異：APP678 のアミノ酸 D が N に変異している
Arctic変異：APP693 のアミノ酸 E が G に変異している
Iowa変異：APP694 のアミノ酸 D が N に変異している
Dutch変異：APP693 のアミノ酸 E が Q に変異している
［４．マーカーの分析］
本明細書において、アルツハイマー病の進行度合いの観点から、次のように分類する。
ＮＣ−：脳内のＡβの蓄積が陰性で、かつ、認知機能障害は現れていない者
ＮＣ＋：脳内のＡβの蓄積が陽性で、認知機能障害は現れていない者
ＭＣＩ：脳内のＡβの蓄積が陽性で、軽度認知機能障害が現れている者
ＡＤ： 脳内のＡβの蓄積が陽性で、認知機能障害が現れている者
ＰｉＢ＋：ＮＣ＋とＭＣＩとＡＤのグループを合わせたグループ
認知機能障害の有無に関わらず、脳内のＡβの蓄積が陽性と判定された者
通常、脳内のＡβの蓄積状態の判断については、PiB-PET画像を元に大脳皮質と白質のPiB集積量の比較により判定する。
本発明のマーカーの分析方法は、被験対象に由来する生体由来試料をＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）と、ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号７）、ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）（配列番号１）、ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）（配列番号２）、ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）（配列番号３）、ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号４）、及びＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）（配列番号５）からなる群から選ばれる少なくとも１つとを含むマーカーの検出に供して、前記生体由来試料中のＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）と、ＡＰＰ６６９−７１１、ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）、ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）、ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）、ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）、及びＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）からなる群から選ばれる少なくとも１つとの各測定レベルを得る測定工程と、
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
ＡＰＰ６６９−７１１／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）レベルの比：
ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）レベルの比：
ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）レベルの比：
ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）レベルの比：
ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）； 及び
ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）レベルの比：
ＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）
からなる群から選ばれる少なくとも１つの比を求める算出工程と、
被験対象の前記各比が、脳内のＡβの蓄積が陰性である認知機能正常者ＮＣ−の前記各比を基準レベルとして、前記各比の基準レベルよりも高い場合に、被験対象の脳内Ａβの蓄積量は、前記認知機能正常者ＮＣ−の脳内Ａβの蓄積量よりも多いと判断する評価工程と、
を含む。これにより、脳内のＡβ蓄積状態を判断する、あるいは判断の補助とすることができる。
また、本発明のマーカーの分析方法は、被験対象に由来する血液試料をＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）を含むマーカーの検出に供して、前記血液試料中のＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）の測定レベルを得る測定工程と、
被験対象の前記ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）の測定レベルが、脳内のＡβの蓄積が陰性である認知機能正常者ＮＣ−のＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）のレベルを基準レベルとして、前記基準レベルよりも低い場合に、被験対象の脳内Ａβの蓄積量は、前記認知機能正常者ＮＣ−の脳内Ａβの蓄積量より多いと判断する評価工程と、
を含む。これにより、脳内のＡβ蓄積状態を判断する、あるいは判断の補助とすることができる。
マーカーのレベルとは、基本的には濃度を意味するが、当業者が濃度に準じて用いる他の単位、例えば、質量分析における検出イオン強度であってもよい。本発明による生体由来試料中のマーカーの濃度分析は、測定値と基準値との比較によって行われる。より正確な分析のため、比較される測定値と基準値とは、同じ条件（前処理条件や保存条件など）で用意された生体由来試料に基づく値であることが好ましい。前記マーカーの基準レベルとしては、脳内のＡβ蓄積が陰性である認知機能正常者ＮＣ−についての測定値を用いることができる。あるいは、前記マーカーの基準レベルとして、脳内のＡβ蓄積が陰性である認知機能正常者ＮＣ−についての確立された濃度基準値を用いてもよい。
マーカーの測定は、好ましくは、生体分子特異的親和性に基づく検査によって行われる。生体分子特異的親和性に基づく検査は、当業者によく知られた方法であり、特に限定されないが、イムノアッセイが好ましい。具体的には、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay）（サンドイッチイムノ法、競合法、及び直接吸着法を含む）、免疫沈降法、沈降反応、免疫拡散法、免疫凝集測定、補体結合反応分析、免疫放射定量法、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイなどの、競合及び非競合アッセイ系を含むイムノアッセイが含まれる。イムノアッセイにおいては、生体由来試料中の上記マーカーに結合する抗体を検出する。
本発明において、マーカーの測定を、アミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のペプチドを認識可能な抗原結合部位を持つ免疫グロブリン、またはアミロイド前駆タンパク質（ＡＰＰ）由来のペプチドを認識可能な抗原結合部位を含む免疫グロブリン断片を用いて作製された抗体固定化担体を用いて行ってもよい。前記抗体固定化担体を用いた免疫沈降法により質量分析装置での試料中ペプチドの検出を行うことができる（Immunoprecipitation-Mass Spectrometry； IP-MS）。
実施例の項で示すように、被験対象に由来する血液試料をＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）を含むマーカーの検出に供して、前記血液試料中のＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）の測定レベルを得て、被験対象の前記ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）の測定レベルが、脳内のＡβの蓄積が陰性である認知機能正常者ＮＣ−のＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）のレベルを基準レベルとして、前記基準レベルよりも低い場合に、被験対象の脳内Ａβの蓄積量は、前記認知機能正常者ＮＣ−の脳内Ａβの蓄積量より多いと判断することができる。
以下に実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。以下において％で示される物の量は、特に断りがない場合は、その物が被験者である場合は重量基準、液体である場合は体積基準で示されている。
［実験例１］
（１）臨床サンプルを用いた、本発明マーカーによるアルツハイマー病診断の性能評価
国立長寿医療研究センターにて、ＮＣ−、ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤのグループに分類された症例の血漿サンプルを用意した。
ＮＣ−： 脳内のＡβの蓄積が陰性で、かつ、認知機能障害は現れていない者
ＮＣ＋：脳内のＡβの蓄積が陽性で、認知機能障害は現れていない者
ＭＣＩ：脳内のＡβの蓄積が陽性で、軽度認知機能障害が現れている者
ＡＤ： 脳内のＡβの蓄積が陽性で、認知機能障害が現れている者
ＰｉＢ＋：ＮＣ＋とＭＣＩとＡＤのグループを合わせたグループ
認知機能障害の有無に関わらず、脳内のＡβが陽性と判定された者
脳内のＡβの蓄積についての陽性と陰性を判断するために、被験者の脳のPiB-PET画像を取得した。大脳皮質のPiB集積量が、非特異的な白質のPiB集積量よりも多い、もしくは同等であった被験者は陽性と判定した。白質への非特異的な集積のみで、皮質にはほとんど集積しない被験者は陰性と判定した。認知機能障害は2011年に発表されたNIA-AA診断基準に準拠して判断した。
各グループの特徴と症例数を表３に示す。
アルツハイマー病の早期診断への応用を考えた場合、ＮＣ−グループと比較して、認知機能障害は現れてないけれども脳内のＡβ蓄積が陽性であると判断されたＮＣ＋グループから測定レベル変動が見られる血中マーカーが診断に有効であると考えられる。つまり、脳内のＡβ蓄積の陽性と陰性を判別できる診断性能を有する血中マーカーを見つけることが重要になる。この観点から、マーカー解析に関してはＮＣ−グループに比べて、他のグループとの間で測定レベル差があるかどうかを評価基準とした。
（２）抗体固定化ビーズの作製
Ａβの第３−８残基をエピトープとする抗Ａβ抗体（6E10: Covance）250μgを Ficin アガロースビーズ (Thermo) 1250 μL(33%スラリー)により消化、Ａβの第１８−２２残基をエピトープとする抗Ａβ抗体 (4G8: Covance）100 μgをリシルエンドペプチダーゼ (LysC) 500 ngにより消化し、それぞれの消化物をサイズ排除クロマトグラフィーで分離・分取した。分画したサンプルを還元および非還元 SDS-PAGE で確認し、F(ab')2 に相当するフラクションをプールした。この 6E10 と 4G8 の F(ab')2 画分をそれぞれ30mMの濃度の cysteamine で還元することにより F(ab') が得られた。次に、アミノ磁気ビーズ (Dynabeads M-270 Amine: Invitrogen) 5 μL(ビーズ量150 μg)を用意し、その表面に結合しているアミノ基に SM(PEG)24 の NHS基を室温で30分間反応させることで、PEGとビーズを共有結合させた。磁気ビーズに結合された SM(PEG) 24 に、6E10 F(ab')と 4G8 F(ab')を 0.25 μgずつ同時に加えたものを室温で2時間反応させてマレイミド基とチオール基を共有結合させた。最後に、0.4 mM L-システインを室温で30分間反応させることで、マレイミド基のブロッキングを行った。作製された抗体固定化ビーズは使用するまで4℃で保存した。
（３）内部標準ペプチドの準備
内部標準ペプチドとして AnaSpec (San Jose, CA, USA)の安定同位体標識されたAβ1-38（SIL-Aβ1-38と呼ぶ）を使用した。SIL-Aβ1-38 は Pheと Ileの炭素原子が13Cで置換されている。SIL-Aβ1-38の乾燥品を50 mM NaOHで溶解した後に、COSMOSIL(R) 5Diol-120-II [7.5 mm I.D. x 600mm] column (Nacalai Tesque, Kyoto) を設置した Prominence HPLC System (Shimadzu Corp, Kyoto, Japan)でサイズ排除クロマトグラフィー（SEC）を行った。移動相：40 mM Tris-HCl, pH8.0、流速：1 mL/min、カラム温度：25 ℃、検出波長：214/280 nmの設定で行った。分取したフラクションの一部は非還元状態で15-20% Tricine-SDS-PAGEへ供し、Silver Staining kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)でバンドを染色した。単量体と確認されたフラクションを 1 mg/mL bovine serum albuminを含む40 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH8.0 で希釈した後、分注して -80 ℃で保存した。一部を取り出し、Human Amyloid β (1-38) (FL) Assay Kit (Immuno-Biological Laboratories; Gunma, Japan)を用いてSIL-Aβ1-38の濃度を測定した。
（４）血漿中Ａβ及びＡβ様ペプチドの測定
全６２症例に対して、抗体固定化ビーズを用いて内部標準ペプチドとしてSIL-Aβ1-38を用いて、IP-MSを行った。
免疫沈降法は次のとおりに実施した。
ヒト血漿 250 μLに、10 pM SIL-Aβ1-38を含む結合バッファー (0.2%(w/v) n-Dodecyl-β-D-maltoside (DDM), 0.2%(w/v) n-Nonyl-β-D-thiomaltoside (NTM), 800mM GlcNAc, 100mM Tris-HCl, 300mM NaCl, pH7.4) 250 μLを混合させた。この血漿サンプルに含まれる沈殿物は Ultrafree-MC, DV 0.65 μm, centrifugal filter devicesを用いて遠心除去した。Protein G Plus Agarose (50% slurry; Pierce, Rockford, IL) 500 μLをH2O 400 μLで１回洗浄後、洗浄バッファー(0.1%(w/v) DDM, 0.1%(w/v) NTM, 50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH7.4) 400 μLで３回洗浄した。そのProtein G Plus Agaroseに先ほどの血漿サンプルを混合させて4℃で１時間インキュベーションさせた。血漿サンプルからProtein G Plus Agaroseを取り除いた後、OTG-glycineバッファー（1% n-Octyl-β-D-thioglucoside (OTG), 50mM glycine , pH2.8）で２回洗浄、洗浄バッファー100 μLで３回洗浄された抗体固定化ビーズ 150 μgに血漿サンプルを混合させて4℃で１時間インキュベーションすることによりＡβ及びＡβ様ペプチドを捕捉した。その後、洗浄バッファー500 μLで１回洗浄、100 μLで４回洗浄後、50 mM 酢酸アンモニウム20 μLで２回洗浄した。さらにH2O 20 μLで１回洗浄した後、5 mM 塩酸を含む70% アセトニトリル 2.5 μLで抗体固定化ビーズに捕捉されたＡβ及びＡβ様ペプチドを溶出させた。溶出液を0.5 μLずつμFocus MALDI plateTM 900 μm上の4 wellへ滴下した。0.5 μLのマトリックス溶液（0.5 mg/mL CHCA, 0.2%(w/v) MDPNA）を混合した後、Linear TOF MSで測定した。
血漿中Ａβ及びＡβ様ペプチドの測定値はLinear TOFで測定された4wellから得られる内部標準ペプチド（SIL-Aβ1-38）に対する各Ａβ及びＡβ様ペプチドのピーク強度比を平均化した値を用いた。MSピーク強度のシグナル変動を補正するために次のような基準を設けた。１回の免疫沈降からは４つのマススペクトルが取得され、結果的に１つのペプチドに対して４つのピーク強度比が得られる。あるペプチドにおける４つのピーク強度比の中央値の0.7〜1.3倍の間から外れたピーク強度比は外れ値とみなして、平均化のデータ処理には用いないことにした。あるペプチドの平均化に用いるピーク強度比のデータ数は最大４つであるが、検出限界に達しなかった場合（S/N ＜ 3）や、外れ値が出た場合はデータ数が減る。もし、平均化に用いるピーク強度比のデータ数が３つ未満であった場合、その時の免疫沈降において、そのピークの強度比は検出不可（N/D）であると定義した。
図２は、APP672-713 (Aβ1-42)について、各グループにおける内部標準SIL-Aβ1-38に対するAPP672-713 (Aβ1-42)の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。図３（Ａ）、図３（Ｂ）、図４（Ｃ）、及び図４（Ｄ）は、それぞれ、APP672-713 (Aβ1-42)／SIL-Aβ1-38について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。
箱ひげ図において、各グループにおいて、箱で示された範囲は、全検体のうち濃度順位が２５〜７５％に当たるサンプルの強度比分布範囲（四分位範囲）を表し、箱の上下に示す横線は、箱の上端及び下端から四分位範囲の１．５倍までの範囲内にあるサンプルのそれぞれ最大値及び最小値を表し、箱中の横棒は強度比の中央値を表す。
ＮＣ−グループに比べて、他のグループとの間で統計的な有意差があるかどうかをDunnett's testを用いて検定し、P < 0.05を示した場合、有意な差があるとした。検出限界以下＝０と設定した。その結果、60%以上の症例において検出されたＡβ及びＡβ様ペプチドは９種類あり、そのうち、APP672-713(Aβ1-42)において、ＮＣ−と比べてＮＣ＋、ＭＣＩ、およびＡＤで統計的な有意差があった（図２）。APP672-713(Aβ1-42)の診断性能を評価するために、ＮＣ−グループに対するＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ、およびＰｉＢ＋グループのＲＯＣ曲線を作成した。ＲＯＣ曲線以下の面積（ＡＵＣ）は、ＮＣ− ｖｓ ＮＣ＋＝0.789、ＮＣ− ｖｓ ＭＣＩ＝0.746、ＮＣ− ｖｓ ＡＤ＝0.864、ＮＣ− ｖｓ ＰｉＢ＋＝0. 808であり、比較的高い値を示した（図３（Ａ）、図３（Ｂ）、図４（Ｃ）、及び図４（Ｄ））。
図２に示すように、APP672-713(Aβ1-42)については、強度比 APP672-713(Aβ1-42)／SIL-Aβ1-38は、ＮＣ−と比べてＮＣ＋、ＭＣＩ、およびＡＤで統計的な有意差をもって減少が見られた。図３（Ａ）、図３（Ｂ）、図４（Ｃ）、及び図４（Ｄ）に示すように、ＡＵＣは、ＮＣ− ｖｓ ＮＣ＋＝0.789、ＮＣ− ｖｓ ＭＣＩ＝0.746、ＮＣ− ｖｓ ＡＤ＝0.864であることから、APP672-713(Aβ1-42)は、ＮＣ−とＮＣ＋、ＮＣ−とＭＣＩ、及びＮＣ−とＡＤを判別できる能力が比較的高いことが示された。また、ＮＣ− ｖｓ ＰｉＢ＋＝0.808であることから、脳内のＡβ蓄積が陽性である被験者を検出できる性能が比較的高いことも示された。このことから、APP672-713(Aβ1-42)は脳内のＡβの蓄積状態を推測できる血中マーカーであることを示唆しており、そのことによりアルツハイマー病診断の補助として利用できる可能性がある。
（５）より詳細な解析
ＮＣ−と比較して各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ）との間のより明確な差を見るために、さらに以下の検討を行った。
図５は、各グループにおけるAPP672-713(Aβ1-42)に対するAPP672-709 (Aβ1-38)の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。図６（Ａ）、図６（Ｂ）、図７（Ｃ）、及び図７（Ｄ）は、APP672-709 (Aβ1-38)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。
図８は、各グループにおけるAPP672-713(Aβ1-42)に対するAPP674-711 (Aβ3-40)の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。図９（Ａ）、図９（Ｂ）、図１０（Ｃ）、及び図１０（Ｄ）は、APP674-711 (Aβ3-40)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。
図１１は、各グループにおけるAPP672-713(Aβ1-42)に対するAPP672-710 (Aβ1-39)の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。図１２（Ａ）、図１２（Ｂ）、図１３（Ｃ）、及び図１３（Ｄ）は、APP672-710 (Aβ1-39)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。
図１４は、各グループにおけるAPP672-713(Aβ1-42)に対するAPP672-711 (Aβ1-40)の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。図１５（Ａ）、図１５（Ｂ）、図１６（Ｃ）、及び図１６（Ｄ）は、APP672-711 (Aβ1-40)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。
図１７は、各グループにおけるAPP672-713(Aβ1-42)に対するOxAPP672-711 (OxAβ1-40)の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。図１８（Ａ）、図１８（Ｂ）、図１９（Ｃ）、及び図１９（Ｄ）は、OxAPP672-711 (OxAβ1-40)／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。
図２０は、各グループにおけるAPP672-713(Aβ1-42)に対するAPP669-711の強度比（Intensity ratio）を示す箱ひげ図である。図２１（Ａ）、図２１（Ｂ）、図２２（Ｃ）、及び図２２（Ｄ）は、APP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)について、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ、ＰｉＢ＋）のＲＯＣ曲線である。
６０％以上の症例において検出された９種類のＡβ及びＡβ様ペプチドの中で、APP672-713 (Aβ1-42)以外の８種類のピーク強度をAPP672-713 (Aβ1-42)のピーク強度でそれぞれ割った値（比率）を比較解析した。その結果、APP672-709 (Aβ1-38)／APP672-713 (Aβ1-42)、APP674-711 (Aβ3-40)／APP672-713 (Aβ1-42)、APP672-710 (Aβ1-39)／APP672-713 (Aβ1-42)、APP672-711 (Aβ1-40)／APP672-713 (Aβ1-42)、OxAPP672-711 (OxAβ1-40)／APP672-713 (Aβ1-42)、及びAPP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)において、ＮＣ−と比較して、ＮＣ＋、ＭＣＩ、及びＡＤは統計学的有意に増加していることが示された（図５、８、１１、１４、１７、及び２０）。特に、APP669-711／APP672-713(Aβ1-42)はアルツハイマー病の進行に伴って上昇する傾向が強いことが示された（図２０）。
APP672-709 (Aβ1-38)／APP672-713 (Aβ1-42)、APP674-711 (Aβ3-40)／APP672-713 (Aβ1-42)、APP672-710 (Aβ1-39)／APP672-713 (Aβ1-42)、APP672-711 (Aβ1-40)／APP672-713 (Aβ1-42)、OxAPP672-711 (OxAβ1-40)／APP672-713 (Aβ1-42)、及びAPP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)の診断性能を評価するために、ＮＣ−グループに対するＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ、およびＰｉＢ＋グループのＲＯＣ曲線を作成した。その結果、これら6種類の比率の全てにおいて、高いAUCを示しており、ＮＣ−とＮＣ＋、ＮＣ−とＭＣＩ、及びＮＣ−とＡＤを判別できる能力、及び脳内のＡβ蓄積が陽性である被験者を検出できる性能が高いことが示された［図６（Ａ）、図６（Ｂ）、図７（Ｃ）、及び図７（Ｄ）；図９（Ａ）、図９（Ｂ）、図１０（Ｃ）、及び図１０（Ｄ）；図１２（Ａ）、図１２（Ｂ）、図１３（Ｃ）、及び図１３（Ｄ）；図１５（Ａ）、図１５（Ｂ）、図１６（Ｃ）、及び図１６（Ｄ）；図１８（Ａ）、図１８（Ｂ）、図１９（Ｃ）、及び図１９（Ｄ）；図２１（Ａ）、図２１（Ｂ）、図２２（Ｃ）、及び図２２（Ｄ）］。
図２１（Ａ）、図２１（Ｂ）、図２２（Ｃ）、及び図２２（Ｄ）から、これらの中でも特に、APP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)のＲＯＣ曲線において、ＮＣ−グループに対するＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤのAUCは0.930以上であったことから、ＮＣ−とＮＣ＋、ＮＣ−とＭＣＩ、及びＮＣ−とＡＤを判別できる能力が非常に高いことが示された。また、ＮＣ− ｖｓ ＰｉＢ＋＝0.969であることから、脳内のＡβ蓄積が陽性である被験者を検出できる性能が非常に高いことも示された。このことから、これら６種類の比率は脳内のＡβの蓄積状態を推測できる血中マーカーであることを示唆しており、そのことによりアルツハイマー病診断の補助として利用できる可能性がある。
次に、ＮＣ−と比較して、ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤは統計学的有意に増加していることが示されたAPP672-709 (Aβ1-38)／APP672-713 (Aβ1-42)、APP674-711 (Aβ3-40)／APP672-713 (Aβ1-42)、APP672-710 (Aβ1-39)／APP672-713 (Aβ1-42)、APP672-711 (Aβ1-40)／APP672-713 (Aβ1-42)、OxAPP672-711 (OxAβ1-40)／APP672-713 (Aβ1-42)、及びAPP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)について、カットオフ値（Cut-off point）を設定することによるアルツハイマー病の判別評価を行った。図６、７、９、１０、１２、１３、１５、１６、１８、１９、２１、及び２２におけるそれぞれのＲＯＣ曲線で、sensitivity - (1 - specificity)が最も高い値を示した各ペプチド／APP672-713 (Aβ1-42)をカットオフ値に設定した。設定したカットオフ値と、その場合のSpecificityと、ＮＣ−グループに対する各グループ（ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ、ＰｉＢ＋）のSensitivity、Positive Predictive Value（PPV）、Negative Predictive Value（NPV）、Accuracyを表４に示す。
表４において、
Cut-off point: カットオフ値
Positive Predictive Value（PPV）＝（真陽性の数）／（真陽性の数＋偽陽性の数）
Negative Predictive Value（NPV）＝（真陰性の数）／（真陰性の数＋偽陰性の数）
Accuracy＝（真陽性の数＋真陰性の数）／全症例数
APP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)がSpecificityと、Sensitivity、Positive Predictive Value（PPV）、Negative Predictive Value（NPV）、Accuracyの全てにおいて非常に高い数値を示しており、ＮＣ−と、ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ、及びＰｉＢ＋を判別できる能力が非常に高いことを示しており、特に脳内のＡβ蓄積の陽性判断に有効であることを示していた。また、ＮＣ−と、ＮＣ＋、ＭＣＩ、及びＡＤを判別できる能力が非常に高いことから、アルツハイマー病診断の補助として活用できることも示している。その他の５種類の比率に関しても、Specificityと、Sensitivity、Positive Predictive Value（PPV）、Negative Predictive Value（NPV）、又はAccuracyにおいて高い値を示しているため、ＮＣ−と、ＮＣ＋、ＭＣＩ、ＡＤ、及びＰｉＢ＋を判別できる能力が高いことを示しており、特に脳内のＡβ蓄積の陽性判断に有効である可能性を示していた。また、ＮＣ−と、ＮＣ＋、ＭＣＩ、及びＡＤを判別できる能力が高いことから、アルツハイマー病診断の補助として活用できる可能性も示している。
（６）PiB測定値との相関解析
脳内のＡβ蓄積はアルツハイマー病の重要な病理学的指標であり、認知症が顕在化するかなり前からＡβの過剰蓄積は開始していることが知られている。PiBはＡβ凝集体に特異的に結合する放射性薬剤であり、その集積をPETで測定することにより脳内のＡβの蓄積を画像化することができる。高い精度で脳内のＡβ蓄積が陽性である被験者を判断できる能力を示した血漿中APP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)が脳内Ａβ蓄積状態を反映しているかどうかを調べるために、APP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)と脳皮質領域のPiB集積平均値（mcSUVR:mean cortical Standard Uptake Value Ratio）との相関を解析した。
図２３は、全６２症例において、横軸にPiB集積平均値（mcSUVR）、縦軸にAPP669-711/APP672-713(Aβ1-42)比率、を示す散布図である。
PiB集積平均値は皮質のPiB集積を定量し、小脳を基準に大脳の集積比を求めた。IP-MSにより得られたAPP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)比率と、PETにより得られたPiB集積平均値（mcSUVR）の相関をPearson product-moment correlation coefficientにより評価した。その結果、相関係数(r)は0.687、p<0.001であった（図２３）。
APP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)比率とPiB集積平均値（mcSUVR）は有意に強い相関があることが示された。このことは、血漿中のAPP669-711／APP672-713 (Aβ1-42)比率は脳内のＡβ蓄積状態を反映していることを意味しており、脳内Ａβ蓄積状態を判断する血中マーカーとして利用できる可能性を示している。
以上例証した結果は、本発明のマーカーは、脳内Ａβ蓄積状態を判断する血中マーカーとして有用であることを示している。また、そのことによりアルツハイマー病診断の補助ならびに発症前診断に活用することができることが示された。

Claims (4)

  1. 被験対象に由来する血液試料を、
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）と、
    ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号７）、ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）（配列番号１）、ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）（配列番号２）、ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）（配列番号３）、ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号４）、及びＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）（配列番号５）からなる群から選ばれる少なくとも１つと
    を含むマーカーの検出に供して、前記血液試料中の
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）と、
    ＡＰＰ６６９−７１１、ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）、ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）、ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）、ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）、及びＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）からなる群から選ばれる前記少なくとも１つと
    の各測定レベルを得る測定工程と、
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
    ＡＰＰ６６９−７１１／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）レベルの比：
    ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）レベルの比：
    ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）レベルの比：
    ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）レベルの比：
    ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）； 及び
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）レベルの比：
    ＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの比を求める算出工程と
    を行い、
    被験対象の前記各比が、脳内のＡβの蓄積が陰性である認知機能正常者ＮＣ−の前記各比を基準レベルとして、前記各比の基準レベルよりも高い場合に、被験対象の脳内Ａβの蓄積量は、前記認知機能正常者ＮＣ−の脳内Ａβの蓄積量よりも多いことを示す、脳内のＡβ蓄積状態を判断するための分析方法。
  2. 血液試料中のＡＰＰ６６９−７１１（配列番号７）とＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）との組み合わせ：
    ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）（配列番号１）とＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）との組み合わせ：
    ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）（配列番号２）とＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）との組み合わせ：
    ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）（配列番号３）とＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）との組み合わせ：
    ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号４）とＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）との組み合わせ： 及び
    ＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）（配列番号５）とＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）との組み合わせ
    からなる群から選ばれる脳内のＡβ蓄積状態を判断するマーカー。
  3. 被験対象に由来する血液試料をＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）を含むマーカーの検出に供して、前記血液試料中のＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）の測定レベルを得る測定工程を行い、
    被験対象の前記ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）の測定レベルが、脳内のＡβの蓄積が陰性である認知機能正常者ＮＣ−のＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）のレベルを基準レベルとして、前記基準レベルよりも低い場合に、被験対象の脳内Ａβの蓄積量は、前記認知機能正常者ＮＣ−の脳内Ａβの蓄積量より多いことを示す、脳内のＡβ蓄積状態を判断するための分析方法。
  4. 被験対象に対して行われた医学的介入の前後において、
    被験対象に由来する血液試料を、
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）（配列番号６）と、
    ＡＰＰ６６９−７１１（配列番号７）、ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）（配列番号１）、ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）（配列番号２）、ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）（配列番号３）、ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）（配列番号４）、及びＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）（配列番号５）からなる群から選ばれる少なくとも１つと
    を含むマーカーの検出に供して、前記血液試料中の
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）と、
    ＡＰＰ６６９−７１１、ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）、ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）、ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）、ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）、及びＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）からなる群から選ばれる前記少なくとも１つと
    の各測定レベルを得る測定工程と、
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６６９−７１１レベルの比：
    ＡＰＰ６６９−７１１／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）レベルの比：
    ＡＰＰ６７２−７０９（Ａβ１−３８）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）レベルの比：
    ＡＰＰ６７４−７１１（Ａβ３−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）レベルの比：
    ＡＰＰ６７２−７１０（Ａβ１−３９）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）；
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）レベルの比：
    ＡＰＰ６７２−７１１（Ａβ１−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）； 及び
    ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）レベルに対するＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）レベルの比：
    ＯｘＡＰＰ６７２−７１１（ＯｘＡβ１−４０）／ＡＰＰ６７２−７１３（Ａβ１−４２）
    からなる群から選ばれる少なくとも１つの比を求める算出工程と
    を行い、
    医学的介入の前における被験対象の前記各比と、医学的介入の後における被験対象の前記各比との比較を行う、脳内のＡβ蓄積状態に関して前記医学的介入の有効性を判断するための方法。
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